Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu bezfeederowego pożywki Complete KnockOut Serum Replacement

Ogólnym celem niniejszej procedury jest kriokonserwacja i odzyskiwanie komórek IPS w warunkach hodowli z wykorzystaniem komórek karmnych lub bez nich. Jest to realizowane poprzez rozpoczęcie pakowania komórek IPC w sposób standardowy. Drugim krokiem procedury jest przeniesienie komórek do bezserwatkowego medium do zamrażania.

Trzecim krokiem procedury jest kriokonserwacja przeprowadzona w sposób rutynowy. Ostatnim krokiem procedury jest rozmrożenie komórek i rozpoczęcie ich hodowli. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące pomyślne mrożenie i rozmrażanie komórek IPS w medium do mrożenia wolnym od surowicy, co potwierdza prawidłowa morfologia i regeneracja po rozmrożeniu.

Witajcie, jestem Kate Wagner z ośrodka GCO w Life Technologies. Wizualna demonstracja tego protokołu jest kluczowa, ponieważ IPC są bardzo wrażliwe na mrożenie oraz temperaturę. Ułatwieniem w tym protokole jest możliwość zastosowania zamiennika surowicy KnockOut w całym procesie pracy.

Obecnie rodzina produktów KSR obejmuje pełną gamę pożywek i odczynników do hodowli zarodkowych komórek macierzystych oraz indukowanych pluripotencyjnych komórek macierzystych w systemach z wykorzystaniem komórek feeder, bez komórek feeder oraz wolnych od składników pochodzenia zwierzęcego (xeno-free). KSR może być stosowane podczas izolacji, wzrostu, kriokonserwacji, ekspansji oraz w pierwszych etapach różnicowania. Poniższy film przedstawi proces rozmrażania i zamrażania komórek z użyciem KSR w systemie wolnym od feederów.

Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw ogrzać odpowiednią ilość pełnego pożywki bez komórek karmnych do 37°C w kąpieli wodnej, odessać zużytą pożywkę z naczynia hodowlanego, którym jest szalka o średnicy 60 mm. W tym przypadku przepłukać ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste dwukrotnie za pomocą DPBS.

Następnie dodaj jeden mililitr dispy do płytki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy minuty. Po tym czasie odessaj roztwór dispy i delikatnie przemyj komórki DPBS.

Następnie dodaj pełne pożywkę wolną od komórek karmiących, aby pokryć dno naczynia, i użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie zebrać komórki i przenieść je do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów. Przepłucz naczynie pełną pożywką wolną od komórek karmiących, delikatnie spłukując wszelkie komórki, które nie oddzieliły się od podłoża. Przenieś roztwór z płukania do tej samej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej komórki.

Przepłucz naczynie drugi raz pożywką i odessaj ten roztwór płuczący z komórkami, a następnie odwiruj komórki w wirówce przy 1000 RPM przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu ostrożnie odessij i wylej nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie potrząśnij probówką, aby całkowicie oddzielić osad komórkowy od dna probówki.

Następnie, używając pipety serologicznej o pojemności 5 mL, dodaj 1 mL medium do zamrażania A i resuspenduj komórki, delikatnie pipetując zawiesinę w górę i w dół. Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny bez grudek, dodaj do probówki 1 mL medium do zamrażania B, aplikując je kroplami przy jednoczesnym delikatnym wirowaniu zawiesiny komórek w celu wymieszania. Rozdziel po 1 mL zawiesiny komórek do każdej fiolki kriogenicznej i zamrażaj komórki w temperaturze -80 °C przez noc w komorze z izopropanolem.

Następnego dnia przenieść fiolki z komórkami do zbiornika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania. Zamrożoną fiolkę z komórkami rozmrozić szybko, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez około trzy do czterech minut, aż w fiolce pozostanie jedynie niewielki zamrożony fragment. Po wyjęciu fiolki z łaźni wodnej spryskać ją 70% izopropanolem w celu dekontaminacji, a następnie za pomocą pipety 5 ml aseptycznie przenieść całą zawartość fiolki do stożkowej probówki 15 ml.

Kolejny krok może być najtrudniejszym elementem procedury. Pożywkę wolną od komórek karmicieli należy dodawać do komórek powoli i ostrożnie. Aby zredukować szok osmotyczny, powoli dodawaj kroplami 4 mL pełnej pożywki wolnej od komórek karmicieli do komórek w 15 mL probówce stożkowej.

Podczas dodawania pożywki delikatnie poruszaj probówką przód-tył, aby wymieszać komórki. Pozwoli to zmniejszyć szok osmotyczny komórek. Kompletne pożywkę bez komórek dokarmiających (feeder free) można zastąpić zamiennikiem serum knockout zawierającym pożywkę warunkowaną przez komórki MET lub pożywką z zamiennikiem serum knockout do stosowania z komórkami dokarmiającymi; instrukcje dotyczące przygotowania pożywek znajdują się w tekście protokołu.

Po dodaniu wszystkich czterech mililitrów pożywki, odwiruj komórki przy 1000 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ostrożnie odessać i usunąć nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie resuspendować osad komórkowy w czterech mililitrach kompletnej pożywki bez komórek karmicielskich.

Używając pipety o pojemności 5 ml, ostrożnie dodaj zawiesinę komórkową kroplami do naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm powleczonego GelTrucks. Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze w temperaturze od 36 do 38 °C z nawilżoną atmosferą zawierającą od 4 do 6% dwutlenku węgla w powietrzu. Ostrożnie zakręć naczyniem w płaszczyznach północ-południe oraz wschód-zachód, aby równomiernie rozmieścić komórki.

24 godziny po rozmrożeniu. Wymień pożywkę w naczyniu na świeżą. Następnie wymieniaj zużytą pożywkę codziennie, aż komórki osiągną około 70 do 80% konfluencji.

Ten obraz kontrastowy przedstawia ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane na szalkach hodowlanych pokrytych gelt TRX z zastosowaniem kompletnego zamiennika surowicy w pożywce bez komórek karmicieli. iPSC wykazują morfologię podobną do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, charakteryzującą się dużymi jądrami i skąpą cytoplazmą. Przykład komórek po rozmrożeniu i odstawieniu zamiennika surowicy.

Przedstawiono tutaj pożywkę bezzależną od komórek feederowych na podłożu gelt TrackX. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu wszystkich kolonii komórek w tej samej wielkości. W przypadku kriokonserwacji usprawnia to regenerację komórek.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.