Name: In vivo (in vivo) Kwantyfikacja oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G przy użyciu spektralnie rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G in vivo przy użyciu spektralnie rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia badanie oligomerów białkowych w żywych komórkach drożdży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez UW-Milwaukee Research Growth Initiative, Wisconsin Institute for Biomedical and Health Technologies oraz Bradley Foundation.

<ol><li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaicu%2C+V+%22Nanoscopy+and+Multidimensional+Optical+Fluorescence+Microscopy%22">Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy</a>. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer. New York. (2006).</li>
<li>Raicu, V., Popescu, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaicu%2C+V+%22Integrated+Molecular+and+Cellular+Biophysics%22">Integrated Molecular and Cellular Biophysics</a>. , Springer. London. (2008).</li>
<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renaissance+of+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The renaissance of fluorescence resonance energy transfer.</a> Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).</li>
<li>Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+quantified+in+vivo+by+spectrally+resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer.</a> Biochem J. 385, 265-277 (2005).</li>
<li>Maurel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies%3A+application+to+GPCR+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nat Methods. 5, 561-567 (2008).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).</li>
<li>Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+protein+interactions+with+photoquenching+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET.</a> Nat Methods. 3, 519-524 (2006).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).</li>
<li>Wlodarczyk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FRET+signals+in+the+presence+of+free+donors+and+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors.</a> Biophys J. 94, 986-1000 (2008).</li>
<li>Förster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimentelle+und+theoretische+Untersuchung+des+zwischenmolekularen+bergangs+von+Elektronenanregungsenergie.+Z.+Naturforsch%5BTitle%5D)+AND+%22A%3A+Astrophys+Phys+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch.</a> A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-2124 (2006).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).</li>
<li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+Resonance+Energy+Transfer+in+Homo-Oloigomeric+Complexes+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins.</a> J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).</li>
<li>Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VII, 2007 Jan 1, San Jose, CA, USA , , (2007).</li>
<li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+supramolecular+structure+and+spatial+distribution+of+protein+complexes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells.</a> Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).</li>
<li>Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspectroscopic+method+for+determination+of+size+and+distribution+of+protein+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo.</a> Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).</li>
<li>Kurjan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+response+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Pheromone response in yeast.</a> Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).</li>
<li>Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+G-protein-coupled+receptors%3A+lessons+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej prezentacji przedstawiliśmy sposób określania wielkości oraz informacji strukturalnych dotyczących kompleksu oligomeru białkowego in vivo. Choć zaprezentowane dane uzyskano dla konkretnego receptora błonowego (tj. Ste2p) ekspresowanego w komórkach drożdży, metoda ta jest uniwersalna i może być zastosowana do każdego rodzaju białka ekspresowanego w dowolnym typie komórek, pod warunkiem, że białka te są znakowane odpowiednimi markerami fluorescencyjnymi. Przyszłe modyfikacje tego protokołu będą obejmo...

<table><tbody><tr><td>Pepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże azotowe dla drożdży bez (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; i aminokwasami</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Suplementy do syntetycznego podłoża selekcyjnego dla drożdży (Drop-out Medium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70210</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Acros Organics</td><td>424090010</td><td></td></tr><tr><td>Leucyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP385</td><td></td></tr><tr><td>Histydyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP382</td><td></td></tr><tr><td>Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy z rozdzielczością spektralną</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem g z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Badanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach jest istotnym obszarem badań, ponieważ zgromadzone informacje przynoszą korzyści zarówno w zastosowaniach przemysłowych, jak i w poszerzaniu podstawowej wiedzy biologicznej. Transfer Energii Rezonansowej Förstera (FRET) pomiędzy cząsteczką donora w stanie wzbudzenia elektronicznego a pobliską cząsteczką akceptora jest często wykorzystywany do badań oddziaływań białko-białko w żywych komórkach. Badane białka są znakowane dwoma różnymi rodzajami sond fluorescencyjnych i eksprymowane w komórkach biologicznych. Następnie sondy fluorescencyjne są wzbudzane, zazwyczaj za pomocą światła laserowego, a właściwości spektralne emisji fluorescencji pochodzącej z sond są zbierane i analizowane. Informacje dotyczące stopnia oddziaływań białkowych są zawarte w danych emisji spektralnej. Zazwyczaj komórka musi zostać przeskanowana wielokrotnie, aby zgromadzić wystarczającą ilość informacji spektralnych do dokładnego ilościowego określenia zakresu oddziaływań białkowych dla każdego obszaru zainteresowania wewnątrz komórki. Jednak skład molekularny tych obszarów może ulec zmianie w trakcie procesu akwizycji, co ogranicza przestrzenną analizę ilościowych wartości pozornej wydajności FRET do średniej z całych komórek. Dzięki zastosowaniu mikroskopu dwufotonowego z rozdzielczością spektralną jesteśmy w stanie uzyskać pełny zestaw obrazów z rozdzielczością spektralną po zaledwie jednym pełnym skanowaniu wzbudzenia badanej próbki. Z tych danych spektralnych na poziomie pikseli obliczana jest mapa wydajności FRET w całej komórce. Poprzez zastosowanie prostej teorii FRET w kompleksach oligomerycznych do eksperymentalnie otrzymanego rozkładu wydajności FRET w całej komórce, pojedynczy skan z rozdzielczością spektralną ujawnia informacje stechiometryczne i strukturalne na temat badanego kompleksu oligomeru. W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowania komórek biologicznych (drożdże Saccharomyces cerevisiae) eksprymujących receptory błonowe (receptory sterylnego czynnika 2 α) znakowane dwoma różnymi rodzajami sond fluorescencyjnych. Ponadto przedstawiamy krytyczne czynniki związane z gromadzeniem danych fluorescencyjnych przy użyciu systemu obrazowania mikroskopii dwufotonowej z rozdzielczością spektralną. Zastosowanie tego protokołu można rozszerzyć na badanie każdego rodzaju białka, które może być eksprymowane w żywej komórce z dołączonym markerem fluorescencyjnym.

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Badanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach jest ważnym obszarem badawczym, ponieważ zgromadzone informacje przynoszą korzyści zarówno przemysłowi...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest określenie informacji stechiometrycznych i strukturalnych na temat białka. Wszystkie kompleksy ligandów wykazujące żywe komórki biologiczne, komórki drożdży, są zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji białek zainteresowania przyłączonych do sondy fluorescencyjnej donora lub akceptora. Sondy donora mogą być wzbudzane bezpośrednio za pomocą lasera.Podczas gdy akceptory mogą zostać wzbudzone jedynie poprzez transfer energii z pobliskiego wzbudzonego donora, komórki są naświetlane impulsem lasera bliskiej podczerwieni. Fluorescencja emitowana przez sondy jest rozdzielana na składowe spektralne za pomocą siatki transmisyjnej i rzutowana na powierzchnię matrycy CCD z mnożeniem elektronów. W ten sposób dla każdego punktu w próbce otrzymywane są pełne widma fluorescencji z poszczególnych ligandów.Profil spektralny wykrytej fluorescencji zależy od specyficznej interakcji badanych białek. Dane są analizowane w celu określenia oddzielnych emisji sondy donora i akceptora dla każdego piksela obrazu komórki skanowanej. Efektywność transferu energii jest wyznaczana dla każdego piksela obrazu, a następnie piksele są grupowane zgodnie z ich efektywnością FRET i histogramem.Interpretacja histogramu umożliwia in vivo określenie wielkości i konfiguracji białek oraz kompleksów. Cześć, nazywam się Michael Stoneman z Grupy Badawczej Riku na Uniwersytecie Wisconsin w Milwaukee. Nazywam się Singh.Pracuję w laboratorium Rikus w Milwaukee w stanie Wisconsin. Główną zaletą tej techniki jest to, że kompletne profile emisji setek wszystkich kompleksów więzadłowych wewnątrz komórki są uzyskiwane za pomocą jednego pełnego skanowania komórki. Zazwyczaj większość metod mikroskopii fluorescencyjnej wymaga wielokrotnego skanowania badanej komórki w celu zgromadzenia wystarczających informacji spektralnych do określenia wydajności FRET w różnych obszarach zainteresowania wewnątrz komórki.Jednakże biochemiczne reakcje dyfuzyjne mogą zmieniać skład molekularny tych obszarów zainteresowania, ograniczając tym samym informacje uzyskane podczas skanowania obrazu. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad białkami i oddziaływaniami białko-białko w żywych komórkach, takie jak: jaka jest wielkość szkodliwych oligomerów? Na jakim etapie cyklu życia białka tworzą się oligomery i jaka jest rola oligomerów tego białka w funkcjonowaniu komórki?Mikroskop dwifotonowy z rozdzielczością spektralną gromadzi informacje spektralne o kompleksach olima w komórce obrazowanej poprzez skanowanie ogniska wiązki wzbudzenia w wielu punktach badanego preparatu. Para ortogonalnych luster skanujących służy do przemieszczania ogniska wiązki lasera w poprzek próbki w dwóch różnych kierunkach. Ruch luster skanujących jest sterowany komputerowo i zsynchronizowany z ekstrakcją danych o intensywności fluorescencji z kamery CCD, co pozwala na rekonstrukcję przestrzennych map intensywności fluorescencji z przeskanowanych linii, odpowiadających konkretnej długości fali światła.W celu dokładnej rekonstrukcji przestrzennych map natężenia fluorescencji rentgenowskiej oraz obliczenia rzeczywistej długości fali odpowiadającej każdej z tych map, protokół skanowania liniowego musi zostać skalibrowany przy użyciu roztworu fluoresceiny. Aby rozpocząć procedurę kalibracji, ustaw widmo wzbudzenia na długość fali 800 nanometrów, co stanowi dwukrotność maksymalnej długości fali wzbudzenia znacznika donora GFP two two. Aby przesunąć widmo wzbudzenia, przesuń pryzmat znajdujący się wewnątrz wnęki laserowej w celu zmodyfikowania dyspersji prędkości grupowej, korzystając z programu komputerowego, z którym połączona jest kamera. Wyślij polecenie do układu CCD, aby obniżyć temperaturę chipa CCD do najniższej możliwej wartości.W celu zredukowania szumu ciemnego, nanieś pipetą 10 µL roztworu fluoresceiny na szkiełko przedmiotowe i przykryj je szkiełkiem nakrywnym w taki sposób, aby cienka warstwa próbki była równomiernie rozprowadzona w przestrzeni między szkiełkiem nakrywnym a przedmiotowym, a następnie nanieś małą kroplę olejku imersyjnego na powierzchnię szkiełka nakrywnego. Następnie zamocuj szkiełko przedmiotowe w stoliku translacyjnym XY, Z i przesuń szkiełko oraz stolik w kierunku osi optycznej. Ręcznie regulując siłownik liniowy, przesuwaj szkiełko aż do momentu, gdy obiektyw mikroskopu zetknie się z kroplą olejku imersyjnego; przełącz kamerę w tryb akwizycji wideo, aby światło padające na matrycę CCD było wyświetlane na ekranie komputera w czasie rzeczywistym.Wyłącz wszystkie światła w pomieszczeniu, aby zmniejszyć poziom szumu tła wykrywanego przez matrycę CCD. Powoli reguluj mikrometr sterujący stolem translacyjnym w kierunku osi optycznej, aby wprowadzić próbkę w punkt ogniskowania wiązki laserowej. Gdy próbka fluoresceiny zostanie ustawiona w ognisku, emisja pojawi się jako ostra linia na matrycy CCD.Pobierz odczyt intensywności pikseli z matrycy CCD do komputera. Zmierz intensywność pikseli jako funkcję położenia na matrycy CCD, otwierając pobraną macierz wartości intensywności w programie ImageJ i kreśląc linię przechodzącą przez obszar fluorescencji. Użyj polecenia image day.Przeanalizuj profil wykresu, aby utworzyć wykres ilustrujący widmo emisji próbki fluoresceiny. Dostosuj parametr przyrostowy lustra, który steruje ruchem lasera. Ustaw ostrość w kierunku Y w taki sposób, aby sąsiednie pozycje y wewnątrz próbki powodowały przesunięcie piku widm fluorescencji o dokładnie jeden piksel wzdłuż wymiaru widmowego na matrycy CCD.Aby monitorować ten proces, należy pobrać intensywność widma fluoresceiny dla dwóch różnych pozycji Y w próbce. Następnie należy otworzyć obrazy intensywności w programie ImageJ i wyznaczyć pozycję piksela szczytowego dla każdego z widm fluorescencyjnych. Korzystając z kursora w programie ImageJ i pozostawiając otwartą migawkę detektora CCD, należy przeskanować ogniskową lasera w poprzek próbki w kierunku X.Światło emitowane z każdego woksela wzdłuż linii skanowania powinno padać na matrycę CCD na końcu każdego skanowania liniowego; należy zapisać dane z matrycy CCD uzyskane dla tego skanowania liniowego, a następnie wyczyścić piksele matrycy CCD. Zmienić pozycję lasera. Przesunąć ognisko w kierunku Y o wartość określoną wcześniej.Następnie przeprowadź skanowanie wiązki lasera w kierunku X w poprzek próbki. Ponownie, pozostawiając otwartą migawkę detektora CCD, zapisz dane. Powtarzaj tę procedurę skanowania liniowego, aż laser oświetli obszar fizyczny o około 50% większy niż wymiary pojedynczej komórki biologicznej.Zależność między numerem wiersza konkretnego obrazu z mapowania liniowego a długością fali powinna zostać wykorzystana do rekonstrukcji obrazów w celu uzyskania wielu map intensywności fluorescencji wzbudzonej przy różnych długościach fal. Aby uzyskać obraz emisji fluorescencji dla konkretnej długości fali, należy znaleźć numer wiersza na obrazie uzyskanym z pierwszego mapowania liniowego, który odpowiada tej długości fali. Następnie sąsiedni wiersz w kolejnym obrazie z mapowania liniowego odpowiada następnemu wierszowi obrazu emisji fluorescencji.Dla danej długości fali należy zestawić wszystkie wiersze obrazów odpowiadające tej długości, aby uzyskać przestrzenne mapy intensywności fluorescencji XY próbki przy tej długości fali. Powtórz tę procedurę dla wszystkich pozostałych dostępnych długości fal, aby zebrać dane dotyczące próbek. W pierwszej kolejności wyjmij z inkubatora płytki z koloniami transformowanych drożdży.Powinny wystąpić co najmniej trzy typy przekształconych komórek. Komórki wykazujące ekspresję białek docelowych znakowanych oboma rodzajami sond fluorescencyjnych, komórki wykazujące ekspresję wyłącznie białek znakowanych sondami fluorescencyjnymi donora oraz komórki wykazujące ekspresję wyłącznie białek znakowanych sondami fluorescencyjnymi akceptora.Do probówki do mikrocentryfugi dodać 100 µL 100 mM chlorku potasu. Następnie, używając końcówki do mikropipety, pobrać od trzech do pięciu kolonii drożdży z płytki z komórkami wykazującymi ekspresję białek znakowanych zarówno sondą donora, jak i akceptora fluorescencji, i zaszczepić je w 100 mM chlorku potasu. Z tak przygotowanych komórek pobrać 10 µL zawiesiny komórkowej i nanieść na nowe szkiełko przedmiotowe.Przykryj kroplę szkiełkiem podstawowym i nanieś kroplę olejku na powierzchnię szkiełka. Następnie ręcznie zamknij migawkę na drodze wiązki lasera, aby zablokować dopływ światła laserowego do obiektywu mikroskopu. Przymocuj preparat do stolika translacyjnego XY, Z i przesuń stolik wzdłuż osi optycznej, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z kroplą olejku imersyjnego.Teraz włącz oświetlenie szerokopolowe i przejdź do ustawień kamery. Tryb zbierania danych: wideo. Obraz szerokopolowy próbki będzie silnie rozmyty ze względu na obecność kratki transmisyjnej w torze emisji.Należy zatem umieścić filtr pasmowy o małej szerokości połówkowej (FWHM) w torze optycznym przed siatką transmisyjną. Powoli przesuwaj stolik translacyjny w kierunku osi optycznej, obserwując obraz komórek na ekranie kamery, aż komórki zostaną ustawione w ostrości. Przesuń stolik w kierunku X lub Y, aby umieścić pojedynczą komórkę w punkcie ogniskowania wiązki lasera.Wyłącz źródło oświetlenia szerokopolowego i usuń filtr pasmowy z toru emisji. Odblokuj wiązkę lasera na krótki czas, jednocześnie obserwując sygnał odbierany przez matrycę CCD. Jeśli w czasie padania wiązki lasera na komórkę na matrycy CCD zostanie wykryty sygnał fluorescencji, przeprowadź pełny skan akwizycji danych fluorescencyjnych dla tej komórki.Kluczowe jest zastosowanie tych samych parametrów skanowania, a w szczególności liczby linii oraz przyrostu Y, określonych w wcześniej zaprezentowanej procedurze kalibracji. Należy powtórzyć proces lokalizacji komórek i pozyskiwania danych fluorescencyjnych dla dużej liczby komórek wykazujących ekspresję białek sprzężonych zarówno z tagami donorowymi, jak i akceptorowymi. Po zgromadzeniu wystarczającej liczby obrazów fluorescencyjnych komórek z białkami znakowanymi oboma receptorami, należy powtórzyć cały proces zarówno dla komórek wykazujących ekspresję wyłącznie białek znakowanych donorowymi sondami fluorescencyjnymi, jak i dla komórek wykazujących ekspresję wyłącznie białek znakowanych akceptorowymi sondami fluorescencyjnymi.Na koniec należy zrekonstruować wszystkie skany, aby uzyskać przestrzenne mapy intensywności fluorescencji XY z rozdzielczością spektralną dla każdego zestawu danych, stosując procedurę opisaną wcześniej. Na tych trzech rysunkach przedstawiono wynikowe mapy przestrzenne obliczone na podstawie pomiarów dwufotonowej mikroskopii z rozdzielczością spektralną, wykonanych na komórce drożdży wykazującej ekspresję receptora czynnika ste-2 do alpha. Dwuwymiarowe mapy sygnałów donora i akceptora uzyskano poprzez analizę profili emisji spektralnej pobranych z każdego miejsca w komórce.Intensywności fluorescencji są przypisane do kolorów sztucznych zgodnie z ich wartościami, a skala jest przedstawiona jako wstawka. Następnie, wykorzystując obrazy KDA i KAD, obliczono dwuwymiarową mapę pozornych wydajności FRET, używając wartości wyodrębnionych z mapy pozornych wydajności FRET komórki pokazanej przed chwilą, po czym przygotowano wykres histogramu. Zmierzone wartości EAPP komórki są przedstawione za pomocą okręgów.Czerwona linia ciągła reprezentuje dopasowanie do danych pomiarowych z wykorzystaniem sumy poszczególnych funkcji wapnia przedstawionych przez zielone linie ciągłe. Analiza histogramu, opisana w tekście protokołu, potwierdza, że sterylny kompleks ligandu receptora czynnika alfa 2 przyjmuje w warunkach in vivo formę tetrameru o kształcie RBA. Po opanowaniu technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu 12 godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Podczas przeprowadzania tego eksperymentu ważne jest utrzymanie niskiej mocy źródła wzbudzenia. Należy unikać wielokrotnego wzbudzania donora przez pojedynczy impuls.

in-vivo-quantification-g-protein-coupled-receptor-interactions-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vivo ilościowa ocena interakcji receptorów sprzężonych z białkiem G przy użyciu widmowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe metody obrazowania żywych komórek służące do badania chemotaksji. Przedstawiamy metody mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej zdarzeń sygnalizacyjnych w migrujących komórkach. Pomiar zdarzeń sygnalizacyjnych pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna GPCR umożliwia wyczuwanie gradientu chemoatraktantów i kontroluje kierunkową migrację komórek eukariotycznych.

Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Proste metody wykrywania selektywnej aktywacji białek G przez receptory sprzężone z białkiem G pozostają wyjątkowym wyzwaniem w sygnalizacji komórkowej. W tym przypadku biosensory rezonansowego transferu energii (FRET) Fӧrster zostały opracowane poprzez parowanie peptydów GPCR z białkiem G w celu zbadania zmian konformacyjnych w kontrolowanych stężeniach w żywych komórkach.

Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Przedstawiono procedurę wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się jak myszy. Ulepszony reporter aktywności kinazy A, tAKARα, ulega ekspresji w neuronach korowych i jest dostępny do obrazowania przez okno czaszkowe. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej służy do wizualizacji aktywności PKA in vivo podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Ze względu na niski stosunek sygnału do szumu (SNR) czujników opartych na transferze energii rezonansu (FRET) Fӧrster, pomiar sygnałów cAMP był wyzwaniem, zwłaszcza w trzech wymiarach przestrzennych. W tym miejscu opisujemy metodologię obrazowania i analizy hiperspektralnej FRET, która umożliwia pomiar rozkładu cAMP w trzech wymiarach przestrzennych.

Pomiar trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach przy użyciu 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Poznaj metodę kwantyfikacji oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G in vivo przy użyciu spektralnie rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej. Technika ta umożliwia badanie oligomerów białkowych w żywych komórkach drożdży.

In vivo (in vivo) Kwantyfikacja oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G przy użyciu spektralnie rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej (Wideo) | JoVE Journal

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Przeglądaj więcej filmów