Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ulegających ekspresji w oocytach Xenopus

Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie aktywacji kanału BK pod kontrolowanym napięciem, przy jednoczesnej kontroli roztworu wewnątrzkomórkowego. Osiąga się to poprzez pierwszą ekspresję kanałów BK w cytach Xenopus poprzez wstrzyknięcie im mRNA kanału BK. Drugim etapem zabiegu jest przygotowanie systemu perfuzyjnego.

Trzecim etapem zabiegu jest utworzenie giga uszczelnienia między błoną oocytu a pipetą z plastrem. Ostatnim etapem zabiegu jest wycięcie łaty membranowej. Ostatecznie wyniki uzyskane przy użyciu technologii patch clamp w połączeniu z systemem profusion pokazują, że kanały BK są aktywowane przez zmiany napięcia i stężenia wapnia.

Cześć, nazywam się Jin Cho Young i pracuję w laboratorium Dr. Jamie Zus na Uniwersytecie Waszyngtońskim. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, w tym pytania dotyczące molekularnego mechanizmu aktywacji kanałów jonowych. Więc zacznijmy.

Pierwszy etap procedury rozpoczyna się na kilka dni przed zaciśnięciem plastra i wykorzystuje mRNA kanału BK, które zostało przepisane in vitro. Po zebraniu cytów Xenopus Lavu w stadium od piątego do szóstego, wstrzyknij 0,05 do 50 nanogramów mRNA kanału BK do cytu. Za pomocą nano wstrzyknij dwa automatyczne wtryskiwacze nanolitrów.

Powtórz wstrzyknięcie na kilkunastu oocytach dla każdego mRNA po wstrzyknięciu. Dwukrotnie przepłukać oocyty roztworem ND 96. Następnie umieść oocyty na płytce hodowlanej i inkubuj je w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez dwa lub więcej dni, aby dać oocytom czas na ekspresję kanału BK.

Po dwóch do pięciu dniach inkubacji oocyty powinny wykazywać ekspresję kanałów BK, a więc są już gotowe do zaciśnięcia plastrów. Przed przystąpieniem do pracy z oocytami ustaw wszystko, czego będziesz potrzebować do zaciśnięcia plastra, zaczynając od systemu perfuzyjnego. Pokazany tutaj system to łącznik zaworu automatycznego.

16 System profuzji Azot pod ciśnieniem wypycha roztwory profuzji ze zbiorników roztworu przez rurki profuzyjne do ołówka i końcówki profuzy. Przepływ każdego strumienia roztworu obfitości jest kontrolowany przez jeden zawór zbiornika i jeden zawór elektroniczny. W tym protokole jeden ze zbiorników nie jest pod ciśnieniem i pełni funkcję kolektora odpadów, a także mechanizmu uwalniania ciśnienia.

Przed przystąpieniem do doświadczeń można przygotować roztwory perfuzyjne o różnych stężeniach wapnia lub magnezu. Dodaj roztwory perfuzyjne do zbiorników i oznacz każdy z nich, aby wskazać stężenie wapnia lub magnezu. Aby najpierw skonfigurować system profusion, podłącz rurki do ołówka profusion.

Następnie włącz elektroniczny sterownik zaworu i otwórz zawory elektroniczne, aby upewnić się, że rurki i ołówek obfitości są wolne od zatorów i pęcherzyków powietrza. Przepchnij wodę dejonizowaną przez każdą rurkę za pomocą strzykawki wypełnionej wodą dejonizowaną. W tym momencie podłącz rurki do zbiorników roztworu i otwórz zawór butli z gazem, aby zastosować azot pod ciśnieniem.

Otwórz jeden zawór zbiornika, aby napełnić rurkę jednym z roztworów zbiornika. W razie potrzeby kliknij zawór zbiornika, aby usunąć pęcherzyki z roztworu. Zamknij zawór zbiornika po napełnieniu rurki roztworem, napełnij końcówkę perfuzyjną wodą i przykręć ją do ołówka perfuzyjnego.

Uważaj, aby nie uwięzić żadnych bąbelków. Podłączając końcówkę, przymocuj kredkę perfuzyjną do etapu kąpieli za pomocą plasteliny, upewnij się, że końcówka obfitości znajduje się w przestrzeni wanny. System obfitości jest teraz skonfigurowany.

W tym momencie dodaj do kąpieli wodę dejonizowaną. Upewnij się, że końcówka profusion jest zanurzona w wodzie. Sprawdź, czy każdy roztwór perfuzyjny prawidłowo wypływa z końcówki perfuzyjnej.

Zamknij zawór elektroniczny podłączony do rurki pojemnika na odpady i otwórz zawór jednego z roztworów obfitości. Pod mikroskopem obserwuj strumień płynu obfitego wychodzący z końcówki perfuzyjnej. Zamknij zawór tego roztworu obfitości i otwórz zawór pojemnika na odpady.

Strumień obfitości powinien prawie zniknąć. Powtórzyć ten sam test dla każdego z roztworów perfuzyjnych. Po upewnieniu się, że wszystkie roztwory perfuzyjne przepływają prawidłowo, zastąp dejonizowaną wodę w kąpieli żądanym roztworem do kąpieli.

Teraz nadszedł czas, aby ustawić aparaturę rejestrującą. Srebrną elektrodę rejestrującą należy ponownie pokryć chlorkiem srebra przed każdą sesją zaciskania plastrów. Najpierw wyjmij drut elektrody z uchwytu na pipety i zanurz końcówkę drutu elektrody w fiolce zawierającej świeży wybielacz na co najmniej 15 minut.

W ten sposób na drucie osadza się warstwa chlorku srebra. Opłucz drut elektrody wodą dejonizowaną i osusz. Następnie zainstaluj elektrodę srebrowo-srebrowo-chlorkową z powrotem w uchwycie pipety.

Teraz włącz komputer. Podłącz klucz sprzętowy do portu drukarki w komputerze. Klucz sprzętowy musi być podłączony, aby można było korzystać z oprogramowania do akwizycji danych, którym jest impuls HEA.

Włącz wzmacniacz i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych. Impuls HEA. Załaduj plik protokołu i dostosuj ustawienia konfiguracyjne, takie jak skala bodźca.

Celem dostosowania ustawień konfiguracyjnych jest zapewnienie, że potencjał testowy jest dokładnie równy potencjałowi dowodzenia. Teraz jesteśmy gotowi do przygotowania oocytów. Pobrać oocyty z inkubatora.

Zanurz oocyt w roztworze odpędzającym na pięć do 10 minut. Roztwór do usuwania oddziela błonę żyłkową od błony plazmatycznej, co umożliwia usunięcie błony witelowej. Po pięciu do 10 minutach delikatnie usuń błonę vitel z oocytu.

Za pomocą dwóch kleszczy. Witryna divi OC jest niezwykle delikatna i dlatego powinna być przenoszona tak rzadko, jak to konieczne. Uważając, aby nie dopuścić do wystawienia oocytu Devi na działanie powietrza lub pęcherzyków, użyj szklanej pipety wypełnionej wystarczającą ilością roztworu, aby przenieść oocyt do kąpieli.

Kanały na błonie oocytów są teraz odsłonięte i gotowe do pipety z plastrem. Wyciągnij pipetę z plastrem, wkładając szklaną rurkę kapilarną do ściągacza mikropipet. Obserwuj pipety pod mikroskopem, aby określić kształt końcówki i średnicę otworu.

Średnica otworu powinna wynosić od dwóch do czterech mikrometrów, aby zmniejszyć prąd pojemnościowy podczas nagrywania, a aby zapewnić gładką końcówkę, pokryj końcówkę woskiem, a następnie odpal. Wypoleruj go pod mikroskopem. Napełnij końcówkę pipety, umieszczając końcówkę pipety w roztworze pipety i pociągając za tłok.

Spowoduje to zwilżenie końcówki pipety. Następnie napełnij pipetę w jednej trzeciej roztworem pipety za pomocą strzykawki. Następnie umieść pipetę w uchwycie na pipety z srebrną elektrodą chlorkowo-srebrną w środku.

Upewnij się, że drut elektrodowy styka się z roztworem pipety. Kolejnym krokiem jest wycięcie plastra na lewą stronę z przygotowanego oocytu. Najpierw znajdź przezroczystą krawędź oocytu pod mikroskopem.

Za pomocą manipulatora przesuń pipetę z plastrem blisko oocytu, upewniając się, że jest zanurzona. W roztworze kąpieli zanotować szeregową rezystancję pipety. Idealna rezystancja szeregowa pipety krosowej wynosi od jednego do 1,5 milioma po napełnieniu roztworem pipety i zanurzeniu w roztworze do kąpieli.

Teraz powoli dociskaj pipetę do oocytu, aż jej opór w przybliżeniu się podwoi. Uzyskać uszczelnienie giga omów, stosując delikatne ssanie ustami przez rurkę ssącą podłączoną do uchwytu pipety. Po potwierdzeniu, że utworzono giga pieczęć, ustabilizuj łatkę, przytrzymując ją na minus 30 miliwoltach przez kilka minut.

Aby uzyskać plaster wywrócony na lewą stronę, należy go wyciąć, szybko wciskając pipetę głębiej w miejsce OO, a następnie delikatnie ją wyciągając. Łatka wywrócona na lewą stronę jest teraz gotowa do zaciśnięcia łatki. Przesuń pipetę trzymającą plaster na lewą stronę na około 100 mikronów od otworu końcówki perfuzyjnej.

Zamknij elektroniczny zawór do zbierania odpadów i otwórz zawór zbiornika, aby uzyskać żądany roztwór obfitości. Rozpocznij rejestrowanie prądów na łacie. Zmień napięcie i roztwory profuzji zgodnie z potrzebami.

Po zakończeniu nagrywania wyczyść ołówek i końcówkę rurki profusion, przepychając się przez wodę dejonizowaną, aby uniknąć zatkania. Uzyskane tutaj nagrania z zacisku plastra pokazują, że kanały BK typu dzikiego na plastrze błony oocytów reagują zarówno na napięcie, jak i wapń. Rysunek ten przedstawia zapis łatki z nominalnym zerowym stężeniem wapnia w roztworze perfuzyjnym.

Fale kwadratowe nad ścieżkami prądu wskazują napięcie przyłożone do łaty. Przyłożono cztery napięcia w zakresie od 50 miliwoltów do 200 miliwoltów w przyrostach co 50 miliwoltów. Maksymalny prąd, około dwóch nanoamperów, uzyskano przy maksymalnym napięciu 200 miliwoltów.

Ten wzrost amplitudy prądu wraz ze wzrostem napięcia wskazywał, że prawdopodobieństwo otwarcia kanałów BK wzrastało wraz z napięciem. Ten rysunek pokazuje reakcję łatki na lewą stronę na różne napięcia. Gdy w roztworze perfuzyjnym znajdował się jeden mikromolowy wapń, zastosowano stopnie napięcia.

Podobnie jak na rysunku następującym, odpowiedź na krok napięcia 200 miliwoltów, górna odpowiedź wzrosła do około trzech nanoamperów, gdy w ósemce Perfu był wapń, w porównaniu z dwoma nanoamperami bez wapnia. Wskazuje to, że prawdopodobieństwo otwarcia kanałów BK wzrastało w obecności wapnia. Podsumowując, ta procedura zaciskania krosek wykazała, że kanały BK były zależne od napięcia i wapnia.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak nagrać aktywację Iron Channel za pomocą techniki zacisku krosowego w połączeniu z profesjonalnym systemem tankowania. Teraz. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.