Dostarczanie genów do postnatalnego mózgu szczura poprzez niekomorowe wstrzykiwanie plazmidów i elektroporację

Witajcie, jestem RI Ov. A ja jestem Alexia Ying. Jesteśmy studentami studiów podyplomowych na Cent University. W tym filmie przedstawimy metodę elektroporacji in vivo w celu dostarczenia genu docelowego do określonego obszaru tkanki mózgowej.

Przejdźmy zatem do szczegółów. Metoda elektroporacji in vivo oferuje szybki i wydajny sposób dostarczania genów zainteresowania lub krótkich interferujących RNA do żywej tkanki mózgowej.

Stanowi ono niskokosztową alternatywę dla tworzenia zwierząt transgenicznych oraz dla metod wirusowej dostawy genów. W tym filmie zaprezentujemy szczegółową procedurę postnatalnej dostawy genów do kory mózgowia noworodka. Wykorzystamy plazmid kodujący ulepszone zielone białko fluorescencyjne oraz promotor beta-aktyny kurczaka z enhancerem CMV.

Wszystkie manipulacje chirurgiczne wykonujemy w szafie z laminarnym przepływem powietrza, aby zachować sterylność i zminimalizować ryzyko kontaminacji zwierzęcia bakteriami lub grzybami. Do dostarczania plazmidu do kory stosujemy mikroinżektor WPI z elektronicznym sterownikiem oraz strzykawkę Hamiltona o pojemności 10 µL zamocowaną do manipulatora stereotaktycznego. Czerwony szczur zostaje poddany znieczuleniu przy użyciu jednostki anestezjologicznej składającej się z komory i maski.

Następnie szczenię zostaje unieruchomione za pomocą uchwytów usznych na stole grzewczym przymocowanym do manipulatora stereotaktycznego. Do manipulacji chirurgicznych i monitorowania mikroiniekcji używamy mikroskopu dwuokularowego. Do elektroporacji wykorzystujemy operator elektryczny in vivo CYV 21 z elektrodami w kształcie pęsety.

W celu rekonwalescencji szczeniąt po znieczuleniu stosuje się podgrzewaną komorę. Zazwyczaj przygotowujemy 10 µL roztworu do iniekcji plazmidu w probówce cienkościennej o pojemności 200 µL. Taka ilość roztworu jest wystarczająca dla kilku eksperymentów.

Mieszamy 8 µL roztworu plazmidu z 1 µL 10 XPBS oraz 1 µL 0,1% wodnego roztworu fast green. Końcowe stężenie plazmidu w roztworze do iniekcji powinno wynosić od 1 do 3 µg/µL. Zastosowanie niższych stężeń plazmidowego DNA obniży wydajność transfekcji, natomiast zbyt wysokie stężenie DNA spowoduje zbyt dużą lepkość roztworu, co uniemożliwi iniekcję przez cienką końcówkę kapilary szklanej.

Do przygotowania szklanej pipety używamy kapilary z borokrzemianowego szkła z włóknem oraz pionowego wyciągacza elektrod szklanych przy maksymalnych parametrach wyciągania i grzania. Następnie łamiemy końcówkę pipety za pomocą kawałka papieru, aby uzyskać końcówkę o średnicy od 10 do 20 mikrometrów. Następnie sprawdzamy średnicę i kształt końcówki pod obiektywem mikroskopu.

Za pomocą cienkiej kapilary polimerowej wypełniamy około jednej trzeciej objętości strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL. Używając oleju mineralnego, upewniamy się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie napełniamy szklaną pipetę olejem mineralnym i wkładamy pipetę do strzykawki Hamiltona.

Ponownie należy unikać pęcherzyków powietrza. Strzykawka z szklaną pipetą jest następnie mocowana w mikroinjektorze połączonym z kontrolerem. Układ do mikroiniekcji zamontowany na urządzeniu stereotaktycznym pozwala na bezpieczne zanurzenie końcówki szklanej pipety w probówce z roztworem do iniekcji plazmidu.

Gdy końcówka dotknie powierzchni roztworu, zanurzamy ją głębiej o jeden do dwóch milimetrów. Następnie, za pomocą kontrolera mikroinjektora, napełniamy pipetę około jedną mikrolitrem mieszaniny do iniekcji. Wszystkie przedstawione tutaj eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z regulacjami Uniwersytetu w Helsinkach dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.

Dla każdego eksperymentu napełniamy strzykawkę szczelną gazowo izofluranem. Mocujemy strzykawkę w aparacie do znieczulania podłączonym do źródła przepływu powietrza, zwierzę przechodzi do maski zamocowanej w układzie stereotaktycznym. W aparacie do znieczulania ustawiamy przepływ powietrza na około 250 milliliters minute oraz poziom izofluranu na 4%. Umieszczamy czerwony stożek w klatce zwierzęcia na od dwóch do pięciu minut.

Gdy P przestaje się poruszać, kładziemy go na podkładce grzewczej przymocowanej do zestawu stereotaktycznego. Rostralną część głowy P umieszczamy w masce. Zazwyczaj upływa od pięciu do 10 minut, zanim szczenię wejdzie w stan głębokiej anestezji.

Po osiągnięciu tego stanu zmniejszamy przepływ izofluranu do około 1,5 do 2%. Skórę na głowie szczenięcia przemywamy 70% etanolem, używając małych gazików i cienkich pęset. Wycinamy skórę od karku szczenięcia aż do czoła, odginamy fragmenty skóry na boki i lekko wsuwamy pręty uszne do otworów jam czaszki w celu unieruchomienia głowy i skóry. Za pomocą mikroskopu binokularnego lokalizujemy punkt odniesienia na czaszce, aby zidentyfikować obszar zainteresowania zgodnie ze współrzędnymi stereotaktycznymi, następnie ustawiamy pipetę do iniekcji nad tym obszarem i zaznaczamy go, nakraplając 25 do 50 nanolitrów roztworu do iniekcji na powierzchnię czaszki.

Ostrożnie i delikatnie wiercimy otwór w czaszce w zaznaczonym punkcie, używając szybkowirującego wiertła chirurgicznego pod mikroskopem, aż w miejscu wiercenia pojawi się płyn. Mocujemy szczypce do elektroporacji oraz elektrody po bokach czaszki. Nakładamy żel przewodzący w celu uzyskania lepszej przewodności.

Kroplę cieczy z nawierconego obszaru usuwamy za pomocą małego tamponu, a następnie wprowadzamy szklaną igłę do otworu. Zgodnie z współrzędnymi miejsca iniekcji, wstrzyknięto od 25 do 100 nanolitrów roztworu z prędkością od 5 do 20 nanolitrów na sekundę. Następnie szybko usuwamy pipetę i niezwłocznie przystępujemy do elektroporacji.

Elektroporację przeprowadza się poprzez przyłożenie pięciu impulsów o czasie trwania 50 milliseconds przy amplitudzie impulsu 99 volts i częstotliwości 1 hertz. Następnie usuwamy elektrody oraz stabilizatory uszne. Przeciętą skórę zaszywamy, używając kombinacji pęset tępych i ostrych oraz nici chirurgicznych.

Szczenię umieszczono w ciepłej komorze na 15 do 30 minut, aby wspomóc jego rekonwalescencję po znieczuleniu. Następnie szczenię wróciło do klatki z matką. Ekspresja transgenu w pomyślnie przetransfekowanych komórkach pojawi się około 10 godzin po elektroporacji i pozostanie stabilna przez kilka tygodni.

To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach. Do widzenia.