Wielkoskalowy ekran małych cząsteczek in vivo oparty na danio pręgowanym

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest odkrycie małych cząsteczek, które specyficznie modulują kluczowe aspekty rozwoju i fizjologii embrionalnej. Osiąga się to poprzez umieszczenie dużej liczby zapłodnionych jaj w 96 jajach, podczas gdy w drugim etapie przesiewa się płytki. Podwielokrotności biblioteki małych cząsteczek dodaje się do 96-dołkowych płytek obok zarodków w 96.

Płytki studzienkowe są badane pod kątem fenotypów wywołanych przez małe cząsteczki. Uzyskano wyniki, które pokazują, które małe cząsteczki konkretnie wpływają na rozwój lub fizjologię super ryb. Cześć, nazywam się Charles Hong i pracuję w Vanderbilt University School of Medicine.

W naszym laboratorium wykonujemy wysokoprzepustowe badania chemiczne z wykorzystaniem zarodków dwurybowych. Jest to stosunkowo łatwa technika, którą można szeroko zastosować do odkrywania nowych związków bioaktywnych. Po południu przed dniem badania chemicznego należy ustawić od 10 do 20 zbiorników hodowlanych zebry pręgowanego.

Umieścić przegrodę w każdym zbiorniku i napełnić każdy zbiornik wodą z systemu akwakultury za pomocą sieci rybackiej, jednego dorosłego samca i jednej do dwóch dorosłych samic do pojemnika wewnętrznego. W każdym zbiorniku hodowlanym oznacz zbiorniki i załóż na nie pokrywę rano w dniu ekranu. Usuń przegrody ze zbiorników hodowlanych i pozwól danio pręgowanemu na łączenie się w pary.

W ciągu następnej godziny. Pozwól, aby zapłodnione jaja wpadły przez siatkę na dnie każdego pojemnika wewnętrznego. Po godzinie zwróć dorosłe ryby seber z powrotem do stałych zbiorników magazynowych.

Wyjmij pojemnik wewnętrzny i zbierz jaja, przecedzając wodę w każdym zbiorniku hodowlanym przez plastikowe sitko do herbaty. Odwróć sitko na szalce Petriego i delikatnie opłucz sitko, aby spłukać jajka na szalkę Petriego. Używając butelki do mycia zawierającej pożywkę E 3, należy usunąć wszystkie niezapłodnione jaja, które wydają się nieprzezroczyste.

Używając jednorazowej plastikowej pipety, każda krzyżówka godowa powinna dać około 200 zarodków. Następnie przenieś około pięciu zarodków w pożywce E trzy do każdego dołka 96-dołkowej płytki za pomocą szklanej pipety do pasty. Po umieszczeniu zarodków na 96-dołkowej płytce.

Usuń jak najwięcej pożywki E trzy z dołków za pomocą 12-kanałowej pipety. Uważając, aby nie przebić zarodków. Za pomocą pipety 12-kanałowej dostarczyć 250 mikrolitrów E trzy.

Pożywka zawierająca 0,5 mikrograma na mililitr może zawierać micynę do każdego dołka tak szybko, jak to możliwe, aby nie dopuścić do wyschnięcia zarodków. Umieść 96-dołkowe płytki w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aż osiągną pożądany etap, w którym mają zostać dodane związki. W tym protokole szukamy związków, które zaburzają wczesny wzorzec embrionalny i będą inkubować zarodki przez trzy godziny lub do momentu, gdy stadium 1000 komórek zostanie osiągnięte przez ponad 90% zarodków, które zwykle dostarczane są w bibliotekach małych cząsteczek.

Na 96-dołkowej płytce źródłowej, w której każdy związek jest przechowywany w DMSO jako 10-milimolowy zapas, około 60 minut przed osiągnięciem przez zarodki pożądanego etapu rozmrozić odpowiednią liczbę 96-dołkowych płytek zawierających podwielokrotności małych cząsteczek. Zwróć uwagę na numer seryjny lub inny numer identyfikacyjny tabliczek źródłowych, aby zminimalizować kondensację pary wodnej na płytach. T wpadnij do komory osuszającej zawierającej suszarkę. Prawy.

Krótko odwiruj płytki w wirówce stołowej wyposażonej w adapter płytki wielodołkowej. Usuń aluminiową taśmę sufitową z płyty źródłowej za pomocą 12-kanałowej pipety, rozcieńczyć związki w płycie źródłowej do pożądanego stężenia za pomocą DMSO. W tym protokole używamy końcowego stężenia 0,5 milimola i dodajemy 4,75 mikrolitra DMSO w celu rozcieńczenia 10-milimolowej płytki podstawowej.

Gdy zarodki na płytce 96-dołkowej osiągną pożądany etap, użyj 12-kanałowej pipety, aby przenieść 2,5 mikrolitra związków z płytek źródłowych do płytek biorczych zawierających zarodki. Przykryć płytki zawierające obecnie zarodki i związki pokrywkami i zanotować numer identyfikacyjny płytek źródłowych na płytkach zarodkowych. Wymieszaj płytki, delikatnie obracając i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.

Przykryj każdą płytkę źródłową zawierającą niewykorzystane małe cząsteczki aluminiowym sufitem, taśmą i umieść w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Przed wykonaniem ekranu wizualnego sformułuj konkretne kryterium trafienia. Na przykład w badaniu przesiewowym dla małocząsteczkowych inhibitorów rozwoju czterech mózgowi, trafieniem może być związek, który powoduje utratę przodomózgowia.

Brak oczu jest łatwym wizualnym wskaźnikiem utraty przodomózgowia i nie wymaga fluorescencji do oznaczania w pożądanych momentach rozwoju. Wyjąć z inkubatora 96 płytek dołkowych zawierających zarodki poddane działaniu związków chemicznych i zbadać każdą studzienkę pod mikroskopem stereoskopowym podczas badań przesiewowych na obecność małocząsteczkowych inhibitorów rozwoju czterech mózgowi, zbadać płytki po 28 godzinach pod kątem utraty oka jako markera zahamowania rozwoju czterech mózgów. Zapisać tożsamość płytki i lokalizację dołka dla każdej studzienki, w której co najmniej trzy z pięciu zarodków wykazują zalecany fenotyp hi Umieść 96-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze.

Potwierdź utratę oczu i przodomózgowia po 48 godzinach. Nawet jeśli zarodki nie będą miały przodomózgowia, przeżyją do co najmniej czterech dni. Potwierdź potencjalne trafienie poprzez ponowne przetestowanie działania związku przy kilku dawkach dla każdej dawki, 10 zarodków testuje się w 0,5 mililitra pożywki E trzy w formacie płytki 48-dołkowej.

Czas wydania złożonego do ponownego badania powinien być identyczny z terminem pierwotnego badania przesiewowego. HIIT jest potwierdzany, gdy wywołany fenotyp jest odtwarzany w sposób zależny od dawki po ponownym przetestowaniu związku. Na koniec zidentyfikuj związek hi z bazy danych małych cząsteczek w bibliotece chemicznej.

Korzystając z wizualnego ekranu chemicznego opartego na danio pręgowanym, odkryliśmy małocząsteczkowy inhibitor sygnału jeża na podstawie jego wpływu na oś ciała. Zdjęcie przedstawia zarodki wystawione na działanie inhibitora jeża, wykazujące wyraźną brzuszną krzywiznę ogona. Po 24 godzinach te same zarodki badane po 48 godzinach nadal wykazują fenotyp zakrzywiony brzusznie.

Obraz ten przedstawia zarodek traktowany związkiem w porównaniu ze zmutowanym zarodkiem szlaku jeża. Po opanowaniu tej techniki jedna osoba może przebadać około 400 związków tygodniowo w ciągu zaledwie kilku godzin. Technika ta utorowała również drogę biologom chemicznym do badania takich rzeczy, jak rozwój komórek, szlaki sygnalizacji komórkowej i rozwój embrionalny.

Podczas pracy z niescharakteryzowanymi małymi cząsteczkami ważne jest, aby mieć odpowiednie fartuchy i rękawice laboratoryjne, ponieważ te niescharakteryzowane cząsteczki mogą być potencjalnie niebezpieczne.