Utrzymywanie Wolbachia w medium bezkomórkowym

Nazywam się Courtney Ston. Pracuję w Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health w laboratorium dr. Jasona Rascona. Dzisiaj przeprowadzimy oczyszczanie bakterii z hodowli komórek owadziech.

Jest to w rzeczywistości bardzo prosta procedura. Zaczynamy odyznania komórek, a następnie fizycznie niszczymy błony komórkowe eukariotycznego gospodarza, stosując lizę szklanymi kuleczkami. Następnie wykorzystujemy wirowanie różnicowe, aby oddzielić bakterie od szczątków komórek gospodarza.

Następnie stosujemy serię etapów filtracji, aby dodatkowo usunąć cząstki komórek gospodarza, tak aby na koniec pozostał jedynie oczyszczony osad bakteryjny. Jest to w rzeczywistości jeden z głównych wymogów. Jest to komora z laminarnym przepływem powietrza, która służy do utrzymania sterylności, ponieważ hodowle komórkowe są bardzo podatne na kontaminację.

Potrzebujemy również pożywek do hodowli komórkowej oraz samych komórek, które hodujemy w plastikowych kolbach. Niezbędne będą także trzymilimetrowe kulki do rozbijania (blast beads), stożkowate probówki o pojemności 50 ml oraz wirówka zdolna do wirowania z wysoką prędkością, około 18 000 G, w celu osadzenia bakterii, a także zdolna do wirowania z prędkością około 3000 G lub 2 500 G w celu osadzenia komórek gospodarza. Pierwszym krokiem będzie zatem przygotowanie naszych hodowlanych komórek.

Są hodowane, prawda? To są kolby T 75. Zawierają 15 ml pożywki hodowlanej oraz nasze komórki.

W pierwszej kolejności rozpoczniemy od zniszczenia warstwy komórkowej i zebrania komórek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Należy przesuwać końcówkę pipety w górę i w dół po warstwie komórek, aby przenieść wszystkie komórki do medium. Gdy komórki znajdą się w medium, przenosimy je pipetą do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.

Teraz do obu zawiesin komórkowych dodamy szklane kuleczki o średnicy 3 mm. Zostały one poddane autoklawowaniu i mogą być ponownie wykorzystane. Przed kolejnym użyciem można je przemyć, namoczyć w wybielaczu, a następnie ponownie wysterylizować w autoklawie.

Należy wlać zawartość, dbając o to, aby nie dotknąć wlewkiem szklanego słoika B wlewu probówki wirówkowej. Do każdej probówki wirówkowej wsypujemy szklane kuleczki do poziomu około 5 ml. Następnie przystępujemy do fizycznej lityzacji komórek eary, aby uwolnić bakterie do zawiesiny.

Używamy wstrząsarki vortex, ustawiamy ją na najwyższą prędkość i wstrząsamy przez pięć minut. W ten sposób wstrząsamy komórki z szklanymi koralikami o średnicy 3 mm przez pięć minut, a następnie przenosimy nadsącz za pomocą czystej pipety do czystej i sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 mL. Otrzymujemy w ten sposób nowo stworzoną zawiesinę, która składa się z uwolnionych bakterii i roztworu, a także z szczątków całych komórek.

Kolejnym krokiem będzie wirowanie z niską prędkością w celut osadzenia materiału stałego i pozostawienia bakterii w zawiesinie. Użyjemy wirówki ustawionej na 2 500 ×g przez 10 minut. Wirowanie przeprowadzimy w temperaturze 4 °C, aby ułatwić zebranie osadu na dnie.

Następnie umieszczamy próbkę w urządzeniu, upewniamy się, że jest wyważona, zamykamy pokrywę i wirujemy przez 10 minut. W ten sposób odwirowałem supernatant zawierający szczątki komórek gospodarza oraz oczyszczone bakterie. Proces przeprowadzono przy 2 500 G przez 10 minut.

Jak widać, na dnie probówki znajduje się osad składający się z resztek komórkowych. Nowo uwolnione bakterie wciąż znajdują się w nadosadzie, ponieważ siła odśrodkowa nie była wystarczająca, aby je również wytrącić. Kolejnym krokiem będzie zatem usunięcie nadosadu i przefiltrowanie go przez filtr o rozmiarze pięciu mikronów.

Jest to filtr o wielkości oczek 5 µm, który pasuje do dowolnego rodzaju strzykawki. Zamierzam użyć strzykawki o pojemności 30 ml; wystarczy wysunąć tłok, a następnie, nie dotykając samego filtra (szczególnie jego dolnej części, która musi pozostać sterylna), przymocować strzykawkę do filtra, wkręcając ją. Następnie delikatnie naciskamy tłok, aby przepuścić nadsącz przez filtr do probówki.

Nie należy naciskać zbyt mocno, ponieważ można uszkodzić filtr, przez co przestanie on działać. Jeśli dojdzie do sytuacji, w której konieczne jest zastosowanie dużego nacisku, należy zdjąć filtr i wymienić go na nowy, co oznacza, że jest on mocno zapchany szczątkami komórkowymi. W tym momencie, w zależności od objętości, jako dodatkowa metoda uzyskania bardzo czystej kultury bakteryjnej, dodajemy do probówki do wirówki wysokich obrotów 250 mM roztwór sacharozy, który został wysterylizowany przez filtrowanie.

Należy napełnić butelkę w co najmniej 80%. Zazwyczaj napełniamy ją aż do szyjki. Probówki muszą być wypełnione w takim stopniu, aby nie zapadły się pod wpływem ciśnienia w naszej wirówce wysokich obrotów.

W tym kroku odwirujemy znadpływ, aby uzyskać oczyszczone bakterie, przy 18 000 ×g w wirówce wysokich obrotów. Należy oczywiście upewnić się, że probówki są rozmieszczone symetrycznie, a następnie zamknąć urządzenie. Ustawimy czas wirowania na 10 minut.

Proces ten przeprowadzamy w temperaturze 10 °C lub niższej, co ustawiliśmy tutaj na panelu sterowania. Prędkość kątowa dla tego konkretnego rotora w wirówce wynosi 12,5 obr./min. Korzystając z tabeli konwersji, wiemy, że odpowiada to sile odśrodkowej wynoszącej około 18 670 ×g. W ten sposób wykonaliśmy wirowanie przy wysokiej prędkości, aby osadzić nasze oczyszczone bakterie w formie pelletu.

Jak widać, otrzymaliśmy wyraźny osad bakteryjny na dnie probówki do wirowania wysokoprędkościowego. Teraz usuniemy cały nadsącz do pojemnika na odpady ciekłe. W tym momencie musimy resuspender bakterie.

Resuspenderę go w dwóch mililitrach naszego pożywki hodowlanej, którą jest pożywka Schneidera dla owadów, uzupełniona o 10% nieaktywnej termicznie płodowej surowicy bydlęcej. Następnie resuspenderę osad, pipetując go w górę i w dół, aż wszystkie bakterie powrócą do roztworu. Teraz, gdy bakterie znajdują się ponownie w zawiesinie, przeprowadzimy jeszcze jeden etap oczyszczania, aby pozbyć się wszelkich pozostałych odłamków komórek gospodarza.

W tym celu użyjemy filtra 2,7 µm. Praktycznym rozwiązaniem jest wykorzystanie plastikowej obudowy z naszego filtra 5 µm jako uchwytu. Pobieramy roztwór, przykręcamy strzykawkę do filtra 2,7 µm, a następnie filtrujemy go do probówki do długoterminowego przechowywania.

Podobnie jak w przypadku poprzedniego filtra, należy delikatnie nacisnąć tłok. W ten sposób otrzymaliśmy roztwór oczyszczonych bakterii. W następnej kolejności pokażę Państwu, w jaki sposób przeprowadzamy analizę żywotności.

Używamy zestawu do oceny żywotności bakterii LIVE/DEAD BacLight firmy Molecular Probes. Zestaw ten zawiera dwa barwniki: jodek propidyny oraz SYTO 9. Jodek propidyny fluorescuje na czerwono i barwi wyłącznie bakterie, których błona komórkowa nie jest w pełni nienaruszona, natomiast SYTO 9 barwi wszystkie bakterie.

Kiedy obserwuje się te bakterie pod mikroskopem wyposażonym w optykę fluorescencyjną, wszystkie bakterie będą fluorescować na zielono, a podgrupa tych, które są martwe, będzie fluorescować na czerwono. Pobieramy niewielką alikwot z naszej oczyszczonej próbki i w tym przypadku pobiorę tylko 10 µL, czyli wystarczającą ilość do przygotowania jednego preparatu. Następnie rozdzielę ją do dwóch kolejnych.

Następnie dodam dwa pozostałe barwniki, czyli tylko 1 µL mieszaniny jodku propidyny i Cyto 9, do zawiesiny bakteryjnej. Można teraz pozostawić próbkę do inkubacji w ciemności przez 15 minut. Stwierdziliśmy jednak, że można przejść bezpośrednio do montażu preparatu i niemal natychmiast obejrzeć wyniki.

W porządku, teraz zamierzam obejrzeć pod mikroskopem preparat zawierający bakterie zabarwione barwnikiem Live/Dead z podświetleniem tylnym. Naniosę go na szkiełko, nałożę szkiełko nakrywkowe, a następnie dokonam obserwacji. Użyję naszego mieszanego filtra czerwono-zielonego, aby móc ocenić żywotność moich bakterii.

Zatem kiedy otwieram migawkę, widzę moje bakterie, które są mniej więcej jak drobne punkciki. Widzę jednak, że około 90 do 95% bakterii jest zielonych, podczas gdy jedynie około, powiedziałbym, 5% jest czerwonych. Zatem mamy bardzo wysoką przeżywalność, prawda?

Właśnie przedstawiłem proces oczyszczania żywych bakterii Akia z hodowlanych komórek owadów. Protokół ten obejmował fizyczną dezintegrację eukariotycznych komórek gospodarza, a następnie wirowanie różnicowe w celu wyizolowania oczyszczonych bakterii, a także serię etapów filtracji, aby zapewnić jakość oczyszczonych bakterii i całkowicie oddzielić je od wszystkich komponentów komórek gospodarza. Następnie omówiliśmy test przeżywalności live-dead w świetle przechodzącym, który wykorzystuje dwa barwniki do oceny żywotności bakterii.

Oczyszczone bakterie można teraz wykorzystać w wielu zastosowaniach, w tym do zakażania innych hodowli komórkowych w celu zwiększenia infekcyjności konkretnego układu. Można również przeprowadzać badania metaboliczne lub liczne inne analizy z wykorzystaniem żywych, oczyszczonych bakterii.