Name: Test transportu makromolekularnego między komórkami w roślinie Planta z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-27T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj metodę badania transportu białek między komórkami roślinnymi z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego i mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala wizualizować ruch białek fluorescencyjnych w epidermie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasza praca jest wspierana przez granty z NIH/NIGMS, NSF, USDA/NIFA oraz BARD przyznane VC.

Wstęp
Transport symplastyczny makrocząsteczek poprzez połączenia międzykomórkowe roślin, czyli plasmodesmaty, jest przedmiotem zainteresowania wielu fitopatologów i biologów roślin. Na przykład wiadomo, że kilka białek wirusowych reguluje granice wykluczania wielkości plasmodesmat, aby umożliwić przemieszczanie się wirusa1-3. Ponadto przyjmuje się, że niektóre białka endogenne, w tym ważne regulatory rozwojowe, przemieszczają się z komórki do komórki, prawdopodobnie przez plasmodesmaty, aby pełnić funkcje nieautonomiczne komórkowo4. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na wiarygodną metodologię służącą do identyfikacji i wizualizacji transportu makrocząsteczek między komórkami roślinnymi.
1) Hodowla roślin docelowych
W celu uzyskania wysokiej wydajności transformacji należy używać zdrowych, silnych roślin.
1. Rośliny Arabidopsis 
Wyprawia się jedną roślinę Arabidopsis na podłożu Pro-Mix BX w doniczce (10 cm x 10 cm x 10 cm) w komorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi, przy krótkim fotoperiodzie (8 h światła o natężeniu 130-150 μE m-2 s-1 w temperaturze 23°C/16 h ciemności w temperaturze 20°C) i wilgotności względnej 40-65% przez okres od 6 do 8 tygodni5. Rośliny należy okresowo nawozić dostępnymi komercyjnie produktami zgodnie z opisem5. Do eksperymentów wybiera się liście o rozmiarach przekraczających 15 mm x 35 mm (pomiar długości obejmuje ogonek liściowy).
2. N. benthamiana oraz N. tabacum
Uprawiaj jedną roślinę w podłożu Pro-Mix BX w doniczce (20 cm x 20 cm x 20 cm) w komorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi przy długim fotoperiodzie (16 h światła o natężeniu 130-150 μE m-2 s-1 w temperaturze 23°C/8 h ciemności w 20°C) i względnej wilgotności 40-65% przez 7 do 10 tygodni. Nawoź rośliny sporadycznie dostępnymi w handlu produktami zgodnie z opisem. Do doświadczeń wybieraj liście o rozmiarach większych niż 50 mm x 70 mm dla N. benthamiana lub 10 mm x 125 mm dla N. tabacum (pomiary długości nie obejmują ogonka).
2) Przygotowanie wkładu do armatki genowej z mikrocząsteczkami złota pokrytymi DNA
Protokół dla tego etapu eksperymentu został opisany szczegółowo we wcześniejszej publikacji6. Aby uzyskać najwyższą wydajność transformacji, co ułatwia późniejszą analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej na dalszych etapach eksperymentu, bardzo ważne jest zastosowanie dobrze oczyszczonego DNA plazmidowego o wysokim stężeniu (~1 μg/μl).
W przypadku tego testu ważne jest upewnienie się, że przygotowany wkład nie transformuje jednocześnie dwóch lub więcej sąsiadujących komórek z wysoką częstotliwością, ponieważ liczba komórek związanych z klastrem sygnału fluorescencyjnego służy jako wskaźnik zakresu transportu symplastycznego (tj. pojedyncza komórka zawierająca sygnał wskazuje na brak ruchu, natomiast wielokomórkowy klaster sygnału wskazuje na jego wystąpienie). Jakość każdego wkładu można sprawdzić, analizując ekspresję białka 16–20 godzin po bombardowaniu. Nasz protokół6 produkuje wkłady, w których klastry ekspresji wielokomórkowej powstają wyłącznie w &lt;3% wszystkich zdarzeń ekspresji w tym przedziale czasowym, co czyni je odpowiednimi do niniejszego eksperymentu.
3) Biolistyczna dostawa mikrocząsteczek powlekanych DNA
<ol>
	<li>Odetnij liście w tym samym stadium rozwoju (tj. o tej samej wielkości i wieku, patrz krok 1) za pomocą ostrej żyletki i natychmiast ułóż je stroną abaksjalną do góry na płaskiej powierzchni ze styropianu. Strona abaksjalna liścia stanowi lepszy substrat do bombardowania ze względu na mniejszą gęstość trichomów i cieńszą kutykulę. Liście Arabidopsis, ze względu na ich stosunkowo niewielki rozmiar, należy przykryć kawałkiem siatki okiennej, a następnie przymocować siatkę do powierzchni styropianowej za pomocą pinezek. Utrzymanie liści w pozycji płaskiej zwiększa efektywność dostarczania cząsteczek i minimalizuje uszkodzenia tkanki podczas mikrobombardowania.</li>
	<li>Włóż do pistoletu kasetę z mikrocząsteczkami pokrytymi DNA (przygotowaną w kroku 1). W przypadku Arabidopsis strzelanie przeprowadza się przy ciśnieniu 80-10 psi dla mikrocząsteczek 1-μm oraz 140-160 psi dla mikrocząsteczek 0.6-μm. W przypadku N. benthamiana i tytoniu strzelanie przeprowadza się przy ciśnieniu 10-120 psi dla mikrocząsteczek 1-μm oraz 160-180 psi dla mikrocząsteczek 0.6-μm. W przypadku Arabidopsis zazwyczaj wykorzystujemy jedną kasetę na liść, ponieważ każdy liść posiada powierzchnię wystarczającą tylko na jeden strzał, który rozprowadza mikrocząsteczki na obszarze o średnicy 10-12 mm. W przypadku większych liści N. benthamiana i tytoniu możliwe jest wielokrotne bombardowanie tego samego liścia; musi ono być jednak przeprowadzone w symetrycznych pozycjach po każdej stronie nerwu głównego, aby celować w obszary liścia będące w tym samym stadium rozwoju (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Zdejmij liście z powierzchni styropianowej i umieść je w szalce Petriego na 3 warstwach zwilżonego papieru filtracyjnego Whatman, szczelnie zamknij szalkę Parafilmem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 36-48 hr, aby umożliwić ekspresję dostarczonych transgenów oraz potencjalny ruch produktów białkowych z komórki do komórki.</li>
</ol>
4) Obrazowanie ekspresji białka
Sygnał fluorescencyjny przejściowo ekspresowanych białek z tagiem jest wizualizowany za pomocą mikroskopii konfokalnej. Należy zadbać o dobór optymalnych ustawień mikroskopu dla detekcji każdego badanego białka. Na przykład białka wykazujące ograniczoną akumulację wewnątrzkomórkową i słabą intensywność sygnału, takie jak białko ruchu wirusa mozaiki tytoniu (TMV MP) zlokalizowane w plazmodesmatach1-3,6, powinny być obserwowane przy użyciu obiektywu 40X, który zapewnia wyższą rozdzielczość i czułość, podczas gdy białka o rozkładzie cytoplazmatycznym i silnej intensywności sygnału, takie jak wolne YFP, mogą być wizualizowane przy użyciu obiektywu 10X z funkcją zoomu konfokalnego w celu szybszego obrazowania (patrz. Rycina 1).
Transport symplastyczny wnioskuje się na podstawie pojawienia się wielokomórkowych klastrów zawierających sygnał fluorescencyjny. Liczba takich klastrów oraz liczba komórek w każdym klastrze wskazują na zakres transportu międzykomórkowego. Aby uzyskać wiarygodne dane, należy zarejestrować co najmniej 10 klastrów ekspresji dla każdego systemu eksperymentalnego. Na przykład, jeśli porównywany jest transport białka między komórkami w dwóch różnych tle genetycznych (np. w roślinach typu dzikiego i transgenicznych), należy zarejestrować łącznie 20 klastrów ekspresji. Co ważne, eksperymenty, których wyniki mają być ze sobą porównane, powinny być przeprowadzane jednocześnie.
5. Reprezentatywne wyniki
Poniższa rycina przedstawia reprezentatywne eksperymenty służące do wykrywania transportu symplastycznego białek znakowanych fluorescencyjnie. Panele A i B pokazują typowe obrazy konfokalne uzyskane po mikrobombardowaniu liścia N. benthamiana konstruktem ekspresyjnym TMV MP-YFP. W panelu A obserwuje się ruch symplastyczny TMV MP-YFP na podstawie pojawienia się wielokomórkowych skupisk sygnału YFP. Nie wszystkie przejściowo ekspresowane białka TMV MP-YFP są zdolne do przemieszczania się, co potwierdza sygnał jednokomórkowy w niektórych próbkach po mikrobombardowaniu (panel B). Statystycznie, w &lt;40% policzonych skupisk sygnału TMV MP-YFP nie jest w stanie przemieszczać się między komórkami, podczas gdy w &gt;60% skupisk białko przemieszcza się między 2-5 komórkami, przy czym najczęstszym jest rozprzestrzenienie na dwie komórki (ok. ~50% przypadków) (Rycina 1C).
Białka o stosunkowo niewielkim rozmiarze cząsteczkowym, nieposiadające wrodzonej aktywności ruchowej, mogą dyfundować przez PD, przemieszczając się z komórki do komórki. Na przykład wolne YFP, lub 1xYFP (ok. 27 kDa, panel D), rozprzestrzenia się pomiędzy kilkoma komórkami w 30% policzonych skupisk (panele C). Ta niespecyficzna dyfuzja nie występuje w przypadku translacyjnego dimeru YFP, czyli 2xYFP (54 kDa, panel E), którego rozmiar jest porównywalny z białkiem fuzyjnym TMV MP-YFP (57 kDa) i który jest całkowicie autonomiczny komórkowo (Rycina 1C).
<img src="/files/ftp_upload/2208/2208fig1.jpg" alt="Analiza fluorescencyjna mikroskopowa; ekspresja białek wirusowych; schemat; wyniki eksperymentu; porównanie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1.Typowe wyniki uzyskane w teście transportu symplastycznego w N. benthamiana tkanki liściowe. (A, B) Wizualizacja TMV MP-YFP. (C) Ilościowe oznaczenie klastrów sygnału. Odpowiednio 1xYFP i 2xYFP, wolne YFP i translacyjny dimer YFP. (D) Wizualizacja 1xYFP. (E) Wizualizacja 2xYFP. Na mikrografiach lewe panele przedstawiają sygnał YFP, a prawe panele przedstawiają obrazy złożone z sygnałów YFP (na zielono) i autofluorescencji chloroplastów (na biało). Obrazy stanowią pojedyncze przekroje konfokalne. Gwiazdki na mikrografiach wskazują komórki epidermy wykazujące sygnał YFP. Paski skali = 50 μm.

<ol><li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+non-destructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses.+%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. </a> Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).</li>
<li>Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viral+movement+proteins%3A+agents+for+cell-to-cell+trafficking+of+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes.</a> Virology. 344, 169-184 (2006).</li>
<li>Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+spread+by+diffusion+on+ER-associated+movement-protein-rafts+through+plasmodesmata+gated+by+viral+induced+host+beta-1%2C3-glucanases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases.</a> Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).</li>
<li>Zambryski, P. C., Crawford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+gatekeepers+for+cell-to-cell+transport+of+developmental+signals+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).</li>
<li>Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+plants+and+presercation+of+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth of plants and presercation of seeds.</a> Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).</li>
<li>Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+transient+genetic+transformation+of+Arabidopsis+leaves+by+biolistic+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment.</a> Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).</li>
<li>Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+but+not+branched%2C+plasmodesmata+allow+the+nonspecific+trafficking+of+proteins+in+developing+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves.</a> Cell. 97, 743-754 (1999).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11, 309-322 (1999).</li>
<li>Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+symplastic+trafficking+during+development+in+Arabidopsis+thaliana+apices%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices.</a> Development. 126, 1879-1889 (1999).</li>
<li>Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+movement+of+GFP+during+embryogenesis+and+early+seedling+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).</li>
<li>Crawford, K. M., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-targeted+and+targeted+protein+movement+through+plasmodesmata+in+leaves+in+different+developmental+and+physiological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states.</a> Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).</li>
<li>Roberts, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+unloading+in+sink+leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+comparison+of+a+fluorescent+solute+with+a+fluorescent+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus.</a> Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).</li>
<li>Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus+%28TMV%29+replicase+and+movement+protein+function+synergistically+in+facilitating+TMV+spread+by+lateral+diffusion+in+the+plasmodesmal+desmotubule+of+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Kluczem do sukcesu analizy transportu symplastycznego jest uzyskanie wysokiej wydajności transformacji, co pozwala na wytworzenie statystycznie istotnych i łatwo wykrywalnych skupisk sygnałów. Można to osiągnąć, wykorzystując liście zebrane ze zdrowych, silnych roślin oraz przygotowując cząsteczki złota pokryte czystym i skoncentrowanym preparatem DNA.
Użycie liści znajdujących się na tym samym etapie wzrostu jest również kluczowe dla wiarygodności analizy. Znane jest, że otwór plasmodesm jes...

<table><tbody><tr><td>Mikrocząsteczki złota, o średnicy 1,0 &amp;mu;m</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td></td></tr><tr><td>Mikrocząsteczki złota, o średnicy 0,6 &amp;mu;m</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr><tr><td>Przewody Tefzel</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Stacja przygotowawcza do kartridży Helios</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2420</td><td></td></tr><tr><td>Obcinak do przewodów</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Działo genowe Helios</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2432</td><td></td></tr><tr><td>Regulator gazu helu</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2413</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza makromolekularnego transportu międzykomórkowego in planta z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

W niniejszej pracy przedstawiamy prosty i szybki protokół wykrywania i oceny zakresu transportu makromolekularnego między komórkami in planta. W tym protokole białko zainteresowania z tagiem fluorescencyjnym jest przejściowo ekspresowane w tkance roślinnej po dostarczeniu konstruktu DNA kodującego to białko za pomocą biolistyki. Następnie rozkład wewnątrz- i międzykomórkowy tagowanego białka jest analizowany przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Szczegółowo opisujemy tę technologię, dostarczając protokoły krok po kroku w celu analizy i oceny zakresu symplastycznego transportu białek u trzech gatunków roślin: Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana oraz N. tabacum (tytoń).

Transport makromolekularny między komórkami roślinnymi można oceniać poprzez przejściową ekspresję białka docelowego znakowanego fluorescencyjnie oraz analizę jego rozkładu wewnątrz- i międzykomórkowego za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Analiza makromolekularnego transportu międzykomórkowego in planta z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy prosty i szybki protokół wykrywania oraz oceny zakresu transportu makromolekularnego między komórkami in planta. W tym protokole ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest analiza zakresu przemieszczania się znakowanego fluorescencyjnie białka między komórkami w epidermie rośliny. Osiąga się to poprzez uzyskanie cząsteczek złota pokrytych DNA w celu przejściowej ekspresji badanego białka fuzyjnego w epidermie rośliny. W drugim kroku DNA jest dostarczane do epidermy rośliny, co umożliwia ekspresję i przemieszczanie się badanego białka fuzyjnego.Następnie ekspresowane białko fuzyjne obserwuje się pod mikroskopem konfokalnym, aby monitorować ekspresję i lokalizację białek testowych znakowanych fluorescencyjnie. Otrzymane wyniki wykazują zakres transportu białka znakowanego fluorescencyjnie między komórkami na podstawie analizy rozkładu sygnału fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Cześć, jestem Ben Myers z laboratorium KY w Katedrze Biochemii i Biologii Komórki na State University of New York w Stony Brook.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę analizy zakresu przemieszczania się białek znakowanych fluorescencyjnie z komórki do komórki w epidermie rośliny. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania transportu międzykomórkowego białek ruchu wirusów roślinnych w różnych genotypach roślin oraz do porównywania mobilności międzykomórkowej różnych typów białek. Przejdźmy zatem do realizacji.Aby rozpocząć ten protokół, wyhoduj jedną roślinę arabidopsis na podłożu Promix bx. W doniczce o odpowiedniej wielkości, w komorze o kontrolowanych warunkach środowiskowych z krótkim fotoperiodem i wilgotnością względną od 40 do 65%. W przypadku roślin nicotiana, hamana oraz nicotiana tobacco, wyhoduj każdą roślinę na podłożu Promix BX w większej doniczce. Ponownie zapewnij komorę o kontrolowanych warunkach środowiskowych z długim fotoperiodem i wilgotnością względną od 40 do 65%.Nawozić roślinę sporadycznie, korzystając z dostępnych w handlu produktów, zgodnie z wcześniejszym opisem. Po sześciu do ośmiu tygodniach wzrostu rośliny Opsis wybrać do eksperymentu liście o rozmiarach większych niż 15 millimeter na 35 millimeter, przy czym pomiar długości obejmuje ogonek. W przypadku roślin end benanna oraz NAC prowadzić uprawę przez siedem do 10 tygodni. Następnie wybrać liście o rozmiarach większych niż 50 millimeter na 70 millimeter dla end benanna oraz 100 millimeter na 125 millimeter dla nac.W tych przypadkach pomiary długości nie obejmują peoli. Przed rozpoczęciem dostarczania do BIC mikrocząsteczek powlekanych DNA należy przygotować kasetę do armatki genowej z mikrocząsteczkami złota powlekanych DNA, zgodnie z wcześniejszym szczegółowym opisem. Następnie należy usunąć liście w tym samym stadium rozwoju za pomocą ostrej żyletki i niezwłocznie ułożyć je stronami AAL skierowanymi do góry na płaskiej powierzchni ze styropianu.Strona abaksjalna liścia stanowi lepszy substrat do bombardowania ze względu na niższą gęstość trichomów i cieńszą kutykulę. Małe liście, takie jak u rapid opsis, można unieruchomić, przykrywając je kawałkiem siatki okiennej i mocując siatkę do powierzchni styropianu za pomocą pinezek. Liście powinny pozostać płasko, aby zwiększyć efektywność dostarczania cząstek i zminimalizować uszkodzenia tkanki podczas mikrobombardowania.Następnie włóż do pistoletu kasetę z mikrocząsteczkami pokrytymi DNA. W przypadku królika. Wykonaj strzał przy ciśnieniu od 140 do 160 PSI dla mikrocząsteczek o rozmiarze 0.6 micron.Przeprowadź bombardowanie próbki, używając jednego wkładu na liść, aby rozprowadzić mikrocząsteczki na powierzchni o średnicy od 10 do 12 milimetrów. W przypadku end benanna i end baum wykonaj strzelanie przy ciśnieniu od 160 do 180 PSI dla mikrocząsteczek o rozmiarze 0,6 mikrona w przypadku większych liści end benanna i end tobacco.Możliwe jest przeprowadzenie wielokrotnego bombardowania tego samego liścia, jednak należy je wykonywać w symetrycznych pozycjach po obu stronach nerwu głównego, aby objąć obszary liścia znajdujące się na tym samym etapie rozwoju. Sygnał fluorescencyjny przejściowo ekspresowanych białek znakowanych wizualizuje się za pomocą mikroskopii konfokalnej. Należy zadbać o dobranie optymalnych ustawień mikroskopu w celu wykrycia każdego z testowanych białek.Użyj obiektywu o powiększeniu 40x do obserwacji białek wykazujących ograniczoną akumulację wewnątrzkomórkową ze słabą intensywnością sygnału, takich jak lokalizacja w błonie plazmatycznej białka ruchu wirusa mozaiki tytoniu, T-M-V-M-P. Zapewnia to wyższą rozdzielczość i zwiększoną czułość. Jednak do szybszego obrazowania białek wykazujących rozkład cytoplazmatyczny z silną intensywnością sygnału, takich jak wolne żółte białko fluorescencyjne (YFP), można użyć obiektywu 10x z funkcją zoomu konfokalnego. Prosty transport wnioskuje się na podstawie obecności wielokomórkowych skupisk zawierających sygnał fluorescencyjny.Liczba takich skupisk oraz liczba komórek w każdym z nich wskazują na zakres transportu międzykomórkowego. Aby uzyskać wiarygodne dane, zarejestruj co najmniej 100 ekspresji skupisk na system eksperymentalny, dbając o to, aby eksperymenty były przeprowadzane jednocześnie.Określenie momentu przeprowadzenia porównań. W tym przypadku wykryto prosty transport białek znakowanych fluorescencyjnie. Przedstawiono typowe obrazy konfokalne uzyskane po mikrobombardowaniu liścia end hamana konstruktem wykazującym ekspresję A TMV mp YFP.Uproszczony ruch TMV MP YFP obserwuje się na podstawie pojawienia się wielokomórkowych skupisk sygnału YFP. Jednakże nie wszystkie przejściowo wyrażone białka TMV MP YFP są zdolne do ruchu, co potwierdza sygnał w pojedynczych komórkach w niektórych mikrobombardowaniach.Statystycznie w mniej niż 40% policzonych klastrów sygnału TMV MP YFP nie jest w stanie przemieszczać się między komórkami. Natomiast w ponad 60% klastrów białko przemieszcza się między dwiema a pięcioma komórkami. Przy najczęstszym rozprzestrzenianiu się na dwie komórki, białka o stosunkowo niewielkim rozmiarze cząsteczkowym, pozbawione wrodzonej aktywności ruchowej, mogą dyfundować przez SMA plazmy, aby przemieszczać się z komórki do komórki.Na przykład wolne YFP lub pojedyncze XYFP rozprzestrzeniają się pomiędzy kilka komórek i w ponad 30% policzonych skupisk. Z kolei taka niespecyficzna dyfuzja nie występuje w przypadku translacyjnego dimeru YFP lub dwóch XYFP, których rozmiar jest porównywalny z białkiem fuzyjnym TMV MP YFP i które wykazują całkowitą autonomiczność komórkową. Przedstawiliśmy właśnie sposób analizy ruchu białek znakowanych fluorescencyjnie między komórkami z wykorzystaniem ekspresji przejściowej za pomocą systemu pistoletu genowego w epidermie roślin.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o przygotowaniu zdrowych, silnych roślin oraz wysokiej jakości cząsteczek złota pokrytych DNA do dostarczania DNA, a także o przeanalizowaniu odpowiedniej liczby klastrów ekspresji w celu uzyskania statystycznie wiarygodnych wyników. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.

a-cell-to-cell-macromolecular-transport-assay-planta-utilizing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test transportu makrocząsteczek od komórki do komórki in Planta z wykorzystaniem bombardowania biologicznego

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Ukierunkowana degradacja białek stanowi główny mechanizm regulujący funkcjonowanie komórki. Zachodzi za pośrednictwem konserwatywnego szlaku ubikwityna-proteasom, który przyłącza łańcuchy poliubikwityny do białka docelowego, które następnie służą jako molekularne "znaczniki" dla proteasomu 26S. W tym miejscu opisujemy prosty i niezawodny bezkomórkowy test proteasomalnej degradacji białek.

Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Istniejące metody modyfikacji roślin mają ograniczone zastosowanie. Zaproponowana tu nowatorska technologia oparta na peptydach obiecuje zarówno prostotę, jak i skuteczność we wprowadzaniu egzogennych białek lub genów do pożądanych przedziałów wewnątrzkomórkowych nienaruszonych roślin.

Peptydowa metoda transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellarne w roślinach

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Przedstawiono ulepszony protokół pomiaru przejściowej ekspresji genów z konstruktów reporterowych w komórkach aleuronowych jęczmienia po bombardowaniu cząsteczkami. Połączenie zautomatyzowanego mielenia ziarna z 96-dołkowymi testami enzymatycznymi na płytkach zapewnia wysoką wydajność zabiegu.

Pomiar ekspresji genów w warstwach aleuronu z bombardowanego jęczmienia ze zwiększoną przepustowością

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Poznaj metodę badania transportu białek między komórkami roślinnymi z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego i mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala wizualizować ruch białek fluorescencyjnych w epidermie.

Analiza makromolekularnego transportu międzykomórkowego in planta z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego

Przeglądaj więcej filmów