Name: Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu kompletnego pożywki do wymiany surowicy KnockOut bez podajnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Naucz się kriokonserwacji ludzkich komórek iPS przy użyciu pożywki KnockOut SR bez surowicy. Protokół obejmuje zamrażanie w -80°C, przechowywanie w ciekłym azocie oraz odzyskiwanie komórek w warunkach feeder-free lub z feederami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uwaga: Aby zachować sterylne warunki hodowli, wszystkie procedury w niniejszym protokole są wykonywane zgodnie ze sterylnymi zasadami pracy laboratoryjnej i przeprowadzane pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.
Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że wszelkie podłoża zostały wyrównane do temperatury 37°C i odpowiednio nasycone gazem.
Przygotowywanie naczyń hodowlanych powlekanych Geltrexem
Uwaga: zapoznaj się z dodatkiem dotyczącym zastosowania naczyń hodowlanych powlekanych CELLstart.
<ol>
 <li>Powoli rozmrozić jedną probówkę Geltrex (1 mL) w temperaturze 2-8°C i rozcieńczyć go w stosunku 1:100 w 99 mL pożywki Knockout D-MEM/F-12. Delikatnie wymieszać roztwór. 
 
 Uwaga: Niektóre linie komórek iPS mogą wymagać innego rozcieńczenia Geltrex dla zapewnienia optymalnego wzrostu. Alternatywne rozcieńczenia znajdują się w aneksie.</li>
 <li>Pokryć całą powierzchnię każdego naczynia hodowlanego roztworem Geltrex (1 mL dla naczynia 35-mm, 1,5 mL dla naczynia 60-mm).</li>
 <li>Uszczelnić każde naczynie Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu, i inkubować naczynia przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. 
 
 Uwaga: Na tym etapie można przechowywać naczynia hodowlane pokryte Geltrex w temperaturze 4°C do 1 miesiąca. Każde naczynie należy uszczelnić Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu Geltrex.</li>
 <li>Przed użyciem przenieść naczynia pokryte Geltrex do komory z laminarnym przepływem powietrza i pozwolić im wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej (około 1 godziny).</li>
</ol>
Przygotowanie pożywki bezkomórkowej Complete KnockOut SR
<ol>
 <li> Aby przygotować 1 ml roztworu Basic FGF o stężeniu 10 μg/ml, należy w warunkach aseptycznych wymieszać wymienione poniżej składniki. Roztwór należy podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C przez maksymalnie 6 miesięcy. 
 <table border="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Podstawowy FGF</td>
 <td>10 μg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-PBS</td>
 <td>990 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% BSA</td>
 <td>10 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 Uwaga: BSA można zastąpić HSA lub Knockout SR w tym samym stężeniu.</li>
 <li>Aby przygotować 50 ml roztworu Dispase o stężeniu 2 mg/ml, należy aseptycznie wymieszać wymienione poniżej składniki. Roztwór należy wysterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie.
 <table border="0">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Dyspaza</td>
 <td>100 mg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-PBS</td>
 <td>50 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Aby w warunkach aseptycznych przygotować 100 ml pełnego medium KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF), należy połączyć składniki wymienione w poniższej tabeli. 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Komponent</td>
 <td>Stężenie roztworu zapasu</td>
 <td>Stężenie końcowe</td>
 <td>Objętość </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Knockout DMEM/F12 (Kat. nr 12660-012)</td>
 <td>-</td>
 <td>1X</td>
 <td>76,8 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GlutaMAX -I (Katalog nr 35050-061)</td>
 <td>200 mM</td>
 <td>2 mM</td>
 <td>1 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KnockOut SR (Katalog nr 10828-028)</td>
 <td>-</td>
 <td>20%</td>
 <td>20 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KnockOut SR-GFC (nr kat. A10580-01)</td>
 <td>50x</td>
 <td>1X</td>
 <td>2 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF (nr kat. PHG0024).</td>
 <td>10 μg/mL</td>
 <td>20 ng/ml</td>
 <td>200 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 Pożywkę KSR-FF można przechowywać w temperaturze 2–8°C przez maksymalnie jeden tydzień.</li>
 <li>Tuż przed doprowadzeniem kompletnego medium do stanu równowagi pod względem temperatury i składu gazowego, w warunkach aseptycznych dodaj wymaganą objętość 2-merkaptoetanolu (stężenie roztworu zapasu 55 mM) dla uzyskania stężenia końcowego 0,1 mM. Na przykład, aby przygotować 100 ml pożywki KSR-FF, należy dodać 182 μl 2-merkaptoetanolu o stężeniu 55 mM (rozcieńczenie 1:550). Alternatywnie 2-merkaptoetanol można dodać do gotowej pożywki 1X i przechowywać w temperaturze 2–8°C przez maksymalnie jeden tydzień.</li>
</ol>
Przygotowanie medium do mrożenia / krioteknik
Pożywka do kriokonserwacji składa się z dwóch komponentów: medium zamrażającego A oraz medium zamrażającego B. Są one dodawane do komórek w różnych momentach i muszą pozostać rozdzielone. Każdy z nich stanowi 50% całkowitej objętości wymaganej pożywki do kriokonserwacji. Całkowita objętość pożywki do kriokonserwacji potrzebna dla każdej zamrażanej fiolki wynosi 1 mL. Płytka 60 mm z hESC o 90% konfluencji może zostać wykorzystana do zabezpieczenia 2 fiolek hESC w pożywce do kriokonserwacji.
Przygotować odpowiednią objętość każdego medium do zamrażania, dodając dodatkowe 2-5mL w celu zapewnienia zapasu.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Medium do mrożenia A (50% objętości końcowej):</td>
 <td>50% DMEM/F12</td>
 <td>50% KSR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medium do mrożenia B (50% objętości końcowej):</td>
 <td>80% DMEM/F12</td>
 <td>20% DMSO</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Przykład:
Jeśli zamrażasz 20 fiolek komórek, będziesz potrzebować 20mL Medium do Kriokonserwacji. Dodaj 4mL zapasu, co daje łącznie 24mL Medium do Kriokonserwacji. Oznacza to, że będziesz potrzebować 12mL Medium do Zamrażania A (50% z 24mL) oraz 12mL Medium do Zamrażania B (50% z 24mL).
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Pożywka do mrożenia A (12 ml):</td>
 <td>6 ml DMEM/F12</td>
 <td>6 ml KSR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pożywka do zamrażania B (12 ml):</td>
 <td>9,6 ml DMEM/F12</td>
 <td>2,4 ml DMSO</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Końcowy skład medium do krio konserwacji to 65% DMEM/F12, 25% KSR i 10% DMSO.
Kriokonserwacja iPSC
<ol>
 <li>Podgrzać wymaganą objętość Dispase w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.</li>
 <li>Równoważyć wymaganą objętość KSR-FF w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 15 min. Szczegółowe informacje dotyczące wymaganych objętości znajdują się w Tabeli 1 poniżej.</li>
 <li>Odssać zużyte medium z naczynia hodowlanego za pomocą pipety, a następnie dwukrotnie wypłukać komórki za pomocą D-PBS.</li>
 <li>Delikatnie dodać podgrzany roztwór Dispase do naczynia hodowlanego (np. 1 mL roztworu Dispase na 60-mm płytkę hodowlaną). Obracać naczynie hodowlane, aby pokryć całą powierzchnię komórek.</li>
 <li>Inkubować naczynie hodowlane w temperaturze 37°C przez 3 minuty.</li>
 <li>Wyjąć naczynie z inkubatora, odessać roztwór Dispase i delikatnie przemyć komórki za pomocą D-PBS.</li>
 <li>Delikatnie zebrać komórki z powierzchni płytki hodowlanej za pomocą skrobaka do komórek i przenieść je do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15mL.</li>
 <li>Dwukrotnie wypłukać płytkę hodowlaną za pomocą KSR-FF, delikatnie „spłukując” wszelkie nieodłączone komórki. Połączyć medium do płukania z komórkami w probówce 15mL.</li>
 <li>Wirować probówkę przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.</li>
 <li>Ostrożnie odessać nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego, i usunąć go.</li>
 <li>Przygotować odpowiednią liczbę krioprobówek. Po kontakcie komórek z DMSO należy je podzielić na porcje i zamrozić w ciągu 2-3 minut.</li>
 <li>Delikatnie potrząsnąć probówką, aby całkowicie oddzielić osad komórkowy od dna probówki, i resuspendować komórki w Medium do Zamrażania A [poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5-mL]. Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny grudek, dodać do niej taką samą objętość Medium do Zamrażania B, dodając je kroplami przy delikatnym mieszaniu zawiesiny komórkowej. 
 
 Uwaga: Na tym etapie komórki są w kontakcie z DMSO, dlatego pracę należy wykonywać sprawnie. Po kontakcie komórek z DMSO należy je podzielić na porcje i zamrozić w ciągu 2-3 minut.</li>
 <li>Przenieść po 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej krioprobówki.</li>
 <li>Szybko umieścić probówki w urządzeniu Mr. Frosty [w celu szybkiego zamrożenia] i przenieść do temperatury -80°C na noc.</li>
 <li>Po całonocnym przechowywaniu w -80°C przenieść komórki do zbiornika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania.</li>
</ol>
Rozmrażanie ampułki z iPSC i odzyskiwanie komórek
Uwaga: KSR-FF można zastąpić pożywką warunkowaną przez MEF zawierającą KSR lub pożywką KSR do stosowania z komórkami karmidłowymi. Instrukcje dotyczące przygotowania pożywek znajdują się w dodatku.
Podgrzej wstępnie 10mL pożywki KSR-FF w probówce o pojemności 50 mL.
<ol>
 <li>Dostosować odpowiednią liczbę naczyń pokrytych Geltrexem do temperatury pokojowej i odessać z nich cały płyn bezpośrednio przed wysiewaniem komórek.</li>
 <li>Ostrożnie wyjąć fiolkę z hESC (lub iPSC) z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie.</li>
 <li>Szybko rozmrozić zamrożoną fiolkę z komórkami w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, aż w fiolce pozostanie jedynie niewielka zamrożona grudka.</li>
 <li>Spryskać fiolkę 70% izopropanolem w celu jej dekontaminacji, a następnie przenieść ją do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza.</li>
 <li>Aseptycznie przenieść całą zawartość fiolki do 15 mL probówki stożkowej za pomocą pipety 5 mL.</li>
 <li>Przepłukać fiolkę 1 mL KSR-FF i dodać ten płyn do 15 mL probówki wirówkowej.</li>
 <li>Powoli, kroplami dodać 4 mL KSR-FF do komórek w 15 mL probówce stożkowej. Podczas dodawania medium delikatnie poruszać probówką w przód i w tył, aby wymieszać komórki (redukuje to szok osmotyczny komórek).</li>
 <li>Wiwrować 15 mL probówkę z zawiesiną komórkową przy 1000rpm (200 x g) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Ostrożnie odessać i usunąć supernatan, nie naruszając granulatu komórkowego.</li>
 <li>Resuspender granulat komórkowy w uprzednio ogrzanym KSR-FF (np. 4mL/naczynie 60 mm) za pomocą pipety 5 mL i delikatnie pipetować komórki w górę i w dół, aż granulat zostanie całkowicie rozproszony. Oczekiwana żywotność powinna wynosić powyżej 70%; jeśli żywotność jest mniejsza niż 70%, komórki mogą potrzebować więcej czasu na osiągnięcie konfluencji.</li>
 <li>Za pomocą tej samej pipety przenieść zawiesinę komórkową kroplami do pokrytego Geltrexem naczynia hodowlanego, uprzednio dostosowanego do temperatury pokojowej.</li>
 <li>Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37°C, w nawilżonej atmosferze z 4 do 6% CO2 w powietrzu. Ostrożnie poruszać naczyniem w płaszczyźnie północ-południe i wschód-zachód, aby równomiernie rozłożyć komórki.</li>
 <li>Delikatnie wymieniać medium w naczyniu hodowlanym 24 godziny po rozmrożeniu, a następnie codziennie w celu usunięcia szczątków komórkowych i dostarczenia świeżych składników odżywczych, aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 70-80%. W celu dalszej hodowli i pasażowania komórek iPS należy zapoznać się z naszym protokołem pt. „Feeder-Free Culture and Passaging of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium”</li>
</ol>
Oczekiwane wyniki
Przed kriokonserwacją komórki powinny osiągnąć konfluencję na poziomie około 70-80%. Trawienie dyspazą powoduje zwijanie się i składanie kolonii wzdłuż ich marginesów. Po zebraniu komórki są zamrażane w postaci małych skupisk w medium do kriokonserwacji. Po rozmrożeniu fiolki komórki regenerują się i przywierają do wcześniej pokrytej płytki w formie małych skupisk. Rosną one szybko, prowadząc do uzyskania pełnej konfluencji płytki w ciągu 5-6 dni.
Tabela 1 - Zalecane objętości
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Komponent</td>
 <td>Szkiełko 35mm</td>
 <td>Szkiełko 60mm</td>
 <td>Szkiełko 100mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pełna pożywka KnockOut SR</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>4 mL</td>
 <td>10 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór Geltrex</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>1.5 mL</td>
 <td>4-5 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispaza</td>
 <td>0.5 mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>3-4 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-PBS do płukania</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>4 mL</td>
 <td>10 mL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">kliknąć tutaj, aby zobaczyć załącznik</a>.

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

Autorzy niniejszego artykułu są zatrudnieni przez firmę Life Technologies, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w tym artykule.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 Knockout</td><td></td><td>12660-012</td><td>Uwaga: w kwestii stosowania alternatywnych produktów DMEM GlutaMAX-I (nr kat. 35050-061) należy zapoznać się z załącznikiem</td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy KnockOut</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl czynników wzrostu KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, ludzkie białko rekombinowane, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Uwaga: alternatywne rozmiary opakowań bFGF znajdują się w aneksie.</td></tr><tr><td>2-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td></td><td>17105-041</td><td>Uwaga: alternatywne metody pasażowania znajdują się w załączniku</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 ml</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;bufor fosforanowy (D-PBS) bez jonów wapnia i magnezu</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500 ml</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna komora do hodowli tkanek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator ustawiony na 37°C&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kontroler pipetowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna ustawiona na 37°C&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne (5 ml, 10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 15 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki hodowlane 60 mm traktowane do hodowli tkanek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik do przechowywania ciekłego azotu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Containers do mrożenia w izopropanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krioprobówki 1,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek ips przy użyciu bezfeederowego pożywki complete knockout serum replacement

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Odkrycie z 2006 roku, że fibroblasty ludzkie i mysie mogą zostać przeprogramowane w celu uzyskania komórek iPS 1-3 o właściwościach uderzająco podobnych do embrionalnych komórek macierzystych, stworzyło cenne nowe źródło komórek pluripotencjalnych dla celów odkrywania leków, terapii komórkowej oraz badań podstawowych.
Pożywki i odczynniki GIBCO od lat zajmują czołowe miejsce w badaniach nad pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Knockout DMEM uzupełniony o Knockout Serum Replacement jest preferowanym medium do wzrostu embrionalnych komórek macierzystych, a obecnie także do hodowli komórek iPS 3-9. Ten standardowy system pożywek może teraz być stosowany do hodowli bezwarstwowej po dodaniu Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Tradycyjne metody hodowli ludzkich komórek ES i iPS wymagają zastosowania warstw karmiących z fibroblastów mysich lub ludzkich lub pożywki warunkowanej przez komórki karmiące. Metody hodowli te są pracochłonne, trudne do skalowania, a utrzymanie komórek hiPS w stanie niedróżnicowanym jest utrudnione ze względu na niedookreślone warunki. Firma Invitrogen opracowała koktajl czynników wzrostu Knockout SR Growth Factor Cocktail, aby umożliwić łatwe przejście hodowli komórek hiPS i hES na systemy bezwarstwowe (feeder-free) przy jednoczesnym zachowaniu stosowania Knockout SR.

Niniejszy protokół opisuje szczegółową procedurę krioterapii ludzkich komórek iPS w medium do krioterapii KnockOut SR oraz odzyskiwania tych komórek w kompletnym medium KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) lub medium KnockOut SR z wykorzystaniem komórek zasilających (feeder-based).

Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu bezfeederowego pożywki Complete KnockOut Serum Replacement

Odkrycie z 2006 roku, że fibroblasty ludzkie i mysie mogą zostać przeprogramowane w celu wygenerowania komórek iPS 1-3 o właściwościach niezwykle podobnych do embrionalnych komórek macierzystych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest kriokonserwacja i odzyskiwanie komórek IPS w warunkach hodowli z wykorzystaniem komórek karmnych lub bez nich. Jest to realizowane poprzez rozpoczęcie pakowania komórek IPC w sposób standardowy. Drugim krokiem procedury jest przeniesienie komórek do bezserwatkowego medium do zamrażania.Trzecim krokiem procedury jest kriokonserwacja przeprowadzona w sposób rutynowy. Ostatnim krokiem procedury jest rozmrożenie komórek i rozpoczęcie ich hodowli. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące pomyślne mrożenie i rozmrażanie komórek IPS w medium do mrożenia wolnym od surowicy, co potwierdza prawidłowa morfologia i regeneracja po rozmrożeniu.Witajcie, jestem Kate Wagner z ośrodka GCO w Life Technologies. Wizualna demonstracja tego protokołu jest kluczowa, ponieważ IPC są bardzo wrażliwe na mrożenie oraz temperaturę. Ułatwieniem w tym protokole jest możliwość zastosowania zamiennika surowicy KnockOut w całym procesie pracy.Obecnie rodzina produktów KSR obejmuje pełną gamę pożywek i odczynników do hodowli zarodkowych komórek macierzystych oraz indukowanych pluripotencyjnych komórek macierzystych w systemach z wykorzystaniem komórek feeder, bez komórek feeder oraz wolnych od składników pochodzenia zwierzęcego (xeno-free). KSR może być stosowane podczas izolacji, wzrostu, kriokonserwacji, ekspansji oraz w pierwszych etapach różnicowania. Poniższy film przedstawi proces rozmrażania i zamrażania komórek z użyciem KSR w systemie wolnym od feederów.Aby rozpocząć tę procedurę, najpierw ogrzać odpowiednią ilość pełnego pożywki bez komórek karmnych do 37°C w kąpieli wodnej, odessać zużytą pożywkę z naczynia hodowlanego, którym jest szalka o średnicy 60 mm. W tym przypadku przepłukać ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste dwukrotnie za pomocą DPBS.Następnie dodaj jeden mililitr dispy do płytki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy minuty. Po tym czasie odessaj roztwór dispy i delikatnie przemyj komórki DPBS.Następnie dodaj pełne pożywkę wolną od komórek karmiących, aby pokryć dno naczynia, i użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie zebrać komórki i przenieść je do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów. Przepłucz naczynie pełną pożywką wolną od komórek karmiących, delikatnie spłukując wszelkie komórki, które nie oddzieliły się od podłoża. Przenieś roztwór z płukania do tej samej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej komórki.Przepłucz naczynie drugi raz pożywką i odessaj ten roztwór płuczący z komórkami, a następnie odwiruj komórki w wirówce przy 1000 RPM przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu ostrożnie odessij i wylej nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie potrząśnij probówką, aby całkowicie oddzielić osad komórkowy od dna probówki.Następnie, używając pipety serologicznej o pojemności 5 mL, dodaj 1 mL medium do zamrażania A i resuspenduj komórki, delikatnie pipetując zawiesinę w górę i w dół. Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny bez grudek, dodaj do probówki 1 mL medium do zamrażania B, aplikując je kroplami przy jednoczesnym delikatnym wirowaniu zawiesiny komórek w celu wymieszania. Rozdziel po 1 mL zawiesiny komórek do każdej fiolki kriogenicznej i zamrażaj komórki w temperaturze -80 °C przez noc w komorze z izopropanolem.Następnego dnia przenieść fiolki z komórkami do zbiornika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania. Zamrożoną fiolkę z komórkami rozmrozić szybko, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez około trzy do czterech minut, aż w fiolce pozostanie jedynie niewielki zamrożony fragment. Po wyjęciu fiolki z łaźni wodnej spryskać ją 70% izopropanolem w celu dekontaminacji, a następnie za pomocą pipety 5 ml aseptycznie przenieść całą zawartość fiolki do stożkowej probówki 15 ml.Kolejny krok może być najtrudniejszym elementem procedury. Pożywkę wolną od komórek karmicieli należy dodawać do komórek powoli i ostrożnie. Aby zredukować szok osmotyczny, powoli dodawaj kroplami 4 mL pełnej pożywki wolnej od komórek karmicieli do komórek w 15 mL probówce stożkowej.Podczas dodawania pożywki delikatnie poruszaj probówką przód-tył, aby wymieszać komórki. Pozwoli to zmniejszyć szok osmotyczny komórek. Kompletne pożywkę bez komórek dokarmiających (feeder free) można zastąpić zamiennikiem serum knockout zawierającym pożywkę warunkowaną przez komórki MET lub pożywką z zamiennikiem serum knockout do stosowania z komórkami dokarmiającymi; instrukcje dotyczące przygotowania pożywek znajdują się w tekście protokołu.Po dodaniu wszystkich czterech mililitrów pożywki, odwiruj komórki przy 1000 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ostrożnie odessać i usunąć nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie resuspendować osad komórkowy w czterech mililitrach kompletnej pożywki bez komórek karmicielskich.Używając pipety o pojemności 5 ml, ostrożnie dodaj zawiesinę komórkową kroplami do naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm powleczonego GelTrucks. Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze w temperaturze od 36 do 38 °C z nawilżoną atmosferą zawierającą od 4 do 6% dwutlenku węgla w powietrzu. Ostrożnie zakręć naczyniem w płaszczyznach północ-południe oraz wschód-zachód, aby równomiernie rozmieścić komórki.24 godziny po rozmrożeniu. Wymień pożywkę w naczyniu na świeżą. Następnie wymieniaj zużytą pożywkę codziennie, aż komórki osiągną około 70 do 80% konfluencji.Ten obraz kontrastowy przedstawia ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane na szalkach hodowlanych pokrytych gelt TRX z zastosowaniem kompletnego zamiennika surowicy w pożywce bez komórek karmicieli. iPSC wykazują morfologię podobną do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, charakteryzującą się dużymi jądrami i skąpą cytoplazmą. Przykład komórek po rozmrożeniu i odstawieniu zamiennika surowicy.Przedstawiono tutaj pożywkę bezzależną od komórek feederowych na podłożu gelt TrackX. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu wszystkich kolonii komórek w tej samej wielkości. W przypadku kriokonserwacji usprawnia to regenerację komórek.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu kompletnego pożywki do wymiany surowicy KnockOut bez podajnika

Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące adaptacji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do hodowli bez warstwy komórek żerujących (feeder-free) z wykorzystaniem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (KSR-FF). Po zakończeniu adaptacji przedstawiono również instrukcje dotyczące ich dalszego utrzymania.

Adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek iPS z wykorzystaniem bezkomórkowego medium Complete KnockOut Serum Replacement

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Regularna charakterystyka indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), w celu zapewnienia utrzymania ich stanu pluripotencjalnego, jest ważnym krokiem przed wykorzystaniem tych komórek do innych zastosowań. W tym miejscu opisujemy metodę rozmnażania ludzkich iPSC na małą skalę, zaprojektowaną specjalnie w celu umożliwienia ich łatwej i rutynowej charakterystyki za pomocą immunocytochemii.

Rozmnażanie na małą skalę ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej

Tutaj przedstawiamy protokół rozwoju trójwymiarowego (3-D) systemu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) o nazwie surowica wolnego od embrionów (SFEB). Ten model 3D może być używany jak organotypowa kultura plasterków do modelowania rozwoju ludzkiej kory mózgowej i do fizjologicznego badania rozwijających się obwodów neuronalnych.

Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są powszechnymi prekursorami zarówno plemników, jak i jaj. Ludzkie embrionalne PGC są określane z pluripotencjalnych komórek epiblastów poprzez interakcje cytokin. Tutaj opisujemy 13-dniowy protokół indukcji komórek ludzkich transkryptomalnie przypominających PGC na powierzchni ciał zarodkowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją.

Wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

To badanie dostarcza szczegółowego protokołu do efektywnej kriokonserwacji komórek nabłonkowych barwnika siatkówki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych.

Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Tutaj prezentujemy metodę różnicowania i rozszerzania ludzkich komórek NK wyrażających chimeryczny receptor antygenowy (CAR) pochodzących z ludzkiego iPSC z ulepszonym zabijaniem przeciwko różnym nowotworom złośliwym. Protokół ten demonstruje różnicowanie i ekspansję komórek CAR-NK pochodzących z iPSC zoptymalizowanych pod kątem metody NK oraz pomiar aktywności przeciwnowotworowej przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych.

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Naucz się kriokonserwacji ludzkich komórek iPS przy użyciu pożywki KnockOut SR bez surowicy. Protokół obejmuje zamrażanie w -80°C, przechowywanie w ciekłym azocie oraz odzyskiwanie komórek w warunkach feeder-free lub z feederami.

Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu bezfeederowego pożywki Complete KnockOut Serum Replacement

Przeglądaj więcej filmów