Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu kompletnego pożywki do wymiany surowicy KnockOut bez podajnika
July 15th, 2010
Ten protokół opisuje szczegółową procedurę kriokonserwacji ludzkich komórek iPS w pożywce kriokonserwacyjnej KnockOut SR i odzyskiwania tych komórek na kompletnym podłożu KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) lub na pożywce KnockOut SR opartej na pożywce.
Ogólnym celem tej procedury jest kriokonserwacja i odzyskanie komórek IPS w warunkach hodowli opartej na karmicielu lub bez karmnika. Osiąga się to poprzez rozpoczęcie pakowania IPC w normalny sposób. Drugim etapem zabiegu jest przeniesienie komórek do pożywki do zamrażania wolnej od surowicy.
Trzecim krokiem procedury jest kriokonserwacja w normalny sposób. Ostatnim krokiem zabiegu jest rozmrożenie komórek i rozpoczęcie konserwacji. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na udane zamrażanie i rozmrażanie komórek IPS w pożywce do zamrażania bez surowicy poprzez zdrową morfologię i regenerację po rozmrożeniu.
Cześć, nazywam się Kate Wagner i pracuję w GCO w Life Technologies. Wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie, ponieważ IPC mogą być bardzo wrażliwe na zamarzanie i T. To, co ułatwia ten protokół, to fakt, że zamiennik serum nokautującego może być stosowany przez cały czas trwania pracy.
Obecnie rodzina produktów KSR obejmuje pełną listę pożywek i odczynników do hodowli embrionalnych komórek macierzystych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na bazie karmy, bez paszy i bez ksenotypów. KSR może być używany do wzrostu derywacji, kriokonserwacji, ekspansji i pierwszych początkowych etapów różnicowania. Poniższy film pokaże, jak rozmrażać i zamrażać się za pomocą KSR w maszynie bez Piotra.
Aby rozpocząć tę procedurę. Najpierw podgrzać w odpowiedniej ilości pełnoporcjowego wolnego pożywki do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej odessać zużytą pożywkę z naczynia hodowlanego, które jest 60 milimetrowym naczyniem. W takim przypadku należy dwukrotnie przepłukać ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą DPBS.
Następnie dodaj jeden mililitr dispy do potrawy. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie odessać roztwór dispa i delikatnie umyć komórki DPBS.
Następnie dodaj kompletne wolne pożywkę, aby przykryć naczynie i użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie zeskrobać komórki przenoszące komórki do sterylnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Opłucz naczynie pełnym naczyniem z wolnego podłoża, delikatnie spryskując wszelkie komórki, które nie oderwały się. Przenieś roztwór płuczący do tej samej 15-mililitrowej probówki zawierającej komórki.
Opłucz naczynie po raz drugi pożywką i wyciągnij roztwór do płukania z komórkami osadów przez odwirowanie z prędkością 1000 obr./min przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie przesuń rurkę, aby całkowicie usunąć osad komórek z dna tuby.
Następnie dodaj jeden mililitr pożywki zamrażającej A, używając pięciomililitrowej pipety serologicznej i ponownie zawieś komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół. Po równomiernym zawieszeniu grudek dodać jeden mililitr pożywki zamrażającej B do probówki kroplami, delikatnie obracając zawiesinę komórek w celu wymieszania. Przydziel jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej kriogenicznej komórki zamrażalnika w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc w komorze izopropanolowej.
Następnego dnia przenieś fiolki z komórkami do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania. Szybko rozmrozić zamrożoną fiolkę z komórkami, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na około trzy do czterech minut, aż w fiolce pozostanie tylko mały zamrożony kawałek. Po wyjęciu fiolki z łaźni wodnej spryskaj ją 70% izopropanolem w celu jej odkażenia, a następnie użyj pięciomililitrowej pipety, aby aseptycznie przenieść całą zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.
Kolejny krok może być najtrudniejszym aspektem zabiegu. Pożywkę wolną od podajnika należy dodawać powoli i ostrożnie do komórek. Aby zmniejszyć szok osmotyczny, powoli dodawaj kroplami cztery mililitry kompletnego, wolnego od pożywki do komórek w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów.
Podczas dodawania pożywki delikatnie przesuwaj probówkę do przodu ido tyłu, aby wymieszać komórki. Zmniejszy to szok osmotyczny dla komórek. Kompletna pożywka wolna od podajnika może zostać zastąpiona zamiennikiem surowicy do wybijania zawierającym pożywkę kondycjonowaną metamfetaminą lub pożywką zastępczą zastępczą surowicy do wybijania do użytku z podajnikami, instrukcje przygotowania pożywki znajdują się w tekście protokołu.
Po dodaniu wszystkich czterech mililitrów pożywki odwirować komórki z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ostrożnie odessać i wyrzucić zdrowy zmysł, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie ponownie zawieś osad komórkowy w czterech mililitrach kompletnego, wolnego od pożywki pożywki.
Za pomocą pięciomililitrowej pipety delikatnie dodaj zawiesinę komórek kroplami do pokrytej 60-milimetrową naczynią hodowlaną pokrytą gelt trucks. Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze od 36 do 38 stopni Celsjusza z nawilżoną atmosferą o zawartości od czterech do 6% dwutlenku węgla w powietrzu. Ostrożnie obracaj naczynie w układzie z północy na południe, ze wschodu na zachód, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
24 godziny po rozmrożeniu. Zastąp podłoże w naczyniu świeżym podłożem. Następnie wymieniaj zużytą pożywkę codziennie, aż komórki staną się zlewające się w około 70 do 80%.
Ten kontrastowy obraz przedstawia ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste wyhodowane na szalkach hodowlanych pokrytych żelem TRX przy użyciu całkowitej wymiany surowicy, pożywki wolnej od karmowania. IPC wykazują morfologię podobną do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, charakteryzujących się dużymi jądrami i skąpą cytoplazmą. Przykład komórek po rozmrożeniu i wymianie surowicy nokautowej.
Pożywka bez podajnika w gelt TrackX jest pokazana tutaj. Postępując zgodnie z tą procedurą, należy pamiętać, aby wszystkie kolonie komórek były tej samej wielkości. Podczas kriogenizacji poprawia to regenerację komórek.
Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Ten protokół opisuje procedurę krioprezerwacji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) z użyciem medium krioprezerwacyjnego KnockOut SR i odzyskiwania ich w pełnym medium KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) lub medium KnockOut SR opartym na feederze. Metoda podkreśla znaczenie wizualnej demonstracji ze względu na wrażliwość komórek iPS podczas zamrażania i rozmrażania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Techniki krioprezerwacji
Tło
- Ludzkie komórki iPS są wrażliwe na procesy zamrażania i rozmrażania.
- Produkty KnockOut SR ułatwiają różne etapy hodowli komórek macierzystych.
- Właściwa krioprezerwacja jest kluczowa dla utrzymania żywotności komórek.
- Warunki kultury wolne od feedera i oparte na feederze mogą być wykorzystywane dla komórek iPS.
Cel badania
- Dostarczenie niezawodnego protokołu krioprezerwacji komórek iPS.
- Zapewnić skuteczne odzyskanie komórek po rozmrożeniu.
- Demonstracja użycia produktów KSR w całym procesie.
Zastosowane metody
- Przygotowanie komórek iPS do krioprezerwacji.
- Zastosowanie wolnego od surowicy medium zamrażającego do konserwacji komórek.
- Krioprezerwacja w -80 stopniach Celsjusza, następnie przechowywanie w ciekłym azocie.
- Rozmrażanie i ponowne zawieszenie komórek w pełnym medium wolnym od feedera.
Główne wyniki
- Skuteczna zamrażanie i rozmrażanie komórek iPS, co wykazano zdrową morfologią.
- Komórki utrzymały żywotność i wzrost zarówno w warunkach wolnych od feedera, jak i opartych na feederze.
- Skuteczność protokołu potwierdzono poprzez wizualną ocenę odzyskania komórek.
- Utrzymanie jednolitej wielkości kolonii komórek poprawiło tempo odzyskiwania.
Wnioski
- Protokół zapewnia systematyczne podejście do krioprezerwacji komórek iPS.
- Produkty KnockOut SR są skuteczne w utrzymaniu zdrowia komórek podczas procesu.
- Wizualne demonstracje poprawiają zrozumienie i wykonanie protokołu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable cryopreservation and recovery of human iPS cells using feeder-free, defined media directly addresses scalability and standardization challenges in early discovery and translational research. This protocol enables consistent pluripotent cell banking, supporting robust assay development and downstream applications in drug discovery portfolios. Feeder-free workflows reduce biological variability, enhancing predictive confidence and portfolio triage at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent banking of pluripotent cells for repeated hypothesis testing and pathway interrogation.
- Reduces biological variability by eliminating feeder layers, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by maintaining cell health and pluripotency post-thaw.
- Supports predictive confidence in early-stage screening and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, feeder-free system for preparing validated iPS cells for high-throughput assays.
- Improves reproducibility and scalability of cell-based assays by using defined media components.
- Enables reliable compound evaluation by ensuring healthy, undifferentiated cell recovery.
- Supports platform reuse and assay standardization across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Maintains disease-relevant cell models for translational biomarker studies when using patient-derived iPS cells.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting robust cell recovery and expansion.
- Reduces risk of batch-to-batch variability in preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing reliable cell sources.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation and recovery protocol fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless transitions between banking, expansion, and assay deployment stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by providing healthy, pluripotent cells on demand.
- Screening: Delivers assay-ready iPS cells with reproducible morphology and viability for quantitative readouts.
- Analytics: Enables consistent measurement of cell health and recovery, supporting cross-condition comparisons.
- Translational Research: Maintains continuity for disease modeling and biomarker alignment when using patient-derived lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, feeder-free workflow for pluripotent cell management across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Standardizes cryopreservation and recovery, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pluripotent stem cell handling and feeder-free culture techniques.
- Needs access to defined media, cryopreservation equipment, and controlled thawing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell colony size and handling procedures for optimal recovery.
- Adaptation may be needed for different iPS cell lines or disease models.
- Careful osmotic shock management is critical for maintaining cell viability post-thaw.
