Oznaczanie toksyczności β-amyloidu przy użyciu transgenicznego modelu C. elegans

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie toksyczności peptydu beta-amyloidu w systemie modelowym InVivo. Powtarzalność i względna prostota tego testu pozwala na szybkie testowanie leków, warunków środowiskowych lub modyfikacji genetycznych pod kątem toksyczności beta-amyloidu. Kluczowym czynnikiem w opracowaniu tego testu jest wytwarzanie transgenicznych robaków cl egana z indukowaną temperaturą mięśni ekspresją peptydu beta-amyloidu.

Ta wrażliwa na temperaturę ekspresja jest modyfikowana przez skonstruowanie transgenu, który zawiera nienormalnie długi, trzy główne nieulegające translacji regiony, co sprawia, że mRNA transgenu jest celem ekspresji nadzoru mRNA tego transgenu, co jest słabe u robaków typu dzikiego z funkcjonalnym systemem nadzoru mRNA z powodu degradacji mRNA transgenu. Jeśli ten transgen zostanie wprowadzony do tła genetycznego, które zawiera mutację w istotnym składniku systemu nadzoru mRNA, ekspresja transgenu będzie znacznie wyższa. Jeśli tło genetyczne zawiera wrażliwą na temperaturę mutację w systemie nadzoru mRNA, to propagacja tego szczepu okopowego w temperaturze niedopuszczalnej zablokuje degradację mRNA genu rowu i spowoduje wysoką ekspresję genu rowowego robaki okopowe wykorzystujące ten system do regulacji ekspresji mięśni ściany ciała peptydu beta-amyloidu w górę z 16 stopni Celsjusza do 25 stopni Celsjusza, Powoduje dużą akumulację peptydu beta-amyloidowego, dysfunkcję komórek mięśniowych i paraliż robaków pomiar czasu.

Potrzeba populacji tych okopowych robaków, aby zostać sparaliżowanym po temperaturze. Upshift jest czułym testem toksyczności beta-amyloidu. Osiąga się to poprzez wykonanie świeżych płytek z pożywką wzrostową nicieni do testu paraliżu, co pomaga zminimalizować zmienne środowiskowe, które mogą wpływać na tempo paraliżu.

W drugim etapie, zsynchronizowanym z wiekiem populacji robaków okopowych lub zainicjowanym, minimalizuje to wpływ etapu rozwojowego na ekspresję transgenu. Następnie, zsynchronizowane trzecie stadium larwalne są przesuwane w górę z 16 stopni Celsjusza do 25 stopni Celsjusza, zwiększając stabilność transgenu mRNA i prowadząc do akumulacji peptydu beta amyloidu. Pomiar czasu od zmiany biegu na wyższy do paraliżu dla każdego robaka pozwala uchwycić tempo dysfunkcji mięśni, a tym samym określić toksyczne skutki akumulacji peptydu beta-amyloidu, uzyskuje się wyniki, które pokazują wpływ określonych metod leczenia na toksyczność endogennie eksprymowanego peptydu beta-amyloidowego.

Tak więc główną zaletą naszej techniki, w przeciwieństwie do używania transgenicznych modeli myszy do oznaczania aktywności leków, jest to, że możemy to zrobić znacznie szybciej i znacznie taniej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Punktacja L czterech robaków w teście paraliżu jest bardzo trudna do nauczenia.

Tak więc, kiedy oceniasz sparaliżowanego robaka L 4, to, na co chcesz zwrócić uwagę, to izolowany ruch halo w obszarze głowy robaka. Kiedy to się porusza i całe ciało robaka jest sparaliżowane, oceniamy tego robaka jako sparaliżowanego. Eseje paraliżu są wykonywane na płytkach ze standardowymi pożywkami hodowlanymi nicieni lub NGM rutynowo używanymi do rozmnażania i genetyki CL egan

Aby przygotować płytki w autoklawie, roztwór NGM zawierający chlorek sodu, agar i peptyd w kolbie Erlenmeyera, a następnie dodać odpowiednie ilości następujących sterylnych roztworów, które można znaleźć w dołączonym pisemnym protokole. Porcjować 10 mililitrów cieczy NGM na każdą szalkę Petriego o wymiarach 60 milimetrów na 15 milimetrów. Pozwól NGM zestalić się przez noc w temperaturze pokojowej.

W przypadku badania wpływu związków lub ekstraktów, należy nanieść podwielokrotność ekstraktu na każdą płytkę i użyć rozsiewacza, aby równomiernie rozprowadzić go na powierzchni płytki. Pozostaw płytki do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej. Objętości powyżej jednego mililitra będą wymagały więcej czasu na wyschnięcie.

Następnie umieść każdą płytkę z 250 mikrolitrami szczepu E coli OP 50 wyhodowanego w pożywce LB przez noc do gęstości optycznej od 0,4 do 0,6, pozwól bakteriom wyschnąć przez noc w temperaturze pokojowej. Wiek płytki ma znaczący wpływ na szybkość paraliżu, w związku z czym starsze płytki mają tendencję do wysychania. Płytki należy wylać w ciągu tygodnia od testu paraliżu.

Idealnie byłoby, gdybyś chciał użyć płytek, które zostały wylane trzy do czterech dni przed synchronicznymi talerzami do składania jaj używanymi w każdym eksperymencie, powinny pochodzić z tej samej partii, zmieniając wielkość trawnika i/lub bakterie zmienią również zachowanie robaków Testy paraliżu można przeprowadzić przy użyciu alternatywnych szczepów E. coli. Na przykład HT one 15 jest używany w eksperymentach RNAi. Może to jednak zmienić kinetykę testu paraliżu.

Dlatego musisz używać kontroli wewnętrznych, które są odpowiednie Szczep. CL 476 jest najczęściej używany do oznaczania paraliżu indukowanego przez beta. Ten szczep i inne modele transgeniczne są dostępne dla badaczy akademickich za symboliczną opłatą w Centrum Genetycznym Saint Ahadi.

Aby zmaksymalizować synchronizację wieku badanej populacji, preferowane jest. Zacznij od zsynchronizowanego pokolenia rodzicielskiego. Na tydzień przed rozpoczęciem testu paraliżu badanej populacji, użyj platynowego zbieracza robaków, aby przenieść od 20 do 30 dorosłych grobów na kilka 10-centymetrowych płytek NGM.

Rozprowadzić OP 50 przez dwie godziny jaja składać w temperaturze 16 stopni Celsjusza, co jest temperaturą dopuszczalną dla CL 4 1 76. Usuń dorosłe osobniki GR i pozwól potomstwu rosnąć przez siedem dni, do tego czasu będą one dorosłymi osobnikami w grobie drugiego dnia. Drugi dzień grawitacji.

Dorośli są wykorzystywani do przygotowania populacji testowych synchronicznych pod względem wieku dla każdego warunku doświadczalnego. Celem jest wygenerowanie potrójnych płytek zawierających od 50 do 75 synchronicznych starzejących się robaków za pomocą platynowego zbieracza robaków Przenieś 10 do 12 dnia, dwóch grawowanych dorosłych na 60-milimetrowe płytki NGM naznaczone OP 50. Pozwól robakom złożyć jaja w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie oderwij dorosłe osobniki i pozwól jajom wykluć się i urosnąć do 16 stopni Celsjusza.

W tym momencie najlepiej jest mieć kogoś, kto nie będzie oceniał płytek, aby je zakodować tak, aby wynik był ślepy na warunki eksperymentalne. Etap rozwoju embrionalnego, w którym jaja są składane, który w optymalnych warunkach wynosi w przybliżeniu stadium 26 komórek u robaków typu dzikiego, jest funkcją wieku dorosłego i odżywiania. Jeśli dorosłe osobniki grawitacyjne używane do składania jaj są starsze lub wygłodzone, jaja zostaną złożone w późniejszym stadium, a populacja synchroniczna nie zostanie osiągnięta, co wpłynie na kinetykę testu paraliżu.

Konieczne jest stosowanie monogenowych kultur bakteryjnych, takich jak E coli, OP 50, ponieważ wszelkiego rodzaju zanieczyszczenie bakteryjne może poważnie wpłynąć na ten test. Odtwarzalność jest największa, jeśli twoje potrójne płytki mają podobną liczbę robaków Aby indukować transgen i przeprowadzić test paraliżu. Przesuń płyty w górę do 25 stopni Celsjusza.

48 godzin po zakończeniu synchronicznego składania jaj robak powinien znajdować się w trzecim stadium larwalnym. Płytki należy układać bez układania w stosy w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby płytki mogły osiągnąć tę temperaturę. W tym samym czasie zacznij oceniać paraliż robaków po 18 do 20 godzinach od rozpoczęcia zmiany biegu na wyższy.

W tym momencie wszystkie robaki w populacji powinny osiągnąć czwarte stadium larwalne, kontynuować punktację w dwugodzinnych odstępach, aż wszystkie robaki na każdej z płytek zostaną sparaliżowane. Z nieznanych przyczyn paraliż nie występuje nawet na całej długości ciała. Obszar głowy jest ostatnią częścią robaka, która przestaje się poruszać.

W ten sposób robaki, które niedawno zainicjowały paraliż, nie mogą przemieszczać się po płytce, ale mogą poruszać głowami, usuwając w ten sposób bakterie wokół przedniej części i pozostawiając aureolę oczyszczonych bakterii. Robaki te niezmiennie stają się całkowicie sparaliżowane i dlatego robaki z aureolami są określane jako sparaliżowane. Niektóre robaki nie będą miały aureoli, ale też nie będą wykazywać spontanicznego ruchu.

Są one testowane poprzez szturchanie ich zbieraczem robaków. Jeśli szturchnięty robak nie może przejść przez propagację fal całego ciała po szturchnięciu, jest również oceniany jako sparaliżowany w celu skutecznego oceniania. Najłatwiej jest przenieść sparaliżowane robaki do niezauważonego sektora płyty, aby nie zostały przypadkowo ponownie ocenione w następnym okresie punktacji.

Pozwala to również błędnie skategoryzowanym robakom na zademonstrowanie ruchu, co pozwala na wygenerowanie krzywej paraliżu przez korektę punktacji. W każdym punkcie czasowym odsetek robaków na każdej płytce, które nie zostały sparaliżowane, jest przeliczany na procent, a średni niezrównany procent jest wykreślany w stosunku do czasu od momentu zainicjowania zmiany biegu na wyższy. Otrzymana krzywa jest formalnie analogiczna do krzywej przeżycia, a zatem może być analizowana przy użyciu standardowych nieparametrycznych statystyk przeżycia.

Przesunięcie w górę transgenicznych robaków myo three A beta musi być wykonane w środkowym stadium L four, aby można było zainicjować paraliż. Promotor Myo 3 jest regulowany rozwojowo. Gdy robaki osiągną późny wiek L cztery lub dorosłość, poziom ekspresji został znacznie zmniejszony.

Ekspresja transgenu jest zablokowana, jeśli robaki są głodzone, dlatego bardzo ważne jest, aby robaki były dobrze odżywione przez cały eksperyment. Nigdy nie zaobserwowaliśmy, aby sparaliżowany robak wracał do zdrowia w jakichkolwiek warunkach. Po 12 do 16 godzinach zmiany biegu na wyższy, CL 41 76 zostanie sparaliżowany, niezależnie od tego, czy zmniejszysz go do 16 stopni w obciążeniu, CL 41 76 regulacja w górę ekspresji transgenu, która powoduje paraliż, może wystąpić w niższych temperaturach.

Należy jednak pamiętać, że czas jego trwania będzie miał wpływ na tempo paraliżu. Szybkość paraliżu zależy od konkretnego użytego szczepu transgenu. Skonstruowaliśmy szczepy myo three A beta, które mają wskaźnik paraliżu szybszy i wolniejszy niż CL 41 76, w związku z czym należy odpowiednio dostosować okno punktacji dla testu paraliżu.

Pokazano tutaj wykres krzywej paraliżu dla CL 4 1 76, zarówno nieleczonych, jak i wystawionych na działanie 6,27 milimolowej kofeiny. Leczenie to powoduje wysoce statystycznie istotne opóźnienie paraliżu wynoszące około czterech godzin, co interpretujemy jako wskazujące na zahamowanie toksyczności beta. W tym modelu eksperyment ten badał wpływ innego związku znajdującego się w kawie.

Wykres jest typowy dla zabiegów, które nie wpływają na toksyczność beta. Należy zauważyć, że w obu eksperymentach około połowa nieleczonych populacji CL 4 1 76 jest sparaliżowana po 24 godzinach, a paraliż jest całkowity po 28 godzinach. Są to typowe ramy czasowe dla paraliżu kontroli.

CL 4, 1, 7, 6 znaczne odchylenia od tego czasu wskazują na zmienione warunki środowiskowe lub spontaniczną delecję kopii transgenu. Dodatkowe informacje na temat szczepu CL 4 1 76 można znaleźć w załączonym protokole. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wieku płytek, stadium populacji robaków i zdolności do oceny współczynnika paraliżu robaków.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak używać tego systemu Sea Elgan do dokładnego badania toksyczności beta-amyloidu. Powinieneś być w stanie wykryć dość subtelny wpływ na tę toksyczność różnych metod leczenia środowiskowego lub farmakologicznego. Zmienne, o których mówiliśmy, są ważne, aby zwrócić uwagę, ponieważ umożliwi to wykonanie testu bardzo powtarzalnie i ze stałą kinetyką paraliżu.

Jest to bardzo ważne, jeśli chcesz porównać swoje wyniki wykonane w laboratorium w różnym czasie przez różne osoby lub porównać swoje wyniki z innymi badaczami korzystającymi z tego systemu modelowego.