Indukcja i ocena kliniczna przewlekłego nawrotowego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Nazywam się Christine Beaton. Jestem asystentem naukowym w laboratorium George'a Chena na Wydziale Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. W ciągu najbliższych kilku dni pokażę wam, jak indukować i monitorować przewlekłe nawrotowe EAE, co oznacza eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia u szczurów z DA.

To jest zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, a raczej powinienem powiedzieć, jeden ze zwierzęcych modeli stwardnienia rozsianego. Charakteryzuje się rosnącym paraliżem wiotkim u tych zwierząt i cechami histologicznymi, które przypominają chorobę ludzką. Zajmie to więc kilka dni.

Tak więc pierwszego dnia pokażę Wam jak przygotować emulsję genową z naiwnym czerwonym homogenatem rdzenia kręgowego w kompletnym adiuwantie trans. Drugiego dnia pokażę wam, jak uodpornić szczury na UCAE, a następnie będziemy czekać od siedmiu do 15 dni, aby zobaczyć pierwsze objawy kliniczne u tych zwierząt, w którym to momencie pokażę wam różne etapy progresji EAE u różnych zwierząt. Więc najpierw pokażę Ci wszystkie odczynniki i materiały, które są potrzebne do przygotowania emulsji.

Więc to, czego używam, to kompletny przedni adiuwant H 37 ra, ale ten, mimo że ma już gruźlicę mikrobową, zamierzam go uzupełnić do czterech miligramów na M z bardziej wysuszonymi prątkami gruźlicy IH 37 ra. Aby przygotować tę wysuszoną bakterię, muszę włożyć ją do większej ilości smoły i zrobić z niej cienki proszek za pomocą Pele. Gdy to zrobisz, dodam te bakterie do adiuwanta.

Następnie adiuwant jest gotowy. Następnym krokiem jest przygotowanie mojego antygenu. Więc zamierzam wyjąć rdzenie kręgowe szczura D, które są zamrożone w temperaturze minus 80, i aby utrzymać je naprawdę zamrożone, położę je na szalce do ważenia w suchym lodzie, i zamierzam wyjąć je jeden po drugim i używając prostych żyletek, zamierzam zmielić rdzenie kręgowe na naczynia do ważenia.

Zamierzam wtedy nałożyć mój suplementowany adiuwant na wir. A podczas wirowania, zamierzam stopniowo dodawać rdzeń kręgowy do mojego adiuwanta po tym, jak wymieszamy cały rdzeń kręgowy z adiuwantem na wirze. Będziemy wirować przez kolejne pięć minut, a następnie przeniesiemy przygotowane zanurzenie do pięciu szklanych strzykawek M.

Zamierzamy połączyć dwie szklane strzykawki o średnicy pięciu M za pomocą mostka 16 G i zamierzamy przepchnąć emulsję z jednej strzykawki do drugiej tak szybko, jak to możliwe dla tego mostka. A po kilku minutach, gdy emulsja zacznie twardnieć, przejdziemy na mniejszy mostek. To jest 18 G, a to sprawi, że emulsja będzie jeszcze twardsza i będziemy ją trzymać w tych strzykawkach z tym mostkiem owiniętym w folię aluminiową przez noc w lodówce.

Zważyłem więc na papierze 30 miligramów gruźlicy drobnoustrojów. Przeniosłem je do morara. Używając Pelego, zredukowałem agregaty bakterii do cienkiego proszku.

Ale nie chcesz naciskać tłuczkiem zbyt mocno, aby nie złamać bakterii. Kiedy bakterie gromadzą się na początku zabiegu, są żółto-beżowe. Jeśli zrobiłeś cienki, cienki proszek, w końcu będziesz miał biały proszek i tego właśnie chcesz, ale nie chcesz naciskać zbyt mocno, aby rozbić bakterie.

Kiedy już to zrobiłem, wziąłem 10 mil ampera kompletnego adiuwantu trans i upewniłem się, że wszystkie bakterie są w zawiesinie. Rozbiłem tę próbkę i wlałem całe 10 mil kompletnego adiuwantu trans do morty na wierzchu zdezagregowanych prątków gruźlicy. A teraz zamierzam przenieść uzupełniony kompletny adiuwant trans do rurki o długości 50 mil.

Więc teraz biorę mój suplementowany kompletny adiuwant trans i wkładam go do tubki. Oczywiście, bakterie znajdują się na dnie płynu i postaram się usunąć większość z nich do tuby. Ale jeśli zostawię trochę w moździerzu, nie będzie to tak dużym problemem, ponieważ zamierzam ponownie użyć tej zaprawy bez czyszczenia, aby przygotować emulsję rdzenia kręgowego.

A oto rdzeń kręgowy. Utrzymywano je w stanie zamrożonym na poziomie minus 80. Zważyłem ich 10 gramów, aby dodać do 10 ml mojego suplementowanego adiuwantu.

Więc co zamierzam zrobić z tymi rdzeniami kręgowymi, trzymając je zamrożone tak długo, jak to możliwe, zamierzam je bardzo drobno zmielić w tych naczyniach do ważenia za pomocą żyletek. Tak więc, aby bardzo drobno zmielić te rdzenie kręgowe, potrzebujesz dwóch żyletek i naczynia do ważenia. Więc to, co robię, to biorę jeden rdzeń kręgowy, wkładam go do naczynia do ważenia i zaczynam go kroić, i kładę rękę tak, że skoro jest zamrożony, jego serce, zacznie skakać, a ja złapię pierwsze duże kawałki i zacznie się bardzo szybko rozmrażać i przyklejać do boku mojej żyletki.

Używam więc drugiej żyletki, aby go zdjąć i staram się go zmielić tak drobno, jak to możliwe i tak szybko, jak to możliwe, aby nie miał czasu się stopić, ponieważ znacznie trudniej jest go przeciąć, gdy się rozpuści. Dlatego niezwykle ważne jest, aby rdzeń kręgowy został całkowicie zmielony, bardzo drobno, ponieważ im drobno drobny, im najdrobniejszy, tym bardziej jednorodne będzie zanurzenie, a tym więcej szczurów zachoruje i będzie miało bardziej jednorodną chorobę. Dlatego niezwykle ważne jest, aby bardzo, bardzo dobrze zmielić wszystkie te rdzenie kręgowe.

Więc teraz zamierzam dalej mielić każdy z tych rdzeni kręgowych dokładnie w ten sam sposób, dopóki nie skończę z całymi 10 gramami rdzenia kręgowego. Więc teraz zamierzam trochę wymieszać rdzeń kręgowy w morcie, aby upewnić się, że zebrałem wszystkie prątki gruźlicy, które pozostały w morcie po zakończeniu suplementacji adiuwantem. A to, co zamierzam teraz zrobić, to nałożyć adiuwant na wir.

I wirując nieprzerwanie, tak szybko, jak to możliwe, zamierzam stopniowo dodawać mój średni rdzeń kręgowy do tego adiuwanta. Więc teraz mam mój uzupełniony adiuwant na wirze i zamierzam zacząć dodawać, dodawać mój sznurek do panelu środków krok po kroku. Powodem, dla którego bardzo powoli dodaję antygen A do adiuwanta, jest to, że robimy emulsję wody w oleju.

Tak więc adiuwant to głównie olej mineralny, a antygen jest równym roztworem. Więc to, co chcemy zrobić, to bardzo powoli mieszać antygen z olejem, tak aby olej całkowicie pokrył antygen za każdym razem, gdy go dodajemy. Więc gdybyśmy dodali go za jednym razem, nie pokryłby całkowicie antygenu.

Więc teraz dodałem cały rdzeń kręgowy do adiuwanta na wirze i przykleiłem rurkę do wiru, aby pozwolić mu wirować przez kolejne pięć minut, aby upewnić się, że wszystko zostanie całkowicie wymieszane. I dostosowuję prędkość tak, aby mieć jak najwyższy wierzchołek, nie tracąc zbyt wiele w późnej części rury. Tak więc teraz minęło kolejne pięć minut, a ja zamierzam zatrzymać wir i przelać mojego kupca do szklanych strzykawek.

Zmontowałem więc pełną strzykawkę. Przymocowałem go do mostka o większej średnicy, a do drugiej strony mostka przymocowałem tylko cylinder jednej strzykawki, a teraz zamierzam dodać emulsję do tej strzykawki. A więc teraz nie.

Teraz wezmę cały płyn do dolnej strzykawki, odłączę górną, dokończę montaż górnej, upewnię się, że w dolnej strzykawce lub w mostku nie ma pęcherzyków powietrza. A teraz zamierzam ponownie się dołączyć. Więc teraz mam obie strzykawki połączone ze sobą przez ten mostek.

Jedna jest pełna zanurzenia, druga jest pusta. A to, co zamierzam teraz zrobić, to przepchnąć tak szybko, jak to możliwe, licznik jednej strzykawki do drugiej w przód i w tył. Więc teraz zamierzam zmienić mostek o dużej średnicy na mniejszy na mostek 18 G.

Mniejszy mostek sprawi, że emulsja będzie jeszcze gęstsza. Tak więc, aby zmienić mostki, umieściłem całą emulsję w jednej strzykawce. Wyjmuję pustą strzykawkę, upewniam się, że nic nie zgubiłem w mostku, zdejmuję mostek, zakładam nowy, goń wszystkie pęcherzyki powietrza i ponownie podłączam drugą strzykawkę.

I powtarzam procedurę, że teraz emulsja jest znacznie trudniejsza do przejścia i uważam, aby nie zerwać tego mostu, który jest bardzo delikatny. I powtarzam tę procedurę z innym zestawem strzykawek, o ile mam emulsję w probówce. Używam więc tylu strzykawek, ile potrzeba, aby zużyć całą emulsję.

Więc teraz mieszałem emulsję kilka razy, może 10, 15 razy, ale to się różni w zależności od tych partii. A teraz staje się to niezwykle trudne do przejścia. I zrobię to jeszcze kilka razy, no cóż, a może nie.

Naprawdę teraz utknął, więc zamierzam to tam zostawić. W przeciwnym razie istnieje ryzyko złamania strzykawki lub mostka. Więc kiedy przestaje przechodzić, jeśli dzieje się to bardzo wcześnie, oznacza to, że most może być zatkany.

Ale w tym momencie, skoro wymieszałem go co najmniej 10 lub 15 razy, oznacza to, że emulsja jest gotowa. Jest bardzo gruby, więc powinienem go zostawić w spokoju. Teraz zawinę go w folię aluminiową i włożę na noc do lodówki.

Tak więc wczoraj przygotowaliśmy emulsję z czerwonymi rdzeniami kręgowymi i zostawiliśmy emulsję na noc w lodówce. Dzisiaj wyjmujemy go i zamierzamy wstrzyknąć mu 200 mikrolitrów na szczura u podstawy ogona. Ale zanim go wstrzykniemy, musimy upewnić się, że emulsja jest dobra.

Więc nadal powinien być solidny, i nadal jest to ładny solidny. Pęknięcie, które tu widzicie, mówi nam nawet, że jest to ładne ciało stałe, nie jest podzielone na fazy, na dwie fazy, co byłoby złe. Więc ta emulsja jest dobra do użycia.

Tak więc każda klatka otrzyma 200 mikrolitrów naszej emulsji. I aby go wstrzyknąć, używamy trzech strzykawek mil, ale upewniamy się, że używamy strzykawek z końcówką lu lock, ponieważ jeśli używamy poślizgniętych, jego strzykawek. Emulsja jest tak gęsta, że igła może wyskoczyć, gdy próbujemy wstrzyknąć.

Dlatego zawsze używaj strzykawki typu lu lock. A jako igłę staramy się iść z najmniejszą możliwą igłą, ale z tak gęstą emulsją musimy iść z igłą o rozmiarze 20. Ponieważ musimy wstrzykiwać bardzo precyzyjnie u podstawy ogona, anżujemy szczury przez kilka minut i korzystamy z okazji, że te szczury mocno śpią, aby je oznaczyć i oznaczyć.

Używamy dziurkaczy w uszy, a każdy szczur jest identyfikowany na podstawie określonego wzoru uderzania. Teraz jesteśmy gotowi do wstrzyknięcia szczurom i zamierzamy podać każdemu szczurowi 200 mikrolitrów emulsji u podstawy ogona, a jednocześnie oznaczymy uszy. Przygotowuję emulsję w strzykawce do wstrzykiwań tylko dla jednego szczura na raz, ponieważ często jest to naprawdę trudne do wstrzyknięcia, a ja naciskam naprawdę mocno, a nie chcę wstrzykiwać szczurowi więcej, niż potrzebuje.

Więc napełniam strzykawkę tylko na jeden hu na raz. Aby napełnić strzykawkę, podłączam plastikową strzykawkę do wstrzykiwania do mostka, który jest połączony ze szklaną strzykawką zawierającą emulsję. Do plastikowej strzykawki włożyłem około 300 mikrolitrów emulsji.

Następnie podłączam igłę i wyciskam powietrze z igły, aby nie stracić tych 50 mikrolitrów straconego miejsca w igle. I upewniam się, że mam tylko 200 mikrolitrów, a następnie wstrzykuję go u podstawy ogona szczura. Więc teraz, kiedy wstrzyknęliśmy wszystkie nasze serca, będziemy je codziennie monitorować.

Będziemy więc ważyć je każdego ranka i sprawdzać dwa razy dziennie pod kątem klinicznych objawów EAE. Pierwszymi objawami, jak wam pokażę, gdy się pojawią, będzie zwiotczały ogon i spodziewamy się, że te oznaki pojawią się u pierwszych szczurów około siódmego dnia, ósmego dnia po wstrzyknięciu. Większość szczurów zachoruje około 10 do 12 dnia, a najnowsze szczury zachorują około 15 do 17 dnia.

Jesteśmy teraz w 13 dniu po tym, jak uodporniliśmy nasze serca emulsją rdzenia kręgowego, a teraz zamierzam monitorować te zwierzęta, aby sprawdzić ich wynik kliniczny. Ale zanim to zrobię, pozwólcie, że przedstawię Wam sposób, w jaki trzymamy nasze zwierzęta. Tak więc choroby autoimmunologiczne są tą cechą, że każdy patogen obecny u zwierzęcia zmniejszy odpowiedź autoimmunologiczną.

Aby tego maksymalnie uniknąć, trzymamy nasze szczury w określonych warunkach. W tym boksie, który zawiera przefiltrowane powietrze i jest pod nadciśnieniem, zwierzęta są trzymane w autoklawowanych klatkach. Tak więc absolutnie wszystko w klatce jest autoklawowane, zanim założymy siatkę na szczury.

I mają filtry na górze klatek. Pokarm to standardowa karma dla gryzoni. To ja pochodzełem.

Podajemy też naszym szczurom zakwaszoną wodę. Bierzemy zwykłą wodę pitną i dodajemy kwas solny zgodnie ze standardowymi protokołami, a także używamy zakwaszonych wód, aby utrzymać florę jelitową do minimum, co zmniejszy ryzyko upośledzenia naszej odpowiedzi autoimmunologicznej. Więc teraz jestem gotowy do przeprowadzenia oceny klinicznej moich szczurów.

Punktacja waha się od zera, co oznacza brak objawów klinicznych, do sześciu, co jest stanem chorobliwym, w którym to przypadku należy złożyć zwierzęta w ofierze. A teraz poprowadzę was krok po kroku, pokazując przykłady każdego wyniku klinicznego, który możemy znaleźć w tym modelu. Tak więc jesteśmy teraz w 13 dniu po uodpornieniu szczurów na UCAE.

A w tej klatce mam dwa szczury, które jeszcze nie zachorowały. Nie mają więc absolutnie żadnych klinicznych objawów yay. Tak więc oba szczury są nadal zdrowe.

Biegają, biegają dookoła i jak widać, kiedy się ruszają, unoszą ogon z pościeli. Czasami więc pozwalają ogonowi wyschnąć, ale przez większość czasu próbują podnieść go z pościeli. A jeśli będą miały szansę, wyjdą również z klatki, co oznacza, że mają pełną kontrolę nad wszystkimi czterema kończynami i mogą wstać, jeśli zajdzie taka potrzeba.

Tak więc pierwszym klinicznym objawem EA jest bezwładny ogon. Więc jeśli podniosę szczura i przyciśnię palec do ogona, szczur będzie miał tendencję do chwytania czubkiem ogona. Tak jak właśnie zauważyłeś, ten szczur nie ma ogona i mogę to zrobić z drugim.

Ogon chwyta palec, co oznacza, że te szczury mają pełny reaktywny ogon. Mają wynik kliniczny równy zero, co w rzeczywistości oznacza, że w ogóle nie ma a, e. Oto szczur, który ma wynik kliniczny O 0,5.

Więc jeśli tylko spojrzysz na niego w klatce, zachowuje się absolutnie, normalnie biega dookoła, wspina się z boku klatki, ale czubek ogona nigdy nie odrywa się od ściółki. Więc ten szczur może mieć częściowy ogon kończyny. Więc to, co robię, to chwytam szczura i wykonuję ten sam test, i chociaż ogon ma pewien ton, koniec nie zwija się całkowicie na moim palcu.

Więc ocenię tego szczura z wynikiem 1,5, co jest częściowym li-ogonem. Tak więc wynik kliniczny jednego charakteryzuje się kompletnym ogonem z klapą, więc żadna część ogona nie ma żadnego odcienia, ale czerwony nadal może używać swoich tylnych linii. Jak więc widać, ten szczur stoi z boku klatki, co pokazuje, że jego tylne nogi funkcjonują normalnie.

Ale jeśli sprawdzę ogon tych szczurów, podnosząc je, nie ma absolutnie żadnego tonu w ich ogonie. Innym testem, który możesz wykonać, jest to, że gdy RU znajduje się na dnie klatki, jeśli podniesiesz ogon za pomocą normalnego ru, ogon będzie powoli opadał, a może nawet nie dosięgnie ziemi z RU z wynikiem jeden. Jeśli podniesiesz ogon, natychmiast spadnie na ziemię.

Ten RU może poruszać wszystkimi czterema kończynami, ale tylne kończyny są zbyt słabe, aby umożliwić mu wstanie. Więc sklasyfikuję to RU z wynikiem klinicznym wynoszącym dwa. Tak więc główna różnica między wynikiem jeden a drugim polega na tym, że wynik jednego to tylko bezwładny ogon.

Tylne nogi są w pełni sprawne, a przy wyniku trzech szczur przewróciłby się na bok. Dwa jest pośrednie, więc szczur może go używać z powrotem, tylnych nóg, ale są one znacznie słabsze niż u normalnego szczura. Tak więc ten szczur ma niezwykłą cechę EAE.

Zwykle EAE charakteryzuje się rosnącym paraliżem zwiotlonym, ale w niektórych przypadkach, które są dość rzadkie, jak ten, szczury rozwijają pierwszy paraliż kończyny przedniej, zanim kończyna tylna zostanie sparaliżowana. I tak jest w przypadku tego szczura. Więc jeśli na niego spojrzysz, jego głowa jest niżej niż reszta ciała, ponieważ prawa strona ma trudności z przednimi kończynami i nie może wspiąć się na bok klatki.

I chociaż jego tylne kończyny pracują normalnie, nie może pchać przednimi kończynami. Tak więc nadal oceniłbym tego szczura z wynikiem dwóch, co odpowiadałoby łagodnym paras, chociaż zwykle widzimy, że z tylnymi kończynami w tym ru widzimy to z czterema kończynami. Tak więc ten RU ma znacznie poważniejszy fenotyp niż poprzednie.

Ma wynik kliniczny wynoszący trzy. Tak więc, jak wam pokażę, przednie kończyny funkcjonują absolutnie normalnie, ale dwie tylne kończyny mają obecny umiarkowany parais. Tak więc obie kończyny są używane przez RU do poruszania się, ale RU upada na bok i nie może całkowicie kontrolować tych nóg.

Te zarodniki stają się znacznie słabsze niż normalnie byłyby bez EE. I na tym etapie nie martwimy się już o wiotkienie ogona, ponieważ wiele z tych szczurów po pewnym czasie zaczyna mieć bardzo żylasty ogon. Więc ten nadal ma bardzo wiotki ogon, ale czasami można zauważyć pewną dystonię. Tak więc ogon zaczyna poruszać się w nieskoordynowany sposób.

Nie patrzymy już na ogon na tym poziomie, patrzymy tylko na to, jak funkcjonują kończyny. Oceniamy to na 3,5 punktu, ponieważ jeśli spojrzymy na jego tylne kończyny, jedna się porusza, ale druga jest całkowicie sparaliżowana i w ogóle nie pomaga w ruchu do przodu ru. Jest to więc uważane za całkowity paraliż jednej linii tylnej, a zatem wynik 3,5.

Ten RU ma wynik kliniczny cztery, co oznacza całkowity paraliż linii tylnej, a to charakteryzuje się całkowitą niezdolnością do poruszania tylnymi nogami. Szczur, którego mamy w tej klatce, ma wynik kliniczny wynoszący pięć, co odpowiada całkowitemu paraliżowi linii tylnej z dodatkowym nietrzymaniem moczu. To zwierzę jest nietrzymające moczu, jak widzimy, jego całkowita waga w tym obszarze, czego nie widzimy u innych zwierząt, które nie są na kontynencie.

Kiedy nasz HUS ma trzy lub więcej punktów, dajemy im butelki z wodą z długimi rurkami, aby upewnić się, że mają dostęp do wody. Kładziemy też jedzenie na dnie klatki, a także dajemy im okłady żelowe. Ale mimo to za każdym razem, gdy wyprowadzamy szczury, aby je monitorować, czyli dwa razy dziennie, zawsze podajemy im wodę na wypadek, gdyby nie miały dostępu do wystarczającej ilości wody w ciągu dnia.

Tutaj mam szczura z wynikiem klinicznym czterech. Na tym etapie zwierzęta te trzeba trochę zachęcić do jedzenia. Więc to, co robię, to moczę ich jedzenie, co znacznie ułatwia im żucie.

Tak więc w ciągu ostatnich dwóch tygodni pokazałem wam, jak indukować i monitorować przewlekłe nawroty EAE u szczurów DA. W pierwszym kroku pokazałem wam, jak przygotować się do zanurzenia w rdzeniu kręgowym, a następnie jak wstrzyknąć je u podstawy ogona tych szczurów. A dzisiaj pokazałem wam, jak ocenić te szczury z różnymi poziomami choroby.

Oczywiście jest to model chronicznego nawrotu, więc spodziewamy się, że szczury będą miały zmienne wyniki. Choroba przejdzie w remisję w ciągu kilku dni i z czasem będzie nawracać. Niektóre szczury wejdą w bardziej przewlekłą fazę choroby.

Będzie się to różnić w zależności od zwierzęcia. Teraz, zanim zakończymy ten film, chcę podkreślić jedną rzecz dotyczącą testowania leków w tych modelach. Bardzo ważną kwestią jest jak najlepsze losowanie zwierząt.

Jedną bardzo ważną rzeczą, o której należy wiedzieć, jest to, że najwcześniej zwierzę zachoruje, tym cięższa jest jego choroba. Nie chcesz więc grupować wszystkich swoich zwierząt kontrolnych w pierwszym dniu, a w ciągu następnych kilku dni jesteś leczony jako zwierzęta. To, co robimy, polega na tym, że gdy tylko zwierzę zachoruje i w dniu, w którym chcemy rozpocząć leczenie, umieszczamy zwierzęta losowo w dwóch różnych grupach.

Jeśli, na przykład, mamy jedną grupę kontrolną i jedną leczoną, to pierwsze serce trafi do grupy kontrolnej, drugie do grupy leczonej i tak dalej, aż wszystkie zwierzęta zostaną umieszczone w swojej własnej grupie. Dbamy jednak o to, aby ta randomizacja nastąpiła tak wcześnie, jak to możliwe w protokole. Mam więc nadzieję, że ten film był dla Ciebie pomocny i że będziesz w stanie wywołać i monitorować przewlekłe nawroty EAE u szczurów D.

I powodzenia w eksperymentach.