Indukcja i ocena kliniczna przewlekłej postaci nawrotowej eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Nazywam się Christine Beaton. Jestem asystentką badawczą w laboratorium George'a Chen w Katedrze Fizjologii i Biofizyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. W ciągu najbliższych dni pokażę Państwu, jak indukować i monitorować przewlekłe nawracające EAE, czyli eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, u szczurów DA.

Jest to model zwierzęcy stwardnienia rozsianego, a właściwie jeden z modeli zwierzęcych tej choroby. Charakteryzuje się on u tych zwierząt wstępującym wiotkim porażeniem oraz cechami histologicznymi przypominającymi obraz choroby u ludzi. Cały proces zajmie kilka dni.

W pierwszym dniu pokażę Państwu, jak przygotować emulsję geniczną z homogenatem rdzenia kręgowego naiwnych szczurów w kompletnym adjuwancie T. Drugiego dnia zaprezentuję sposób immunizacji szczurów w celu wywołania EAE, a następnie odczekamy od siedmiu do 15 dni, aż u tych zwierząt pojawią się pierwsze objawy kliniczne; wtedy pokażę różne stadia progresji EAE u poszczególnych osobników. Na początek przedstawię wszystkie odczynniki i materiały niezbędne do przygotowania emulsji.

Stosuję kompletny adiuwant front H 37 ra, jednak mimo że zawiera on już Mycobacterium tuberculosis, uzupełnię jego stężenie do 4 mg/mL, dodając więcej wysuszonych bakterii Mycobacterium tuberculosis H 37 ra. Aby przygotować te wysuszone bakterie, muszę umieść je w moździerzu i za pomocą tłuczka rozetrzeć je na drobny proszek. Po wykonaniu tej czynności dodam bakterie do adiuwantu.

Adjuwant jest już gotowy. Następnym krokiem jest przygotowanie antygenu. Wyjmuję rdzenie kręgowe szczurów D, które są zamrożone w temperaturze -80°C. Aby utrzymać je w stanie głębokiego zamrożenia, umieszczam je na naczyniu wagowym w suchym lodzie, a następnie wyjmuję po kolei i za pomocą zwykłych żyletki siekam rdzenie kręgowe do naczyń wagowych.

Następnie umieszczę uzupełniony adiuwant na wirówce typu vortex. Podczas wirowania będę stopniowo dodawać rdzeń kręgowy do adiuwantu. Po wymieszaniu całego rdzenia kręgowego z adiuwantem na vortexie, będziemy wirować próbkę przez kolejne pięć minut, a następnie przeniesiemy przygotowaną zawiesinę do szklanych strzykawek o pojemności 5 ml.

Połączymy dwie szklane strzykawki o pojemności 5 ml za pomocą łącznika 16 G i będziemy przetłaczać emulsję z jednej strzykawki do drugiej tak szybko, jak to możliwe dla tego łącznika. Po kilku minutach, gdy emulsja zacznie gęstnieć, przejdziemy na mniejszy łącznik. Jest to łącznik 18 G, który sprawi, że emulsja stanie się jeszcze gęstsza; pozostawimy ją w tych strzykawkach z założonym łącznikiem, owiniętą w folię aluminiową, na noc w lodówce.

Odważyłem 30 mg Mycobacterium tuberculosis na papierze wagowym. Przeniosłem je do moździerza, a następnie za pomocą pestika rozdrobiłem agregaty bakterii na cienki proszek.

Nie należy jednak uciskać tłuczkiem zbyt mocno, aby nie rozbić bakterii. Gdy bakterie występują w agregatach na początku procedury, mają kolor żółto-beżowy. Jeśli uzyskacie bardzo drobny proszek, w efekcie otrzymacie proszek biały i taki jest zamierzony cel, ale nie wolno uciskać zbyt mocno, by nie uszkodzić bakterii.

Po wykonaniu tej czynności pobrałem ampułkę 10 ml kompletnego adiuwantu Trans i upewniłem się, że wszystkie bakterie znajdują się w zawiesinie. Otworzyłem tę próbkę i wlałem całe 10 ml kompletnego adiuwantu Trans do moździerza, na rozdzielone prątki gruźlicy mycobacterium tuberculosis. Teraz przeniosę uzupełniony kompletny adiuwant Trans do probówki 50 ml.

Teraz przenoszę mój uzupełniony kompletny adiuwant trans do probówki. Bakterie znajdują się oczywiście na dnie cieczy, więc postaram się przenieść ich jak najwięcej do probówki. Jeśli jednak część z nich zostanie w moździerzu, nie będzie to dużym problemem, ponieważ użyję tego samego moździerza bez czyszczenia go do przygotowania emulsji rdzenia kręgowego.

Oto rdzenie kręgowe. Były one przechowywane w zamrożeniu w temperaturze -80°C. Odważyłem 10 g tkanki, aby dodać ją do 10 ml uzupełnionego adiuwantu.

To, co zrobię z tymi rdzeniami kręgowymi, utrzymując je w stanie zamrożenia tak długo, jak to możliwe, to bardzo drobne posiekanie ich w naczyniach wagowych za pomocą żyletki. Aby bardzo drobno posiekać rdzenie kręgowe, potrzebne są dwie żyletki oraz naczynie wagowe. Postępuję w następujący sposób: biorę jeden rdzeń kręgowy, umieszczam go w naczyniu wagowym i zaczynam go kroić, przykrywając go ręką, ponieważ ze względu na zamrożenie tkanka może odskakiwać; najpierw odcinam duże kawałki, a następnie rdzeń zacznie szybko tajać i przyklejać się do boku żyletki.

Używam więc drugiej żyletki, aby go zdjąć, i staram się posiekać go tak drobno i szybko, jak to możliwe, aby nie zdążył się rozpuścić, ponieważ po rozpuszczeniu cięcie jest znacznie trudniejsze. Jest zatem niezwykle ważne, aby rdzeń kręgowy został całkowicie i bardzo drobno posiekany, ponieważ im drobniejsza będzie struktura, tym bardziej jednorodna będzie zawiesina, a w konsekwencji więcej szczurów zachoruje w sposób bardziej jednolity. Bardzo ważne jest zatem, aby wszystkie te rdzenie kręgowe bardzo starannie posiekać.

Teraz będę rozdrabniać każdy z tych rdzeni kręgowych w dokładnie ten sam sposób, aż przetworzę całe 10 g rdzenia kręgowego. Następnie wymieszam zawartość moździerza, aby upewnić się, że zebrałem wszystkie bakterie Mycobacterium tuberculosis, które pozostały w moździerzu po dodaniu adiuwantu. W kolejnym kroku umieszczę adiuwant na wstrząsarce typu vortex.

Podczas ciągłego mieszania w vortexie z maksymalną prędkością, będę stopniowo dodawać mielony rdzeń kręgowy do tego adiuwantu. Teraz mam uzupełniony adiuwant w vortexie i zaczynam powoli dodawać mielony rdzeń kręgowy. Powodem, dla którego dodaję antygen bardzo powoli do adiuwantu, jest fakt, że tworzymy emulsję typu woda w oleju.

Przymiotnik składa się głównie z oleju mineralnego, a antygen jest roztworem o równym stężeniu. Naszym celem jest bardzo powolne mieszanie antygenu z olejem, aby olej całkowicie pokrywał antygen przy każdym dodawaniu. Gdybyśmy dodali go jednorazowo, antygen nie zostałby całkowicie pokryty.

W tym momencie dodałem cały homogenat rdzenia kręgowego do adiuwantu na wirówce laboratoryjnej i pozostawiłem probówkę na urządzeniu na kolejne pięć minut, aby upewnić się, że wszystko zostanie całkowicie wymieszane. Dostosowałem prędkość tak, aby uzyskać maksymalne możliwe mieszanie bez nadmiernej utraty materiału z dna probówki. Pięć minut wirowania dobiegło końca, więc zatrzymuję urządzenie i przenoszę zawiesinę do szklanych strzykawek.

Złożyłam więc pełną strzykawkę. Przymocowałam ją do mostka o większej średnicy, a do drugiego końca mostka przymocowałam sam tłok jednej strzykawki i teraz zamierzam dodać do tej strzykawki emulsję. Zatem teraz, nie.

Teraz przeniosę cały płyn do dolnej strzykawki, odłączę górną, dokończę jej montaż i upewnię się, że w dolnej strzykawce oraz w łączniku nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie ponownie je połączę. W ten sposób obie strzykawki są teraz połączone za pomocą tego łącznika.

Jedna jest całkowicie wypełniona, druga jest pusta. Teraz będę przesuwać tłoki obu strzykawek w przód i w tył tak szybko, jak to możliwe. Następnie zmienię mostek o dużym przekroju na mniejszy, czyli mostek 18 G.

Mniejszy łącznik sprawi, że emulsja stanie się jeszcze gęstsza. Aby zatem zmienić łącznik, przenoszę całą emulsję do jednej strzykawki. Usuwam pustą strzykawkę, upewniając się, że nic nie wyciekło z łącznika, zdejmuję go, nakładam nowy, usuwam wszystkie pęcherzyki powietrza i ponownie podłączam drugą strzykawkę.

Powtarzam tę procedurę; teraz emulsja jest znacznie gęstsza, więc uważam, aby nie przerwać tego bardzo kruchego mostka. Powtarzam ten proces z kolejnymi zestawami strzykawek tak długo, aż w probówce skończy się emulsja. Używam zatem tylu strzykawek, ile jest konieczne, aby zużyć całą emulsję.

Wymieszałem teraz emulsję kilkanaście razy, może 10 lub 15, choć zależy to od danej partii. Teraz staje się ona niezwykle gęsta i trudno ją mieszać. Zrobię to jeszcze kilka razy, a może jednak nie.

Teraz jest to naprawdę zablokowane, więc zostawię to w tym miejscu. W przeciwnym razie istnieje ryzyko uszkodzenia strzykawki lub mostka. Zatem jeśli płyn przestaje przepływać i dzieje się to na bardzo wczesnym etapie, może to oznaczać, że mostek jest zapchany.

Jednak w tym momencie, ponieważ wymieszałem ją co najmniej 10 lub 15 razy, oznacza to, że emulsja jest gotowa. Jest ona bardzo gęsta, więc powinnam ją teraz pozostawić. Teraz owinę ją folią aluminiową i włożę do lodówki na noc.

Wczoraj przygotowaliśmy emulsję z czerwonymi rdzeniami kręgowymi i pozostawiliśmy ją na noc w lodówce. Dzisiaj ją wyjmujemy i będziemy wstrzykiwać 200 µL na szczura u podstawy ogona. Jednak przed iniekcją musimy upewnić się, że emulsja jest odpowiedniej jakości.

Zatem powinna ona nadal pozostawać w stanie stałym i nadal jest to jednorodny ciało stałe. Pęknięcie, które tutaj widzimy, potwierdza nawet, że jest to jednolity ciało stałe i nie rozwarstwiła się na dwie fazy, co byłoby niepożądane. Zatem ta emulsja nadaje się do użycia.

Zatem każda klatka otrzyma 200 µL naszej emulsji. Do wstrzyknięcia używamy strzykawek 3 ml, dbając o to, aby były to strzykawki z końcówką typu Luer-Lock, ponieważ w przypadku strzykawek z końcówką typu slip, ze względu na gęstość emulsji, igła mogłaby wysunąć się podczas próby wstrzyknięcia.

Zawsze należy stosować strzykawkę typu Luer-Lock. W kwestii igły staramy się użyć najcieńszej z możliwych, jednak przy tak gęstej emulsji konieczne jest zastosowanie igły 20G. Ponieważ musimy wykonać wstrzyknięcie bardzo precyzyjnie u podstawy ogona, podajemy szczurom anastezyję na kilka minut i wykorzystujemy fakt, że zwierzęta głęboko śpią, aby je oznakować.

Stosujemy dziurkowanie uszu, a każda szczur jest identyfikowana poprzez specyficzny wzór wykonanych otworów. Jesteśmy teraz gotowi do iniekcji; każdemu szczurowi podamy 200 µL emulsji u podstawy ogona, jednocześnie wykonując oznaczenia na uszach. Przygotowuję emulsję w strzykawce tylko dla jednego zwierzęcia na raz, ponieważ iniekcja jest często bardzo trudna i muszę mocno naciskać, a nie chcę podać szczurowi większej dawki niż jest to wymagane.

W związku z tym napełniam strzykawkę tylko dla jednej jednostki hu na raz. Aby napełnić strzykawkę, łączę plastikową strzykawkę wtryskową z łącznikiem, który z kolei jest połączony ze szklaną strzykawką zawierającą emulsję. Do plastikowej strzykawki wprowadzam około 300 µL emulsji.

Następnie podłączam igłę i wypycham z niej powietrze, aby nie stracić tych 50 µL objętości martwej w igle. Upewniam się, że mam dokładnie 200 µL, a następnie wstrzykuję go u podstawy ogona szczura. Teraz, gdy wstrzyknęliśmy preparat do wszystkich serc, będziemy monitorować zwierzęta codziennie.

Będziemy zatem ważyć zwierzęta każdego ranka i dwa razy dziennie sprawdzać je pod kątem klinicznych objawów EAE. Pierwszymi oznakami, które pokażę państwu w momencie ich wystąpienia, będzie wiotkość ogona; spodziewamy się, że objawy te pojawią się u pierwszych szczurów około siódmego lub ósmego dnia po wstrzyknięciu. Większość szczurów zachoruje między 10. a 12. dniem, a ostatnie osobniki zachorują około 15. do 17. dnia.

Jesteśmy obecnie w 13. dniu po immunizacji serc emulsją z rdzenia kręgowego i teraz będę monitorować te zwierzęta, aby ocenić ich wynik kliniczny. Zanim jednak to zrobię, przedstawię sposób, w jaki utrzymujemy nasze zwierzęta. W przypadku chorób autoimmunologicznych charakterystyczne jest to, że każdy patogen obecny w organizmie zwierzęcia będzie osłabiał odpowiedź autoimmunologiczną.

Aby w maksymalnym stopniu tego uniknąć, utrzymujemy nasze szczury w specyficznych warunkach. Są one przetrzymywane w tej kabinie, w której znajduje się filtrowane powietrze i panuje nadciśnienie, a same zwierzęta są umieszczane w autoklawowanych klatkach. Zatem absolutnie wszystko w klatce jest autoklawowane przed umieszczeniem w niej szczura.

Klatki są wyposażone w filtry na górze. Jako pokarm stosowana jest standardowa karma dla gryzoni firmy I originated.

Szczurom podajemy również zakwaszoną wodę. Do zwykłej wody pitnej dodajemy kwas solny zgodnie ze standardowymi protokołami; używamy zakwaszonej wody, aby ograniczyć florę jelitową do minimum, co zmniejszy ryzyko upośledzenia odpowiedzi autoimmunologicznej. Teraz jestem gotowy do oceny klinicznej szczurów.

Zakres punktowy obejmuje od zera, co oznacza brak objawów klinicznych, do sześciu, co określa stan chorobowy wymagający uśmiercenia zwierząt. Teraz przeprowadzę Państwa krok po kroku, pokazując przykłady każdego stopnia oceny klinicznej, jakie można zaobserwować w tym modelu. Znajdujemy się obecnie w 13. dniu po immunizacji szczurów preparatem UCAE.

A w tej klatce mam dwa szczury, które jeszcze nie zachorowały. Zatem nie wykazują one absolutnie żadnych objawów klinicznych. Obie sztuki są nadal zdrowe.

Biegają w kółko i, jak widać, podczas ruchu unoszą ogon nad ściółkę. Czasami pozwalają, aby ogon wyschł, ale przez większość czasu starają się unosić go nad ściółkę. Jeśli mają taką możliwość, potrafią również wydostać się z klatki, co oznacza, że mają pełną kontrolę nad wszystkimi czterema kończynami i potrafią stanąć, jeśli jest to konieczne.

Zatem pierwszym objawem klinicznym EA jest wiotki ogon. Jeśli wezmę szczura i nacisnę palcem na ogon, szczur będzie miał tendencję do chwytania końcówką ogona. Jak właśnie Państwo widzieli, ten szczur nie ma wiotkiego ogona i mogę to samo sprawdzić u drugiego osobnika.

Ogon chwyta palec, co oznacza, że szczury te mają w pełni reaktywny ogon. Mają wynik kliniczny zero, co w rzeczywistości oznacza całkowity brak objawów. Tutaj znajduje się szczur, który ma wynik kliniczny 0,5.

Zatem jeśli obserwuje się go w klatce, zachowuje się on całkowicie normalnie – biega i wspina się po ściankach klatki, ale końcówka ogona nigdy nie odrywa się od ściółki. Oznacza to, że szczur ten może mieć częściowy niedowład ogona. W związku z tym chwytam szczura i wykonuję ten sam test; mimo że ogon wykazuje pewien napięcie, jego koniec nie zwija się całkowicie wokół mojego palca.

Zatem ocenię tego szczura na 1,5, co oznacza częściowy wiotkość ogona. Wynik kliniczny 1 charakteryzuje się całkowitą wiotkością ogona, zatem żadna część ogona nie wykazuje napięcia, ale szczur wciąż może używać kończyn tylnych. Jak widać, ten szczur opiera się o ściankę klatki, co wskazuje na prawidłowe funkcjonowanie tylnych kończyn.

Jeśli jednak sprawdzę ogon tych szczurów, podnosząc je, okaże się, że w ogonie nie ma absolutnie żadnego napięcia. Innym testem, który można przeprowadzić, gdy szczur znajduje się na dnie klatki, jest uniesienie ogona: u normalnego szczura ogon będzie opadać powoli lub w przypadku szczura z wynikiem jeden może nawet nie dotknąć podłoża. Jeśli jednak uniesiesz ogon zwierzęcia z ubytkami, opadnie on natychmiast na ziemię.

Ta jednostka badawcza może poruszać wszystkimi czterema kończynami, ale kończyny tylne są zbyt słabe, aby pozwolić jej na stanie. Dlatego przypiszę tej jednostce badawczej wynik kliniczny dwa. Główną różnicą między wynikiem jeden a dwa jest to, że wynik jeden oznacza jedynie wiotki ogon.

Tylne kończyny są w pełni sprawne, a przy wyniku trzech szczur upadałby na bok. Wynik dwa jest stanem pośrednim, w którym szczur może posługiwać się tylnymi kończynami, lecz są one znacznie słabsze niż u zdrowego szczura. Zatem ten szczur wykazuje nietypową cechę EAE.

Zazwyczaj EAE charakteryzuje się wznoszącym wiotkim porażeniem, jednak w niektórych, dość rzadkich przypadkach, tak jak w tym, u szczurów najpierw rozwija się niedowład kończyn przednich, a dopiero później kończyn tylnych. Tak właśnie jest w przypadku tego szczura. Patrząc na niego, widać, że głowa znajduje się niżej niż reszta ciała, ponieważ zwierzę ma trudności z poruszaniem kończynami przednimi i nie może wspiąć się na ściankę klatki.

I choć jego kończyny tylne funkcjonują prawidłowo, nie jest on w stanie odepchnąć się kończynami przednimi. W związku z tym oceniłbym tego szczura na dwa punkty, co odpowiada łagodnej paraparezie, choć zazwyczaj obserwujemy to w obrębie kończyn tylnych w tej RU, tutaj natomiast widzimy to w czterech kończynach. Zatem ta RU wykazuje znacznie cięższy fenotyp niż poprzednie.

Wynik kliniczny wynosi trzy. Jak mogę Państwu pokazać, przednie kończyny funkcjonują całkowicie prawidłowo, natomiast obie tylne kończyny wykazują umiarkowaną parezę. Obie tylne kończyny są wykorzystywane przez zwierzę do poruszania się, jednak zwierzę przewraca się na bok i nie potrafi w pełni kontrolować tych kończyn.

Zarodniki te stają się znacznie słabsze, niż byłyby normalnie bez EE. Na tym etapie nie martwimy się już wiotkością ogona, ponieważ wiele z tych szczurów po pewnym czasie zaczyna mieć bardzo sztywny ogon. Ten osobnik nadal ma bardzo wiotki ogon, ale czasami można zauważyć dystonię. Wówczas ogon zaczyna poruszać się w sposób nieskoordynowany.

Na tym etapie nie oceniamy już ogona, a jedynie funkcjonowanie kończyn. Przyznajemy tutaj wynik 3,5, ponieważ jeśli przyjrzymy się kończynom tylnym, jedna się porusza, ale druga jest całkowicie sparaliżowana i w ogóle nie pomaga w przemieszczaniu się szczura do przodu. Jest to zatem uznawane za całkowity paraliż jednej kończyny tylnej, co skutkuje wynikiem 3,5.

Ta jednostka eksperymentalna ma wynik kliniczny wynoszący cztery, co oznacza całkowity niedowład kończyn tylnych, charakteryzujący się pełną niezdolnością do poruszania tylnymi nogami. Szczur w tej klatce ma wynik kliniczny wynoszący pięć, co odpowiada całkowitemu niedowładowi kończyn tylnych z dodatkowym nietrzymaniem moczu. Zwierzę to jest nietrzymujące, co widać po całkowitym zwilżeniu tego obszaru, czego nie obserwujemy u pozostałych zwierząt, które nie wykazują nietrzymania.

W przypadku, gdy nasze HUS uzyskają wynik trzech lub więcej, dostarczamy im butelki z wodą z długimi rurkami do picia, aby upewnić się, że mają do niej dostęp. Dodatkowo umieszczamy pokarm na dnie klatki oraz podajemy im żele nawadniające. Mimo tych wszystkich działań, podczas każdego monitorowania szczurów, które odbywa się dwa razy dziennie, zawsze oferujemy im wodę na wypadek, gdyby w ciągu dnia nie wypili wystarczającej ilości.

Mam tutaj szczura z wynikiem klinicznym równym czterem. Na tym etapie zwierzęta te wymagają pewnej zachęty do jedzenia. Dlatego namaczam ich pokarm, co znacznie ułatwia im żucie.

W ciągu ostatnich dwóch tygodni pokazałem Państwu, jak indukować i monitorować przewlekłe nawracające EAE u szczurów DA. W pierwszym kroku przedstawiłem sposób przygotowania immersji rdzenia kręgowego, a następnie sposób jej wstrzykiwania u podstawy ogona tych szczurów. Dzisiaj natomiast pokazałem, jak oceniać stopień zaawansowania choroby u tych szczurów na różnych poziomach.

Oczywiście jest to chroniczny model nawracający, więc spodziewamy się, że wyniki u szczurów będą fluktuować. Choroba wejdzie w fazę remisji w ciągu kilku dni, a następnie z czasem powróci. Niektóre szczury wejdą w bardziej chroniczną fazę choroby.

Będzie to zależeć od konkretnego zwierzęcia. Zanim jednak zakończymy ten film, chcę podkreślić jedną kwestię dotyczącą testowania leków w tych modelach. Bardzo istotnym punktem jest jak najlepsza randomizacja zwierząt.

Bardzo istotną kwestią jest to, że im wcześniej zwierzę zachoruje, tym cięższy jest przebieg choroby. W związku z tym nie należy grupować wszystkich zwierząt kontrolnych pierwszego dnia, a zwierząt leczonych w ciągu kolejnych kilku dni. Postępujemy w następujący sposób: gdy tylko zwierzę zachoruje w dniu, w którym chcemy rozpocząć leczenie, przydzielamy je losowo do jednej z dwóch różnych grup.

Jeśli mamy, na przykład, jedną grupę kontrolną i jedną grupę badaną, pierwsze serce trafi do grupy kontrolnej, drugie do grupy badanej i tak dalej, aż wszystkie zwierzęta zostaną przydzielone do odpowiednich grup. Dbamy jednak o to, aby ta randomizacja odbyła się tak wcześnie, jak to możliwe w protokole. Mam nadzieję, że ten film był dla Państwa pomocny i że będą Państwo w stanie indukować oraz monitorować przewlekłe nawracające EAE u szczurów linii D.

Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.