Mikrokosmosy bloku agarowego do kontrolowanego rozkładu tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe

Ogólnym celem tej procedury jest zaszczepienie tlenowego grzyba rozkładającego drewno w mikrokosmosie szalki Petriego, gdzie wilgotność drewna i podłoża egzogenne są ściśle kontrolowane. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie mikrokosmosów z dokładnymi objętościami znanych edii. Następnie drewno, które ma ulec degradacji, i wszelkie egzogenne podłoża stałe są montowane na plastikowej siatce na powierzchni rolnej, nie dopuszczając do kontaktu między podłożami.

Mikrokosmos jest następnie zaszczepiany i inkubowany z badanym grzybem. Po inkubacji wycina się klocki drzewne w celu określenia ubytku masy i przygotowania tkanek do analiz. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują stopień biodegradacji drewna i rolę źródeł pierwiastków egzogennych poprzez pomiary utraty masy, obserwacje morfologii grzybni i ukierunkowane analizy pierwiastków, takie jak spektroskopia plazmy sprzężonej indukcyjnie.

Cześć, nazywam się Brooke Jacobson i pracuję w laboratorium dr Jonathana Schillinga na Wydziale Bioproduktów i Inżynierii Biosystemów na Uniwersytecie w Minnesocie. Dzisiaj pokażemy, że jesteś procedurą wykorzystania szalek Petriego jako mikrośrodowisk do rozkładu tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania mechanizmów rozkładu lignocelulozy grzybów.

Lignoceluloza to tkanka roślinna składająca się z ligniny, celulozy i hemi celulozy. Tkanka, którą badamy najczęściej, to błędy w drewnie z mniej technicznymi aspektami konstrukcji bloku ślimaka, które są najczęstszymi przyczynami awarii i kluczowymi źródłami zmienności wśród badań, co sprawia, że publikacja wideo naszej konfiguracji bloku ślimaka jest przydatna. Z doświadczenia wiemy, że ta procedura daje wyniki o wysokiej jakości i niskiej zmienności.

Więc zacznijmy. Do tych eksperymentów użyj szalek Petriego, które są o jeden centymetr głębsze niż typowe szalki Petriego, aby zwiększyć przestrzeń nad drewnem. W mikrokosmosie.

Rozpocznij przygotowanie mikrokosmosu od przygotowania wystarczającej ilości edii na 20 mililitrów na szalkę Petriego, aby nie zawierały wapnia i żelaza. Wpisz agar z 15 gramami agaru do 500-mililitrowej kolby miarowej zawierającej około 400 mililitrów wody dejonizowanej wzbogaconej suplementami. Użyj wcześniej przygotowanych roztworów podstawowych, aby dodać mikroelementy do mieszanki.

Po dodaniu składników odżywczych napełnij kolbę miarową do linii 500 mililitrów. Następnie przenieś pożywkę do kolby o pojemności 1000 mililitrów. Autoklaw w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 16 PSI przez 20 minut.

Należy uważać, aby nie przekroczyć objętości 500 mililitrów na kolbę, aby uniknąć zestalenia się agro przed podaniem płytek testowych. Po sterylizacji w autoklawie pozwól mediom ostygnąć w dotyku, aby zminimalizować kondensację. Minimalizacja wilgoci ma kluczowe znaczenie w tych eksperymentach, ponieważ zawartość wilgoci lub mc.

Ponad 80% spowoduje niedotlenienie tkanek. Ogranicz rozkład przez grzyby tlenowe i jednorazowo zwiększ zmienność. Chłodny. Użyj przenośnego pipet i 10-mililitrowych sterylnych pipet polistyrenowych do aseptyki.

Przenieś agar na wysoki stos płytek w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie obficie przytnij plastikowe siatki, aby zmieściły się w dnie płyty. Po przecięciu i dokładnym umyciu kratek wodą z mydłem, przygotuj siatki siatkowe do suszenia i autoklawowania do tej demonstracji.

Używana jest południowa sosna żółta lub SYP, ponieważ stanowi ważne źródło drewna. W budownictwie mieszkaniowym w USA należy używać nieobrobionej tarcicy i ciąć bloki bez węzłów o wymiarach 19 na 19 milimetrów z jednego podłużnego cięcia wzdłuż słojów. Pokrój tę długość na 19-milimetrowe bloki sześcienne.

Podziel 19-milimetrowe sześcienne bloki na pół wzdłuż słojów za pomocą dłuta i młotka zamiast piły. To sprawia, że jedna szorstka krawędź bloku jest skierowana w dół na plastikowej siatce w mikrokosmosie agrobloku i gładka górna krawędź do etykietowania. Oznacz gładką krawędź bloków ołówkiem, wytnij wystarczającą ilość bloków, aby spełnić wymagania zabiegów, a także niezaszczepione kontrole, które posłużą zarówno jako monitory zanieczyszczeń, jak i jako próbki danych wyjściowych kondycjonowane równolegle do materiału suszonego w piecu, umieść próbki w aluminiowych miskach serwatkowych i w piecu konwekcyjnym w temperaturze 100 stopni Celsjusza na 48 godzin.

Przenieś próbki z pieca do wysuszacza, aby je raz schłodzić. Chłodny. Wstępnie zważyć próbki, aby określić początkową suchą masę w piecu. Na koniec przygotuj próbki, w tym plastikowe siatki i drewno do autoklawu, szczelnie owijając folią, aby zminimalizować zwilżenie.

Nie wymaga to, aby każda próbka była owijana osobno, ale aby ekspozycja na parę była niska i stała. Autoklawować oznakowane próbki w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 16 PSI przez godzinę. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego zmontuj puste AE, płytkę źródłową dla materiałów egzogenicznych podłoża roślinnego z siatki inokulum, paski paraformowe sharpie, kleszcze i narzędzia do przenoszenia.

Następnym krokiem inokulacji jest dodanie produktów do rolnicy, zawierającej szalki Petriego, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Narzędzia do przenoszenia płomienia i kleszcze z 95% etanolem, tak jak są używane. Najpierw dodaj plastikową siatkę do szalki Petriego.

Następnie dodaj tutaj podłoże drewniane. Wzdłuż siatki dodawane są dwa drewniane bloki, dzięki czemu można sparować dane z wczesnych i późnych zbiorów. Bloki te dodaje się obok ziarna i są skierowane w stronę punktu źródła inokulum grzybów.

Następnie dodaj materiały egzogenne. Tu. Rola gipsu jest testowana na gniciu przez grzyb nitkowaty. Dlatego grzyb powinien napotkać te krążki gipsowe przed dotarciem do drewna.

Jeden krążek gipsowy dodaje się między każdym blokiem a punktem inokulum na wierzchu siatki. Uważaj, aby nie stykać się między krążkami w drewnie, trzymając je blisko siebie. Do inokulum grzybów użyj korka burskiego numer cztery o średnicy siedmiu milimetrów, aby zrobić zatyczki z dwutygodniowych kultur wyhodowanych w 20 mililitrach agaru.

Pomaga to kontrolować objętość inokulum. W przypadku niezaszczepionych grup kontrolnych najlepiej jest dodać zatyczkę ze sterylnej płytki. Nie dopuszczaj do kontaktu inokulum ani z podłożami egzogennymi, ani z drewnem, ale umieść je blisko siebie.

Użyj jednej zatyczki inokulum na blok. Zamknij naczynia za pomocą paramu, który został pocięty brzytwą, przytrzymaj płytki poziomo i zawiń param płynnym, ciągłym ruchem. Na koniec oznacz pokrywki naczyń za pomocą markera odpornego na alkohol, który oznacza numery bloków bezpośrednio nad odpowiednimi podłożami.

Narysuj także kółka nad krążkami gipsowymi. Ostrożnie przenieść płytki do inkubatora biologicznego, aby uniknąć przepychania się zawartości i zminimalizować kondensację spowodowaną wahaniami temperatury. Stosowane tutaj warunki to 20 stopni Celsjusza i w ciemności zbiory szeregów czasowych odbywają się aseptycznie, z wyjątkiem ostatniego zbioru.

W piątym tygodniu punktu zbiorów usuń całą partię zabiegową. Spryskaj każde dno i górę 70% etanolem i użyj flamastrowanych kleszczy, aby usunąć materiał z wnętrza szafy bezpieczeństwa biologicznego. Rób zdjęcia przed zniszczeniem talerzy rolniczych, skupiając się na dowolnym morfie F lub melonie.

Następnie usuń bloki, które mają być leczone. Odroluj nadmiar pha, ale uważaj, aby nie stracić zepsutego materiału z piekarnika. Wysuszyć bloki w aluminiowych szalkach i określić ubytek masy za pomocą świeżej i suchej masy elementów sterujących w celu monitorowania nadmiernego odprowadzania wilgoci.

Dane dotyczące utraty masy pomagają ocenić postęp rozpadu i są ważnymi danymi. Jeżeli stężenia pierwiastków mają być obliczane na podstawie grama wagowego, dane procentowe muszą być znormalizowane. W celach statystycznych oznacz i śledź wszystkie ciemnobrązowe bloki, które są wyraźnie podmokłe.

Na koniec zniszcz kultury w workach nadających się do sterylizacji w autoklawie, oszczędzając plastikową siatkę nośną i wszelkie inne komponenty, które można poddać recyklingowi do wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Korzystając z konfiguracji mikrokosmosu agri block, klocki z drewna sosnowego spoczywają na plastikowej siatce, aby podnieść klocki ponad kontakt z agri. Okrągłe kręgi wrastały w bezpośredni kontakt z powierzchniami gipsu i w drewnianych klockach.

Grzybnia ta stanowi ważne połączenie między drewnem a egzogennymi źródłami składników odżywczych. W kontrolowaniu tych egzogennych źródeł materiału w agarze lub materiałach stałych kluczową zaletą projektu agroblokowego w porównaniu z projektem bloku glebowego jest średni procentowy spadek masy jako miara stopnia rozkładu drewna przez ser crain's po pięciu i 15 tygodniach. Inkubacja z sosną w mikrokosmosach agro bloków jest pokazana tutaj.

Leczenie nie było żadne. Pięć milimolowych chlorków wapnia dodanych do agaru o czystości większej niż 99% czystego gipsu lub 1% gipsu wzbogaconego żelazem dla każdej sztabki zbioru pod tą samą literą nie różnią się znacząco. Przy słupkach błędów reprezentujących odchylenie standardowe, zaobserwowano ponad 60% utratę masy w kontrolnych brązowych zgniłych blokach sosnowych, co spełnia standardowy cel American Society for Testing and Materials wynoszący więcej niż 50% rozpad

Średni współczynnik zmienności rozpadu wynosił 0,055 w 16. tygodniu. Oprócz małej zmienności zaobserwowano efekt leczenia. Rozkład grzybów został zahamowany przez dodatki wapnia, czy to do agaru w postaci chlorku wapnia, czy czystego gipsu.

Co ciekawe, tempo rozpadu odbija się wraz z dodaniem żelaza do gipsu. Sugerowanie, że to żelazo, a nie wapń, ma kluczowe znaczenie w obserwacji pięciu powtórzeń w 15. tygodniu rozpadu. Przez tę samą brązową zgniliznę, grzyba testowego, okrągłe blaszki, kolor grzybni ujawnia mein.

Różnice w strzępkach zewnętrznych między zabiegami, blokady zostały usunięte i wysuszone. Ujawniając brak meiny w kuracji bezwapniowej. Żółknięcie w zabiegach z czystym wapniem i pojawienie się rdzy w leczeniu wzbogaconym żelazem.

Dla porównania grupa kontrolna reprezentuje bloki niezaszczepione. Co ciekawe, efekty mein są tracone przy użyciu podłoża o wysokiej zawartości żelaza. Podsumowując, sugeruje się, że grzyb ten wykorzystuje żelazo, a nie wapń.

W tych materiałach właśnie pokazaliśmy, jak używać konfiguracji bloku ślimaka, aby skutecznie przetestować biodegradację tkanek roślinnych przez tlenowe grzyby strzępkowe. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do kontaktu substratów ze sobą, zwłaszcza tkanki roślinnej i ślimaka, zminimalizować zawartość wilgoci ze ślimaka i płytek krwi oraz dokładnie sprawdzić, czy zawartość każdej płytki nie przesunęła się przed inkubacją. Mając na uwadze te zmienne, możesz kontrolować środowisko rozkładu znacznie lepiej niż w przypadku korzystania z konfiguracji bloków glebowych.

Możesz generować dane o mocy statystycznej potrzebnej do udzielenia odpowiedzi na Twoje pytania badawcze. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.