Name: Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ulegających ekspresji w oocytach Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj techniki patch clamp i perfuzji do badania aktywacji kanałów BK w oocytach Xenopus. Ta metoda umożliwia precyzyjne rejestrowanie prądów jonowych przy kontrolowanym napięciu i stężeniu wapnia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health) R01-HL70393 i R01-NS060706 przyznane J.C. J.C. jest profesorem inżynierii biomedycznej w ramach funduszu Spencer T. Olin Endowment.

1. Iniekcja mRNA do oocytów
<ol>
	<li>Wstrzyknąć od 0,05 do 50 ng transkrybowanego in vitro mRNA do oocytów Xenopus laevis (stadium V-VI) przy użyciu auto-nanolitrowego injektora Nanoject II (Drummond Scientific Company, model 3-00-204). Zabieg powtórzyć dla kilkunastu oocytów w przypadku każdego mRNA.</li>
	<li>Wstrzyknięte oocyty przepłukać dwukrotnie roztworem ND-96 (96 mM chlorku sodu (NaCl, Mr 58,4 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74,56 g/mol), 1,8 mM chlorku wapnia (CaCl2•2H2O, Mr 147,02), 1 mM chlorku magnezu (MgCl2•6H2O, Mr 203,31 g/mol), 5 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, Mr 238,31 g/mol), 2,5 mM pirogronianu sodu (Mr 10,04 g/mol) oraz 1x penicyliny-streptomycyny, pH 7,6), następnie umieścić je na płytce hodowlanej i inkubować w temperaturze 18°C przez ponad 2 dni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie systemu perfuzyjnego
<img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="Schemat układu perfuzyjnego z azotem, zbiornikami z roztworami, zaworami elektronicznymi i kaniulą perfuzyjną." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Ilustracja systemu perfuzyjnego Automate ValveLink 16. System perfuzyjny wykorzystuje sprężony azot do wypychania roztworów perfuzyjnych z rezerwuarów, przez przewody perfuzyjne, do końcówki i pióra perfuzyjnego. Przepływ każdego strumienia roztworu perfuzyjnego jest kontrolowany przez jeden zawór rezerwuaru oraz jeden zawór elektroniczny. W niniejszym protokole jeden z rezerwuarów nie jest pod ciśnieniem i pełni funkcję kolektora odpadów oraz mechanizmu upustowego. (Rysunek zaadaptowany ze strony dostawcy http://www.autom8.com)
<ol>
	<li>Podłącz dreny do ołówka perfuzyjnego. Włącz elektroniczny sterownik zaworów i otwórz zawory elektroniczne.</li>
	<li>Aby upewnić się, że przewody i końcówka perfuzyjna są wolne od zatorów i pęcherzyków powietrza, należy przepchnąć wodę dejonizowaną (DI) przez każdy przewód, używając strzykawki wypełnionej wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Podłączyć rurki do zbiorników z roztworami i otworzyć zawór butli z gazem, aby wprowadzić azot pod ciśnieniem.</li>
	<li>Otwórz zawór zbiornika, aby napełnić przewody roztworem ze zbiornika. W razie potrzeby stuknij w zawór zbiornika, aby usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu. Zamknij zawór po napełnieniu przewodów roztworem.</li>
	<li>Napełnić końcówkę perfuzyjną wodą i przykręcić ją do ołówka perfuzyjnego. Należy uważać, aby podczas podłączania końcówki nie uwięznąć żadnych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przymocuj ołówek perfuzyjny do platformy kąpieli za pomocą modeliny. Upewnij się, że końcówka perfuzyjna znajduje się w przestrzeni kąpieli. System perfuzyjny został teraz skonfigurowany.</li>
	<li>Napełnić kąpiel wodą dejonizowaną (DI). Należy upewnić się, że końcówka perfuzyjna jest zanurzona w wodzie.</li>
	<li>Sprawdź, czy każdy roztwór perfuzyjny wypływa prawidłowo z końcówki perfuzyjnej. Zamknij zawór elektroniczny podłączony do rurki kolektora odpadów i otwieraj zawory dla każdego roztworu perfuzyjnego po kolei (140 mM wodorotlenek potasu (KOH, Mr 56,1 g/mol), 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, Mr 238,31 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74,56 g/mol), 1 mM glikolu etylenowego-bis(2-aminoetylotere)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA, Mr 380,35 g/mol), pH jest dostrajane do wartości 7,1–7,2 za pomocą kwasu metanosulfonowego (MeSO3, Mr 96,1 g/mol), Ca2+ (lub w razie potrzeby dodaje się Mg2+ do pożądanej koncentracji). Pod mikroskopem należy zaobserwować strumień płynu perfuzyjnego wypływający z końcówki perfuzyjnej. Należy zamknąć zawór roztworu perfuzyjnego i otworzyć zawór zbiornika na odpady. Strumień perfuzyjny powinien niemal całkowicie zaniknąć. Powtórzyć ten sam test dla wszystkich roztworów perfuzyjnych.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że wszystkie roztwory perfuzyjne przepływają prawidłowo, należy zastąpić wodę dejonizowaną (DI) w kąpieli roztworem do kąpieli (140 mM wodorotlenku potasu (KOH, Mr 56,1 g/mol), 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, Mr 238,31 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74,56 g/mol), pH reguluje się do wartości 7,1-7,2 za pomocą kwasu metanosulfonowego (MeSO3, Mr 96,1 g/mol)).</li>
</ol>
3. Metoda Patch Clamp
<ol>
	<li>Przed każdą sesją patch-clampu należy ponownie pokryć elektrodę rejestrującą Ag warstwą AgCl. Najpierw należy wyjąć drut elektrody z uchwytu pipety i zanurzyć połowę drutu w fiolce zawierającej świeży wybielacz na co najmniej 15 minut. Pozwala to na osadzenie warstwy AgCl na drucie.</li>
	<li>Drut elektrody należy przepłukać wodą dejonizowaną i osuszyć. Następnie należy ponownie zamontować elektrodę Ag/AgCl w uchwycie pipety.</li>
	<li>Elektrodę kąpielową (referencyjną) należy podłączyć do przedwzmacniacza i umieścić w kąpieli. Przygotowuje to elektrody do rejestracji.</li>
	<li>Następnie należy przygotować system do akwizycji danych. Włącz komputer i podłącz klucz sprzętowy do portu drukarki w komputerze. Klucz sprzętowy musi być podłączony, aby móc korzystać z oprogramowania do akwizycji danych, którym jest HEKA pulse.</li>
	<li>Włącz wzmacniacz (Axon Instruments, AXOPATCH 20B) i uruchom program HEKA Pulse. Wczytaj plik protokołu i dostosuj ustawienia konfiguracji, takie jak skala bodźca (Stimulus Scale). Celem dostosowania ustawień konfiguracji jest zapewnienie, aby potencjał testowy był dokładnie równy potencjałowi sterującemu. Przygotowuje to sprzęt do akwizycji danych.</li>
	<li>Przygotuj oocyty. Zanurz oocyt w roztworze do usuwania błony (20 mM N-metyl-D-glukaminy (NMG, Mr 195.2 g/mol), 20 mM aspartanianu (bez K+) (Mr 13.1 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74.56 g/mol), 10 mM kwasu etylenoglikol-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA, Mr 380.35 g/mol), 1 mM chlorku magnezu (MgCl2•6H2O, Mr 203.31 g/mol), 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynowy etanosulfonowego (HEPES, Mr 238.31 g/mol), pH dostosowane do 7,4 za pomocą wodorotlenku sodu (NaOH, Mr 40.0 g/mol)) na 5–10 min. Roztwór do usuwania błony oddziela błonę witelinową od błony plazmatycznej, co umożliwia usunięcie błony witelinowej.</li>
	<li>Delikatnie usuń błonę witelinową z oocytu za pomocą dwóch par pęset. Oocyt po dewitelinizacji jest niezwykle kruchy, dlatego należy go przemieszczać w jak najmniejszym zakresie.</li>
	<li>Aby uniknąć wystawienia dewitelinizowanego oocytu na działanie powietrza lub pęcherzyków, użyj szklanej pipety wypełnionej odpowiednią ilością roztworu, aby przenieść oocyt do kąpieli. Przygotowuje to oocyt do rejestracji.</li>
	<li>Przygotuj pipety do patch-clampu. Wytnij szklane pipety, wkładając szklaną rurkę kapilarną (VWR International, Kat # 53432-921) do wyciągacza mikroelektrod Sutter P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller. Obserwuj pipety pod mikroskopem, aby określić kształt końcówki i średnicę otworu. Średnica otworu powinna wynosić 2–4 µm.</li>
	<li>Aby zmniejszyć prąd pojemnościowy podczas rejestracji i zapewnić gładkość końcówki, pokryj końcówkę woskiem, a następnie wypal ją w płomieniu.</li>
	<li>Wypełnij końcówkę pipety, umieszczając ją w roztworze do pipet (140 mM wodorotlenku potasu (KOH, Mr 56.1 g/mol), 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynowy etanosulfonowego (HEPES, Mr 238.31 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74.56 g/mol), 2 mM chlorku magnezu (MgCl2•6H2O, Mr 203.31 g/mol), pH dostosowane do 7,1–7,2 za pomocą kwasu metanosulfonowego (MeSO3, Mr 96.1 g/mol)) i odciągając tłok. Pozwala to na zwilżenie końcówki.</li>
	<li>Wypełnij 1/3 pipety roztworem do pipet za pomocą strzykawki i umieść pipetę w uchwycie z elektrodą Ag/AgCl wewnątrz, tak aby stykowała się z roztworem do pipet. Przygotowuje to pipetę do patch-clampu.</li>
	<li>Aby wyciąć patch typu inside-out z przygotowanego oocytu, znajdź pod mikroskopem wyraźną krawędź oocytu. Przesuń pipetę do patch-clampu blisko oocytu za pomocą manipulatora. Zmierz rezystancję szeregową pipety. Idealna rezystancja szeregowa pipety do patch-clampu wynosi od 1 do 1,5 MΩ, gdy jest ona wypełniona roztworem do pipet i zanurzona w roztworze kąpielowym.</li>
	<li>Powoli dociśnij pipetę do oocytu, aż rezystancja wzrośnie mniej więcej dwukrotnie.</li>
	<li>Zastosuj delikatne ssanie błony ustami poprzez rurkę ssącą połączoną z uchwytem pipety, aż do uzyskania uszczelnienia gigaomowego (giga-ohm seal). Stabilizuj patch, utrzymując napięcie -30 mV przez kilka minut.</li>
	<li>Aby uzyskać patch typu inside-out, wytnij go, szybko wsuwając pipetę głębiej w oocyt, a następnie delikatnie ją wyciągając.</li>
	<li>Patch typu inside-out jest teraz gotowy do clampowania. Przesuń pipetę z patchem na odległość około 10 µm od otworu końcówki perfuzyjnej.</li>
	<li>Zamknij elektroniczny zawór odpływu i otwórz zawór zbiornika z wybranym roztworem perfuzyjnym.</li>
	<li>Rozpocznij rejestrację prądów przez patch. Zmieniaj napięcie i roztwory perfuzyjne według potrzeb.</li>
	<li>Po zakończeniu rejestracji oczyść przewody perfuzyjne, igłę i końcówkę, przepychając przez nie wodę dejonizowaną, aby uniknąć zatorów.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Podczas przygotowywania oocytów do metody patch clamp, 5-10 minowe traktowanie roztworem do usuwania błony witeliny powoduje oddzielenie błony witeliny od błony plazmatycznej, co umożliwia usunięcie błony witeliny.
Idealna rezystancja szeregowa pipety patch wynosi od 1-1.5 MΩ, gdy jest ona wypełniona roztworem do pipety i zanurzona w roztworze kąpielowym.
Poniżej znajduje się reprezentatywny zapis kanałów BK typu dzikiego w płacie błony oocytu. W lewym górnym rogu przebiegi prostokątne wskazują napięcie przyłożone do płata – drugi stopień napięcia wzrasta od 50 mV do 20 mV z przyrostem 50 mV. Poniżej znajdują się odpowiadające im zapisy prądowe dla roztworu perfuzyjnego o nominalnym stężeniu 0 Ca.2+ (wolne [Ca²⁺])2+] wynosi około 0,5 nM). Wzrost amplitudy prądu wskazuje, że prawdopodobieństwo otwarcia kanałów BK zwiększa się wraz z napięciem. Po prawej stronie ten sam fragment błony jest perfundowany za pomocą 1.0 μM Wapń2+ przy zastosowaniu tego samego protokołu napięciowego. Amplituda prądu wzrasta w większym stopniu przy tym samym napięciu, co wskazuje na wzrost prawdopodobieństwa otwarcia wraz z [Ca2+]. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="Wykres clampy napięciowej prądów jonów wapnia przy różnych stężeniach, przedstawiający wyniki elektrofizjologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2">

<ol><li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes%3A+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).</li>
<li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maxi-K+%28Ca%29%2C+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li>
<li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+hair+cell+tuning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li>
<li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li>
<li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li>
<li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li>
<li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Mg2%2B+enhances+the+function+of+BK-type+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li>
<li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+mechanism+of+BK+%28Slo1%29+channels%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li>
<li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+%28BK%29+channel%3A+activation+by+Ca2%2B+and+voltage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li>
<li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li>
<li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2%2B-dependent+activation+of+BK-type+mslo1%5BTitle%5D)+AND+%22K%2B+channels.+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li>
<li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2%2B+coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li>
<li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%7Bbeta%7D+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

System ekspresyjny w oocytach jest idealny do charakterystyki elektrofizjologicznej napięciowo zależnych kanałów jonowych ze względu na stosunkowo niskie tło endogennych kanałów. Ponadto, jako że jest to system ekspresji przejściowej, stanowi on wydajną metodę prowadzenia badań nad mutogenezą tych kanałów. Należy jednak zauważyć, że system ekspresyjny w oocytach różni się od systemu w komórkach ssaków, w związku z czym mogą występować różnice w modyfikacjach potranslacyjnych oraz w asocjacji z różnymi podjednostkami. Co ...

<table><tbody><tr><td>Automatyczny wstrzykiwacz nanolitrowy Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet P-97 (metoda wypalania/Browna)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzji i sterownik elektroniczny</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>ValveLink 16</td><td>Średnica wewnętrzna końcówki perfuzyjnej: 100 mikronów</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet (metoda wypalania/Browna)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Axon Instruments</td><td>AXOPATCH 200B</td><td></td></tr><tr><td>Interfejs komputerowy</td><td>INSTRUTECH Corporation</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Głowica wzmacniacza (Headstage)</td><td>Axon Instruments</td><td>CV 203BU</td><td></td></tr></tbody></table>

techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach xenopus

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu zbadania aktywacji kanałów potasowych o dużym przewodnictwie, zależnych od napięcia i Ca2+2+aktywowany K+ kanały (BK). Protokół ten może być również wykorzystany do badania zależności między strukturą a funkcją w przypadku innych kanałów jonowych i receptorów neurotransmiterów1Kanały BK są szeroko ekspresjonowane w różnych tkankach i są zaangażowane w wiele funkcji fizjologicznych, w tym w regulację skurczu mięśni gładkich, strojenie częstotliwości komórek rzęskowych wewnętrznych oraz regulację uwalniania neurotransmiterów.2-6Kanały BK są aktywowane przez depolaryzację błony oraz wewnątrzkomórkowy Ca2+.2+ oraz Mg2+ 6-9W związku z tym protokół został opracowany w celu kontrolowania zarówno napięcia błony, jak i roztworu wewnątrzkomórkowego. W tym protokole mRNA kanałów BK jest wstrzykiwane do Xenopus laevis oocyty (stadium V-VI), a następnie 2–5 dni inkubacji w temperaturze 18°C10-13Platki błonowe zawierające pojedyncze lub wiele kanałów BK są wycinane w konfiguracji inside-out z wykorzystaniem techniki patch clamp.10-13Wewnętrzna strona patcha jest podczas rejestracji perfundowana odpowiednimi roztworami, co umożliwia zbadanie aktywacji kanałów w różnych warunkach. Podsumowując, mRNA kanałów BK wstrzykuje się do Xenopus laevis oocyty w celu ekspresji białek kanałowych w błonie oocytu; techniki patch-clamp są wykorzystywane do rejestrowania prądów przepływających przez kanały przy kontrolowanym napięciu i składzie roztworów wewnątrzkomórkowych.

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu zbadania aktywacji dużych przewodzących, zależnych od napięcia i Ca2+ kanałów potasowych (BK). Protokół może...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja aktywacji kanałów BK przy kontrolowanym napięciu, przy jednoczesnej kontroli składu roztworu wewnątrzkomórkowego. Osiąga się to poprzez uprzednią ekspresję kanałów BK w komórkach Xenopus Cytes za pomocą wstrzyknięcia mRNA kanałów BK. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie systemu perfuzyjnego.Trzecim krokiem procedury jest utworzenie giga-uszczelnienia (giga seal) pomiędzy błoną oocytu a pipetą do patch-clampu. Ostatnim krokiem procedury jest wycięcie fragmentu błony (patch). Ostatecznie wyniki uzyskane dzięki zastosowaniu techniki patch clamp w połączeniu z systemem perfuzji wykazują, że kanały BK są aktywowane przez zmiany napięcia oraz stężenia wapnia.Witam, nazywam się Jin Cho Young i pracuję w laboratorium dr Jamie Zus na Washington University. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, w tym pytania dotyczące molekularnego mechanizmu aktywacji kanałów jonowych. Zacznijmy zatem.Pierwszy krok procedury rozpoczyna się kilka dni przed rejestracją prądów metodą patch-clamp i wykorzystuje mRNA kanału BK przetranskrybowanego in vitro. Po zebraniu oocytów Xenopus w piątym lub szóstym stadium, wstrzyknąć od 0,05 do 50 nanogramów mRNA kanału BK do oocytu. Należy użyć nanoinjektora automatycznego o objętości 2 nanolitry.Powtórzyć iniekcję u kilkunastu oocytów dla każdego mRNA po wykonaniu pierwszej iniekcji. Przepłukać oocyty dwukrotnie roztworem ND 96. Następnie umieścić oocyty w płytce hodowlanej i inkubować je w temperaturze 18 °C przez dwa lub więcej dni, aby umożliwić ekspresję kanału BK w oocytach.Po dwóch do pięciu dniach inkubacji oocyty powinny wykazują ekspresję kanałów BK i tym samym są gotowe do metody patch-clamp. Przed rozpoczęciem pracy z oocytami należy przygotować wszystkie pozostałe elementy niezbędne do przeprowadzenia pomiarów, zaczynając od systemu perfuzji. System przedstawiony tutaj to automate valve link.Sprężony azot w systemie profuzji wypycha roztwory profuzyjne z zbiorników z roztworami, przez przewody profuzyjne, do ołówka i końcówki profuzyjnej. Przepływ każdego strumienia roztworu profuzyjnego jest kontrolowany przez jeden zawór zbiornika oraz jeden zawór elektroniczny. W niniejszym protokole jeden ze zbiorników nie jest pod ciśnieniem i pełni funkcję kolektora odpadów, a także mechanizmu uwalniania ciśnienia.Przed rozpoczęciem eksperymentów można przygotować roztwory perfuzyjne o różnych stężeniach wapnia lub magnezu. Należy wlać roztwory perfuzyjne do zbiorników i opisać każdy z nich, podając stężenie wapnia lub magnezu. Aby przygotować system perfuzyjny, w pierwszej kolejności należy podłączyć rurki do kaniuli perfuzyjnej.Następnie włącz kontroler zaworów elektronicznych i otwórz zawory elektroniczne, aby upewnić się, że przewody i końcówka do perfuzji są wolne od zatorów i pęcherzyków powietrza. Przepchnij wodę dejonizowaną przez każdy przewód, używając strzykawki wypełnionej wodą dejonizowaną. W tym momencie podłącz przewody do zbiorników z roztworami i otwórz zawór butli z gazem, aby przyłożyć ciśnienie azotu.Otwórz jeden zawór zbiornika, aby napełnić rurkę jednym z roztworów zbiornikowych. W razie potrzeby kliknij zawór zbiornika, aby usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu. Zamknij zawór zbiornika po napełnieniu rurki roztworem, napełnij końcówkę perfuzyjną wodą i przykręć ją do ołówka perfuzyjnego.Należy uważać, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Podczas podłączania końcówki, przymocuj ołówek perfuzyjny do podstawy kąpieli za pomocą plasteliny, upewniając się, że końcówka perfuzyjna znajduje się w przestrzeni kąpieli. System perfuzyjny jest teraz skonfigurowany.Na tym etapie należy dodać do kąpieli wodę dejonizowaną. Upewnij się, że końcówka perfuzyjna jest zanurzona w wodzie. Sprawdź, czy każdy roztwór perfuzyjny wypływa z końcówki perfuzyjnej prawidłowo.Zamknij zawór elektroniczny podłączony do rurki kolektora odpadów i otwórz zawór jednego z roztworów perfuzyjnych. Pod mikroskopem zaobserwuj strumień płynu perfuzyjnego wypływającego z końcówki perfuzyjnej. Zamknij zawór tego roztworu perfuzyjnego i otwórz zawór kolektora odpadów.Strumień perfuzyjny powinien niemal całkowicie zniknąć. Powtórz ten sam test dla każdego z roztworów perfuzyjnych. Po upewnieniu się, że wszystkie roztwory perfuzyjne przepływają prawidłowo, zastąp wodę dejonizowaną w kąpieli pożądanym roztworem kąpielowym.Nadszedł czas na przygotowanie aparatury pomiarowej. Przed każdą sesją patch clampingu należy ponownie pokryć srebrną elektrodę rejestrującą chlorkiem srebra. Najpierw należy wyjąć drut elektrody z uchwytu pipety i zanurzyć połowę końcówki drutu w fiolce ze świeżym podchlorynem w czasie co najmniej 15 minut.Powoduje to osadzenie warstwy chlorku srebra na drucie. Przepłucz drut elektrody wodą dejonizowaną i osusz go przez dotykanie papierowym ręcznikiem. Następnie zamontuj elektrodę srebro/chlorek srebra z powrotem w uchwycie pipety.Teraz włącz komputer. Podłącz klucz sprzętowy do portu drukarki w komputerze. Klucz sprzętowy musi być podłączony, aby można było korzystać z oprogramowania do akwizycji danych, którym jest HEA pulse.Włącz wzmacniacz i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych. Impuls HEA. Wczytaj plik protokołu i dostosuj ustawienia konfiguracji, takie jak skala bodźca.Celem dostosowania ustawień konfiguracji jest zapewnienie, aby potencjał pomiarowy był dokładnie równy potencjałowi sterującemu. Teraz jesteśmy gotowi do przygotowania oocytów. Wyjmij oocyty z inkubatora.Zanurz oocyt w roztworze do usuwania otoczki na od pięciu do 10 minut. Roztwór ten oddziela błonę witelijną od błony plazmatycznej, co umożliwia usunięcie błony witeliny. Po pięciu do 10 minutach delikatnie usuń błonę witelijną z oocytu.Używając dwóch pincet. Miejsce pobrania oocytu jest niezwykle delikatne, dlatego należy przesuwać je w jak najmniejszym niezbędnym zakresie. Dbając o to, aby nie wystawić oocytu na działanie powietrza lub pęcherzyków, należy użyć pipety szklanej wypełnionej odpowiednią ilością roztworu, aby przenieść oocyt do kąpieli.Kanały w błonie oocytu są teraz odsłonięte i gotowe do aplikacji pipety do patch-clampu. Wykonaj pipetę do patch-clampu, wkładając szklaną kapilarę do mikro-wyciągarki pipet. Obserwuj pipety pod mikroskopem, aby określić kształt końcówki oraz średnicę otworu.Średnica otworu powinna wynosić od dwóch do czterech mikrometrów, aby zredukować prąd pojemnościowy podczas rejestracji; aby zapewnić gładkość końcówki, należy ją pokryć woskiem, a następnie wypalić. Wypoleruj ją pod mikroskopem. Napełnij końcówkę pipety, umieszczając ją w roztworze do pipet i pociągając tłok.Pozwala to na zwilżenie końcówki pipety. Następnie, za pomocą strzykawki, należy napełnić pipetę w jednej trzeciej jej objętości roztworem do pipetowania. Następnie pipetę należy umieścić w uchwycie do pipet z włożoną do środka elektrodą srebro/chlorek srebra.Upewnij się, że elektroda drutowa styka się z roztworem w pipecie. Następnym krokiem jest wycięcie patcha typu inside-out z przygotowanego oocytu. Najpierw zlokalizuj pod mikroskopem wyraźną krawędź oocytu.Używając manipulatora, przesuń pipetę patchową blisko oocytu, upewniając się, że jest ona zanurzona. W roztworze kąpielowym zmierz oporność szeregową pipety. Idealna oporność szeregowa pipety patchowej, gdy jest ona wypełniona roztworem do pipety i zanurzona w roztworze kąpielowym, wynosi od 1 do 1,5 MΩ.Teraz powoli dociskaj pipetę do oocytu, aż jego opór wzrośnie około dwukrotnie. Uzyskaj uszczelnienie gigaomowe (giga seal), stosując delikatne ssanie ustami przez rurkę ssącą podłączoną do uchwytu pipety. Po potwierdzeniu utworzenia uszczelnienia gigaomowego, stabilizuj patch, utrzymując go przy napięciu minus 30 mV przez kilka minut.Aby uzyskać konfigurację inside-out, wytnij łatkę, szybko wsuwając pipetę głębiej w miejsce OO, a następnie delikatnie ją wycofując. Konfiguracja inside-out jest teraz gotowa do clampingu. Przesuń pipetę z łatką inside-out na odległość około 100 mikronów od otworu końcówki perfuzyjnej.Zamknąć elektroniczny zawór odpływu i otworzyć zawór zbiornika z wybranym roztworem perfuzyjnym. Rozpocząć rejestrację prądów przez patch. Zmieniać napięcie i roztwory perfuzyjne zgodnie z potrzebami.Po zakończeniu rejestracji należy oczyścić rurki perfuzyjne oraz końcówkę, przepłukując je wodą dejonizowaną, aby zapobiec zatorom. Rejestracje metodą patch clamp uzyskane w tym doświadczeniu wykazują, że kanały BK typu dzikiego na płacie błony oocytu reagują zarówno na napięcie, jak i na wapń. Na tej rycinie przedstawiono rejestrację patch clamp przy nominalnym zerowym stężeniu wapnia w roztworze perfuzyjnym.Kwadratowe przebiegi nad śladami prądowymi wskazują napięcie przyłożone do patcha. Przyłożono cztery wartości napięcia w zakresie od 50 millivolts do 200 millivolts w przyrostach co 50 millivolts. Maksymalny prąd, wynoszący około two nano amps, uzyskano przy maksymalnym napięciu 200 millivolts.Wzrost amplitudy prądu wraz ze zwiększaniem napięcia wskazał, że prawdopodobieństwo otwarcia kanałów BK zwiększało się wraz z napięciem. Na tym rysunku przedstawiono odpowiedź patcha typu inside-out na różne wartości napięcia. Skoki napięcia były aplikowane przy stężeniu wapnia 1 µM w roztworze perfuzyjnym.Podobnie jak na poprzedniej rycinie, w odpowiedzi na skok napięcia o 200 millivolt, górna odpowiedź wzrosła do około trzech nano amps w obecności wapnia w Perfu eight, w porównaniu do dwóch nano amps bez wapnia. Wskazuje to, że prawdopodobieństwo otwarcia kanałów BK wzrosło w obecności wapnia. Podsumowując, ta procedura patch clamping wykazała, że kanały BK są zależne od napięcia i wapnia.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak rejestrować aktywację kanału żelazowego przy użyciu techniki patch clamp w połączeniu z systemem perfuzyjnym. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Techniki Patch Clamp i Perfuzja do Badania Kanałów Jonowych Ekspresowanych w Xenopus komórkach jajnikowych

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K+ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb+ lub Li+ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Aby uzupełnić powszechnie stosowane metody badania TRPV4, opisano dwie metody: Jego mechanowrażliwość może być badana za pomocą luminometrii Ca2+-aequorin w transgenicznych drożdżach po prowokacji hypo-osmotycznej.  Można go również badać w oocytach Xenopus z wstrzyknięciem TRPV4-RNA za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego całej komórki lub zacisku krosowego w trybie on-cell lub wyciętym.

Luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów Xenopus molekularnej mechanowrażliwości TRPV4

Metoda "cut-open Vaseline gap" służy do uzyskiwania niskoszumowych zapisów prądów jonowych i bramkujących z zależnych od napięcia kanałów jonowych wyrażonych w oocytach Xenopus z wysoką rozdzielczością kinetyki szybkich kanałów. Przy niewielkich modyfikacjach fluorometria cęgów napięciowych może być sprzężona z protokołem rozcięcia oocytów.

Technika zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową Xenopus z fluorometrią

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Opisano zoptymalizowane procedury izolacji pojedynczych pęcherzyków, mikroiniekcji cytoplazmatycznego RNA, usuwania otaczających warstw komórek i ekspresji białek w oocytach Xenopus. Ponadto przedstawiono prostą metodę szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych z kanałami jonowymi bramkowanymi ligandem.

Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

Ten artykuł opisuje ulepszenie konwencjonalnej fluorometrii zaciskowej (VCF), gdzie zamiast barwników maleimidowych stosuje się fluorescencyjne nienaturalne aminokwasy (fUAA), aby badać strukturalne przegrupowania w kanałach jonowych. Procedura obejmuje iniekcję DNA oocytów Xenopus, koiniekcję RNA/fUAA oraz jednoczesne pomiary prądu i fluorescencji.

Fluorometria zaciskowa napięcia w oocytach Xenopus przy użyciu fluorescencyjnych nienaturalnych aminokwasów

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania białek połączeniowych w oocytach Xenopus i rejestrowania prądu połączeniowego między dwoma przypisanymi oocytami za pomocą komercyjnego wzmacniacza zaprojektowanego do zapisów napięcia z dwoma oocytami w trybie pomiaru wysokiego prądu bocznego.

Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus

Poznaj techniki patch clamp i perfuzji do badania aktywacji kanałów BK w oocytach Xenopus. Ta metoda umożliwia precyzyjne rejestrowanie prądów jonowych przy kontrolowanym napięciu i stężeniu wapnia.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Przeglądaj więcej filmów