Name: Oznaczanie toksyczności β-amyloidu przy użyciu transgenicznego modelu C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Poznaj metodę oznaczania toksyczności β-amyloidu w modelu C. elegans z indukowalną ekspresją w mięśniach. Protokół umożliwia szybkie i ekonomiczne testowanie leków oraz modyfikatorów genetycznych toksyczności Aβ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować obecnym i byłym członkom laboratorium Link, którzy pomogli w opracowaniu opisanych tutaj protokołów, w szczególności Gin Fonte, która opracowała pierwotną procedurę. Praca ta była wspierana przez granty z NIH (AG12423) oraz Alzheimer's Association (Zenith Award) przyznane C.D.L.

1) Przygotowanie płytek z pożywką do wzrostu nicieni do testu paraliżu.
Testy paraliżu przeprowadza się na standardowych płytkach z pożywką NGM (Nematode Growth Media), rutynowo stosowanych do hodowli i badań genetycznych C. elegans (Stiernagle, 2006).
<ol>
 <li>Roztwór NGM zawierający NaCl, Agar i Pepton w kolbie Erlenmeyera poddać autoklawowaniu, a następnie dodać odpowiednie ilości sterylnego CaCl2, uracylu, cholesterolu, 1M MgSO4 oraz 1M KPO4. Do każdej szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm odmierzyć 10 mL ciekłego NGM. Pozostawić NGM do zastygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>W przypadku badania wpływu związków/ekstraktów, nanieść ekstrakt na każdą płytkę i za pomocą rozwieracza równomiernie rozprowadzić go po powierzchni szalki. Pozostawić ekstrakt do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Objętości przekraczające 1 mL będą wymagały więcej czasu na wyschnięcie.</li>
 <li>Na każdą płytkę nanieść kroplą 250 μL szczepu E. coli OP5O hodowanego przez noc w pożywce LB do uzyskania gęstości optycznej 0,4–0,6. Pozostawić bakterie do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Istotne zmienne
Wiek szalek ma istotny wpływ na test paraliżu, ponieważ starsze szalki mają tendencję do wysychania. Należy używać szalek przygotowanych nie wcześniej niż tydzień przed wykonaniem testu paraliżu. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy przygotować szalki na 3-4 dni przed zainicjowaniem synchronicznych populacji nicieni [patrz punkt (2) poniżej]. W każdym eksperymencie należy używać wyłącznie szalek przygotowanych z tej samej partii.
Zmiana wielkości trawnika bakteryjnego (np. punktowy w porównaniu z rozlanym) i/lub rodzaju bakterii wpłynie również na zachowanie nicieni. Testy paraliżu można przeprowadzać, wykorzystując alternatywne szczepy E. coli jako źródło pożywienia (np. szczep HT115 stosowany w eksperymentach RNAi poprzez podawanie w pożywce), jednak może to zmienić kinetykę paraliżu, co wymaga zastosowania odpowiednich kontroli wewnętrznych.
2) Przygotowanie populacji nicieni zsynchronizowanych pod względem wieku
Szczep CL4176 (smg-1(cc546ts) I; dvIs27 [myo-3/ minigen Aβ + gen markerowy rol-6(su1006)] X) jest najczęściej stosowany do badania paraliżu indukowanego przez Aβ. Ten szczep oraz inne modele transgeniczne są dostępne dla pracowników naukowych z uczelni za niewielką opłatą z Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).
<ol>
 <li>Aby zmaksymalizować synchronizację wieku populacji testowej, zaleca się rozpoczęcie od zsynchronizowanego pokolenia rodzicielskiego. Na tydzień przed rozpoczęciem testu paraliżu populacji testowej, za pomocą platynowej igły do przenoszenia nicieni należy przenieść 20-30 dorosłych osobników z jajami (gravid adults) na kilka płytek NGM o średnicy 10 cm z wysianym szczepem OP50, aby umożliwić składanie jaj przez 2 godziny w temperaturze 16°C (temperatura dopuszczalna dla szczepu CL4176). Następnie należy usunąć dorosłe osobniki i pozwolić potomstwu rosnąć przez 7 dni, aż osiągną etap dorosłych osobników z jajami w „drugim dniu”. </li>
 <li>(Dzień 1) Dorosłe osobniki z jajami w drugim dniu są wykorzystywane do przygotowania zsynchronizowanych pod względem wieku populacji testowych. Celem dla każdego warunku doświadczalnego jest przygotowanie trzech powtórzeń na płytkach, z których każda zawiera 50-75 zsynchronizowanych pod względem wieku nicieni. Za pomocą platynowej igły do przenoszenia nicieni należy przenieść 10-12 dorosłych osobników z jajami z drugiego dnia na płytki NGM o średnicy 60 mm (objętość 10 mL) z naniesionym szczepem OP50. Należy pozwolić nicieniom składać jaja w temperaturze 16°C przez 2 godziny, a następnie usunąć dorosłe osobniki i pozwolić jajom wykluć się oraz rosnąć w temperaturze 16°C. Na tym etapie najlepiej, aby płytki zostały zakodowane przez osobę, która nie będzie przeprowadzać oceny, tak aby oceniający nie znał warunków doświadczalnych.</li>
</ol>
Istotne zmienne
Stadium rozwoju embrionalnego w momencie składania jaj (~stadium 26 komórek dla nicieni typu dzikiego w optymalnych warunkach) jest funkcją wieku oraz odżywienia osobników dorosłych. Jeśli użyte do przygotowania populacji testowej dorosłe samice ciężarne są starsze lub głodzone, składane będą jaja w późniejszym stadium, co zmniejszy synchronizację wieku populacji oraz powtarzalność kinetyki paraliżu. Niezbędne jest stosowanie kultur monoaksenicznych (tj. zawierających wyłącznie bakterie OP50), ponieważ zanieczyszczenia mikrobiologiczne mogą poważnie wpłynąć na ten test; powtarzalność jest najwyższa, gdy na trzech powtórzonych płytkach znajduje się podobna liczba nicieni.
3) Indukcja transgenu i test paraliżu
<ol>
 <li>(Dzień 3) Przenieś płytki do temperatury 25°C 48 godzin po zakończeniu synchronicznego znoszenia jaj; nicienie powinny znajdować się w trzecim stadium larwalnym (L3). Płytki należy ułożyć w inkubatorze w 25°C bez nakładania ich na siebie, aby wszystkie osiągnęły temperaturę 25°C w tym samym czasie.
</li>
 <li>(Dzień 4) Rozpocznij ocenę paraliżu nicieni (szczep CL4176) od 18 do 20 godzin po rozpoczęciu wzrostu temperatury. W tym momencie wszystkie nicienie w populacji powinny osiągnąć czwarte stadium larwalne (L4). Kontynuuj ocenę w odstępach dwugodzinnych, aż wszystkie nicienie na każdej z płytek zostaną sparaliżowane. Z nieznanych przyczyn paraliż nie postępuje równomiernie wzdłuż ciała: region głowy jest ostatnią częścią nicienia, która przestaje się poruszać. W związku z tym nicienie, u których niedawno rozpoczął się paraliż, nie mogą przemieszczać się po płytce, ale mogą poruszać głowami, oczyszczając w ten sposób bakterie wokół przedniej części ciała i pozostawiając „halo” oczyszczonych bakterii. Nicienie te nieuchronnie ulegną całkowitemu paraliżowi, dlatego nicienie z halo są klasyfikowane jako sparaliżowane. Niektóre nicienie nie będą miały halo, ale również nie wykażą spontanicznego ruchu; są one sprawdzane poprzez dotknięcie zgłębnikiem do nicieni. Jeśli dotknięty nicień nie jest w stanie wykonać pełnej fali skurczu ciała, jest on również oceniany jako sparaliżowany. Aby usprawnić ocenę, najłatwiej jest przenieść sparaliżowane nicienie do nieoznaczonego sektora płytki, tak aby nie zostały one nieumyślnie ponownie ocenione w następnym okresie. (Pozwala to również błędnie sklasyfikowanym nicieniom wykazać ruch, co umożliwia korektę oceny).</li>
 <li>Aby wygenerować krzywą paraliżu, w każdym punkcie czasowym frakcja nicieni na każdej płytce, które nie zostały sparaliżowane, jest przeliczana na procent, a średni procent „niesparaliżowanych” jest nanoszony na wykres w funkcji czasu od momentu rozpoczęcia wzrostu temperatury. (Uzasadnieniem dla takiego sposobu przedstawienia danych jest fakt, że wynikowa krzywa jest formalnie analogiczna do krzywej przeżywalności, a zatem może być analizowana przy użyciu standardowych nieparametrycznych statystyk przeżywalności).</li>
</ol>
Istotne zmienne
Podwyższenie temperatury u transgenicznych nicieni myo-3/Aβ musi nastąpić przed osiągnięciem przez nie połowy stadium L4, aby zainicjować paraliż, ponieważ promotor myo-3 jest regulowany rozwojowo i wykazuje znacząco obniżoną ekspresję w późnym stadium L4 lub u osobników dorosłych. Podobnie, ekspresja tego transgenu jest blokowana w przypadku zagłodzenia nicieni, dlatego niezbędne jest, aby zwierzęta były dobrze karmione przez cały czas trwania eksperymentu. Nigdy nie zaobserwowano, aby sparaliżowany nicień powrócił do sprawności w żadnych warunkach, a po 12-16 hr podwyższenia temperatury wszystkie nicienie szczepu CL4176 ulegną paraliżowi, nawet jeśli zostaną przeniesione z powrotem do 16°C. W szczepie CL4176 wystarczająca nadekspresja transgenu prowadząca do paraliżu może wystąpić w niższych temperaturach (tj. 20-25°C), choć czas wystąpienia paraliżu ulegnie zmianie. Tempo paraliżu zależy od konkretnego użytego szczepu transgenicznego (stworzyliśmy szczepy myo-3/Aβ o tempie paraliżu zarówno szybszym, jak i wolniejszym niż w przypadku CL4176), zatem w przypadku alternatywnych szczepów może być konieczna korekta okna oceny.
4) Reprezentatywne wyniki
Na Rysunku 1 przedstawiono wykres krzywej paraliżu dla szczepu CL4176, zarówno nieleczonego, jak i eksponowanego na 6,27 mM kofeiny (stężenie końcowe na płytce NGM). Zabieg ten skutkuje wysoce istotnym statystycznie opóźnieniem paraliżu o około 4 h, co interpretujemy jako dowód na supresję toksyczności Aβ w tym modelu. Na Rysunku 2 przedstawiono niezależny eksperyment badający efekty kafestolu, innego związku występującego w kawie. Wykres ten jest typowy dla zabiegów, które nie wpływają na toksyczność Aβ. Należy zauważyć, że w obu eksperymentach około połowa nieleczonych populacji CL4176 jest sparaliżowana w 24 h, a paraliż jest całkowity do 28 h. Są to typowe ramy czasowe dla paraliżu kontrolnych populacji CL4176. Znaczne odchylenia od tego czasu świadczą o zmienionych warunkach środowiskowych lub spontanicznej delecji kopii transgenu. (CL4176 zawiera zintegrowaną z chromosomem macierz transgeniczną z wieloma kopiami transgenu myo-3/Aβ. Chociaż ta macierz transgeniczna jest zazwyczaj dość stabilna, każda propagacja szczepu w temperaturach &gt;16°C spowoduje selekcję rzadkich osobników, u których doszło do spontanicznej delecji transgenów, co prowadzi do powstania wariantów o obniżonej ekspresji Aβ i wolniejszym przebiegu paraliżu).
<img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Wykres procentowego paraliżu w czasie; porównanie zestawu danych dla kofeiny i grupy nieleczonej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Krzywa paraliżu dla nicieni szczepu CL4176 nieleczonych lub eksponowanych na 6.27 mM kofeiny (Sigma). Wskazane czasy liczone są od momentu rozpoczęcia podwyższenia temperatury. Słupki błędów = S.E.M.
<img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Wykres efektu działania kafestolu, % nie sparaliżowanych vs czas, analiza porównawcza, wizualizacja danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Krzywa paraliżu dla nicieni CL4176 poddanych działaniu 0.48 mM kafestolu (Sigma). Słupki błędów = S.E.M.

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
<li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li>
<li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+beta-peptide+%281-42%29+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li>
<li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li>
<li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li>
<li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisany przez nas protokół może być skutecznie wykorzystany do badania wpływu związków na toksyczność Aβ. Opublikowane przykłady obejmują wpływ składników ekstraktu z Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) oraz rezerpiny (Arya et al. 2009). Wykazano również, że związki, które działały ochronnie przeciwko toksyczności Aβ w innych układach, wykazują działanie ochronne także w tym modelu (np. memantyna, nasze niepublikowane wyniki). Istotnym uzasadnieniem dla opracowania tego modelu jest fakt, że dobrze rozwinięte narzędzia genetyczne i molekularne dostępne dla C. elegans mogą być wykorzystane do badania mechanizmów toksyczności Aβ. W związku z tym można badać wpływ specyficznych mutacji na toksyczność Aβ (np. efekt redukcji sygnalizacji insulinopodobnej poprzez wprowadzenie mutacji utraty funkcji daf-2, Florez-McClure et al. 2007), a model ten może służyć również do badania efektów nadekspresji transgenów (Fonte et al. 2008). Ostatnio w szerokim zakresie wykorzystaliśmy ten model do zbadania wpływu pojedynczych podstawień aminokwasowych w Aβ na toksyczność (dane niepublikowane).
Opisany tutaj model transgeniczny służy do badania wpływu ostrej ekspresji Aβ na funkcje komórek mięśniowych. W momencie wystąpienia paraliżu komórki mięśniowe i ich sarkomery pozostają nienaruszone; fenotyp paraliżu nie jest wynikiem śmierci komórek mięśniowych. Jednak po wystąpieniu paraliżu (~48 hr po początkowym podniesieniu temperatury) dochodzi do utraty integralności mięśni i ostatecznie do śmierci nicieni. Nie badaliśmy tego wtórnego efektu ekspresji Aβ i nie wykorzystywaliśmy go jako markera toksyczności.
Opisany tutaj model indukowalnej ekspresji Aβ nie jest odpowiedni do badania terapii modulujących samo tworzenie się β-amyloidu. Chociaż robaki transgeniczne z konstytutywną ekspresją Aβ tworzą łatwo wykrywalne złogi amyloidowe (Fay et al. 1998; Link et al. 2001), robaki transgeniczne z indukowalną ekspresją Aβ rzadko wykazują złogi amyloidu, a fenotyp paraliżu wydaje się niezależny od odkładania się amyloidu (Drake et al. 2003). Nasze wyniki są zgodne z poglądem, że ostra toksyczność indukowalnej ekspresji Aβ wynika z akumulacji rozpuszczalnych oligomerów Aβ, a nie z odkładania się amyloidu.

<table><tbody><tr><td>NaCl (6g)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar (40g)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>Pepton (5g)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (2L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2mL)</td><td></td><td></td><td>147,02mg/mL w ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Uracyl (2mL)</td><td></td><td></td><td>2mg/mL w ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Cholesterol (2mL)</td><td></td><td></td><td>5mg/mL w etanolu (nie autoklawować)</td></tr><tr><td>1M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (2mL)</td><td></td><td></td><td>246,5mg/mL w ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (50mL)</td><td></td><td></td><td>98mg KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.mL, 48mg K2HPO4/mL w ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, pH</td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu c. elegans

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Powszechnie uważa się, że akumulacja peptydu β-amyloidu (Aβ) odgrywa kluczową rolę w indukcji choroby Alzheimera, jednak odpowiednie mechanizmy toksyczności pozostają niejasne. Aβ odkłada się również w mięśniach w przebiegu zapalenia mięśni z ciałami inkluzyjnymi, ciężkiej ludzkiej miopatii. Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego Aβ. W zależności od tkanki lub czasu ekspresji Aβ, nicienie transgeniczne mogą wykazywać łatwo mierzalne fenotypy, które służą jako wskaźnik toksyczności Aβ. Na przykład nicienie transgeniczne z panneuronalną ekspresją Aβ wykazują deficyty w uczeniu się asocjacyjnym (Dosanjh et al. 2009), podczas gdy nicienie transgeniczne z konstytutywną ekspresją specyficzną dla mięśni wykazują postępujący, zależny od wieku fenotyp paraliżu (Link, 1995; Cohen et al. 2006). Jeden szczególnie użyteczny model C. elegans wykorzystuje mutację wrażliwą na temperaturę w systemie nadzoru mRNA, aby uzyskać indukowaną temperaturą ekspresję transgenu Aβ w mięśniach, co skutkuje powtarzalnym fenotypem paraliżu po podniesieniu temperatury (Link et al. 2003). Metody leczenia przeciwdziałające toksyczności Aβ w tym modelu [np. ekspresja transgenu ochronnego (Hassan et al. 2009) lub ekspozycja na ekstrakty z Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] w powtarzalny sposób zmieniają tempo paraliżu indukowanego wzrostem temperatury u tych transgenicznych nicieni. W niniejszym opracowaniu opisujemy nasz protokół pomiaru tempa paraliżu w tym transgenicznym modelu C. elegans, ze szczególnym uwzględnieniem zmiennych eksperymentalnych, które mogą wpływać na ten pomiar.

Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego peptydu β-amyloidu (Aβ). Indukowana ekspresja Aβ w mięśniach C. elegans prowadzi do szybkiego, powtarzalnego fenotypu paraliżu, który może być wykorzystany do monitorowania terapii modulujących toksyczność Aβ.

Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Przyjmuje się powszechnie, że akumulacja peptydu $\beta$-amyloidowego (A$\beta$) odgrywa kluczową rolę w indukowaniu choroby Alzheimera, jednak istotne...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena toksyczności beta-amyloidu w modelu InVivo. Powtarzalność i względna prostota tego testu umożliwiają szybkie badanie wpływu leków, warunków środowiskowych lub modyfikacji genetycznych na toksyczność beta-amyloidu. Kluczowym czynnikiem w opracowaniu tego testu jest wytworzenie transgenicznych nicieni C. elegans z indukowalną temperaturą ekspresją beta-amyloidu specyficzną dla mięśni.Ta ekspresja wrażliwa na temperaturę jest projektowana poprzez konstrukcję transgenu zawierającego nienaturalnie długi niekodujący region 3', co sprawia, że mRNA transgenu staje się celem systemu nadzoru mRNA. Ekspresja tego transgenu jest zatem słaba u nicieni typu dzikiego z funkcjonalnym systemem nadzoru mRNA z powodu degradacji mRNA transgenu. Jeśli transgen ten zostanie wprowadzony do tła genetycznego zawierającego mutację w istotnym komponencie systemu nadzoru mRNA, ekspresja transgenu będzie znacznie wyższa. Jeśli tło genetyczne zawiera mutację wrażliwą na temperaturę w systemie nadzoru mRNA, to namnażanie tego szczepu transgenicznego w temperaturze niepermissywnej zablokuje degradację mRNA transgenu i doprowadzi do wysokiej ekspresji transgenu. Nicienie transgeniczne wykorzystujące ten system do regulacji ekspresji peptydu beta-amyloidu w mięśniach ściany ciała poddane podwyższeniu temperatury z 16 °C do 25 °C wykazują wysoką akumulację peptydu beta-amyloidu, dysfunkcję komórek mięśniowych oraz paraliż nicieni, co pozwala na pomiar czasu.Czas, po którym populacja tych transgenicznych nicieni ulega paraliżowi po podwyższeniu temperatury, stanowi czuły test toksyczności beta-amyloidu. Osiąga się to poprzez przygotowanie świeżych płytek z podłożem do hodowli nicieni (NGM) do testu paraliżu, co pozwala zminimalizować wpływ zmiennych środowiskowych na wskaźniki występowania paraliżu.W drugim kroku inicjuje się populacje robaków transgenicznych o zsynchronizowanym wieku, co minimalizuje wpływ etapu rozwojowego na ekspresję transgenu. Następnie zsynchronizowane osobniki w trzecim stadium larwalnym są przenoszone z temperatury 16 °C do 25 °C, co zwiększa stabilność mRNA transgenu i prowadzi do akumulacji peptydu beta-amyloidu. Pomiar czasu od podwyższenia temperatury do wystąpienia paraliżu u każdego robaka pozwala określić tempo dysfunkcji mięśni, a tym samym ocenić toksyczne efekty akumulacji peptydu beta-amyloidu; uzyskane wyniki wykazują wpływ konkretnych zabiegów na toksyczność endogennie wyrażanego peptydu beta-amyloidu.Główną zaletą naszej techniki, w przeciwieństwie do wykorzystania transgenicznych modeli mysich do oceny aktywności leku, jest to, że możemy przeprowadzić ją znacznie szybciej i przy znacznie mniejszym nakładzie kosztów. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa. Punktacja dla nicieni w stadium L4 w teście paraliżu jest bardzo trudna do opanowania.Podczas oceny paraliżu u robaka w stadium L4, należy zwrócić uwagę na odizolowany ruch „halo” w obszarze głowy zwierzęcia. Jeśli głowa wykazuje taki ruch, podczas gdy reszta ciała robaka pozostaje sparaliżowana, uznajemy go za sparaliżowanego. Testy paraliżu są przeprowadzane na płytkach ze standardową pożywką NGM (nematode growth media), rutynowo stosowaną do hodowli i badań genetycznych C. elegans.Aby przygotować płytki, należy wysterylizować w autoklawie roztwór NGM zawierający chlorek sodu, agar i peptyd w kolbie Erlenmeyera, a następnie dodać odpowiednie ilości następujących sterylnych roztworów, które można znaleźć w załączonym protokole pisemnym. Odmierzyć 10 mililitrów ciekłego NGM do każdej płytki Petriego o wymiarach 60 milimetrów na 15 milimetrów. Pozostawić NGM do zastygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.W przypadku badania wpływu związków lub ekstraktów, nanieś odpowiednią porcję ekstraktu na każdą płytkę i za pomocą rozprzestrzeniacza rozprowadź go równomiernie po całej powierzchni płytki. Pozostaw płytki do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Objętości przekraczające 1 ml będą wymagały więcej czasu na wyschnięcie.Następnie na każdą płytkę nanieś kropelkowo 250 µL szczepu E. coli OP 50 wyhodowanego w pożywce LB przez noc do gęstości optycznej 0,4–0,6 i pozostaw bakterie do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Wiek płytki ma istotny wpływ na wskaźnik paraliżu, a starsze płytki mają tendencję do przesychania. Płytki powinny zostać przygotowane w ciągu jednego tygodnia przed wykonaniem testu paraliżu.W idealnym przypadku należy używać płytek, które zostały zalane od trzech do czterech dni przed synchronicznym zniesieniem jaj; wszystkie płytki wykorzystywane w danym eksperymencie powinny pochodzić z tej samej partii. Zmiana rozmiaru trawnika i/lub rodzaju bakterii wpłynie również na zachowanie nicieni. Testy paraliżu można przeprowadzać z użyciem alternatywnych szczepów E. coli. Na przykład w eksperymentach RNAi stosuje się szczep HT115, co jednak może zmienić kinetykę testu paraliżu.W związku z tym należy zastosować odpowiednie kontrole wewnętrzne dla danej szczepu. Szczep CL 476 jest najczęściej wykorzystywany do oceny paraliżu indukowanego przez beta. Ten szczep oraz inne modele transgeniczne są dostępne dla badaczy akademickich za symboliczną opłatą w Saint Ahadi Genetic Center.W celu maksymalizacji synchronizacji wieku populacji testowej zaleca się rozpoczęcie od zsynchronizowanego pokolenia rodzicielskiego. Na tydzień przed rozpoczęciem testu paraliżu populacji testowej, używając platynowej pęsety do nicieni, przenieś od 20 do 30 dorosłych osobników w stadium grave na kilka 10 centymetrowych płytek NGM.Rozsiać z OP 50 na dwie godziny w celu składania jaj w temperaturze 16 °C, która jest temperaturą dopuszczalną dla CL 4 1 76. Usunąć dorosłe osobniki GR i pozwolić potomstwu rosnąć przez siedem dni, po których staną się dorosłymi osobnikami w drugim dniu grawidacji. Drugi dzień grawidacji.Do przygotowania populacji testowych o zsynchronizowanym wieku dla każdego wariantu doświadczalnego wykorzystuje się osobniki dorosłe. Celem jest przygotowanie trzech powtórnych płytek zawierających od 50 do 75 zsynchronizowanych wiekowo nicieni przy użyciu platynowej pęsety do nicieni. Przenieś od 10 do 12 dorosłych osobników w drugim dniu rozwoju na 60 milimetrowe płytki NGM z naniesioną hodowlą OP 50. Pozostaw nicienie do złożenia jaj w temperaturze 16 °C przez dwie godziny, następnie usuń osobniki dorosłe i pozwól jajom wykluć się oraz rozwijać w temperaturze 16 °C.Na tym etapie najlepiej, aby osoby niebiorące udziału w ocenie szalek dokonały ich zakodowania, tak aby analiza wyników była ślepa względem warunków eksperymentalnych. Stadium rozwoju embrionalnego w momencie zniesienia jaj, które dla robaków typu dzikiego w optymalnych warunkach odpowiada w przybliżeniu stadium 26 komórek, jest funkcją wieku i odżywienia osobników dorosłych. Jeśli osobniki dorosłe wykorzystane do zniesienia jaj będą starsze lub głodzone, zniesione zostaną jaja w późniejszym stadium rozwoju, co uniemożliwi uzyskanie synchronicznej populacji, wpływając tym samym na kinetykę testu paraliżu.Kluczowe jest stosowanie monogenicznych kultur bakteryjnych, takich jak e coli OP 50, ponieważ zanieczyszczenie bakteriami dowolnego rodzaju może poważnie wpłynąć na ten test. Powtarzalność jest najwyższa, jeśli na płytkach powtórzonych trzykrotnie znajduje się podobna liczba nicieni. Aby indukować transgene i przeprowadzić test paraliżu, należy zwiększyć temperaturę inkubacji płytek do 25 °C.48 godzin po zakończeniu synchronicznego znoszenia jaj, nicienie powinny znajdować się w trzecim stadium larwalnym. Płytki należy ułożyć w inkubatorze w temperaturze 25°C, unikając ich piętrowania, aby mogły osiągnąć tę temperaturę. Jednocześnie należy rozpocząć ocenę paraliżu nicieni od 18 do 20 godzin po zainicjowaniu podwyższenia temperatury.Na tym etapie wszystkie nicienie w populacji powinny osiągnąć czwarte stadium larwalne; należy kontynuować ocenę w odstępach dwugodzinnych, aż wszystkie nicienie na każdej z płytek zostaną sparaliżowane. Z nieznanych przyczyn paraliż nie obejmuje całego ciała równomiernie. Region głowy jest ostatnią częścią nicienia, która przestaje się poruszać.W związku z tym nicienie, u których niedawno wystąpił paraliż, nie są w stanie przemieszczać się po płytce, lecz mogą poruszać głowami, oczyszczając w ten sposób obszar z bakterii wokół przedniej części ciała i pozostawiając aureolę oczyszczonych bakterii. Nicienie te nieuchronnie ulegną całkowitemu sparaliżowaniu, dlatego osobniki z aureolami są klasyfikowane jako sparaliżowane. Niektóre nicienie nie będą miały aureoli, ale również nie wykażą spontanicznego ruchu.Próbki te testuje się, dotykając ich wybierakiem do nicieni. Jeśli dotknięty nicień nie wykazuje pełnej propagacji fali ciała po pobudzeniu, zostaje on również uznany za sparaliżowany w celu sprawnego przeprowadzenia oceny. Najłatwiej jest przenieść sparaliżowane nicienie do nieoznaczonego sektora płytki, aby uniknąć ich niezamierzonego ponownego przeliczenia podczas kolejnego okresu oceny.Pozwala to również błędnie skategoryzowanym nicieniom na wykazanie ruchu, co umożliwia korektę punktacji w celu wygenerowania krzywej paraliżu. W każdym punkcie czasowym frakcja nicieni na każdej płytce, które nie zostały sparaliżowane, jest przeliczana na procent, a średni procent niesparaliżowanych osobników nanosi się na wykres w funkcji czasu, licząc od momentu rozpoczęcia przesunięcia temperatury (upshift). Otrzymana krzywa jest formalnie analogiczna do krzywej przeżywalności i może zatem być analizowana przy użyciu standardowych nieparametrycznych statystyk przeżywalności.Przeszczepienie transgenicznych nicieni myo-3 Aβ musi zostać przeprowadzone do połowy stadium L4, aby doszło do inicjacji paraliżu. Promotor Myo-3 jest regulowany rozwojowo. Po osiągnięciu przez nicienie późnego stadium L4 lub wieku dorosłego, poziom ekspresji ulega znacznemu obniżeniu.Ekspresja transgenu jest blokowana w przypadku głodzenia nicieni, dlatego niezwykle istotne jest, aby zwierzęta były dobrze karmione przez cały czas trwania eksperymentu. Nigdy nie zaobserwowano, aby sparaliżowany nicień powrócił do sprawności w żadnych warunkach. Po 12 do 16 godzinach Upshiftu szczep CL 41 76 zostanie sparaliżowany, niezależnie od tego, czy zostanie przeniesiony do temperatury 16°C; w szczepie CL 41 76 nadekspresja transgenu powodująca paraliż może wystąpić w niższych temperaturach.Należy jednak pamiętać, że czas wystąpienia paraliżu może być różny. Tempo paraliżu zależy od konkretnego szczepu transgenicznego. Skonstruowaliśmy trzy szczepy myo A beta, w których tempo paraliżu jest szybsze lub wolniejsze niż w przypadku szczepu CL 41 76, dlatego należy odpowiednio dostosować okno czasowe oceny w teście paraliżu.Przedstawiono tutaj wykres krzywej paraliżu dla szczepu CL 4 1 76, zarówno nieleczonego, jak i poddanego działaniu 6,27 millimolarnej kofeiny. Zabieg ten skutkuje wysoce istotnym statystycznie opóźnieniem paraliżu o około cztery godziny, co interpretujemy jako przejaw supresji toksyczności beta. W tym modelu eksperyment ten służył do oceny efektów innego związku występującego w kawie.Wykres jest typowy dla zabiegów, które nie wpływają na toksyczność beta. Należy zauważyć, że w obu eksperymentach około połowa nieleczonych populacji CL 4 1 76 jest sparaliżowana po 24 godzinach, a paraliż jest całkowity po 28 godzinach. Są to typowe ramy czasowe dla paraliżu grupy kontrolnej.W populacjach CL 4 1 7 6 istotne odchylenia od tego czasu świadczą o zmienionych warunkach środowiskowych lub spontanicznej delecji kopii transgenu. Dodatkowe informacje na temat szczepu CL 4 1 76 znajdują się w towarzyszącym protokole. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby brać pod uwagę wiek płytek, stadium populacji nicieni oraz zdolność do oceny wskaźnika paraliżu nicieni.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak wykorzystać ten system z wykorzystaniem morskich alg do dokładnego badania toksyczności beta-amyloidu. Będą Państwo w stanie wykryć dość subtelne efekty różnorodnych zabiegów środowiskowych lub farmakologicznych na tę toksyczność. Zmienne, o których wspomnieliśmy, są istotne i wymagają uwagi, ponieważ umożliwią one przeprowadzenie analizy w sposób wysoce powtarzalny i z zachowaniem spójnej kinetyki paraliżu.Jest to w rzeczywistości dość istotne, jeśli chcą Państwo porównać wyniki uzyskane w swoim laboratorium w różnym czasie przez różne osoby lub porównać własne wyniki z wynikami innych badaczy korzystających z tego modelu systemowego.

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ocena toksyczności β-amyloidu przy użyciu transgenicznego modelu C. elegans

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wykorzystania C. elegans do oceny neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych jako modelu choroby Parkinsona. Ponadto zastosowano przesiewy genetyczne w celu zidentyfikowania czynników, które albo nasilają degenerację, albo wykazują działanie neuroprotekcyjne.

Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans w celu walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona

W tym filmie opisujemy metodę oceny neuroprotekcyjnego wpływu badanego związku, astragananu, na przeżycie neuronów u Caenorhabditis elegans z powodu neurotoksyczności za pośrednictwem polyQ. W teście wykorzystuje się Caenorhabditis elegans wykazujące ekspresję nieprawidłowo ekspandowanych powtórzeń polyQ połączonych z GFP w ich neuronach ASH w celu pomiaru przeżycia neuronów po leczeniu badanym związkiem.

Test do badania wpływu badanego związku na neurotoksyczność za pośrednictwem PolyQ u robaków

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Opisane tutaj jest etapowe, behawioralne podejście przesiewowe, które może być użyte do badania przesiewowego pod kątem związków wykazujących skuteczność in vivo na poznawcze i funkcjonalne zachowania motoryczne w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Metody te są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych związków pod kątem aktywności w zadaniach pamięci krótkotrwałej i roboczej.

Ocena spontanicznej przemiany, rozpoznawania nowych obiektów i zaciskania kończyn w transgenicznych mysich modelach β amyloidu i neuropatologii tau

Opisujemy protokoły korzystania z platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP), która umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę fenotypową dużych populacji Caenorhabditis elegans. Protokoły te mogą być wykorzystywane do charakteryzowania subtelnych zmian behawioralnych w zmutowanych szczepach lub w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne w wysoce skalowalny sposób.

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

Metoda ilościowa została opracowana do identyfikacji i przewidywania ostrej toksyczności chemikaliów poprzez automatyczną analizę profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans. Protokół ten opisuje, jak leczyć robaki chemikaliami w 384-dołkowej płytce, przechwytywać filmy i określać ilościowo fenotypy związane z toksykologią.

Wysokoprzepustowy test do przewidywania toksyczności chemicznej za pomocą zautomatyzowanego profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans

Produkty translacyjne związane z powtarzalnością, niezależne, są wyłaniającymi się cechami patogennymi kilku powtarzających się chorób opartych na ekspansji. Celem opisanego protokołu jest ocena toksyczności spowodowanej przez te peptydy przy użyciu testów behawioralnych i komórkowych w systemie modelowym C. elegans.

Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Poznaj metodę oznaczania toksyczności β-amyloidu w modelu C. elegans z indukowalną ekspresją w mięśniach. Protokół umożliwia szybkie i ekonomiczne testowanie leków oraz modyfikatorów genetycznych toksyczności Aβ.

Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Przeglądaj więcej filmów