Name: Utrzymanie Wolbachii w podłożu bezkomórkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania Wolbachia pipientis z linii komórkowej Anopheles gambiae i hodowlę w podłożu bezkomórkowym. Protokół obejmuje lizę koralikami szklanymi, różnicową wirowanie oraz testy żywotności bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

utrzymywanie wolbachia w medium bezkomórkowym

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

W niniejszym protokole wideo zaprezentowano procedury pozwalające na (1) oczyszczenie symbiontów Wolbachia z hodowli komórek komarów, (2) zastosowanie testu fluorescencyjnego w celu oceny żywotności oczyszczonych Wolbachia oraz (3) utrzymanie pozyskanych zewnątrzkomórkowych Wolbachia w medium wolnym od komórek. Oczyszczone Wolbachia pozostają żywe w fazie zewnątrzkomórkowej, lecz nie replikują się do momentu ponownego inokulowania do komórek eukariotycznych. Wolbachia zewnątrzkomórkowe oczyszczone w ten sposób zachowują żywotność przez co najmniej tydzień w temperaturze pokojowej, a być może dłużej. Oczyszczone Wolbachia nadają się do mikroiniekcji, ekstrakcji DNA oraz innych zastosowań.

Niniejszy film opisuje metodę oczyszczania Wolbachia pipientis z linii komórkowej Anopheles gambiae, a następnie hodowli tego endosymbionta w medium bezkomórkowym. Przedstawiono również test żywotności bakterii.

Utrzymywanie Wolbachia w medium bezkomórkowym

W niniejszym protokole wideo zaprezentowano procedury pozwalające na (1) oczyszczenie symbiontów Wolbachia z hodowli komórek komarów oraz (2) wykorzystanie testu fluorescencyjnego do ...

Nazywam się Courtney Ston. Pracuję w Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health w laboratorium dr. Jasona Rascona. Dzisiaj przeprowadzimy oczyszczanie bakterii z hodowli komórek owadziech.Jest to w rzeczywistości bardzo prosta procedura. Zaczynamy odyznania komórek, a następnie fizycznie niszczymy błony komórkowe eukariotycznego gospodarza, stosując lizę szklanymi kuleczkami. Następnie wykorzystujemy wirowanie różnicowe, aby oddzielić bakterie od szczątków komórek gospodarza.Następnie stosujemy serię etapów filtracji, aby dodatkowo usunąć cząstki komórek gospodarza, tak aby na koniec pozostał jedynie oczyszczony osad bakteryjny. Jest to w rzeczywistości jeden z głównych wymogów. Jest to komora z laminarnym przepływem powietrza, która służy do utrzymania sterylności, ponieważ hodowle komórkowe są bardzo podatne na kontaminację.Potrzebujemy również pożywek do hodowli komórkowej oraz samych komórek, które hodujemy w plastikowych kolbach. Niezbędne będą także trzymilimetrowe kulki do rozbijania (blast beads), stożkowate probówki o pojemności 50 ml oraz wirówka zdolna do wirowania z wysoką prędkością, około 18 000 G, w celu osadzenia bakterii, a także zdolna do wirowania z prędkośc

maintaining-wolbachia-in-cell-free-medium

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Utrzymywanie Wolbachia w środowisku wolnym od komórek

Zakażenie bakterią Wolbachia u Drosophila

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Organizm modelowy C. elegans wykorzystuje płyn pseudocelomiczny jako pasywny układ krążenia. Bezpośrednia analiza tego płynu nie była wcześniej możliwa. Przedstawiamy tutaj nową technikę bezpośredniego badania przestrzeni zewnątrzkomórkowej, wykorzystując systemowe sygnały wyciszania podczas odpowiedzi RNAi jako przykład potwierdzający zasadność tej metody.

Wampiryczna izolacja płynu zewnątrzkomórkowego z Caenorhabditis elegans

Ten film przedstawia metodę izolacji i sterylnego hodowania embrionalnych komórek C. elegans  in vitro.

Trawienie enzymatyczne i dysocjacja ręczna: metoda przygotowania zarodków C. elegans do hodowli komórkowej

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Ten protokół opisuje, jak ustalić infekcję wirusową in vivo u Drosophila melanogaster przy użyciu metody nanoiniekcji i podstawowych technik analizy interakcji wirus-gospodarz.

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Do wykrywania wewnątrzkomórkowej Wolbachii użyto czterech metod, które wzajemnie się uzupełniały i poprawiały dokładność wykrywania infekcji Wolbachia Aa23 pochodzącej z Aedes albopictus i Aa23-T wyleczonej z rodzimej infekcji Wolbachia za pomocą antybiotyków.

Wykrywanie szczepu Wolbachia wAlbB w liniach komórkowych Aedes albopictus

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Linie komórkowe są przydatne w badaniach nad organizmami wewnątrzkomórkowymi, które nie mogą być hodowane poza komórkami gospodarza. Chociaż linie zakażone Wolbachią umożliwiły wiele odkryć, niejednorodność w obrębie tych linii może prowadzić do zmiennych wyników eksperymentalnych. Przedstawiamy protokół generowania klonów jednokomórkowych i ciągłych hodowli z komórek JW18 zakażonych Wolbachią.

Generacja kultur monoklonalnych z linii komórkowej Drosophila melanogaster JW18 zakażonej Wolbachią

Poznaj metodę oczyszczania Wolbachia pipientis z linii komórkowej Anopheles gambiae i hodowlę w podłożu bezkomórkowym. Protokół obejmuje lizę koralikami szklanymi, różnicową wirowanie oraz testy żywotności bakterii.

Utrzymywanie Wolbachia w medium bezkomórkowym

Przeglądaj więcej filmów