Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium Midgastrula

Ten film pokazuje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium midgasstrula. Widoki żywych kultur pokazują komórki 1 godzinę po posiewie i zróżnicowane neurony po 2 dniach wzrostu w zdefiniowanym pożywce na bazie wodorowęglanów. Neurony są elektrycznie pobudliwe i tworzą połączenia synaptyczne.

Nazywam się Diana Dowd i jestem profesorem na Wydziale Biologii Rozwojowej i Komórkowej oraz anatomii i neurobiologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. A dzisiaj zamierzam zademonstrować przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z zarodków drosophila. Pociąga to za sobą usunięcie wszystkich komórek ze środkowego stadium choroby – zarodka Drosophila – i umieszczenie ich w hodowli komórkowej.

Używamy tych kultur do prawdziwego zrozumienia, jakie są geny i czynniki środowiskowe, które są ważne dla regulacji pobudliwości elektrycznej i transmisji synaptycznej między neuronami Drosophila. Aby rozpocząć tę procedurę, musimy pobrać zarodki Drosophila. Aby to zrobić, bierzemy talerze do zbierania jajek, smarujemy je odrobiną pasty drożdżowej.

Jest to korzystne podłoże dla dorosłych much do składania jaj. Umieszczamy te talerze na butelkach zawierających populację dorosłych much, zwykle od stu do 200 much. A potem pozwalamy muchom, dorosłe muchy składają jaja przez około dwie do trzech godzin.

Następnie usuwamy płytki do pobierania komórek jajowych i są to zarodki, których używamy do procedury hodowli. Kolejnym krokiem w procedurze jest otoczenie zarodków metodą decoate, a to oznacza, że faktycznie usuwamy zarodki. Robimy to, zmywając zarodki do lejka Buechnera, na którym mamy kawałek bibuły filtracyjnej, aby wyłapywał zarodki.

Pozwalamy im siedzieć w lejku Buchnera w 50% roztworze wybielacza. Ten 50% roztwór wybielacza nie tylko rozpuszcza korion, ale także służy jako część naszej procedury sterylizacji. Wykonujemy tę procedurę właściwie nie w kapturze, ale na zewnątrz kaptura, więc zarodki, po odchlorowaniu, myjemy je na szalce Petriego.

Właściwie, kiedy Corian zniknie, błona viel jest dość lepka i ładnie przykleja się do szalki Petriego. Następnie możesz zalać je wodą destylowaną i usunąć wodę destylowaną dwa lub trzy razy, a właściwie po prostu wylać wodę, a zarodki przykleją się do szalki Petriego. Nie używaj plastikowego naczynia do hodowli tkankowych.

Oni się tego nie trzymają. Sterylną część zabiegu rozpoczynamy od pobrania szalek Petriego z zarodków i umieszczenia ich w okapie z przepływem laminarnym. Są to szkiełka nakrywkowe bellco.

Są niepowlekane, ale były w autoklawie i nie były myte. Okazuje się, że nie działają one zbyt dobrze. Po umyciu wyjmujemy zwykle cztery szkiełka nakrywkowe i umieszczamy je na jednej szalce Petriego.

Będziemy więc tworzyć cztery kultury zarodków na każdej szalce Petriego. Okej, więc szalka Petriego jest w zasadzie gotowa do rozpoczęcia hodowli, a ja zwykle tworzę 12 kultur, od 12 do 16 kultur na raz. Porządku? Pożywka hodowlana, której używamy, jest stosunkowo prostą zdefiniowaną pożywką.

Jest to baza A-D-M-E-M, a my przygotowujemy to płynne podłoże raz na dwa tygodnie, aby pozostało dobre przez dwa tygodnie w lodówce. To zostało wysterylizowane. Został przepuszczony przez sterylny filtr o średnicy 0,2 mikrona, a następnie dodajemy do podłoża pięć suplementów.

Przygotowuje się je raz na dwa miesiące, a następnie zamraża w porcjach, które dodaje się do 10 milicali płynnego podłoża. Więc po prostu usuwamy zawartość. Ostatni, to po prostu delikatnie odwracamy to podłoże, aby je wymieszać i jesteśmy gotowi do pracy. Porządku.

Wszystko jest ustawione. Mam gotowe naczynie hodowlane lub szalkę Petriego, w której znajdują się cztery szkiełka nakrywkowe. A teraz wezmę moje danie z embrionami i zrobię to, one teraz siedzą w wodzie destylowanej.

Zamierzam usunąć wodę destylowaną, po prostu ją strząsając. W ten sposób robię to prosto do kosza na śmieci. A teraz zamierzam wylać około dwóch młynów pożywki na te embriony, a teraz są one gotowe do wprowadzenia szklanej igły do poszczególnych zarodków i usunięcia zawartości.

Trzeba mieć media na zewnątrz. Oczywiście, gdyby była tam woda, miałbyś szok osmotyczny. Teraz, aby przygotować się do przygotowania kultur tuż przed usunięciem zawartości zarodka, nakładam kroplę o pojemności pięciu mikrolitrów na szkiełka nakrywkowe.

Jeśli zostawisz go zbyt długo, zmieni się pH podłoża. Dobra, teraz zamierzam umieścić kroplę o pojemności pięciu mikrolitrów na środku każdego z czterech szkiełek nakrywkowych. W rzeczywistości ważne jest, aby te krople mówiły, że pozostają tak nienaruszone, jak to tylko możliwe.

Jeśli podłoże rozprzestrzeni się po całym szkiełku nakrywkowym, komórki są posiane w niektóre, bardzo cienka warstwa płynu jest trudna. Chcesz, aby ułożyły komórki w ładną, okrągłą kroplę płynu. Jak tam widać, mamy cztery ładne okrągłe krople płynu gotowe do użycia.

A teraz wezmę jedną z pipet, którą wyciągnąłem, a następnie po prostu przymocuję ją do tej rurki do pipety ustnej. Możesz użyć dowolnej rurki, ale dobrą rzeczą w tej rurce jest to, że jest ona dostarczana z pipetami o pojemności 100 mikrolitrów kalibrowanymi przez VWR. A w tych, które mamy, jest mała gumowa uszczelka.

Mogę włożyć pipetę do ust, mam na myśli szklaną pipetę do tego końca pipety. A potem, kiedy zasysam zawartość zarodka, nie zamierzam iść dalej niż do tego, do obszaru, w którym zaczyna się zwężać. Jest więc ten ogromny obszar, który oddziela mnie od miejsca, gdzie są komórki.

Więc nie ma, nie ma problemu z zanieczyszczeniem. Jeśli przypadkowo zassasz zawartość do tego obszaru, będziesz miał ogromne problemy z zanieczyszczeniem. W naszych okapach z przepływem laminarnym mamy mikroskopy preparacyjne, które są oparte na analizie mikroskopowej.

To pozwala na dopływ światła spod zarodka, a to pozwala nam zobaczyć bruzdę głowową i jelito środkowe oraz wyobrażenia, które zobaczymy, gdy spojrzymy na rzeczywiste zarodki. W ten sposób wybieramy stadium zarodka, które jest ważne dla hodowli w celu usunięcia zawartości zarodka. Używamy szklanych pipet, ciągniemy za zwykły ściągacz do mikroelektrod, którego używamy do robienia naszych pipet rejestrujących plastry.

Tak naprawdę nie obchodzi nas, jakie są ustawienia. Wyciągamy dość cienkie pipety, ponieważ zamierzamy odłamać pipetę w naczyniu obok zarodka w rozmiarze, którego naprawdę chcemy. Następnie bierzemy te szklane pipety, wprowadzamy je przez błonę pęcherzykową zarodka i używamy rurki do ssania ust, która jest przymocowana z tyłu pipety.

Następnie ekstrahujemy zawartość całego zarodka. Następnie przenosimy go, wyjmujemy pipetę i przenosimy do innego naczynia, które ma szkiełko nakrywkowe z kroplą pożywki o objętości pięciu mikrolitrów. I wydalamy zawartość zarodka do tej kropli o pojemności pięciu mikrolitrów.

Kilkakrotnie pipetowaliśmy w górę iw dół, aby rozproszyć komórki, a następnie pozostawiliśmy tę pokrywę w naczyniu na około 10 minut, zanim zalejemy naczynie dwoma młynkami pożywki. Szalki komórek po ich posianiu umieszcza się w inkubatorze o stężeniu 5% CO2. Jest to bardzo ważne, ponieważ media, których używamy, są pożywkami buforowanymi wodorowęglanami.

Mamy tam kilka HEP-ów, ale to nie wystarcza do buforowania w środowisku powietrznym. I tak trzeba użyć inkubatora z 5% CO2. Jednak musi to być w stosunkowo niskiej temperaturze, około 22 do 23 stopni, jest idealne.

Bierzemy więc standardowy inkubator CO2, który byłby używany z kultur ssaków i podgrzewamy go do 37 stopni. To, co robimy, to wyłączamy grzałkę, umieszczamy ją w naszym laboratorium i możemy umieścić lód na dnie inkubatora, co utrzymuje temperaturę około 21 do 25 stopni. Inną techniką, której używamy, jest to, że ponownie bierzemy jeden z tych standardowych inkubatorów CO2 grzewczych i umieszczamy inkubator w zimnym pomieszczeniu.

Wtedy można dość skutecznie podgrzać inkubator do 23 stopni, jeśli temperatura otoczenia jest zimna. To są dwie metody, których używamy, aby mieć standardową fokę, fokę ssaka do inkubatora, aby pozwolić sobie przetrwać. W porządku, to jest kultura, która została pokryta godzinę temu w tym samym powiększeniu, które widzieliśmy zaraz po poszyciu, godzinę po poszyciu.

Tutaj widzimy neurony, które różnicują się przez około dwa dni. W kulturze neuroblasty podzieliły się jeden lub więcej razy, a następnie dały początek neuronom, które rozszerzają procesy, które tworzą rozległe, nakładające się na siebie sieci neurotyczne. Tutaj mamy dwa ciała komórkowe, które idą w.

Górny przedłuża proces o godzinie 11, a dolny przedłuża proces o godzinie piątej. To są ich główne rozszerzenia. A potem widać, że tworzą drobniejsze gałęzie.

Są one bardzo ściśle przylegające do szklanego podłoża i można zaobserwować procesy, które pochodzą również z innych komórek, które na nie nakładają się. A są to miejsca potencjalnego połączenia synaptycznego. Załatalibyśmy jedną z tych komórek i ogólnie, przy tym poziomie rozwoju procesu, miałyby one synaptyczne funkcjonalne prądy synaptyczne.

Teraz nasze komórki rosną w hodowli 12 godzin po posiewie. Będą mieli całkiem niezłe procesy rozszerzone. Nasza standardowa fizjologia polega na tym, że zaczynamy robić około jednego do dwóch po hodowli.

I widać, że faktycznie kontynuują procesy wzrostu przez następne cztery lub pięć dni. Nagrywaliśmy z komórek do dwóch tygodni w hodowli, ale większość naszych nagrań to od dwóch do sześciu dni w hodowli z tymi kulturami, a następnie przygotowaliśmy zarodki Drosophila w średnim stadium żołądka, mamy sieci neuronów, które komunikują się w hodowli. Jesteśmy w stanie przyjrzeć się właściwościom wypalania tych komórek.

Mają różnorodne właściwości wypalania. Mają, wystrzeliwują w kółko, niektóre komórki wystrzeliwują powtarzalnie, inne komórki wystrzeliwują po urodzeniu, a te komórki są głównie cholinergiczne lub GABA-ergiczne. Przyglądamy się prądom synaptycznym, w których pośredniczą receptory nikotynowe, Aach, H i GABA.