Name: Adaptacja, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek IPS bez podawania przy użyciu kompletnej pożywki KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metodę adaptacji ludzkich komórek iPS do hodowli feeder-free przy użyciu pożywki KnockOut Serum Replacement. Protokół obejmuje przygotowanie naczyń, pasażowanie komórek i codzienną obsługę kultury.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uwaga: Aby zachować sterylne warunki hodowli, wszystkie procedury w niniejszym protokole są wykonywane zgodnie z zasadami sterylności laboratoryjnej i przeprowadzane pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.
Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że wszystkie podłoża są wyrównane do temperatury 37°C i odpowiednio napowietrzone.
Przygotowanie naczyń hodowlanych powlekanych Geltrexem
Uwaga: w kwestii stosowania naczyń hodowlanych pokrytych CELLstart należy zapoznać się z załącznikiem
<ol>
 <li>Powoli rozmrozić jedną probówkę Geltrex (1 mL) w temperaturze 2-8°C i rozcieńczyć go w stosunku 1:100 w 99 mL Knockout D-MEM/F-12. Delikatnie wymieszać roztwór. 
 
 Uwaga: Niektóre linie komórek iPS mogą wymagać innego rozcieńczenia Geltrex dla optymalnego wzrostu. Alternatywne rozcieńczenia znajdują się w załączniku.</li>
 <li>Pokryć całą powierzchnię każdej szalki hodowlanej roztworem Geltrex (1 mL dla szalki 35-mm, 1,5 mL dla szalki 60-mm).</li>
 <li>Uszczelnić każdą szalkę Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu, i inkubować szalki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. 
 
 Uwaga: Na tym etapie szalki hodowlane pokryte Geltrex można przechowywać w temperaturze 4°C do 1 miesiąca. Każdą szalkę należy uszczelnić Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu Geltrex.</li>
 <li>Przed użyciem przenieść szalki pokryte Geltrex do komory z laminarnym przepływem powietrza i pozostawić do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej (około 1 godziny).</li>
</ol>
Przygotowanie pożywki KnockOut SR Medium do hodowli bezkarmiących
<ol>
 <li>Aby przygotować 1 mL roztworu Basic FGF o stężeniu 10 μg/mL, aseptycznie zmieszać poniższe składniki. Roztwór podzielić na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C przez maksymalnie 6 miesięcy. 
 
 <table border="0">
 <tbody >
 <tr >
 <td >Basic FGF</td>
 <td >10 μg</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >D-PBS</td>
 <td >990 μL</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >10% BSA</td>
 <td >10 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 
 Uwaga: BSA można zastąpić HSA lub Knockout SR w tym samym stężeniu.</li>
 <li>Aby przygotować 50 mL roztworu Dispase o stężeniu 2 mg/mL, aseptycznie zmieszać poniższe składniki. Roztwór poddać sterylizacji przez filtrowanie i przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie. 
 
 <table border="0">
 <tbody >
 <tr >
 <td >Dispase</td>
 <td >100 mg</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >D-PBS</td>
 <td >50 mL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Aby przygotować 100 mL kompletnego pożywki KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF), aseptycznie połączyć składniki wymienione w poniższej tabeli. 
<table border="1">
 <tbody >
 <tr >
 <td >Składnik</td>
 <td >Stężenie roztworu stokowego</td>
 <td >Stężenie końcowe</td>
 <td >Objętość </td>
 </tr>
 <tr >
 <td >Knockout DMEM/F12 (Kat. nr 12660-012)</td>
 <td >-</td>
 <td >1X</td>
 <td >76.8 mL</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >GlutaMAX -I (Kat. nr 35050-061)</td>
 <td >200 mM</td>
 <td >2 mM</td>
 <td >1 mL</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >KnockOut SR (Kat. nr 10828-028)</td>
 <td >-</td>
 <td >20%</td>
 <td >20 mL</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >KnockOut SR-GFC (Kat. nr A10580-01)</td>
 <td >50X</td>
 <td >1X</td>
 <td >2 mL</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >bFGF (Kat. nr PHG0024)</td>
 <td >10 μg/mL</td>
 <td >20 ng/mL</td>
 <td >200 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Pożywkę KSR-FF można przechowywać w temperaturze 2-8°C przez maksymalnie jeden tydzień.</li>
<li>Bezpośrednio przed wyrównaniem temperatury i składu gazowego kompletnej pożywki, aseptycznie dodać wymaganą objętość 2-merkaptoetanolu (stężenie stokowe 55 mM), aby uzyskać stężenie końcowe 0,1 mM. Na przykład, aby przygotować 100 mL pożywki KSR-FF, należy dodać 182 μL 2-merkaptoetanolu o stężeniu 55 mM (rozcieńczenie 1:550). Alternatywnie, 2-merkaptoetanol można dodać do kompletnej pożywki 1X i przechowywać w temperaturze 2-8°C przez maksymalnie jeden tydzień.</li>
</ol>
Adaptacja iPSC do pożywki KSR-FF
<ol>
 <li>Przed rozpoczęciem pracy doprowadzić naczynia pokryte Geltrexem do temperatury pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
 <li>Kulturować iPSC na komórkach karmicielskich MEF do momentu osiągnięcia 70-80% konfluencji. Protokoły hodowli na MEF znajdują się w podręczniku GIBCO Mouse Embryonic Fibroblast.</li>
 <li>Podgrzać wymaganą objętość Dyspazy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej. </li>
 <li>Podgrzać wymaganą objętość KSR-FF w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 15 min. Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej. </li>
 <li>Odssać medium z naczyń hodowlanych i dodać odpowiednią ilość roztworu Dyspazy. Inkubować naczynia w temperaturze 37°C przez 3-5 minut.</li>
 <li>Odssać roztwór Dyspazy z każdego naczynia hodowlanego i delikatnie wypłukać komórki karmicielskie MEF za pomocą D-PBS (2 do 3 razy).</li>
 <li>Dodać do każdego naczynia hodowlanego odpowiednią ilość kompletnego medium KnockOut SR. Użyć skrobaczki do komórek lub pipety 5 mL, aby delikatnie zdrapać komórki z powierzchni naczynia hodowlanego. 
 
 Uwaga: alternatywne protokoły adaptacji dla linii komórkowych iPS trudnych do adaptacji znajdują się w aneksie.</li>
 <li>Zebrać zawiesinę komórkową z każdego naczynia hodowlanego do oddzielnych stożkowych probówek 15 mL. Przepłukać każde naczynie hodowlane odpowiednią ilością kompletnego medium KnockOut SR, a medium z płukania D-PBS dodać do probówek stożkowych 15 mL zawierających zawiesinę komórkową. Należy uważać, aby nie rozbić agregatów komórkowych na pojedyncze komórki.</li>
 <li>Wirować probówki stożkowe 15 mL przy 200 x g przez 5 minut w celu osadzenia iPSC.</li>
 <li>Odssać nadsącz z osadu iPSC. Resuspendować osad w odpowiedniej ilości medium KSR-FF zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia (Tabela 1). Nie rozbijać agregatów komórkowych na mniejsze fragmenty, ponieważ mniejsze agregaty słabo przylegają do powierzchni. 
 
 Uwaga: Zaleca się współczynnik rozcieńczenia 1:2 przez pierwsze 3 pasażowania po przeniesieniu iPSC bezpośrednio z medium hodowlanego iPSC MEF do medium KSR-FF. Zazwyczaj odpowiedni jest współczynnik rozcieńczenia od 1:3 do 1:5, jednak pasażowanie w stosunku 1:2 zapewnia wyższą gęstość komórek niezbędną podczas adaptacji do hodowli bezkomórkowej (feeder-free).</li>
 <li>Przed wysianiem iPSC na naczynia pokryte Geltrexem, odessać pozostały roztwór Geltrexu z uprzednio pokrytego naczynia i powoli dodać odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej do każdego naczynia hodowlanego. Uwaga: nie płukać naczyń przed wysianiem.</li>
 <li>Przesuwać naczynie hodowlane przód-tył i na boki kilka razy, aby rozprowadzić komórki po całej powierzchni naczynia. Ostrożnie umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze 37°C w atmosferze uwilgotnionej z dodatkiem 4 do 6% CO2 w powietrzu. Wymieniać zużyte medium na KSR-FF każdego dnia. </li>
</ol>
Pasażowanie ludzkich komórek iPS z użyciem KSR-FF
<ol start="13">
 <li>Obserwuj ludzkie iPSC rosnące w pełnym KSR-FF pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki osiągnęły 70-80% konfluencji i są gotowe do pasażowania. Zob. Rysunek 1. 
 
 Uwaga: Jeśli kolonie staną się zbyt gęste lub zbyt duże, dojdzie do zwiększonej różnicowania.</li>
 <li>Przed pasażowaniem hodowli wytnij i usuń wszelkie zróżnicowane kolonie iPSC.</li>
 <li>Podgrzej wymaganą objętość Dispase w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Szczegóły dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.</li>
 <li>Wstępnie wyrównaj temperaturę wymaganej objętości KSR-FF w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 15 min. Szczegóły dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.</li>
 <li>Odssij zużyte medium z naczynia hodowlanego za pomocą pipety i przepłucz komórki dwukrotnie za pomocą D-PBS.</li>
 <li>Ostrożnie dodaj podgrzany roztwór Dispase do naczynia hodowlanego (np. 1 mL roztworu Dispase na 60-mm płytkę hodowlaną). Zakręć naczyniem, aby pokryć całą powierzchnię komórek.</li>
 <li>Inkubuj naczynie hodowlane w temperaturze 37°C przez 3 minuty.</li>
 <li>Wyjmij naczynie z inkubatora, odssij roztwór Dispase i delikatnie przemyj komórki za pomocą D-PBS.</li>
 <li>Delikatnie zeskrob komórki z powierzchni płytki hodowlanej za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 mL.</li>
 <li>Przepłucz płytkę hodowlaną dwukrotnie KSR-FF, delikatnie "spłukując" wszelkie nieodczepione komórki. Połącz medium płuczące z komórkami w probówce 15 mL.</li>
 <li>Wirować probówkę przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać pellet komórkowy.</li>
 <li>Ostrożnie odssij supernatant, nie naruszając pelletu komórkowego, i usuń go.</li>
 <li>Delikatnie potrząśnij probówką, aby całkowicie oddzielić pellet komórkowy od dna probówki.</li>
 <li>Delikatnie resuspenduj komórki w wyrównanym temperaturowo KSR-FF za pomocą pipety serologicznej 5 mL. Nie trituruj. Uwaga: na tym etapie kluczowe jest delikatne resuspendowanie komórek bez użycia siły, aby uniknąć ich uszkodzenia.</li>
 <li>Przenieś komórki do nowej 60-mm płytki pokrytej Geltrex w żądanym stosunku rozcieńczenia i przesuń płytkę przód-tył oraz na boki kilka razy, aby rozprzestrzenić komórki po jej powierzchni.</li>
 <li>Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze 37°C z nawilżoną atmosferą zawierającą od 4 do 6% CO2 w powietrzu.</li>
 <li>Następnego dnia delikatnie wymień zużyte medium na KSR-FF, aby usunąć szczątki komórkowe. Wymieniaj zużyte medium codziennie w kolejnych dniach. Obserwuj komórki iPS codziennie i pasażuj je w razie potrzeby (mniej więcej co 4-5 dni). Pasażowanie jest zalecane, gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji. W celu kriokonserwacji i rozmrażania komórek iPS zapoznaj się z naszym protokołem pt. "Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium".</li>
</ol>
Oczekiwane wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="Hodowla komórkowa pod mikroskopem; badanie wzrostu komórek; obrazowanie mikroskopowe; badania biologiczne." data-altupdatedat="1754904545000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Poniższe zdjęcie w kontraście fazowym przedstawia iPSC hodowane na szalkach pokrytych Geltrex z użyciem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free. iPSC wykazują morfologię podobną do hESC, charakteryzującą się dużymi jądrami i skąpą cytoplazmą. (powiększenie 40x)
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Komponent</td>
 <td>Szalka 35 mm</td>
 <td>Płytka 60 mm</td>
 <td>Szalka 100 mm</td>
 </tr>
 <tr valign="top">
 <td>pożywka Complete KnockOut SR</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>4 ml</td>
 <td>10 ml</td>
 </tr>
 <tr valign="top">
 <td>Roztwór Geltrex</td>
 <td>1 ml</td>
 <td>1,5 ml</td>
 <td>4-5 ml</td>
 </tr>
 <tr valign="top">
 <td>Dispase</td>
 <td>0,5 ml</td>
 <td>1 ml</td>
 <td>3-4 mL</td>
 </tr>
 <tr valign="top">
 <td>D-PBS do płukania</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>4 mL</td>
 <td>10 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Zalecane objętości
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić appendix</a>.

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

Autorzy tego artykułu są zatrudnieni przez firmę Life Technologies, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>Nr kat. 12660-012</td><td>Uwaga: patrz w załączniku w kwestii stosowania alternatywnych produktów DMEM</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Nr kat. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy KnockOut</td><td></td><td>KnockOut SR, Nr kat. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl czynników wzrostu zamiennika surowicy KnockOut</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, Nr kat. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, ludzkie białko rekombinowane, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, Nr kat. PHG0024</td><td>Uwaga: patrz w załączniku w kwestii alternatywnych wielkości opakowań bFGF.</td></tr><tr><td>2-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td></td><td>Nr kat. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td></td><td>Nr kat. 17105-041</td><td>Uwaga: patrz w załączniku w kwestii alternatywnych metod pasażowania.</td></tr><tr><td>Macierzy piwniczna Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor, 1 mL</td><td></td><td>Nr kat. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) bez wapnia i magnezu</td><td></td><td>Nr kat. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna komora do hodowli tkanek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator ustawiony na 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipet (Pipette-Aid)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna ustawiona na 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do wirowania 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalki hodowlane 60 mm traktowane do hodowli tkanek</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek ips z wykorzystaniem bezkomórkowego medium complete knockout serum replacement

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Odkrycie z 2006 roku, że fibroblasty ludzkie i mysie mogą zostać przeprogramowane w celu wygenerowania komórek iPS 1-3 o właściwościach niezwykle podobnych do embrionalnych komórek macierzystych, stworzyło cenny nowy zasób komórek pluripotencjalnych do celów poszukiwania nowych leków, terapii komórkowej oraz badań podstawowych.
Pożywki i odczynniki GIBCO od lat znajdują się w centrum badań nad pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Pożywka Knockout DMEM uzupełniona o Knockout Serum Replacement jest preferowanym medium do wzrostu embrionalnych komórek macierzystych, a obecnie także do hodowli komórek iPS 3-9. Ten złoty standard systemów pożywek może być teraz stosowany w hodowlach bez użycia komórek karmionek dzięki dodatkowi Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Tradycyjne metody hodowli ludzkich komórek ES i iPS wymagają zastosowania warstw wspierających (feeder layers) z fibroblastów mysich lub ludzkich, bądź pożywki warunkowanej przez komórki wspierające. Metody te są pracochłonne, trudne do skalowania, a utrzymanie komórek hiPS w stanie niezróżnicowanym jest utrudnione ze względu na nieokreślone warunki. Firma Invitrogen opracowała Knockout SR Growth Factor Cocktail, aby umożliwić łatwe przejście hodowli komórek hiPS na systemy bezwarstwowe (feeder-free), przy jednoczesnym zachowaniu możliwości stosowania Knockout SR.

Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące adaptacji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do hodowli bez warstwy komórek żerujących (feeder-free) z wykorzystaniem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (KSR-FF). Po zakończeniu adaptacji przedstawiono również instrukcje dotyczące ich dalszego utrzymania.

Adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek iPS z wykorzystaniem bezkomórkowego medium Complete KnockOut Serum Replacement

Odkrycie z 2006 roku, że ludzkie i mysie fibroblasty można przeprogramować w celu generowania komórek iPS 1-3 o właściwościach niezwykle podobnych do embrionalnych komórek macierzystych...

Ogólnym celem tej procedury jest adaptacja i utrzymanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w hodowli bez komórek feederowych, z wykorzystaniem pożywki bezkomórkowej zawierającej kompletny zamiennik surowicy typu knockout. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie płytek pokrytych żelem, TRX lub Cell Start. Drugim krokiem procedury jest pasażowanie komórek iPS z komórek MEF do pożywki bezkomórkowej z wykorzystaniem dysków.Ostatnim krokiem procedury jest stałe utrzymywanie komórek iPS w warunkach bez udziału komórek feederowych. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące wzrost komórek i stopień pluripotencji zbliżony do tych obserwowanych w hodowlach z wykorzystaniem MEF, co potwierdza barwienie immunocytochemiczne z użyciem markerów pluripotencji. Cześć, jestem Kate Wagner z ośrodka GIB w Life Technologies.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość oszczędności czasu i zwiększenia powtarzalności hodowli komórkowych dzięki zastosowaniu zamiennika surowicy KnockOut w całym procesie badawczym. Obecnie rodzina produktów KnockOut obejmuje pełną gamę pożywek i odczynników do warunków z wykorzystaniem komórek karmiających, bez komórek karmiających oraz wolnych od składników ksenogenicznych dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, mysich embrionalnych komórek macierzystych oraz indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. KSR może być stosowany podczas wyprowadzania linii, wzrostu, ekspansji, krio Konserwacji oraz w początkowych etapach różnicowania.W następującym filmie zaprezentowano proces adaptacji i pakietowania komórek z wykorzystaniem KSR w warunkach bezkarmowych. Do adaptacji i pakietowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach bezkarmowych wymagane są naczynia hodowlane powlekane Geltrex. Na jeden dzień przed przygotowaniem powlekanych naczyń należy powoli rozmrozić jedną probówkę Geltrex, pozostawiając ją w lodówce przez noc. Następnego dnia należy rozcieńczyć rozmrożony Geltrex w stosunku 1:100 w medium podstawowym, przenosząc 1 mL Geltrex do butelki zawierającej 99 mL medium podstawowego. Roztwór należy delikatnie wymieszać.Zalecamy stosowanie KnockOut D-M-E-M-F 12 jako pożywki podstawowej, jednak w tekście protokołu opisano inne dostępne opcje. Przykryj całą powierzchnię każdej szalki hodowlanej roztworem Geltrex. Do każdej szalki o średnicy 60 mm dodaj 1,5 ml roztworu Geltrex.Inkubuj płytki przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Dodatkowe płytki można owinąć folią i przechowywać w lodówce do czterech tygodni. Nadmiar rozcieńczonego gelt TRX można odłożyć i przechowywać w temperaturze od -20 °C do -80 °C, jednak przed użyciem należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.Przenieś żelowe płytki pokryte TRX do komory z laminarnym przepływem powietrza i pozwól im wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej. Ponadto przygotuj wszystkie pozostałe wymagane odczynniki i upewnij się, że wszystkie pożywki mają temperaturę 37 °C i są odpowiednio nasycone gazami. Aby zaadaptować ludzkie IPC do pierwszej kultury w pożywce bez komórek feederowych.Komórki iPSC znajdują się na komórkach karmicielskich MET aż do osiągnięcia 70 do 80% konfluencji. Odessaj pożywkę z każdej 60 milimetrowejy szalki hodowlanej i dodaj odpowiednią ilość roztworu DisPA, która wynosi 1 ml. W tym przypadku inkubuj szalki w temperaturze 37 °C przez trzy do pięciu minut.Odssać roztwór dispa z każdej szalki hodowlanej i delikatnie wypłukać komórki zasilające meth, używając DPBS dwa do trzech razy. Następnie do każdej szalki dodać odpowiednią ilość kompletnego medium zastępującego serum. Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie zdrapać komórki z powierzchni szalki.Przenieść zawiesinę komórkową z każdego naczynia do osobnych probówek stożkowych o pojemności 15 ml. Przepłukać każde naczynie hodowlane odpowiednią ilością pełnej pożywki zastępczej z surowicą i dodać płyn z płukania do probówek stożkowych 15 ml zawierających zawiesinę komórkową. Wirować probówki stożkowe 15 ml przy 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, abyt stworzyć pellet komórkowy.Po odwirowaniu ostrożnie odessaj i odrzuć nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie uderz dnem probówki, aby całkowicie oderwać osad komórkowy od dna. Dodaj odpowiednią ilość kompletnej pożywki zastępczej z surowicą, wolnej od komórek karmicielskich, zgodnie z pożądanym stosunkiem rozdzielenia.Następnie delikatnie resuspenduj osad. Nie rozbijaj skupisk komórkowych na mniejsze fragmenty, ponieważ mniejsze skupiska słabo przylegają do powierzchni. Odessań pozostały roztwór żelu TRE z wcześniej przygotowanych szalek hodowlanych powlekanych żelem Rex i powoli dodaj odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej do każdej szalki.Kilkakrotnie przesuń naczynie hodowlane przód-tył oraz na boki, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki na powierzchni naczynia. Ostrożnie umieść naczynia hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 °C z uwilgotnioną atmosferą zawierającą od 4 do 6% CO2 w powietrzu. Następnie codziennie wymieniaj zużytą pożywkę, aż komórki osiągną około 70 do 80% konfluencji.Gdy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste człowieka hodowane w całkowitym zamienniku surowicy w pożywce bez komórek karmicieli osiągną 70 do 80% konfluencji, są gotowe do subkultury. Jeśli pojawią się jakiekolwiek zróżnicowane komórki, należy je usunąć przed pasażowaniem. Odessać zużytą pożywkę z 60 milimetrowej szalki hodowlanej za pomocą pipety i dwukrotnie przepłukać komórki.Za pomocą DPBS delikatnie dodaj 1 mL uprzednio ogrzanego roztworu do płytek hodowlanych. Zakręć płytką, aby pokryć całą powierzchnię komórek. Inkubuj hodowlę w temperaturze 37 °C przez 3–5 minut.Następnie odessać roztwór i delikatnie przemyć komórki dwukrotnie DPBS, dodać pełny zamiennik surowicy (serum replacement), pożywkę bez komórek karmionkach (feeder free medium), a następnie delikatnie zdjąć komórki z powierzchni naczynia hodowlanego. Za pomocą skrobaka do komórek przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepłukać naczynie hodowlane dwukrotnie pełnym zamiennikiem surowicy.Pożywka bez komórek karmionek delikatnie wypłukuje wszelkie komórki, które nie oddzieliły się od podłoża. Pobrać pożywkę z obu płukań wraz z komórkami do probówki o pojemności 15 ml. Wirować probówkę z prędkością 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby otrzymać osad komórkowy, nie naruszając go przy tym.Ostrożnie odessaj i odrzuć supernatant. Delikatnie potrząśnij probówką, aby całkowicie oddzielić pellet komórkowy od dna. Delikatnie resuspenderuj komórki w pełnym zamienniku surowicy.Pożywka bez komórek feederowych przy użyciu pipety serologicznej o objętości 5 ml. Nie trytrować. Przenieść komórki do nowej płytki 60 mm powlekanej Geltrex w żądanym stosunku rozcieńczenia.Przesuwaj naczynie hodowlane kilka razy w przód i w tył oraz na boki, aby rozprzestrzec komórki po jego powierzchni. Następnego dnia umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C z uwilgotnioną atmosferą zawierającą od 4 do 6% carbon dioxide w powietrzu. Ostrożnie zastąp zużyte medium kompletną pożywką uzupełniającą z surowicą.Dostarczenie świeżej pożywki w celu usunięcia szczątków komórkowych. Następnie należy wymieniać zużytą pożywkę każdego dnia. Ten obraz w kontraście fazowym przedstawia ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane na naczyniach hodowlanych powlekanych gelt TRX z zastosowaniem kompletnego zamiennika surowicy w pożywce bez warstwy komórek karmiarek.Morfologia IPC wykazuje podobieństwo do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, charakteryzując się dużymi jądrami i ubogą cytoplazmą; barwienie immunocytochemiczne pokazuje, że IPC hodowane w pożywce z zamiennikiem surowicy knockout oraz koktajlem czynników wzrostu wykazują ekspresję markerów pluripotencji OCT four i SSEA four. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak adaptować i utrzymywać IPC w warunkach bezkarmiących z zastosowaniem zamiennika surowicy knockout. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

feeder-free-adaptation-culture-passaging-human-ips-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Adaptacja, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek IPS bez podawania przy użyciu kompletnej pożywki KnockOut Serum Replacement Feeder-Free

Niniejszy protokół opisuje szczegółową procedurę krioterapii ludzkich komórek iPS w medium do krioterapii KnockOut SR oraz odzyskiwania tych komórek w kompletnym medium KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) lub medium KnockOut SR z wykorzystaniem komórek zasilających (feeder-based).

Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu bezfeederowego pożywki Complete KnockOut Serum Replacement

Jakość embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) zależy od wyboru odpowiedniego szczepu myszy, takiego jak CF-1. MEFs wspierające pluripotencję oraz pożywka warunkowana (CM) uzyskana z tych komórek powinny zawierać optymalne stężenia Activin A, Gremlin oraz Tgfβ1, które są niezbędne do współdziałania szlaków Activin/Nodal i FGF w celu utrzymania samoodnawiania i pluripotencji.

Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Pomimo podejmowanych wysiłków w celu przejścia na warunki hodowli bez komórek podporowych, izolacja i hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pozostają w dużej mierze zależne od kokultur z embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEFs). W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodologię szybkiego usuwania komórek podporowych z kultur hESC przed przystąpieniem do eksperymentów.

Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Komórki grzebienia nerwowego (NC) pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) mają ogromny potencjał w modelowaniu rozwoju i chorób człowieka oraz w terapiach zastępczych komórek. W tym artykule przedstawiono bezżywieniową adaptację obecnie powszechnie stosowanego protokołu różnicowania in vitro do wyprowadzania komórek NC z hPSC.

Bezkarmowe wyprowadzanie komórek progenitorowych grzebienia nerwowego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia metodę pobierania pożywki kondycjonowanej przez embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC-CM) pochodzących z surowicy (płodowej surowicy bydlęcej, FBS) i karmowiska (mysie fibroblasty embrionalne, MEFs) dla podejścia wolnego od komórek. Może mieć zastosowanie w leczeniu starzenia się i chorób związanych ze starzeniem się.

Kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego

Regularna charakterystyka indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), w celu zapewnienia utrzymania ich stanu pluripotencjalnego, jest ważnym krokiem przed wykorzystaniem tych komórek do innych zastosowań. W tym miejscu opisujemy metodę rozmnażania ludzkich iPSC na małą skalę, zaprojektowaną specjalnie w celu umożliwienia ich łatwej i rutynowej charakterystyki za pomocą immunocytochemii.

Rozmnażanie na małą skalę ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Aby uniknąć ograniczeń związanych z enzymatycznym lub mechanicznym pasażowaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) hodowanych na komórkach żywicielskich, ustaliliśmy szybką, skuteczną, ekonomiczną, wysokowydajną metodę zbierania kolonii hESC lub hiPSC utrzymywanych na warstwie komórek zasilających ludzkie fibroblasty napletka za pomocą dysadhezji za pośrednictwem EDTA.

Szybkie, ekonomiczne, bezenzymatyczne pasażowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na komórkach zasilających przez dysadhezję za pośrednictwem kwasu etylenodiaminotetraoctowego

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Tutaj prezentujemy metodę różnicowania i rozszerzania ludzkich komórek NK wyrażających chimeryczny receptor antygenowy (CAR) pochodzących z ludzkiego iPSC z ulepszonym zabijaniem przeciwko różnym nowotworom złośliwym. Protokół ten demonstruje różnicowanie i ekspansję komórek CAR-NK pochodzących z iPSC zoptymalizowanych pod kątem metody NK oraz pomiar aktywności przeciwnowotworowej przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych.

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Poznaj metodę adaptacji ludzkich komórek iPS do hodowli feeder-free przy użyciu pożywki KnockOut Serum Replacement. Protokół obejmuje przygotowanie naczyń, pasażowanie komórek i codzienną obsługę kultury.

Adaptacja, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek IPS bez podawania przy użyciu kompletnej pożywki KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (Wideo) | JoVE Journal

Adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek iPS z wykorzystaniem bezkomórkowego medium Complete KnockOut Serum Replacement

Przeglądaj więcej filmów