Name: Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium Midgastrula (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Naucz się przygotowywać pierwotne kultury neuronowe z zarodków Drosophila w stadium midgastrula. Ta metoda pozwala badać pobudliwość elektryczną i transmisję synaptyczną w neuronach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NIH NS27501 przyznany DKOD. Dodatkowe wsparcie dla tej pracy pochodziło z grantu HHMI Professor przyznanego DKOD.

I. Zbiór zarodków Drosophila
<ol>
<li>Przygotowanie płytek do zbierania jaj <ol>
<li>Zagotować 200 ml dH2O z 8 g agaru</li>
<li>Schłodzić do 50°C</li>
<li>Dodać 2 ml EtOH i 2 ml kwasu octowego</li>
<li>Wlać do plastikowych naczyń Petri o średnicy 35 mm, dnem do góry</li>
<li>Schłodzić i przechowywać w szczelnym pojemniku w temperaturze 4°C</li>
<li>Pozwala to na przygotowanie około 80 płytek</li>
</ol></li>
<li>Przygotowanie pasty drożdżowej <ol>
<li>Rozpuścić aktywne drożdże piekarnicze marki Fleischmans w wodzie, aby utworzyć pastę</li>
<li>Podgrzewać w mikrofalówce przez 20-30 sekund, aby zabić drożdże (uważając, aby masa nie wykipiała)</li>
<li>Przechowywać w strzykawce 10 cc (bez igły) w temperaturze 4°C przez 2 tygodnie</li>
</ol></li>
<li>Muchy:&nbsp;Imago wykorzystywane do zbierania jaj są zazwyczaj najbardziej produktywne między 3 a 14 dniem po wyjściu z poczwarki, pod warunkiem, że miały dostęp do świeżego pokarmu. Wiele linii mutantów wykazuje obniżoną płodność, co może objawiać się mniejszą liczbą składanych jaj oraz zmianą wieku, w którym są one najbardziej produktywne. Zazwyczaj populacja składająca się z kilkuset osobników dorosłych zapewnia odpowiednią liczbę jaj.</li>
<li>Procedura: Nałożyć cienką warstwę pasty drożdżowej na płytkę do zbierania jaj. Stanowi ona korzystne podłoże do składania jaj. Przenieść dorosłe muchy do czystej butelki do zbierania jaj i przymocować płytkę do wylotu butelki za pomocą taśmy. Nie pozostawiać much w tych butelkach dłużej niż przez 3-4 godziny, ponieważ wilgotność wzrasta, a muchy przyklejają się do pasty i ścianek butelki.</li>
</ol>
II. Dechorionizacja embrionów przy użyciu podchlorynu sodu
<ol>
<li>Przygotować lejek Buchnera połączony z kolbą filtracyjną podłączoną do aspiratora. Włożyć do lejka kawałek papieru Whatman nr 1. Przy włączonej próżni zwilżyć papier sterylną wodą destylowaną.</li>
<li>Przepłukać embriony z płytek zbiorczych na papier filtracyjny, używając strumienia wody z butelki myjącej.</li>
<li>Przepłukać je kilkukrotnie sterylną wodą, wyłączyć aspirator, a następnie dodać objętość lejka 50% roztworu wybielacza. Pozostawić jaja na 5-10 minut. Choriony rozpuszczą się w ciągu 1-2 minut, jednak im dłużej embriony pozostaną w wybielaczu, tym więcej zanieczyszczających drożdży zostanie zniszczonych. Usunąć wszelkie osobniki dorosłe lub larwy, które spłynęły z płytki.</li>
<li>Przepłukać embriony do sterylnej płytki Petriego (NIE do hodowli tkankowej) sterylną wodą destylowaną. Wiele embrionów może przykleić się do dna płytki, jeśli nie została ona wcześniej zwilżona. Kilkukrotnie przepłukać embriony sterylną wodą w tej płytce.</li>
<li>Obezwzględnić embriony w świetle przechodzącym, aby wyselekcjonować te w stadium środkowej gastruli.</li>
</ol>
III. Przygotowanie kultur pojedynczych embrionów
<ol>
<li>Przygotuj DDM1 (patrz przepisy w sekcji IV)</li>
<li>Tuż przed hodowlą zlej wodę z naczynia z embrionami. Przykryj embriony sterylną pożywką.</li>
<li>Przygotuj 3 płytki Petriego o średnicy 35 mm. Do każdej płytki włóż 4 autoklawowane okrągłe szkiełka nakrywowe. Na każde szkiełko nanieś 5 µl pożywki. Używaj szkiełek nakrywowych Bellco z niską zawartością ołowiu. Bellco Biological Glassware 800-257-7043 Cat #1943-00012 </li>
<li>Wyciągnij cienkie pipety. Stosujemy pipety wyciągane za pomocą urządzenia Narishige PP-83. Dokładne wymiary pipety nie są kluczowe; zazwyczaj wyciągamy je cieńsze niż wymagane, a następnie odłamujemy końcówkę w tym samym polu widzenia co embrion, aby ocenić rozmiar. Należy unikać zbyt dużego otworu, aby nie zassać wszystkich embrionów naraz, ale końcówka nie może być zbyt mała, by zasysanie komórek trwało zbyt długo. Należy dążyć do uzyskania rozmiaru pośredniego. Obejrzyj embriony w świetle przechodzącym i użyj rurki do ssania ustnego podłączonej do pipety, aby usunąć zawartość embrionu. Rozprowadź komórki na przygotowanym szkiełku nakrywającym, delikatnie wypuszczając je jak najbliżej szkiełka. Można obejrzeć szkiełka przy większym powiększeniu i w ten sam sposób dodatkowo rozprowadzić komórki.</li>
<li>Pozostaw komórki nie dłużej niż przez 10 minut. Zalej płytkę pożywką i umieść w inkubatorze w atmosferze 4-5% CO2, jeśli używasz pożywki definiowanej. Temperatura powinna wynosić od 22-24°C. Standardowo stosujemy 23°C i 95% wilgotności. Wilgotność jest istotna, aby uniknąć odparowania. Można użyć standardowego inkubatora do hodowli ssaków umieszczonego w chłodni z temperaturą ustawioną na 23°C.</li>
</ol>
IV. Zdefiniowana pożywka DDM1 do hodowli kultur
<ol>
<li>Przygotowanie DMEM: Do 100 ml pożywki Ham's F12/DME (DMEM) (Irvine Scientific #9052). <ol>
<li>Dodać 0,476 g Hepes (20mM) (Sigma #H-3375). Wymieszać.</li>
<li>Dodać 1,25 ml L-Glutaminy 200 mM (Irvine Scientific #9317). Wymieszać.</li>
<li>Przefiltrować w komorze laminarnej przy użyciu octanowego filtra strzykawkowego 0,2 µm (wymagane są 2 filtry).</li>
<li>Wartość pH wynosi 6,64, a osmolalność Osm 288.</li>
<li>Przygotować alikwoty po 10ml w probówkach wirówkowych 15ml.</li>
<li>Przechowywać w temperaturze 4°C nie dłużej niż przez 2 tygodnie. Uwaga: Zawsze należy używać autoklawowanej wody filtrowanej i przygotowywać roztwory w naczyniach przeznaczonych wyłącznie do pożywek i suplementów. Nigdy nie wprowadzać do pożywki elektrody pH ani mieszadła magnetycznego używanego do innych celów. Aby przygotować DDM1: Dodać wymienione poniżej suplementy do DMEM bezpośrednio przed hodowlą. </li>
</ol></li>
<li>Do 10 ml DMEM dodać:
<ul>
<li>100 µl Transferryny</li>
<li>100 µl Putrescyny</li>
<li>100 µl Selenu</li>
<li>100 µl Progesteronu</li>
<li>50 µl Insuliny</li>
</ul>
</li>
</ol>

<ol><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic-AMP-dependent+plasticity+at+excitatory+cholinergic+synapses+in+Drosophila+neurons%3A+Alterations+in+the+memory+mutant+dunce%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce.</a> J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).</li>
<li>Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tipE+regulates+sodium-dependent+repetitive+firing+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).</li>
<li>Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+receptors+containing+Rdl+subunits+mediate+fast+inhibitory+synaptic+transmission+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).</li>
</ol>

W hodowlach Drosophila przygotowanych z embrionów na etapie środkowej gastruli neurony powstają z prekursorowych neuroblastów, z których wiele dzieli się przed różnicowaniem in vitro. System ten stwarza zatem wyjątkową okazję do badania czynników genetycznych i środowiskowych istotnych we wczesnych fazach rozwoju neuronalnego (Rohrbaugh et al., 2003). Wykazaliśmy, że neurony hodowane w prostej, zdefiniowanej pożywce różnicują się w neurony pobudliwe elektrycznie, które tworzą również funkcjonalne połączenia synaptyczne (...

<table><tbody><tr><td>Drosophila melanogaster</td><td>Zwierzę</td><td></td><td></td><td>Muszki owocówki</td></tr><tr><td>Transferryna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1147</td><td>Zapas 100x: 10 mg/ml w wodzie. Filtrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm (octan celulozy). Przechowywać w alikwotach 220 µl (do 20 ml DMEM) w temperaturze -20°C.</td></tr><tr><td>Insulina</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td>Zapas 200x: 10 mg/ml w 0,05N HCl. Filtrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm (octan celulozy). Przechowywać w alikwotach 120 µl (do 20 ml DMEM) w temperaturze -20°C.</td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td>Zapas 100x: 10 mM w ddH2O. Filtrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm (octan celulozy). Przechowywać w alikwotach 220 µl (do 20 ml DMEM) w temperaturze -20°C.</td></tr><tr><td>Selen</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5261</td><td>Zapas 100x: 3 µM w ddH2O. Włożyć 0,0051 g selenu do probówki 15 ml oznaczonej jako A (zapas 3 mM). Dodać 10 ml sterylnej wody. Przenieść 10 µl z probówki A do probówki B zawierającej 10 ml ddH2O (zapas 3 µM). Przefiltrować zawartość probówki B przez filtr strzykawkowy 0,2 µm (octan celulozy). Przechowywać w alikwotach 220 µl (do 20 ml DMEM) w temperaturze -20°C.</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6149</td><td>Zapas 100x: 2 µg/ml. 1. Dodać 1 ml 100% EtOH do butelki z 0,001 g progesteronu. 2. Dodać 49 ml ddH2O. 3. Przenieść 1 ml tej mieszaniny do drugiej probówki z 9 ml ddH2O. 4. Filtrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm (octan celulozy). 5. Przechowywać w alikwotach 220 µl (do 20 ml DMEM) w temperaturze -20°C.</td></tr><tr><td>DDM1</td><td>Pożywka</td><td></td><td></td><td>Do 10 ml DMEM dodać z zapasów: 100 µl transferryny, 100 µl putrescyny, 100 µl selenu, 100 µl progesteronu, 50 µl insuliny.</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki</td><td></td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td>Szkło o niskiej zawartości ołowiu, autoklawowane.</td></tr><tr><td>Filtr papierowy</td><td></td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>#1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10cc</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p&gt;Hodowle przygotowane w tej pożywce należy utrzymywać w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze około 22-24&amp;#x00B0;C. Stosujemy standardowy inkubator do hodowli tkanek ssaków, umieszczony w pomieszczeniu chłodniczym i ogrzewany do 23&amp;#x00B0;C. Zawsze należy używać autoklawowanej wody filtrowanej i przygotowywać roztwory w naczyniach przeznaczonych wyłącznie do pożywek i suplementów. Nigdy nie wprowadzać do pożywek miernika pH ani mieszadełka magnetycznego używanego do innych celów.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków drosophila w stadium środkowej gastruli

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Niniejszy film przedstawia procedurę przygotowania pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila na etapie środkowej gastruli. Zaprezentowano metody zbierania embrionów oraz ich dechorionizacji przy użyciu wybielacza. Za pomocą szklanej pipety przymocowanej do rurki do ssania ustnego pokazano usuwanie wszystkich komórek z pojedynczych embrionów. Przedstawiono metodę dyspersji komórek z każdego embrionu w małej (5 µl) kropli pożywki na niepowlekanej szklanej lamelce. Widok pod mikroskopem po 1 godzinie od wysiania ilustruje preferowaną gęstość komórek. Większość komórek, które przeżywają w zdefiniowanej pożywce, to neuroblasty, które dzielą się jeden lub więcej razy w kulturze, zanim w ciągu 12-24 godzin zaczną wysuwać wypustki neurytowe. Widok pod mikroskopem pokazuje stopień wzrostu i rozgałęzień neurytów oczekiwany w zdrowej kulturze w 2. dniu in vitro. Kultury są hodowane w prostej, zdefiniowanej pożywce wodorowęglanowej, w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 22-24°C. Wypustki neurytowe nadal rozwijają się podczas pierwszego tygodnia hodowli, a po nawiązaniu kontaktu z neurytami sąsiednich komórek często tworzą funkcjonalne połączenia synaptyczne. Neurony w tych kulturach wykazują ekspresję napięciozależnych kanałów sodowych, wapniowych i potasowych oraz są elektrycznie pobudliwe. Ten system hodowli jest przydatny do badania molekularnych czynników genetycznych i środowiskowych regulujących różnicowanie neuronów, ich pobudliwość oraz tworzenie i funkcję synaps.

Niniejszy film demonstruje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila w stadium środkowej gastruli. Widoki żywych kultur przedstawiają komórki 1 godzinę po wysianiu oraz zróżnicowane neurony po 2 dniach wzrostu w zdefiniowanym medium opartym na wodorowęglanach. Neurony te są elektrycznie pobudliwe i tworzą połączenia synaptyczne.

Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium środkowej gastruli

Niniejszy materiał wideo przedstawia procedurę otrzymywania pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila w stadium środkowej gastrulacji. Metody zbierania embrionów ...

Nazywam się Diana Dowd i jestem profesorem w departamencie Biologii Rozwojowej i Komórkowej oraz Anatomii i Neurobiologii na UC Irvine. Dzisiaj zaprezentuję przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów drosophila. Procedura ta polega na usunięciu wszystkich komórek z embrionu drosophila w stadium mid-gastrula i umieszczeniu ich w hodowli komórkowej.Kultury te wykorzystujemy do dokładnego zrozumienia, jakie geny i czynniki środowiskowe są istotne dla regulacji pobudliwości elektrycznej oraz przekaźnictwa synaptycznego między neuronami Drosophila. Aby rozpocząć tę procedurę, musimy zebrać embriony Drosophila. W tym celu pobieramy płytki do zbierania jaj i nakładamy na nie niewielką ilość pasty drożdżowej.Jest to korzystne podłoże dla dorosłych much do składania jaj. Umieszczamy te płytki w butelkach zawierających populację dorosłych much, zazwyczaj od stu do 200 osobników. Następnie pozwalamy dorosłym muchom składać jaja przez około dwie do trzech godzin.Następnie wyjmujemy płytki do zbierania jaj; są to embriony, których używamy w procedurze hodowli. Kolejnym krokiem w procedurze jest usuwanie błony chorionowej (dechorionizacja) z embrionów, co w praktyce oznacza usunięcie chorionu. Robimy to, zmywając embriony do lejka Büchnera, w którym znajduje się kawałek papieru filtracyjnego, aby przechwycić embriony.Pozostawiamy je w lejku Buchnera w 50% roztworze wybielacza. Ten 50% roztwór wybielacza nie tylko rozpuszcza korion, ale służy również jako część naszej procedury sterylizacji. Tę procedurę przeprowadzamy poza dygestorium; po odchlorowaniu embriony przepłukujemy do szalki Petriego.W rzeczywistości, gdy chorion zostanie usunięty, błona żółtkowa jest dość lepka i będzie dobrze przylegać do szalki Petriego. Można wtedy wlać na nie wodę destylowaną, a następnie wymienić wodę destylowaną dwa lub trzy razy, po prostu wylewając ją, dzięki czemu embriony przylgną do szalki Petriego. Nie należy używać plastikowej szalki do hodowli tkankowych.Nie przylegają one do siebie. Sterylną część procedury rozpoczynamy od przeniesienia szalek Petriego z embrionami do komory z laminarnym przepływem powietrza. Są to szkiełka nakrywki marki Bellco.Są one niepowlekane, ale zostały poddane autoklawowaniu i nie były myte. Stwierdziliśmy, że nie sprawdzają się one zbyt dobrze. W przypadku ich mycia, zazwyczaj wyjmujemy cztery szkiełka cover slip i umieszczamy je w jednej płytce Petriego.W każdej czarce Petri przygotujemy zatem cztery hodowle embrionów. Dobrze, ta czarka Petri jest w zasadzie gotowa do rozpoczęcia hodowli; zazwyczaj przygotowuję od 12 do 16 hodowli jednocześnie. Dobrze? Pożywka hodowlana, której używamy, jest stosunkowo prostą pożywką zdefiniowaną.Jest to podłoże ADMEM; przygotowujemy to medium płynne raz na dwa tygodnie, dzięki czemu zachowuje ono swoje właściwości przez dwa tygodnie w lodówce. Zostało ono wysterylizowane poprzez przepuszczenie przez sterylny filtr o wielkości oczek 0,2 mikrona, a następnie do pożywki dodajemy pięć suplementów.Są one przygotowywane raz na dwa miesiące, a następnie mrożone w aliquotach, które dodaje się do 10 ml pożywki ciekłej. Zatem po prostu usuwamy zawartość. Ostatni krok, teraz delikatnie odwracamy tę pożywkę, aby ją wymieszać i jesteśmy gotowi do pracy. Dobrze.Wszystko jest przygotowane. Mam gotową szalkę hodowlaną lub szalkę Petriego z czterema szkiełkami nakrywowymi, gotową do użycia. Teraz wezmę szalkę z zarodkami, które obecnie znajdują się w wodzie destylowanej.Usunę wodę destylowaną, po prostu strząsając ją. W ten sposób wylewam ją bezpośrednio do kosza na odpady. Teraz wleję około 2 mL pożywki na te embriony; teraz mogę przystąpić do wprowadzania szklanej igły do poszczególnych embrionów i usunięcia ich zawartości.Pożywka musi znajdować się na zewnątrz. Oczywiście, gdyby na zewnątrz znajdowała się woda, doszłoby do szoku osmotycznego. Aby przygotować się do właściwego przygotowania kultur tuż przed usunięciem zawartości zarodka, nakładam kroplę o objętości 5 µL na szkiełka nakrywkowe.Jeśli pozostawi się je zbyt długo, pH pożywki ulegnie zmianie. Teraz naniosę kroplę o objętości 5 µL na środek każdego z czterech szkiełek cover slip. Ważne jest, aby krople te pozostały w jak najbardziej nienaruszonej formie.Jeśli pożywka rozleje się po całej szkiełku nakrywce, wysiewanie komórek w bardzo cienkiej warstwie cieczy będzie utrudniony. Należy dążyć do wysiania komórek w postaci ładnej, okrągłej kropli cieczy. Jak widać, przygotowaliśmy cztery takie okrągłe krople cieczy.Teraz wezmę jedną z wyciągniętych pipet i przymocuję ją do tej rurki do pipetowania ustnego. Można użyć dowolnej rurki, ale zaletą tej jest to, że jest ona kompatybilna z kalibrowanymi pipetami 100 µL firmy VWR. Wewnątrz znajduje się niewielka gumowa uszczelka.Mogę włożyć pipetę, a dokładniej pipetę szklaną, do tego końca ssaka. a następnie, podczas zasysania zawartości zarodka, nie będę przesuwać się wyżej niż do tego miejsca, gdzie zaczyna się zwężenie. Dzięki temu istnieje duży odstęp między miejscem, w którym zasysam powietrze ustami, a miejscem, w którym znajdują się komórki.Zatem nie ma problemu z kontaminacją. Jeśli przypadkowo wciągną Państwo zawartość do tego obszaru, wystąpią poważne problemy z zanieczyszczeniem. W naszych dygestoriach z laminarnym przepływem powietrza posiadamy mikroskopy stereoskopowe zamontowane na podstawie.Pozwala to na dopływ światła od dołu zarodka, dzięki czemu możemy dostrzec bruzdę głowową, jelito środkowe oraz pączki, które będą widoczne podczas oglądania rzeczywistych zarodków. W ten sposób wyznaczamy stadium rozwoju zarodka, które jest istotne dla hodowli w celu usunięcia jego zawartości. Używamy do tego szklanych pipet, wyciągniętych w standardowym wyciągarze mikroelektrod, którego używamy do tworzenia pipet do rejestracji patch-clamp.Ustawienia nie są dla nas istotne. Wyciągamy bardzo cienkie pipety, ponieważ zamierzamy odłamać końcówkę pipety w naczyniu obok embrionu, aby uzyskać dokładnie pożądany rozmiar. Następnie bierzemy te szklane pipety, wprowadzamy je przez błonę witelinową embrionu i korzystamy z rurki do ssania ustami, która jest przymocowana do tylnej części pipety.Następnie ekstrahujemy zawartość całego embrionu. Po czym wyjmujemy pipetę i przenosimy ją do innej szalki, w której znajduje się szkiełko nakrywkowe z 5 µL kroplą pożywki. Następnie wydmuchujemy zawartość embrionu do tej 5 µL kropli.Kilkukrotnie pipetowaliśmy zawiesinę w górę i w dół, aby rozproszyć komórki, a następnie pozostawiliśmy szkiełko nakrywki w szalce na około 10 minut, zanim zalaliśmy szalkę 2 mL pożywki. Szalki z wysianymi komórkami umieszczono w inkubatorze z 5% CO2. Jest to bardzo ważne, ponieważ stosowana przez nas pożywka jest buforowana wodorowęglanami.Zawieramy w nich pewną ilość HEP, ale nie jest to wystarczające do buforowania w środowisku powietrznym. Dlatego należy użyć inkubatora z 5% CO2. Musi on być jednak ustawiony na stosunkowo niską temperaturę; idealna jest wartość około 22 do 23 stopni.Stosujemy standardowy inkubator CO2 używany do hodowli ssaczych i nagrzewamy go do 37 stopni. Następnie wyłączamy grzałkę, pozostawiając urządzenie w laboratorium, i umieszczamy lód na dnie inkubatora, co pozwala utrzymać temperaturę w granicach 21 do 25 stopni. Inną stosowaną przez nas techniką jest wykorzystanie ponownie jednego z tych standardowych grzewczych inkubatorów CO2 i umieszczenie go w pomieszczeniu chłodniczym.Wówczas można skutecznie podgrzać inkubator do 23°C, jeśli temperatura otoczenia odpowiada temperaturze pomieszczenia chłodniczego. Są to zatem dwie metody, których używamy, aby utrzymać standardową fokę ssaczą w inkubatorze, by umożliwić jej przeżycie. Dobrze, jest to kultura, którą wysiano godzinę temu; zastosowano to samo powiększenie, które widzieliśmy bezpośrednio po wysianiu, czyli godzinę później.Tutaj widzimy neurony, które różnicowały się przez około dwa dni. W hodowli neuroblasty podzieliły się jeden lub więcej razy, a następnie przekształciły w neurony, które emitują wypustki tworzące rozległe, nakładające się sieci neuronowe. Widoczne są tutaj dwa ciała komórkowe położone naprzeciw siebie.Górna komórka wysuwa wypustkę w kierunku godziny 11, a dolna wysuwa wypustkę w kierunku godziny 5. Są to ich główne wypustki. Następnie można zauważyć, że tworzą one drobniejsze rozgałęzienia.Komórki te przylegają bardzo ściśle do szklanego podłoża, a widoczne są również wypustki pochodzące z innych komórek, które na nie nachodzą. Są to miejsca potencjalnych połączeń synaptycznych. Wybralibyśmy jedną z tych komórek do rejestracji metodą patch-clamp i zazwyczaj, przy takim stopniu rozwinięcia wypustek, wykazywałyby one funkcjonalne prądy synaptyczne.Obecnie nasze komórki rosną w hodowli 12 godzin po wysiewaniu. Powinny one wytworzyć dobrze rozwinięte wypustki. Standardowe badania fizjologiczne rozpoczynamy około jednej do dwóch godzin po rozpoczęciu hodowli.Można zauważyć, że komórki te nadal wypuszczają wypustki przez kolejne cztery lub pięć dni. Rejestrowaliśmy aktywność komórek nawet do dwóch tygodni hodowli, jednak większość naszych pomiarów przeprowadzono między drugim a szóstym dniem hodowli. W przypadku tych kultur, przygotowanych z embrionów drosophila na średnim etapie rozwoju gastrulacji, otrzymujemy sieci neuronów komunikujących się w warunkach in vitro. Dzięki temu jesteśmy w stanie badać właściwości wyładowań tych komórek.Wykazują one zróżnicowane właściwości wyładowań. Niektóre komórki wyładowują się powtarzalnie, inne w serii, a komórki te są głównie cholinergiczne lub GABAergiczne. Badamy prądy synaptyczne pośredniczone przez receptory nikotynowe ACh oraz receptory GABA.

preparation-neuronal-cultures-from-midgastrula-stage-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie kultur neuronowych z zarodków Drosophila w stadium środkowego zawiązka

Niniejszy film prezentuje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju. Obrazy żywych kultur pokazują wypustki neurytów oraz obrazowanie poziomu wapnia z wykorzystaniem Fura-2.

Pierwotne kultury neuronalne z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila. Zdolność do przeprowadzania skutecznej perturbacji RNAi, wraz z innymi molekularnymi, biochemicznymi i obrazowymi metodami analizy komórek, pozwoli na rozstrzygnięcie wielu kwestii badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila.

Podstawowe hodowle komórkowe z embrionów Drosophila w stadium gastruli

Ten film przedstawia metodę hodowli neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy. Proces ten obejmuje leczenie śródmózgowia enzymem proteolitycznym, odłączenie komórek i wyhodowanie ich na pokrytych polimerem szkiełkach nakrywkowych w pożywce bogatej w składniki odżywcze z antybiotykami dla ich wzrostu i długoterminowej żywotności.

Hodowla i utrzymanie neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy

Ten film demonstruje protokół do identyfikacji czynników egzogennych, które inicjują reaktywację nerwowych komórek macierzystych mózgu Drosophila ze stanu spoczynku. Świeżo wyklute larwy są preparowane w celu wyizolowania ich mózgów, które są następnie hodowane w pożywce z lub bez hormonu testowego w celu oceny potencjału hormonu do indukowania reaktywacji i proliferacji nerwowych komórek macierzystych.

Analiza reaktywacji nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Wideo pokazuje proces izolacji i hodowli neuronów dopaminowych ze śródmózgowia embrionów myszy. Izolowane brzuszne dno śródmózgowia jest dysocjowane za pomocą enzymów. Powstałe neurony dopaminowe są zbierane i przenoszone do mikrowysp wewnątrz płytek wielodołkowych. Komórki są inkubowane z pożywką neuronów dopaminowych, aby utrzymać komórki w dużej gęstości wewnątrz mikrowysp.

Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Komórki S2 Drosophila i hodowane neurony są świetnymi systemami do obrazowania transportu organelli napędzanych motorycznie in vivo. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły hodowli obu typów komórek, ich obrazowania i analizy transportu.

Transport organelli w hodowanych komórkach Drosophila: linia komórkowa S2 i neurony pierwotne.

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Ustalono metodę reaktywacji uśpionych nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila. Za pomocą tej metody można oddzielić rolę sygnałów ogólnoustrojowych od sygnałów wewnętrznych w tkance w regulacji spoczynku, wejścia i wyjścia nerwowych komórek macierzystych.

Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Naucz się przygotowywać pierwotne kultury neuronowe z zarodków Drosophila w stadium midgastrula. Ta metoda pozwala badać pobudliwość elektryczną i transmisję synaptyczną w neuronach.

Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium środkowej gastruli

Przeglądaj więcej filmów