Analiza makromolekularnego transportu międzykomórkowego in planta z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest analiza zakresu przemieszczania się znakowanego fluorescencyjnie białka między komórkami w epidermie rośliny. Osiąga się to poprzez uzyskanie cząsteczek złota pokrytych DNA w celu przejściowej ekspresji badanego białka fuzyjnego w epidermie rośliny. W drugim kroku DNA jest dostarczane do epidermy rośliny, co umożliwia ekspresję i przemieszczanie się badanego białka fuzyjnego.

Następnie ekspresowane białko fuzyjne obserwuje się pod mikroskopem konfokalnym, aby monitorować ekspresję i lokalizację białek testowych znakowanych fluorescencyjnie. Otrzymane wyniki wykazują zakres transportu białka znakowanego fluorescencyjnie między komórkami na podstawie analizy rozkładu sygnału fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Cześć, jestem Ben Myers z laboratorium KY w Katedrze Biochemii i Biologii Komórki na State University of New York w Stony Brook.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę analizy zakresu przemieszczania się białek znakowanych fluorescencyjnie z komórki do komórki w epidermie rośliny. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania transportu międzykomórkowego białek ruchu wirusów roślinnych w różnych genotypach roślin oraz do porównywania mobilności międzykomórkowej różnych typów białek. Przejdźmy zatem do realizacji.

Aby rozpocząć ten protokół, wyhoduj jedną roślinę arabidopsis na podłożu Promix bx. W doniczce o odpowiedniej wielkości, w komorze o kontrolowanych warunkach środowiskowych z krótkim fotoperiodem i wilgotnością względną od 40 do 65%. W przypadku roślin nicotiana, hamana oraz nicotiana tobacco, wyhoduj każdą roślinę na podłożu Promix BX w większej doniczce. Ponownie zapewnij komorę o kontrolowanych warunkach środowiskowych z długim fotoperiodem i wilgotnością względną od 40 do 65%.

Nawozić roślinę sporadycznie, korzystając z dostępnych w handlu produktów, zgodnie z wcześniejszym opisem. Po sześciu do ośmiu tygodniach wzrostu rośliny Opsis wybrać do eksperymentu liście o rozmiarach większych niż 15 millimeter na 35 millimeter, przy czym pomiar długości obejmuje ogonek. W przypadku roślin end benanna oraz NAC prowadzić uprawę przez siedem do 10 tygodni. Następnie wybrać liście o rozmiarach większych niż 50 millimeter na 70 millimeter dla end benanna oraz 100 millimeter na 125 millimeter dla nac.

W tych przypadkach pomiary długości nie obejmują peoli. Przed rozpoczęciem dostarczania do BIC mikrocząsteczek powlekanych DNA należy przygotować kasetę do armatki genowej z mikrocząsteczkami złota powlekanych DNA, zgodnie z wcześniejszym szczegółowym opisem. Następnie należy usunąć liście w tym samym stadium rozwoju za pomocą ostrej żyletki i niezwłocznie ułożyć je stronami AAL skierowanymi do góry na płaskiej powierzchni ze styropianu.

Strona abaksjalna liścia stanowi lepszy substrat do bombardowania ze względu na niższą gęstość trichomów i cieńszą kutykulę. Małe liście, takie jak u rapid opsis, można unieruchomić, przykrywając je kawałkiem siatki okiennej i mocując siatkę do powierzchni styropianu za pomocą pinezek. Liście powinny pozostać płasko, aby zwiększyć efektywność dostarczania cząstek i zminimalizować uszkodzenia tkanki podczas mikrobombardowania.

Następnie włóż do pistoletu kasetę z mikrocząsteczkami pokrytymi DNA. W przypadku królika. Wykonaj strzał przy ciśnieniu od 140 do 160 PSI dla mikrocząsteczek o rozmiarze 0.6 micron.

Przeprowadź bombardowanie próbki, używając jednego wkładu na liść, aby rozprowadzić mikrocząsteczki na powierzchni o średnicy od 10 do 12 milimetrów. W przypadku end benanna i end baum wykonaj strzelanie przy ciśnieniu od 160 do 180 PSI dla mikrocząsteczek o rozmiarze 0,6 mikrona w przypadku większych liści end benanna i end tobacco.

Możliwe jest przeprowadzenie wielokrotnego bombardowania tego samego liścia, jednak należy je wykonywać w symetrycznych pozycjach po obu stronach nerwu głównego, aby objąć obszary liścia znajdujące się na tym samym etapie rozwoju. Sygnał fluorescencyjny przejściowo ekspresowanych białek znakowanych wizualizuje się za pomocą mikroskopii konfokalnej. Należy zadbać o dobranie optymalnych ustawień mikroskopu w celu wykrycia każdego z testowanych białek.

Użyj obiektywu o powiększeniu 40x do obserwacji białek wykazujących ograniczoną akumulację wewnątrzkomórkową ze słabą intensywnością sygnału, takich jak lokalizacja w błonie plazmatycznej białka ruchu wirusa mozaiki tytoniu, T-M-V-M-P. Zapewnia to wyższą rozdzielczość i zwiększoną czułość. Jednak do szybszego obrazowania białek wykazujących rozkład cytoplazmatyczny z silną intensywnością sygnału, takich jak wolne żółte białko fluorescencyjne (YFP), można użyć obiektywu 10x z funkcją zoomu konfokalnego. Prosty transport wnioskuje się na podstawie obecności wielokomórkowych skupisk zawierających sygnał fluorescencyjny.

Liczba takich skupisk oraz liczba komórek w każdym z nich wskazują na zakres transportu międzykomórkowego. Aby uzyskać wiarygodne dane, zarejestruj co najmniej 100 ekspresji skupisk na system eksperymentalny, dbając o to, aby eksperymenty były przeprowadzane jednocześnie.

Określenie momentu przeprowadzenia porównań. W tym przypadku wykryto prosty transport białek znakowanych fluorescencyjnie. Przedstawiono typowe obrazy konfokalne uzyskane po mikrobombardowaniu liścia end hamana konstruktem wykazującym ekspresję A TMV mp YFP.

Uproszczony ruch TMV MP YFP obserwuje się na podstawie pojawienia się wielokomórkowych skupisk sygnału YFP. Jednakże nie wszystkie przejściowo wyrażone białka TMV MP YFP są zdolne do ruchu, co potwierdza sygnał w pojedynczych komórkach w niektórych mikrobombardowaniach.

Statystycznie w mniej niż 40% policzonych klastrów sygnału TMV MP YFP nie jest w stanie przemieszczać się między komórkami. Natomiast w ponad 60% klastrów białko przemieszcza się między dwiema a pięcioma komórkami. Przy najczęstszym rozprzestrzenianiu się na dwie komórki, białka o stosunkowo niewielkim rozmiarze cząsteczkowym, pozbawione wrodzonej aktywności ruchowej, mogą dyfundować przez SMA plazmy, aby przemieszczać się z komórki do komórki.

Na przykład wolne YFP lub pojedyncze XYFP rozprzestrzeniają się pomiędzy kilka komórek i w ponad 30% policzonych skupisk. Z kolei taka niespecyficzna dyfuzja nie występuje w przypadku translacyjnego dimeru YFP lub dwóch XYFP, których rozmiar jest porównywalny z białkiem fuzyjnym TMV MP YFP i które wykazują całkowitą autonomiczność komórkową. Przedstawiliśmy właśnie sposób analizy ruchu białek znakowanych fluorescencyjnie między komórkami z wykorzystaniem ekspresji przejściowej za pomocą systemu pistoletu genowego w epidermie roślin.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o przygotowaniu zdrowych, silnych roślin oraz wysokiej jakości cząsteczek złota pokrytych DNA do dostarczania DNA, a także o przeanalizowaniu odpowiedniej liczby klastrów ekspresji w celu uzyskania statystycznie wiarygodnych wyników. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.