Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja aktywacji kanałów BK przy kontrolowanym napięciu, przy jednoczesnej kontroli składu roztworu wewnątrzkomórkowego. Osiąga się to poprzez uprzednią ekspresję kanałów BK w komórkach Xenopus Cytes za pomocą wstrzyknięcia mRNA kanałów BK. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie systemu perfuzyjnego.

Trzecim krokiem procedury jest utworzenie giga-uszczelnienia (giga seal) pomiędzy błoną oocytu a pipetą do patch-clampu. Ostatnim krokiem procedury jest wycięcie fragmentu błony (patch). Ostatecznie wyniki uzyskane dzięki zastosowaniu techniki patch clamp w połączeniu z systemem perfuzji wykazują, że kanały BK są aktywowane przez zmiany napięcia oraz stężenia wapnia.

Witam, nazywam się Jin Cho Young i pracuję w laboratorium dr Jamie Zus na Washington University. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, w tym pytania dotyczące molekularnego mechanizmu aktywacji kanałów jonowych. Zacznijmy zatem.

Pierwszy krok procedury rozpoczyna się kilka dni przed rejestracją prądów metodą patch-clamp i wykorzystuje mRNA kanału BK przetranskrybowanego in vitro. Po zebraniu oocytów Xenopus w piątym lub szóstym stadium, wstrzyknąć od 0,05 do 50 nanogramów mRNA kanału BK do oocytu. Należy użyć nanoinjektora automatycznego o objętości 2 nanolitry.

Powtórzyć iniekcję u kilkunastu oocytów dla każdego mRNA po wykonaniu pierwszej iniekcji. Przepłukać oocyty dwukrotnie roztworem ND 96. Następnie umieścić oocyty w płytce hodowlanej i inkubować je w temperaturze 18 °C przez dwa lub więcej dni, aby umożliwić ekspresję kanału BK w oocytach.

Po dwóch do pięciu dniach inkubacji oocyty powinny wykazują ekspresję kanałów BK i tym samym są gotowe do metody patch-clamp. Przed rozpoczęciem pracy z oocytami należy przygotować wszystkie pozostałe elementy niezbędne do przeprowadzenia pomiarów, zaczynając od systemu perfuzji. System przedstawiony tutaj to automate valve link.

Sprężony azot w systemie profuzji wypycha roztwory profuzyjne z zbiorników z roztworami, przez przewody profuzyjne, do ołówka i końcówki profuzyjnej. Przepływ każdego strumienia roztworu profuzyjnego jest kontrolowany przez jeden zawór zbiornika oraz jeden zawór elektroniczny. W niniejszym protokole jeden ze zbiorników nie jest pod ciśnieniem i pełni funkcję kolektora odpadów, a także mechanizmu uwalniania ciśnienia.

Przed rozpoczęciem eksperymentów można przygotować roztwory perfuzyjne o różnych stężeniach wapnia lub magnezu. Należy wlać roztwory perfuzyjne do zbiorników i opisać każdy z nich, podając stężenie wapnia lub magnezu. Aby przygotować system perfuzyjny, w pierwszej kolejności należy podłączyć rurki do kaniuli perfuzyjnej.

Następnie włącz kontroler zaworów elektronicznych i otwórz zawory elektroniczne, aby upewnić się, że przewody i końcówka do perfuzji są wolne od zatorów i pęcherzyków powietrza. Przepchnij wodę dejonizowaną przez każdy przewód, używając strzykawki wypełnionej wodą dejonizowaną. W tym momencie podłącz przewody do zbiorników z roztworami i otwórz zawór butli z gazem, aby przyłożyć ciśnienie azotu.

Otwórz jeden zawór zbiornika, aby napełnić rurkę jednym z roztworów zbiornikowych. W razie potrzeby kliknij zawór zbiornika, aby usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu. Zamknij zawór zbiornika po napełnieniu rurki roztworem, napełnij końcówkę perfuzyjną wodą i przykręć ją do ołówka perfuzyjnego.

Należy uważać, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Podczas podłączania końcówki, przymocuj ołówek perfuzyjny do podstawy kąpieli za pomocą plasteliny, upewniając się, że końcówka perfuzyjna znajduje się w przestrzeni kąpieli. System perfuzyjny jest teraz skonfigurowany.

Na tym etapie należy dodać do kąpieli wodę dejonizowaną. Upewnij się, że końcówka perfuzyjna jest zanurzona w wodzie. Sprawdź, czy każdy roztwór perfuzyjny wypływa z końcówki perfuzyjnej prawidłowo.

Zamknij zawór elektroniczny podłączony do rurki kolektora odpadów i otwórz zawór jednego z roztworów perfuzyjnych. Pod mikroskopem zaobserwuj strumień płynu perfuzyjnego wypływającego z końcówki perfuzyjnej. Zamknij zawór tego roztworu perfuzyjnego i otwórz zawór kolektora odpadów.

Strumień perfuzyjny powinien niemal całkowicie zniknąć. Powtórz ten sam test dla każdego z roztworów perfuzyjnych. Po upewnieniu się, że wszystkie roztwory perfuzyjne przepływają prawidłowo, zastąp wodę dejonizowaną w kąpieli pożądanym roztworem kąpielowym.

Nadszedł czas na przygotowanie aparatury pomiarowej. Przed każdą sesją patch clampingu należy ponownie pokryć srebrną elektrodę rejestrującą chlorkiem srebra. Najpierw należy wyjąć drut elektrody z uchwytu pipety i zanurzyć połowę końcówki drutu w fiolce ze świeżym podchlorynem w czasie co najmniej 15 minut.

Powoduje to osadzenie warstwy chlorku srebra na drucie. Przepłucz drut elektrody wodą dejonizowaną i osusz go przez dotykanie papierowym ręcznikiem. Następnie zamontuj elektrodę srebro/chlorek srebra z powrotem w uchwycie pipety.

Teraz włącz komputer. Podłącz klucz sprzętowy do portu drukarki w komputerze. Klucz sprzętowy musi być podłączony, aby można było korzystać z oprogramowania do akwizycji danych, którym jest HEA pulse.

Włącz wzmacniacz i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych. Impuls HEA. Wczytaj plik protokołu i dostosuj ustawienia konfiguracji, takie jak skala bodźca.

Celem dostosowania ustawień konfiguracji jest zapewnienie, aby potencjał pomiarowy był dokładnie równy potencjałowi sterującemu. Teraz jesteśmy gotowi do przygotowania oocytów. Wyjmij oocyty z inkubatora.

Zanurz oocyt w roztworze do usuwania otoczki na od pięciu do 10 minut. Roztwór ten oddziela błonę witelijną od błony plazmatycznej, co umożliwia usunięcie błony witeliny. Po pięciu do 10 minutach delikatnie usuń błonę witelijną z oocytu.

Używając dwóch pincet. Miejsce pobrania oocytu jest niezwykle delikatne, dlatego należy przesuwać je w jak najmniejszym niezbędnym zakresie. Dbając o to, aby nie wystawić oocytu na działanie powietrza lub pęcherzyków, należy użyć pipety szklanej wypełnionej odpowiednią ilością roztworu, aby przenieść oocyt do kąpieli.

Kanały w błonie oocytu są teraz odsłonięte i gotowe do aplikacji pipety do patch-clampu. Wykonaj pipetę do patch-clampu, wkładając szklaną kapilarę do mikro-wyciągarki pipet. Obserwuj pipety pod mikroskopem, aby określić kształt końcówki oraz średnicę otworu.

Średnica otworu powinna wynosić od dwóch do czterech mikrometrów, aby zredukować prąd pojemnościowy podczas rejestracji; aby zapewnić gładkość końcówki, należy ją pokryć woskiem, a następnie wypalić. Wypoleruj ją pod mikroskopem. Napełnij końcówkę pipety, umieszczając ją w roztworze do pipet i pociągając tłok.

Pozwala to na zwilżenie końcówki pipety. Następnie, za pomocą strzykawki, należy napełnić pipetę w jednej trzeciej jej objętości roztworem do pipetowania. Następnie pipetę należy umieścić w uchwycie do pipet z włożoną do środka elektrodą srebro/chlorek srebra.

Upewnij się, że elektroda drutowa styka się z roztworem w pipecie. Następnym krokiem jest wycięcie patcha typu inside-out z przygotowanego oocytu. Najpierw zlokalizuj pod mikroskopem wyraźną krawędź oocytu.

Używając manipulatora, przesuń pipetę patchową blisko oocytu, upewniając się, że jest ona zanurzona. W roztworze kąpielowym zmierz oporność szeregową pipety. Idealna oporność szeregowa pipety patchowej, gdy jest ona wypełniona roztworem do pipety i zanurzona w roztworze kąpielowym, wynosi od 1 do 1,5 MΩ.

Teraz powoli dociskaj pipetę do oocytu, aż jego opór wzrośnie około dwukrotnie. Uzyskaj uszczelnienie gigaomowe (giga seal), stosując delikatne ssanie ustami przez rurkę ssącą podłączoną do uchwytu pipety. Po potwierdzeniu utworzenia uszczelnienia gigaomowego, stabilizuj patch, utrzymując go przy napięciu minus 30 mV przez kilka minut.

Aby uzyskać konfigurację inside-out, wytnij łatkę, szybko wsuwając pipetę głębiej w miejsce OO, a następnie delikatnie ją wycofując. Konfiguracja inside-out jest teraz gotowa do clampingu. Przesuń pipetę z łatką inside-out na odległość około 100 mikronów od otworu końcówki perfuzyjnej.

Zamknąć elektroniczny zawór odpływu i otworzyć zawór zbiornika z wybranym roztworem perfuzyjnym. Rozpocząć rejestrację prądów przez patch. Zmieniać napięcie i roztwory perfuzyjne zgodnie z potrzebami.

Po zakończeniu rejestracji należy oczyścić rurki perfuzyjne oraz końcówkę, przepłukując je wodą dejonizowaną, aby zapobiec zatorom. Rejestracje metodą patch clamp uzyskane w tym doświadczeniu wykazują, że kanały BK typu dzikiego na płacie błony oocytu reagują zarówno na napięcie, jak i na wapń. Na tej rycinie przedstawiono rejestrację patch clamp przy nominalnym zerowym stężeniu wapnia w roztworze perfuzyjnym.

Kwadratowe przebiegi nad śladami prądowymi wskazują napięcie przyłożone do patcha. Przyłożono cztery wartości napięcia w zakresie od 50 millivolts do 200 millivolts w przyrostach co 50 millivolts. Maksymalny prąd, wynoszący około two nano amps, uzyskano przy maksymalnym napięciu 200 millivolts.

Wzrost amplitudy prądu wraz ze zwiększaniem napięcia wskazał, że prawdopodobieństwo otwarcia kanałów BK zwiększało się wraz z napięciem. Na tym rysunku przedstawiono odpowiedź patcha typu inside-out na różne wartości napięcia. Skoki napięcia były aplikowane przy stężeniu wapnia 1 µM w roztworze perfuzyjnym.

Podobnie jak na poprzedniej rycinie, w odpowiedzi na skok napięcia o 200 millivolt, górna odpowiedź wzrosła do około trzech nano amps w obecności wapnia w Perfu eight, w porównaniu do dwóch nano amps bez wapnia. Wskazuje to, że prawdopodobieństwo otwarcia kanałów BK wzrosło w obecności wapnia. Podsumowując, ta procedura patch clamping wykazała, że kanały BK są zależne od napięcia i wapnia.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak rejestrować aktywację kanału żelazowego przy użyciu techniki patch clamp w połączeniu z systemem perfuzyjnym. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.