Wielkoskalowe badania z wykorzystaniem rybek zebrafish In vivo Przesiewanie małych cząsteczek

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest odkrycie małych cząsteczek, które specyficznie modulują kluczowe aspekty rozwoju i fizjologii embrionalnej. Osiąga się to poprzez umieszczenie dużej liczby zapłodnionych jaj w płytkach 96-dołkowych, a w drugim kroku przeprowadzenie przesiewu. Do płytek 96-dołkowych z zarodkami dodaje się alikwoty biblioteki małych cząsteczek.

Płytki wielodołkowe są badane pod kątem fenotypów wywołanych przez małe cząsteczki. Uzyskane wyniki wskazują, które małe cząsteczki specyficznie wpływają na rozwój lub fizjologię super fish. Witam, nazywam się Charles Hong i reprezentuję Vanderbilt University School of Medicine.

W naszym laboratorium przeprowadzamy wysokoprzepustowe przesiewy chemiczne z wykorzystaniem embrionów zebrafish. Jest to stosunkowo prosta technika, którą można szeroko adaptować w celu odkrywania nowych związków biologicznie czynnych. Popołudniem w dniu poprzedzającym przesiew chemiczny przygotuj od 10 do 20 zbiorników hodowlanych dla zebrafish.

W każdym zbiorniku należy umieścić przegrodę, a następnie napełnić je wodą z systemu akwakultury i za pomocą siatki transportowej przenieść jednego dorosłego samca oraz jedną do dwóch dorosłych samic do wewnętrznego pojemnika. W dniu hodowli, rano, należy odpowiednio oznakować zbiorniki hodowlane i przykryć je pokrywami. Następnie należy usunąć przegrody ze zbiorników, aby umożliwić danio pręgowanym rozród.

W ciągu następnej godziny należy pozwolić zapłodnionym ikrom przesiąknąć przez siatkę znajdującą się na dnie każdego wewnętrznego pojemnika. Po godzinie dorosłe ryby zebry należy przenieść z powrotem do zbiorników stałego przechowywania.

Usuń wewnętrzny pojemnik i zbierz jaja, przecedzając wodę z każdego zbiornika hodowlanego przez plastikowe sitko do herbaty. Odwróć sitko nad szalką Petriego i delikatnie je wypłucz, aby przenieść jaja do szalki. Używając butelki z myjką zawierającej pożywkę E three, należy usunąć wszystkie niezapłodnione jaja, które są nieprzezroczyste.

Używając jednorazowej pipety plastikowej, każde krzyżowanie powinno dać około 200 embrionów. Następnie, za pomocą szklanej pipety Pasteura, przenieść około pięciu embrionów w medium E3 do każdej studni płytki 96-dołkowej. Po rozmieszczeniu embrionów na płytce 96-dołkowej.

Za pomocą pipety 12-kanałowej usuń z dołków jak największą ilość pożywki E3, uważając, aby nie uszkodzić embrionów. Następnie za pomocą pipety 12-kanałowej nanieś 250 µL pożywki E3.

Do każdej studzienki należy jak najszybciej dodać pożywkę zawierającą 0,5 µg/mL kanamycyny, aby zapobiec wysychaniu embrionów. Płytki 96-dołkowe należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C aż do osiągnięcia pożądanego stadium, w którym mają zostać dodane związki. W niniejszym protokole poszukujemy związków zaburzających wczesne wzorowanie embrionalne i będziemy inkubować embriony przez trzy godziny lub do momentu, w którym ponad 90% embrionów osiągnie stadium 1000 komórek, co jest typowym sposobem dostarczania bibliotek małych cząsteczek.

W 96-dołkowej płytce źródłowej, w której każdy związek jest przechowywany w DMSO jako roztwór stokowy o stężeniu 10 mM, około 60 minut przed osiągnięciem przez embriony pożądanego stadium, rozmroź odpowiednią liczbę płytek 96-dołkowych zawierających alikwoty małych cząsteczek. Zanotuj numery seryjne lub inne numery identyfikacyjne płytek źródłowych, aby zminimalizować kondensację na płytkach. Umieść je w komorze osuszającej z osuszaczem.

Krótko odwiruj płytki w wirówce stołowej wyposażonej w adapter do płytek wielodołkowych. Usuń aluminiową folię z płytki źródłowej; używając pipety 12-kanałowej, rozcieńcz związki w płytce źródłowej do pożądanego stężenia za pomocą DMSO. W niniejszym protokole stosujemy stężenie końcowe 0.5 millimolar i dodajemy 4.75 microliters DMSO w celu rozcieńczenia płytki ze stokiem 10 millimolar.

Gdy embriony w płytce 96-dołkowej osiągną pożądany stopień rozwoju, należy użyć pipety 12-kanałowej, aby przenieść 2,5 µL związków z płytek źródłowych do płytek odbiorczych zawierających embriony. Płytki zawierające embriony i związki należy przykryć pokrywkami, a na płytkach z embrionami zapisać numery identyfikacyjne płytek źródłowych. Płytki należy wymieszać, delikatnie nimi potrząsając, a następnie umieścić w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.

Każdą płytkę źródłową zawierającą niewykorzystane małe cząsteczki należy przykryć folią aluminiową, zakleić taśmą i umieścić w zamrażarce w temperaturze -80 °C do długoterminowego przechowywania. Przed przeprowadzeniem przesiewu wizualnego należy sformułować konkretne kryterium trafienia. Na przykład, w przesiewie inhibitorów małych cząsteczek dla rozwoju przedmózgowia, trafieniem może być związek, który powoduje utratę przedmózgowia.

Brak oczu jest łatwym wskaźnikiem wizualnym utraty przedmózgowia i nie wymaga zastosowania fluorescencji do analizy w wybranych momentach rozwoju. Wyjmij z inkubatora płytki 96-dołkowe zawierające embriony traktowane związkami i obejrzyj każdy dołek pod mikroskopem stereoskopowym. Podczas przesiewania w poszukiwaniu małocząsteczkowych inhibitorów rozwoju przedmózgowia, analizuj płytki po 28 godzinach w celu stwierdzenia zaniku oka jako markera zahamowania rozwoju przedmózgowia. Odnotuj identyfikator płytki oraz położenie dołka w każdym przypadku, gdy co najmniej trzy z pięciu embrionów wykazują określony fenotyp. Umieść płytkę 96-dołkową z powrotem w inkubatorze.

Ponownie potwierdź utratę oczu i przedniego mózgowia po 48 godzinach. Mimo że zarodki nie będą posiadać przedniego mózgowia, przeżyją co najmniej cztery dni. Potwierdź potencjalny wynik pozytywny poprzez ponowne przetestowanie efektów związku w kilku dawkach; dla każdej dawki testuje się 10 zarodków w 0,5 milliliters medium E3 w formacie płytki 48-dołkowej.

Moment przygotowania związku do ponownego testowania powinien być identyczny z momentem pierwotnego przesiewu. HIIT zostaje potwierdzony, gdy wywołany fenotyp zostanie odtworzony w sposób zależny od dawki podczas ponownego testowania związku. Na koniec należy zidentyfikować związek hi w bazie danych małych cząsteczek w bibliotece chemicznej.

Wykorzystując wizualny screening chemiczny oparty na danio pręgowanym, odkryliśmy małocząsteczkowy inhibitor sygnału hedgehog, bazując na jego wpływie na oś ciała. Na tym obrazie przedstawiono embriony narażone na inhibitor hedgehog, u których widoczne jest wyraźne brzuszne wygięcie ogona. Embriony te, obserwowane po 24 godzinach, nadal wykazują fenotyp z wygięciem brzusznym w 48. godzinie.

Na obrazie przedstawiono zarodek poddany działaniu związku w porównaniu z zarodkiem z mutacją w szlaku hedgehog. Po opanowaniu tej techniki jedna osoba może przesiać około 400 związków tygodniowo w zaledwie kilka godzin. Metoda ta utorowała również drogę biologom chemicznym do badania takich zagadnień jak rozwój komórkowy, szlaki sygnalizacyjne komórek oraz rozwój embrionalny.

Podczas pracy z niecharakteryzowanymi małymi cząsteczkami ważne jest zachowanie odpowiednich zasad bezpieczeństwa, w tym stosowanie fartuchów laboratoryjnych i rękawiczek, ponieważ cząsteczki te mogą być potencjalnie niebezpieczne.