Adaptacja, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek IPS bez podawania przy użyciu kompletnej pożywki KnockOut Serum Replacement Feeder-Free

Ogólnym celem tej procedury jest adaptacja i utrzymanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do hodowli wolnej od żywienia przy użyciu całkowitej wymiany surowicy nokautowej, pożywki wolnej od karmy. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie płytek żeltowych, pokrytych TRX lub powlekanych ogniwami. Drugim krokiem procedury jest przejście IPS z MEF do wolnego nośnika przy użyciu przestrzeni dyskowej.

Ostatnim krokiem procedury jest ciągłe utrzymywanie podajnika komórek IPS w stanie wolnym od podajnika. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wykazują podobny wzrost komórek i łodygę, które można znaleźć w kulturach metamfetaminy poprzez barwienie immunologiczne markerami pluripotencjalnymi. Cześć, nazywam się Kate Wagner i pracuję w GIB w Life Technologies.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi technikami jest to, że możesz zaoszczędzić czas i zwiększyć spójność w swojej hodowli komórkowej, gdy używasz zamiennika surowicy nokautującej w całym przepływie pracy. Obecnie rodzina produktów do nokautowania obejmuje pełną listę pożywek i odczynników do stosowania w warunkach opartych na podajnikach, bez karmników i wolnych od ksenotypu dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, mysich embrionalnych komórek macierzystych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. KSR może być używany do wyprowadzania wzrostu, ekspansji, krioprezerwacji i początkowych etapów różnicowania.

Poniższy film pokaże, jak dostosować i pakować ogniwa za pomocą KSR w warunkach bez podajnika. Naczynia hodowlane pokryte żelem TRX są niezbędne do adaptacji i pakowania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach wolnych od karmnika na jeden dzień przed przygotowaniem tych powlekanych naczyń, powoli rozmrozić jedną tubkę gelt TRX, pozostawiając ją w lodówce na noc następnego dnia, rozcieńczyć probówkę z rozmrażanym żeltem TRX od jednego do 100 w podłożu podstawowym, przenosząc jeden mililitr żelu Rex do butelki zawierającej 99 mililitrów roztworu podstawowego Średni. Delikatnie wymieszaj roztwór.

Zalecamy użycie knockout D-M-E-M-F 12 jako podłoża podstawowego, ale prosimy o zapoznanie się z tekstem protokołu, aby zapoznać się z innymi opcjami. Pokryj całą powierzchnię każdej płytki hodowlanej roztworem żelu Rex. Na każde 60-milimetrowe naczynie dodaj 1,5 mililitra roztworu żelu trek.

Inkubuj naczynia przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodatkowe talerze można zawinąć w perfumy i przechowywać w lodówce do czterech tygodni. Dodatkowy rozcieńczony żel TRX może być przydzielony i przechowywany w temperaturze od minus 20 do minus 80 stopni Celsjusza, ale przed użyciem należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.

Przenieś naczynia pokryte żelem TRX do okapu cytrynowego lub przepływowego i pozwól im zrównoważyć się do temperatury pokojowej. Ponadto przygotuj wszystkie inne wymagane odczynniki i upewnij się, że wszystkie podłoża są wyrównane do 37 stopni Celsjusza i odpowiednio zagazowane. Przystosowanie ludzkich IPC do pożywki wolnej od karmowego Pierwsza kultura.

IPSC znajduje się na komórkach karmiących metamfetaminę, dopóki nie osiągną one 70 do 80% zlewania się. Odessać pożywkę z każdej 60-milimetrowej płytki hodowlanej i dodać odpowiednią ilość roztworu dispa, czyli jeden mililitr. W takim przypadku inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut.

Odessać roztwór dispa z każdej płytki hodowlanej i delikatnie zmyć komórki karmiące metamfetaminę DPBS dwa do trzech razy. Następnie dodaj odpowiednią ilość kompletnej pożywki zastępczej surowicy do każdej pożywki hodowlanej. Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie zeskrob komórki z powierzchni naczynia.

Zbierz zawiesinę komórek z każdej płytki do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Przepłukać każde naczynie hodowlane odpowiednią ilością kompletnej pożywki zastępczej surowicy i dodać pożywkę płuczącą do 15-mililitrowych stożkowych probówek zawierających wirówkę do zawiesiny komórek. Stożkowe rurki o pojemności 15 mililitrów o masie 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej do granulowania komórek.

Po odwirowaniu ostrożnie odessać i wyrzucić supernat, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie przesuń rurkę, aby całkowicie usunąć osad komórek z dna probówki. Dodać odpowiednią ilość kompletnej substytucji surowicy, pożywki wolnej od podajnika zgodnie z pożądanym stosunkiem podziału.

I delikatnie ponownie zawiesić granulkę. Nie rozbijaj grudek komórek na mniejsze rozmiary, ponieważ mniejsze grudki nie przylegają dobrze do powierzchni. Odessać resztki żelowego roztworu TRE z wcześniej przygotowanych ponętek hodowlanych pokrytych żelem Rex i powoli dodawać odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej do każdej szalki hodowlanej.

Przesuń naczynie hodowlane do przodu i do tyłu oraz z boku na bok kilka razy, aby rozproszyć komórki na powierzchni naczynia. Delikatnie umieść szalki hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z nawilżoną atmosferą od czterech do 6% CO2 w powietrzu. Następnie wymieniaj zużytą pożywkę codziennie, aż komórki staną się zlewające się w około 70 do 80%.

Kiedy indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste rozwijają pełną wymianę surowicy, pożywka wolna od karmowania są w 70 do 80% zlewne, są gotowe do subhodowli. Jeśli są jakieś zróżnicowane komórki, usuń je przed zapakowaniem. Odessać zużytą pożywkę z 60-milimetrowej pożywki za pomocą pipety i dwukrotnie przepłukać komórki.

Za pomocą DPBS delikatnie dodaj jeden mililitr wstępnie ciepłego roztworu na bazie dysku do naczynia hodowlanego. Zakręć naczyniem hodowlanym, aby pokryć całą powierzchnię komórki. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut.

Następnie odessać roztwór dysprzestrzenny i delikatnie umyć komórki dwukrotnie DPBS, dodać całkowitą wymianę surowicy, pożywkę wolną od pożywki i delikatnie zeskrobać komórki z powierzchni naczynia hodowlanego. Za pomocą skrobaka do komórek przenieś komórki do sterylnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Dwukrotnie wypłukać naczynie hodowlane, całkowicie wymieniając surowicę.

Pożywka wolna od podajnika, delikatnie spryskując wszelkie komórki, które się nie oderwały. Wyciągnij pożywkę z obu płukanek z komórkami w 15-mililitrowej probówce. Odwirować probówkę o stężeniu 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać komórki bez naruszania osadu komórkowego.

Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant. Delikatnie przesuń rurkę, aby całkowicie usunąć osad komórek z dna probówki. Delikatnie zawiesić komórki w całkowitej wymianie surowicy.

Pożywka wolna od pożywki za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej. Nie tri rate. Przenieś komórki do świeżego naczynia pokrytego żelem TRX o grubości 60 milimetrów w pożądanym stosunku podziału.

Przesuń naczynie hodowlane do przodu i do tyłu oraz z boku na bok kilka razy, aby rozproszyć komórki na jego powierzchni. Następnego dnia umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z nawilżoną atmosferą od czterech do 6% dwutlenku węgla w powietrzu. Delikatnie zastąp zużytą pożywkę całkowitą wymianą surowicy.

Nakarm wolnym podłożem w celu usunięcia resztek komórek. Następnie wymieniaj zużyte podłoże codziennie. Ten obraz kontrastu fazowego przedstawia ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane na szalkach hodowlanych pokrytych żelem TRX przy użyciu całkowitej wymiany surowicy, pożywki wolnej od pożywki.

IPC wykazują morfologię podobną do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych charakteryzujących się dużymi jądrami i skąpym barwieniem immunologicznym cytoplazmy, co pokazuje, że IPC hodowane z pożywką zastępczą surowicy nokautującej oraz koktajlem czynnika wzrostu, wyrażały markery pluripotencjalne, OCT cztery i SSEA cztery. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dostosować i utrzymać swoje IPC i wymianę surowicy nokautującej, warunki wolne od karmienia. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.