Adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek iPS z wykorzystaniem bezkomórkowego medium Complete KnockOut Serum Replacement

Ogólnym celem tej procedury jest adaptacja i utrzymanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w hodowli bez komórek feederowych, z wykorzystaniem pożywki bezkomórkowej zawierającej kompletny zamiennik surowicy typu knockout. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie płytek pokrytych żelem, TRX lub Cell Start. Drugim krokiem procedury jest pasażowanie komórek iPS z komórek MEF do pożywki bezkomórkowej z wykorzystaniem dysków.

Ostatnim krokiem procedury jest stałe utrzymywanie komórek iPS w warunkach bez udziału komórek feederowych. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące wzrost komórek i stopień pluripotencji zbliżony do tych obserwowanych w hodowlach z wykorzystaniem MEF, co potwierdza barwienie immunocytochemiczne z użyciem markerów pluripotencji. Cześć, jestem Kate Wagner z ośrodka GIB w Life Technologies.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość oszczędności czasu i zwiększenia powtarzalności hodowli komórkowych dzięki zastosowaniu zamiennika surowicy KnockOut w całym procesie badawczym. Obecnie rodzina produktów KnockOut obejmuje pełną gamę pożywek i odczynników do warunków z wykorzystaniem komórek karmiających, bez komórek karmiających oraz wolnych od składników ksenogenicznych dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, mysich embrionalnych komórek macierzystych oraz indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. KSR może być stosowany podczas wyprowadzania linii, wzrostu, ekspansji, krio Konserwacji oraz w początkowych etapach różnicowania.

W następującym filmie zaprezentowano proces adaptacji i pakietowania komórek z wykorzystaniem KSR w warunkach bezkarmowych. Do adaptacji i pakietowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach bezkarmowych wymagane są naczynia hodowlane powlekane Geltrex. Na jeden dzień przed przygotowaniem powlekanych naczyń należy powoli rozmrozić jedną probówkę Geltrex, pozostawiając ją w lodówce przez noc. Następnego dnia należy rozcieńczyć rozmrożony Geltrex w stosunku 1:100 w medium podstawowym, przenosząc 1 mL Geltrex do butelki zawierającej 99 mL medium podstawowego. Roztwór należy delikatnie wymieszać.

Zalecamy stosowanie KnockOut D-M-E-M-F 12 jako pożywki podstawowej, jednak w tekście protokołu opisano inne dostępne opcje. Przykryj całą powierzchnię każdej szalki hodowlanej roztworem Geltrex. Do każdej szalki o średnicy 60 mm dodaj 1,5 ml roztworu Geltrex.

Inkubuj płytki przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Dodatkowe płytki można owinąć folią i przechowywać w lodówce do czterech tygodni. Nadmiar rozcieńczonego gelt TRX można odłożyć i przechowywać w temperaturze od -20 °C do -80 °C, jednak przed użyciem należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.

Przenieś żelowe płytki pokryte TRX do komory z laminarnym przepływem powietrza i pozwól im wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej. Ponadto przygotuj wszystkie pozostałe wymagane odczynniki i upewnij się, że wszystkie pożywki mają temperaturę 37 °C i są odpowiednio nasycone gazami. Aby zaadaptować ludzkie IPC do pierwszej kultury w pożywce bez komórek feederowych.

Komórki iPSC znajdują się na komórkach karmicielskich MET aż do osiągnięcia 70 do 80% konfluencji. Odessaj pożywkę z każdej 60 milimetrowejy szalki hodowlanej i dodaj odpowiednią ilość roztworu DisPA, która wynosi 1 ml. W tym przypadku inkubuj szalki w temperaturze 37 °C przez trzy do pięciu minut.

Odssać roztwór dispa z każdej szalki hodowlanej i delikatnie wypłukać komórki zasilające meth, używając DPBS dwa do trzech razy. Następnie do każdej szalki dodać odpowiednią ilość kompletnego medium zastępującego serum. Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie zdrapać komórki z powierzchni szalki.

Przenieść zawiesinę komórkową z każdego naczynia do osobnych probówek stożkowych o pojemności 15 ml. Przepłukać każde naczynie hodowlane odpowiednią ilością pełnej pożywki zastępczej z surowicą i dodać płyn z płukania do probówek stożkowych 15 ml zawierających zawiesinę komórkową. Wirować probówki stożkowe 15 ml przy 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, abyt stworzyć pellet komórkowy.

Po odwirowaniu ostrożnie odessaj i odrzuć nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie uderz dnem probówki, aby całkowicie oderwać osad komórkowy od dna. Dodaj odpowiednią ilość kompletnej pożywki zastępczej z surowicą, wolnej od komórek karmicielskich, zgodnie z pożądanym stosunkiem rozdzielenia.

Następnie delikatnie resuspenduj osad. Nie rozbijaj skupisk komórkowych na mniejsze fragmenty, ponieważ mniejsze skupiska słabo przylegają do powierzchni. Odessań pozostały roztwór żelu TRE z wcześniej przygotowanych szalek hodowlanych powlekanych żelem Rex i powoli dodaj odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej do każdej szalki.

Kilkakrotnie przesuń naczynie hodowlane przód-tył oraz na boki, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki na powierzchni naczynia. Ostrożnie umieść naczynia hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 °C z uwilgotnioną atmosferą zawierającą od 4 do 6% CO2 w powietrzu. Następnie codziennie wymieniaj zużytą pożywkę, aż komórki osiągną około 70 do 80% konfluencji.

Gdy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste człowieka hodowane w całkowitym zamienniku surowicy w pożywce bez komórek karmicieli osiągną 70 do 80% konfluencji, są gotowe do subkultury. Jeśli pojawią się jakiekolwiek zróżnicowane komórki, należy je usunąć przed pasażowaniem. Odessać zużytą pożywkę z 60 milimetrowej szalki hodowlanej za pomocą pipety i dwukrotnie przepłukać komórki.

Za pomocą DPBS delikatnie dodaj 1 mL uprzednio ogrzanego roztworu do płytek hodowlanych. Zakręć płytką, aby pokryć całą powierzchnię komórek. Inkubuj hodowlę w temperaturze 37 °C przez 3–5 minut.

Następnie odessać roztwór i delikatnie przemyć komórki dwukrotnie DPBS, dodać pełny zamiennik surowicy (serum replacement), pożywkę bez komórek karmionkach (feeder free medium), a następnie delikatnie zdjąć komórki z powierzchni naczynia hodowlanego. Za pomocą skrobaka do komórek przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepłukać naczynie hodowlane dwukrotnie pełnym zamiennikiem surowicy.

Pożywka bez komórek karmionek delikatnie wypłukuje wszelkie komórki, które nie oddzieliły się od podłoża. Pobrać pożywkę z obu płukań wraz z komórkami do probówki o pojemności 15 ml. Wirować probówkę z prędkością 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby otrzymać osad komórkowy, nie naruszając go przy tym.

Ostrożnie odessaj i odrzuć supernatant. Delikatnie potrząśnij probówką, aby całkowicie oddzielić pellet komórkowy od dna. Delikatnie resuspenderuj komórki w pełnym zamienniku surowicy.

Pożywka bez komórek feederowych przy użyciu pipety serologicznej o objętości 5 ml. Nie trytrować. Przenieść komórki do nowej płytki 60 mm powlekanej Geltrex w żądanym stosunku rozcieńczenia.

Przesuwaj naczynie hodowlane kilka razy w przód i w tył oraz na boki, aby rozprzestrzec komórki po jego powierzchni. Następnego dnia umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C z uwilgotnioną atmosferą zawierającą od 4 do 6% carbon dioxide w powietrzu. Ostrożnie zastąp zużyte medium kompletną pożywką uzupełniającą z surowicą.

Dostarczenie świeżej pożywki w celu usunięcia szczątków komórkowych. Następnie należy wymieniać zużytą pożywkę każdego dnia. Ten obraz w kontraście fazowym przedstawia ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane na naczyniach hodowlanych powlekanych gelt TRX z zastosowaniem kompletnego zamiennika surowicy w pożywce bez warstwy komórek karmiarek.

Morfologia IPC wykazuje podobieństwo do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, charakteryzując się dużymi jądrami i ubogą cytoplazmą; barwienie immunocytochemiczne pokazuje, że IPC hodowane w pożywce z zamiennikiem surowicy knockout oraz koktajlem czynników wzrostu wykazują ekspresję markerów pluripotencji OCT four i SSEA four. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak adaptować i utrzymywać IPC w warunkach bezkarmiących z zastosowaniem zamiennika surowicy knockout. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.