Name: Wielkoskalowy ekran małych cząsteczek in vivo oparty na danio pręgowanym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę wielkoskalowego przesiewania małych cząsteczek in vivo przy użyciu zarodków danio pręgowanego. Technika umożliwia identyfikację związków modulujących rozwój embrionalny i fizjologię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1) Pobieranie ikry danio pręgowanego
<ol>
	<li>Popołudniem w dniu poprzedzającym badanie chemiczne przygotować od 10 do 20 zbiorników hodowlanych dla danio pręgowanych. Napełnić każdy zbiornik wodą z systemu akwakultury. Za pomocą siatki przenieść jednego dorosłego samca oraz jedną do dwóch dorosłych samic do wewnętrznego pojemnika w każdym zbiorniku hodowlanym. Oddzielić samca od samic za pomocą przegrody. Opisać klatki i przykryć je pokrywkami.</li>
	<li>Rano w dniu badania usunąć przegrody ze zbiorników hodowlanych, umożliwiając danio pręgowanym rozród. Przez następną 1 godzinę pozwolić zapłodnionym ikrom opaść przez kratkę znajdującą się na dnie każdego wewnętrznego pojemnika.</li>
	<li>Po 1 godzinie przenieść dorosłe danio pręgowane z powrotem do zbiorników stałych, wyjąć wewnętrzne pojemniki i zebrać ikrę, przecedzając wodę z każdego zbiornika hodowlanego przez plastikowe sitko do herbaty.</li>
	<li>Odwrócić sitko nad szalką Petriego i delikatnie wypłukać ikrę do szalki, używając butelki z wodą destylowaną zawierającej pożywkę E3.</li>
	<li>Wszystkie niezapłodnione ikry, które są nieprzezroczyste, należy usunąć za pomocą jednorazowej plastikowej pipety. Każda krzyżówka powinna dać około 200 embrionów.</li>
</ol>
2) Rozmieszczanie embrionów w płytkach 96-dołkowych
<ol>
	<li>Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś około 5 embrionów w medium E3 do każdego dołka płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Po rozmieszczeniu embrionów na płytce 96-dołkowej, usuń z dołków jak najwięcej medium E3 za pomocą pipety 12-kanałowej (30 - 300 μL), uważając, aby nie uszkodzić embrionów. Używając pipety 12-kanałowej, jak najszybciej wprowadź do każdego dołka 250 μL medium E3 zawierającego 0.5μg/ml kanamycyny, aby zapobiec wysychaniu embrionów.</li>
	<li>Umieść płytki 96-dołkowe w inkubatorze w temperaturze 28.5°C do momentu osiągnięcia przez embriony pożądanego stadium, w którym zostaną dodane związki.</li>
</ol>
3) Transfer biblioteki małych cząsteczek
Choć przenoszenie związków można zautomatyzować za pomocą robotycznych metod transferu, w niniejszym opisie skupimy się na metodzie manualnej.
<ol>
	<li>Biblioteki małych cząsteczek są zazwyczaj dostarczane w formacie 96-dołkowym, przy czym każdy związek jest przechowywany w DMSO jako roztwór stokowy o stężeniu 10 mM. Około 60 minut przed osiągnięciem przez embriony stadium, w którym należy dodać związki, rozmrozić odpowiednią liczbę płytek 96-dołkowych zawierających alikwoty małych cząsteczek (płytka źródłowa). Zanotować numery seryjne lub inne numery identyfikacyjne płytek źródłowych. Aby zminimalizować kondensację na płytkach, rozmrażanie można przeprowadzić w komorze osuszającej zawierającej Drierite (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).</li>
	<li>Krótko odwirować płytki w wirówce nakładkowej wyposażonej w adapter do płytek wielodołkowych.</li>
	<li>Usunąć aluminiową taśmę uszczelniającą z płytki źródłowej. Używając pipety 12-kanałowej, rozcieńczyć związki w płytce źródłowej do stężenia 0,5 mM (na przykład, zaczynając od alikwotów 250 nL roztworu stokowego 10 mM, dodać 4,75 μL DMSO do każdego dołka).</li>
	<li>Gdy embriony w płytce 96-dołkowej (płytka odbiorcza) osiągną pożądane stadium, użyć pipety 12-kanałowej (2-20 μL), aby przenieść 2,5 μL związków (0,5 mM) z płytek źródłowych do płytek odbiorczych zawierających embriony.</li>
	<li>Zanotować numery identyfikacyjne płytek źródłowych na płytkach odbiorczych z embrionami. Przykryć pokrywkami płytki odbiorcze zawierające embriony i związki, delikatnie wymieszać zawartość płytek poprzez powolne okrążanie, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 28,5°C.</li>
	<li>Każdą płytkę źródłową zawierającą niewykorzystane małe cząsteczki (0,5 mM) zakryć aluminiową taśmą uszczelniającą i umieścić w zamrażarce -80°C do długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
4) Przesiewowe badanie wpływu małych cząsteczek poprzez wizualną ocenę fenotypów
<ol>
	<li>Przed przeprowadzeniem przesiewu należy sformułować konkretne kryterium określające, co będzie stanowiło tzw. „hit” (pozytywny wynik).</li>
	<li>W wybranych momentach rozwoju należy wyjąć z inkubatora płytki 96-dołkowe zawierające embriony traktowane związkami i zbadać każdy dołek pod stereomikroskopem. W celu lepszej wizualizacji subtelnych zmian, takich jak zmiany w schemacie krążenia, można zastosować odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy. Do badania zaburzeń ekspresji białek GFP lub DsRed pod promotorem tkankowo specyficznym można wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną.</li>
	<li>Należy szybko przeszukać płytki 96-dołkowe w poszukiwaniu dołków, w których co najmniej 3 z 5 embrionów wykazują określony fenotyp „hit”. Należy odnotować identyfikator płytki oraz położenie dołka dla każdego potencjalnego hitu.</li>
	<li>Potencjalny hit należy potwierdzić poprzez ponowne przetestowanie działania związku w kilku dawkach (1 uM, 5 uM, 10 μM oraz 50 μM). Dla każdej dawki testuje się 10 embrionów w 0,5 mL pożywki E3 w formacie płytki 48-dołkowej. Moment dodania związku podczas powtórnych testów powinien być identyczny jak w pierwotnym przesiewie. Hit zostaje potwierdzony, gdy wywołany fenotyp zostanie odtworzony podczas ponownego testowania związku.</li>
	<li>Należy zidentyfikować związek będący hitem w bazie danych małych cząsteczek w bibliotece chemicznej.</li>
</ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podczas planowania przesiewu chemicznego z wykorzystaniem danio pręgowanego należy zwrócić szczególną uwagę na stabilność rozważanego fenotypu oraz częstość jego występowania w tle. Jest to szczególnie istotne w przypadku poszukiwania chemicznych supresorów fenotypu indukowanego. Przykładowo, w przypadku fenotypu wywołanego indukcją transgenu szokiem termicznym, warunki umożliwiające powtarzalną indukcję fenotypu muszą zostać precyzyjnie określone przed rozpoczęciem przesiewu, aby uniknąć nieakceptowalnie wysokiego odset...

<table><tbody><tr><td>Nazwa materiału</td><td>Typ</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td></tr><tr><td>Minimum 20 par dorosłych danio pręgowanych o pożądanym genotypie.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatki do ryb, zbiorniki hodowlane z wyjmowanym pojemnikiem wewnętrznym i przegrodami (Aquatic Habitats).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (10 cm).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe sitko do herbaty.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelka zmywaczka zawierająca wodę do embrionów.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe polietylenowe pipety transferowe.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe 96-dołkowe płytki analityczne o okrągłym dnie (Corning COSTAR; Lowell, MA).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura (Fisher Scientific).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręczna pompka do pipet, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka E3 dla embrionów: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; , 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; , zawierająca 0.003% PTU (fenylotiomocznik, Sigma; St. Louis, MO). PTU można przygotować jako roztwór 10x, rozpuszczając 0.3-g PTU w 1 L pożywki E3 dla embrionów. Roztwory zawierające PTU należy chronić przed światłem, owijając je folią aluminiową.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety 12-kanałowe, 2-20 &amp;#956;L (Eppendorf).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety 12-kanałowe, 3-300 &amp;#956;L (Eppendorf).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy polistyrenowy zbiornik na końcówki pipet, 50 mL (Fisher Scientific).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka małych cząsteczek o zróżnicowanej strukturze rozmieszczona w formacie 96-dołkowym w stężeniu zapasowym 10 mM w DMSO. Każda płytka matrycowa jest rozdzielana na 96-dołkowe polipropylenowe płytki do przechowywania (Corning) i przechowywana w temperaturze -80&amp;#x00B0;C do momentu użycia.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa taśma uszczelniająca do płytek 96-dołkowych (Nunc, Rochester, NY).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Sigma, St. Louis, MO).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy inkubator, 28.5&amp;#x00B0;C (Fisher Scientific).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop z podstawą do oświetlenia przechodzącego (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wielkoskalowe badania z wykorzystaniem rybek zebrafish in vivo przesiewanie małych cząsteczek

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Ze względu na niewielki rozmiar zarodka, szybki rozwój, przezroczystość, płodność oraz liczne podobieństwa molekularne, morfologiczne i fizjologiczne do ssaków, zebrafish stał się potężnymin vivoplatforma do przesiewania leków w oparciu o fenotyp oraz analizy genetyki chemicznej. W niniejszej pracy prezentujemy prostą, praktyczną metodę wielkoskalowego przesiewania małych cząsteczek z wykorzystaniem embrionów zebrafish.

Danio pręgowany stał się potężną platformą in vivo do przesiewowych badań leków opartych na fenotypie oraz analiz genetyki chemicznej. W niniejszej pracy prezentujemy prostą i praktyczną metodę wielkoskalowego przesiewu małych cząsteczek z wykorzystaniem embrionów danio pręgowanego.

Wielkoskalowe badania z wykorzystaniem rybek zebrafish In vivo Przesiewanie małych cząsteczek

Ze względu na niewielki rozmiar zarodka, szybki rozwój, przezroczystość, płodność oraz liczne podobieństwa molekularne, morfologiczne i fizjologiczne do...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest odkrycie małych cząsteczek, które specyficznie modulują kluczowe aspekty rozwoju i fizjologii embrionalnej. Osiąga się to poprzez umieszczenie dużej liczby zapłodnionych jaj w płytkach 96-dołkowych, które służą jako etap przesiewowy. Następnie do płytek 96-dołkowych z zarodkami dodaje się alikwoty z biblioteki małych cząsteczek.Płytki wielodołkowe są analizowane pod kątem fenotypów wywołanych przez małe cząsteczki. Uzyskane wyniki wskazują, które małe cząsteczki specyficznie wpływają na rozwój lub fizjologię super ryb. Witam, nazywam się Charles Hong z Vanderbilt University School of Medicine.W naszym laboratorium przeprowadzamy wysokoprzepustowe przesiewy chemiczne z wykorzystaniem embrionów danio pręgowanego. Jest to stosunkowo prosta technika, którą można szeroko adaptować w celu odkrywania nowych związków bioaktywnych. Po południu w dniu poprzedzającym przesiew chemiczny przygotuj od 10 do 20 zbiorników hodowlanych dla danio pręgowanego.W każdym zbiorniku należy umieścić przegrodę, a następnie napełnić zbiorniki wodą z systemu akwakultury, przenosząc za pomocą siatki jeden dorosły osobnik męski oraz jedną lub dwie dorosłe samice do wew

large-scale-zebrafish-based-in-vivo-small-molecule-screen

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Duża skala in vivo testowania małych cząsteczek opartych na rybkach zwanych zebrafish

Opisujemy opracowanie systemu do zautomatyzowanego obrazowania i analizy transgenicznych embrionów zebrafish w płytkach wielodołkowych. System ten wykazuje możliwość pomiaru efektów zależnych od dawki małej cząsteczki, BCI, na ekspresję genu reporterowego Fibroblast Growth Factor i dostarcza technologii do tworzenia wysokoprzepustowych skriningów chemicznych na zebrafish.

Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy dla chemicznych badań przesiewowych na daniowiczkach Zebrafish.

W tym artykule, zarodki danio pręgowanego są wykorzystywane do badań przesiewowych toksyczności chemicznej. Toksyczność chemiczna jest skorelowana z odczytami fenotypu. W protokole próbki przedstawiono metodologiczne podejście do przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności chemicznej.

Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem doświadczalnym do badania procesów rozwojowych kręgowców i modelowania chorób ludzkich. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób przeprowadzić ręczne, wysokoprzepustowe badanie chemiczne na zarodkach danio pręgowanego z odczytem hybrydyzacji in situ (WISH) w całości.

Ręczne badanie przesiewowe małych cząsteczek zbliżające się do wysokiej przepustowości przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Poznaj metodę wielkoskalowego przesiewania małych cząsteczek in vivo przy użyciu zarodków danio pręgowanego. Technika umożliwia identyfikację związków modulujących rozwój embrionalny i fizjologię.

Wielkoskalowe badania z wykorzystaniem rybek zebrafish In vivo Przesiewanie małych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów