In vivo (in vivo) Kwantyfikacja oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G przy użyciu spektralnie rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej
19 stycznia 2011
Wykorzystując spektralnie rozdzielczy dwufotonową mikroskopię obrazowania, uzyskuje się mapy na poziomie pikseli efektywności transferu energii rezonansu Förstera (FRET) dla komórek wyrażających receptory błonowe, co do których przypuszczalnie powstają kompleksy homo-oligomeryczne. Na podstawie map wydajności FRET jesteśmy w stanie oszacować informacje stechiometryczne o badanym kompleksie oligomerów.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie metryki stoia i informacji strukturalnych o białku. Wszystkie kompleksy więzadłowe wyrażające żywe komórki biologiczne, komórki drożdży są genetycznie modyfikowane w celu ekspresji interesujących białek przyłączonych do sondy fluorescencyjnej dawcy lub akceptora. Sondy dawcze mogą być wzbudzane bezpośrednio za pomocą lasera.
Podczas gdy akceptory mogą być wzbudzone tylko poprzez transfer energii od pobliskiego wzbudzonego dawcy, komórki są wystawione na działanie światła z pulsującego lasera w bliskiej podczerwieni. Fluorescencyjne inseminacje z sond są rozdzielane na składowe widmowe za pomocą siatki transmisyjnej i rzutowane na powierzchnię matrycy CCD zwielokrotniającej elektrony. W związku z tym uzyskuje się pełne widma fluorescencyjne z indywidualnych, wszystkich więzadeł dla każdej pozycji w próbce.
Profil spektralny wykrytej fluorescencji zależy od specyficznej interakcji badanych białek. Dane są analizowane w celu określenia dla każdego piksela obrazu komórki skanującej oddzielnych emisji z sondy donorowej i akceptorowej. Wydajność transferu energii jest określana dla każdego piksela obrazu, a następnie piksele są zaginane zgodnie z ich wydajnością progową i histogramem.
Interpretacja histogramu pozwala na określenie in vivo białka, wielkości i konfiguracji kompleksu. Cześć, nazywam się Michael Stoneman i pracuję w Riku Research Group na Uniwersytecie Wisconsin w Milwaukee. Nazywam się Singh.
Pochodzę z Rikus Lab w Wisconsin, Milwaukee. Główną zaletą tej techniki jest to, że pełne profile emisyjne z setek wszystkich kompleksów więzadłowych w komórce uzyskuje się za pomocą jednego pełnego skanu komórki. Zazwyczaj większość metod mikroskopii fluorescencyjnej wymaga wielokrotnego skanowania komórki będącej przedmiotem zainteresowania w celu zgromadzenia wystarczającej ilości informacji spektralnych w celu określenia wydajności progów w różnych obszarach zainteresowania w komórce.
Jednak dyfuzyjne reakcje biochemiczne mogą zmienić skład molekularny tych obszarów zainteresowania, a tym samym ograniczyć informacje uzyskane w skanie obrazu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu białek, interakcji białek w żywych komórkach, takich jak jaka jest szkodliwość oligomerów? Na jakim etapie cyklu życiowego białka uprawiają oligomery i jaka jest rola oligomeru tego białka w funkcjonowaniu komórki?
Dwa mikroskopy fotograficzne o rozdzielczości spektralnej gromadzą informacje spektralne o kompleksach olima w komórce obrazu, skanując ognisko wiązki wzbudzenia w badanej próbce w wielu lokalizacjach. Para ortogonalnych luster skanujących służy do przesuwania ogniska wiązki laserowej na próbkę w dwóch różnych kierunkach. Ruch luster skanujących jest sterowany komputerowo i zsynchronizowany z ekstrakcją danych o natężeniu fluorescencji z kamery CCD ze skanów liniowych, można zrekonstruować mapy przestrzenne intensywności fluorescencji odpowiadające określonej długości fali światła.
Aby dokładnie zrekonstruować mapy przestrzenne intensywności fluorescencji promieniowania rentgenowskiego i obliczyć rzeczywistą długość fali odpowiadającą każdej z tych map, protokół skanowania liniowego musi zostać skalibrowany przy użyciu roztworu fluoresceiny. Aby rozpocząć procedurę kalibracji, wyślij do widma wzbudzenia o długości fali 800 nanometrów, co jest dwukrotnością maksymalnej długości fali wzbudzenia znacznika dawcy GFP dwa dwa, aby wysłać do widma wzbudzenia, przetłumacz pryzmat znajdujący się we wnęce lasera, aby zmodyfikować dyspersję prędkości grupy za pomocą programu komputerowego, do którego podłączona jest kamera. Wyślij polecenie do układu CCD, aby obniżyć temperaturę układu CCD do najniższej osiągalnej temperatury.
W celu redukcji ciemnego szumu. Pobrać pipetę 10 mikrolitrów roztworu fluoresceiny na szkiełko mikroskopowe z szkiełkiem nakrywkowym, tak aby cienka warstwa próbki była równomiernie rozproszona w obszarze między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem mikroskopowym, a następnie umieścić niewielką kroplę oleju immersyjnego na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Teraz przymocuj mikroskop, przesuń do stolika translacyjnego XY, Z i przesuń szkiełko i stolik w kierunku osi optycznej Ręcznie regulując siłownik liniowy, przesuwaj szkiełko, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z kroplą olejku immersyjnego, przełącz kamerę w tryb akwizycji danych wideo, aby dopuszczone światło padające na matrycę CCD było wyświetlane na ekranie komputera w czasie rzeczywistym.
Wyłącz wszystkie światła otoczenia w pomieszczeniu, aby zmniejszyć szum tła wykrywany na matrycy CCD. Powoli wyreguluj mikrometr kontrolujący stopień translacji w kierunku osi optycznej, aby wprowadzić próbkę do ogniska wiązki laserowej. Gdy próbka fluoresceiny jest ostra, emisja pojawi się jako ostra linia na matrycy CCD.
Pobierz odczyt intensywności pikseli z matrycy CCD do komputera. Zmierz intensywność pikseli w funkcji położenia na matrycy CCD, otwierając pobraną matrycę wartości intensywności na obrazie J i rysując linię przechodzącą przez obszar fluorescencyjny. Użyj polecenia dnia zdjęciowego.
Przeanalizuj profil wykresu, aby utworzyć wykres ilustrujący widmo emisji próbki fluoresceiny. Dostosuj parametr przyrostowy lustra, który steruje ruchem lasera. Ustawić ostrość w kierunku Y, tak aby sąsiednie pozycje y w próbce powodowały ruch piku widm fluorescencyjnych o dokładnie jeden piksel wzdłuż wymiaru widmowego na matrycy CCD.
Aby to monitorować, należy pobrać intensywność widm fluoresceiny dla dwóch różnych pozycji Y w próbce. Następnie otwórz obrazy intensywności z obrazem J i znajdź pozycję piku pikseli dla każdego z widm fluorescencyjnych. Używając kursora obrazu J, pozostawiając otwartą migawkę przetwornika CCD, zeskanuj ostrość lasera w poprzek próbki w kierunku X.
Światło emitowane z każdego woksela wzdłuż linii skanowania powinno padać na matrycę CCD na końcu każdego skanowania liniowego, przechowywać dane z tablicy CCD uzyskane dla tego skanowania liniowego, a następnie czyścić piksele tablicy CCD. Przesuń pozycję lasera. Ustaw ostrość w kierunku Y o wartość określoną wcześniej.
Następnie zeskanuj wiązkę laserową w kierunku X w poprzek próbki. Po raz kolejny, pozostawiając otwartą migawkę CCD, przechowuj dane. Powtarzaj tę procedurę skanowania linii, aż obszar fizyczny o około 50% większy niż wymiary pojedynczej komórki biologicznej zostanie oświetlony światłem laserowym.
Zależność między numerem wiersza konkretnego obrazu skanowania linii a długością fali powinna być wykorzystana do rekonstrukcji obrazów w celu uzyskania wielu map fluorescencyjnych twarzy byłej żony na różnych długościach fal. Aby uzyskać obraz fluorescencyjny byłej żony dla określonej długości fali, znajdź numer wiersza na obrazie uzyskanym ze skanowania pierwszej linii, który odpowiada tej długości fali. Następnie sąsiedni wiersz kolejnego obrazu skanowania liniowego odpowiada następnemu wierszowi obrazu emisji fluorescencyjnej.
Dla tej konkretnej długości fali ułóż w stos wszystkie wiersze obrazu, które odpowiadają tej długości fali, aby uzyskać mapy przestrzenne intensywności fluorescencji XY próbki na tej długości fali. Powtórz tę procedurę dla wszystkich innych możliwych do uzyskania długości fal, aby zebrać dane o próbkach. Najpierw wyjmij z inkubatora płytki z przekształconymi koloniami drożdży.
Powinny istnieć co najmniej trzy rodzaje transformowanych komórek. Komórki wyrażające interesujące białka oznaczone obydwoma typami sond fluorescencyjnych. Komórki wykazujące ekspresję tylko białek znakowanych sondami fluorescencyjnymi dawcy oraz komórki wyrażające tylko białka znakowane akceptorowymi sondami fluorescencyjnymi.
Dodaj 100 mikrolitrów 100-milimolowego chlorku potasu do mikroprobówki wirówkowej. Następnie za pomocą końcówki mikropipety zeskrob od trzech do pięciu kolonii drożdży z płytki komórek wyrażających białka oznaczone zarówno donorem, jak i z wyjątkiem sond fluorescencyjnych i zaszczepić 100-milimolowy chlorek potasu. W przypadku tych komórek usuń 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i dozuj ją do świeżego mikroskopu. Zjeżdżalnia.
Przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym i umieść kroplę oleju na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Następnie ręcznie zamknij migawkę na drodze wiązki laserowej, aby zablokować światło lasera przed dotarciem do obiektywu mikroskopu. Przymocuj szkiełko mikroskopu do stolika translacyjnego XY, Z i przesuń stolik szkiełka w kierunku osi optycznej, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z kroplą olejku immersyjnego.
Teraz włącz oświetlenie światłem szerokokątnym i przejdź do kamery. Wideo tryb zbierania danych. Obraz o szerokim polu widzenia próbki będzie mocno rozmyty ze względu na obecność siatki transmisyjnej na ścieżce emisji.
W związku z tym należy umieścić filtr pasmowo-przepustowy o małej pełnej szerokości i połowie maksimum w torze optycznym poprzedzającym siatkę transmisyjną. Powoli przesuwaj etap translacji w kierunku osi optycznej, przeglądając obraz komórek na ekranie aparatu, aż komórki zostaną ustawione na ostrości. Przesuń stolik w kierunku X lub Y, aby przesunąć pojedynczą komórkę w miejsce, w którym skupia się wiązka laserowa.
Wyłącz źródło oświetlenia szerokokątnego i wyjmij filtr ścieżki pasma ze ścieżki emisji. Odblokuj wiązkę laserową na krótki czas, jednocześnie oglądając sygnał odbierany na matrycy CCD. Jeśli sygnał fluorescencyjny zostanie wykryty na matrycy CCD w czasie, gdy wiązka laserowa pada na komórkę, wykonaj pełne skanowanie tej komórki w celu uzyskania danych fluorescencyjnych.
Istotne jest, aby używać tych samych parametrów skanowania, w szczególności liczby linii i przyczyny przyrostu, jak określono w procedurze kalibracji przedstawionej wcześniej. Powtórz proces lokalizacji komórki i pozyskiwania danych fluorescencyjnych dla dużej liczby komórek wykazujących ekspresję białka przyłączonego zarówno do znaczników dawcy, jak i znaczników akceptorowych. Po zgromadzeniu wystarczającej ilości obrazów fluorescencyjnych komórek wyrażających białka oznaczone obydwoma receptorami, powtórz cały proces dla obu komórek, wyrażając tylko białka oznaczone sondami fluorescencyjnymi dawcy i komórek wyrażających tylko białka oznaczone akceptorowymi sondami fluorescencyjnymi.
Na koniec zrekonstruuj wszystkie skany, aby uzyskać rozdzielczość spektralną. Mapy przestrzenne intensywności fluorescencji XY dla każdego zestawu danych przy użyciu procedury opisanej wcześniej zilustrowanej na tych trzech rysunkach są wynikowymi mapami przestrzennymi obliczonymi na podstawie dwóch pomiarów mikroskopii fotonowej w rozdzielczości spektralnej przeprowadzonych na komórce drożdży wykazującej ekspresję sterylnego receptora czynnika alfa. Dwuwymiarowe mapy sygnałów donorowych i akceptorowych uzyskano z analizy profili emisji widmowych uzyskanych z każdej lokalizacji komórki.
Intensywności fluorescencji są przypisywane fałszywe kolory zgodnie z ich wartościami, a skala jest pokazana jako wstawka. Dwuwymiarowa mapa pozornej sprawności progów została następnie obliczona przy użyciu obrazów KDA i KAD przy użyciu wartości wyodrębnionych z mapy pozornej wydajności progów komórki, która właśnie została pokazana, przygotowano wykres histogramu. Zmierzone wartości EAPP komórki są reprezentowane przez okręgi.
Czerwona linia ciągła reprezentuje najlepsze dopasowanie do mierzonych danych przy użyciu sumy poszczególnych funkcji wapnia reprezentowanych przez ciągłe zielone linie. Analiza histogramu, który jest opisany w tekście protokołu, potwierdza, że sterylny kompleks wszystkich więzadeł receptora dwóch czynników alfa przyjmuje postać tetrameru w kształcie RBA in vivo. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 12 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tego eksperymentu ważne jest, aby utrzymać moc źródła wzbudzenia na niskim poziomie. Ważne jest, aby unikać wielokrotnego pobudzenia dawcy przez pojedynczy impuls.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu zastosowano system obrazowania za pomocą spektroskopowej mikroskopii dwufotonowej w celu uzyskania map wydajności transferu energii rezonansowej Fёрstera (FRET) na poziomie pikseli w komórkach wykazujących ekspresję receptorów błonowych. Mapy wydajności FRET pozwalają na oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanych kompleksów oligomerycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Przeniesienie energii rezonansowej Förstera (FRET) jest potężną techniką badania oddziaływań białkowych.
- Zrozumienie stechiometrii kompleksów białkowych jest kluczowe dla wyjaśnienia ich funkcji.
- Mikroskopia dwufotonowa umożliwia obrazowanie głębokich tkanek przy minimalnym uszkodzeniu fotochemicznym.
- Genetycznie zmodyfikowane komórki mogą ekspresować specyficzne białka znakowane sondami fluorescencyjnymi do analizy FRET.
Cel badania
- Aby określić informacje stechiometryczne i strukturalne dotyczące kompleksów białkowych.
- Aby zbadać tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych w żywych komórkach.
- Aby pogłębić zrozumienie oddziaływań receptorowych na poziomie komórkowym.
Zastosowane metody
- Inżynieria genetyczna komórek drożdży w celu ekspresji interesujących białek z użyciem sond fluorescencyjnych.
- Wzbudzanie sond donora za pomocą impulsowego lasera bliskiej podczerwieni.
- Rozdział emisji fluorescencyjnej na komponenty widmowe przy użyciu siatki transmisyjnej.
- Projekcja danych widmowych na matrycę CCD z mnożeniem elektronów w celu analizy.
Główne wyniki
- Pomyślnie wygenerowano mapy wydajności FRET na poziomie pikseli.
- Na podstawie map FRET oszacowano informacje stechiometryczne dotyczące kompleksów oligomerycznych.
- Metodologia ta wykazała skuteczność w obrazowaniu żywych komórek biologicznych.
- Uzyskano nową wiedzę na temat oddziaływań receptorów błonowych.
Wnioski
- Badanie przedstawia nowatorskie podejście do analizy oddziaływań białkowych w żywych komórkach.
- Obrazowanie FRET może ujawnić istotne szczegóły dotyczące tworzenia się kompleksów receptorowych.
- Technika ta znajduje potencjalne zastosowanie w zrozumieniu różnych procesów biologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda umożliwia kwantyfikację oddziaływań białko-białko na poziomie pojedynczych pikseli w żywych komórkach z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej z rozdzielczością spektralną, dostarczając informacji stechiometrycznych i strukturalnych na temat kompleksów oligomerycznych. Dzięki rejestracji pełnych danych spektralnych w jednym skanowaniu zredukowano artefakty czasowe wynikające z dynamiki molekularnej podczas akwizycji, co zwiększa wiarygodność danych w procesie walidacji celu. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach odkrywania leków poprzez wyjaśnienie stanów oligomeryzacji receptorów, co pozwala na zwiększenie pewności predykcyjnej w dalszych badaniach przesiewowych oraz w wysiłkach związanych z identyfikacją związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez określanie rozmiaru oraz konfiguracji oligomerów receptorów błonowych, takich jak GPCR, in vivo.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczne ograniczanie ryzyka dzięki bezpośredniej wizualizacji złożonej stechiometrii, co zmniejsza niejednoznaczność w zakresie mechanizmu działania celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie ilościowych, rozdzielczych przestrzennie map wydajności FRET, które korelują z funkcjonalnymi stanami receptorów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne eksponujące znakowane receptory do późniejszego przesiewania związków z określonymi poziomami bazowymi interakcji.
- Wynik ilościowy: Generuje pomiary wydajności FRET na poziomie piksela, umożliwiając powtarzalne, rozdzielone spektralnie odczyty dla standaryzacji analizy.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Ułatwia skalowalne procesy obrazowania stosowalne do każdego białka znakowanego fluorescencyjnie, wspierając ponowne wykorzystanie aparatury w różnych projektach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Wykorzystuje ekspresowane w drożdżach sterylne receptory czynnika 2 α jako model oligomeryzacji GPCR, co jest zgodne z badaniami translacyjnymi nad funkcją receptorów w kontekstach zbliżonych do naturalnych.
- Ciągłość mechanistyczna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez powiązanie struktury oligomeru z funkcją komórkową, co wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o ocenę ryzyka.
- Zgodność z biomarkerami: Umożliwia korelację stanów interakcji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową, co dostarcza danych do opracowania przedklinicznych modeli z rozwarstwieniem według biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć — od walidacji celu, poprzez opracowanie testu, aż po walidację przedkliniczną — dostarczając danych o interakcjach z rozdzielczością przestrzenną, co wspomaga identyfikację związków wiodących oraz dalsze analizy mechanistyczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez rozstrzyganie stanów oligomeryzacji GPCR w żywych komórkach, co zmniejsza niepewność mechanistyczną.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne mapy fluorescencji z ilościowymi wynikami FRET, umożliwiając wiarygodne przesiewanie związków w odniesieniu do określonych linii bazowych oddziaływań.
- Analityka: Zapewnia rozdzielanie widm (spectral unmixing) oraz analizę wydajności FRET w oparciu o histogramy, co pozwala na ilościowe porównania między różnymi warunkami w celu optymalizacji związków wiodących.
- Badania translacyjne: Łączy strukturę oligomeru z jego funkcją w systemie istotnym dla danej choroby, wspierając dopasowanie biomarkerów i ciągłość badań przedklinicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania obrazowania do badania dowolnego białka znakowanego fluorescencyjnie w żywych komórkach, maksymalizując użyteczność platformy w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w oligomeryzacji receptorów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki jednorazowej akwizycji widmowej, minimalizując zmienność czasową.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając informacji strukturalnych, które redukują ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju leku.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o zwalidowaną stechiometrię oddziaływań i konfigurację kompleksów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu mikroskopii fluorescencyjnej, rozdzielania widmowego (spectral unmixing) oraz teorii FRET w celu dokładnej interpretacji danych.
- Zależy od zastosowania dwufotonowego mikroskopu z rozdzielczością spektralną, wyposażonego w siatkę transmisyjną, detektor EMCCD oraz możliwości kalibracji lasera.
- Wymaga standaryzacji przygotowania komórek, protokołów znakowania oraz parametrów obrazowania pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia modyfikacji podczas przenoszenia metody z drożdży na systemy ssacze lub pierwotne hodowle komórkowe ze względu na różnice w ekspresji i obrazowaniu.
- Jest ograniczony koniecznością zastosowania optymalnych par fluoroforów i rozdzielczości spektralnej, aby uniknąć przenikania sygnału (bleed-through) w pomiarach FRET.
