Zoptymalizowana strategia transfekcji do ekspresji i elektrofizjologicznego zapisu rekombinowanych kanałów jonowych bramkowanych napięciem w komórkach HEK-293T

Elektrofizjologia jest powszechnie stosowana do badania aktywności rekombinowanych kanałów jonowych bramkowanych napięciem w hodowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych. Pomyślne zarejestrowanie wymaga, aby komórki wyrażały kanały na wystarczających poziomach w błonie komórkowej do wykrycia i aby komórki były posiane w wystarczająco niskiej gęstości komórek, aby można było wyizolować poszczególne komórki. Wykonywanie zapisów komórek jest często utrudnione przez długie okresy inkubacji w temperaturze 28 stopni Celsjusza potrzebne do takiej ekspresji, gdzie zwykle dochodzi do utraty adhezji komórek i stabilności błony.

W tym miejscu zademonstrowano zoptymalizowaną metodę hodowli komórkowej i transfekcji, która pozwala obejść te problemy. Komórki są transfekowane z umiarkowaną płynnością ko, a następnie inkubowane w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia odpowiedniej ekspresji kanału jonowego. Transfekowane komórki są następnie powlekane na szklanych szkiełkach nakrywkowych o niskiej gęstości i inkubowane w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kilka godzin, aby umożliwić przyłączenie komórek i stabilizację błony.

Po odpowiednim posianiu komórki są następnie identyfikowane za pomocą koeksprymowanego EGFP i klamry krosowej całych komórek. Można przeprowadzić rejestrację lub ponownie inkubować komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Aby jeszcze bardziej zwiększyć ekspresję powierzchni kanału, wyniki zapisów eksperymentów na komórkach transfekowanych kanałami wapniowymi bramkowanymi napięciem, takimi jak L CAV jeden, L CAV dwa lub L cav trzy wskazują, że kanały zostały pomyślnie transfekowane i wyrażone przez komórki.

Chociaż pokazano tylko reprezentatywne wyniki dla L CAV three W naszym laboratorium opracowaliśmy metodę zwiększania ekspresji genów o słabej ekspresji kanałów jonowych do zapisu patch clamp w ludzkich liniach komórkowych. Obecnie konwencjonalne podejście polega na tym, aby najpierw podzielić komórki na szkiełkach nakrywkowych i transfekować CDNA osocza zawierającymi geny kanałów jonowych, a następnie inkubować przez wiele dni w temperaturze 28 stopni Celsjusza w celu osiągnięcia wysokiej wydajności ekspresji kanału jonowego przed zapisem elektrofizjologicznym. Nasze nowe podejście znacznie skraca wymagany czas inkubacji w temperaturze 28 stopni Celsjusza przed nagraniem.

Teraz, skracając czas inkubacji o 28 stopni, stwierdzamy, że błony komórkowe są znacznie bardziej stabilne, a transfekowane komórki znacznie bardziej przylegają do szkiełek nakrywkowych. Zwiększa to liczbę rejestrowalnych komórek i znacznie usprawnia eksperymentowanie. Przed transfekcją podziel w pełni zlewającą się kolbę komórek T HEK 2 9 3, od jednego do czterech, do nowej kolby o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych i umieść komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pozwól komórkom przyczepić się przez trzy do czterech godzin po czterech godzinach, zbadaj komórki za pomocą różnicowego kontrastu interferencyjnego, aby zweryfikować przyczepienie. Zauważ, że komórki nie wyglądają już okrągle i są spłaszczane. Widoczne są przedłużenia lub pseudopodia.

Mniej komórek konfluencji wyglądałoby tak samo, ale byłoby bardziej oddalone od siebie. Po przyłączeniu się komórek połącz niezbędne odczynniki, aby przeprowadzić standardową transfekcję fosforanu wapnia. Przygotować łącznie 12 mikrogramów DNA w 600 mikrolitrach roztworu do transfekcji na kolbę.

Tutaj CDNA z różnych kanałów jonowych są klonowane do P-I-R-E-S dwóch transfekcji plazmidu EGFP tego wektora ekspresji do linii komórkowej ssaków. Prowadzi to do produkcji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji z tego samego mRNA, co sklonowana wstawka, poprzez translację zainicjowaną w wewnętrznym miejscu wejścia rybosomu tuż za sekwencją powlekania kanału jonowego i przed sekwencją powlekania EGFP. Pozwala to na identyfikację dodatnio transfekowanych komórek bez możliwej ingerencji w funkcję białka, która może być spowodowana fuzją białka EGFP bezpośrednio z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

Odpipetować roztwór do transfekcji na komórki kroplami, a następnie delikatnie zamieszać kolbę i umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc następnego dnia. Sprawdź wydajność transfekcji, oglądając komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Dodatnio transfekowane komórki powinny być zielone w całej komórce.

Po sprawdzeniu transfekcji ostrożnie odpipetować od czterech do pięciu mililitrów ciepłego podłoża do odwróconej kolby. Przemyć komórki, powoli obracając kolbę tak, aby powierzchnia kominka była skierowana w dół i kołysząc kolbą tak, aby roztwór do płukania delikatnie przesuwał się po nich. Usuń podłoże i powtórz to pranie.

Krok jeszcze dwa razy. Następnie dodaj sześć mililitrów pożywki do kolby i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Ekspresja kanałów jonowych bezkręgowców wiąże się z pewnymi wyzwaniami.

Po pierwsze, często mają duże rozmiary i dlatego może zająć dużo czasu, aby przemieścić się do retikulum endoplazmatycznego. Ponadto mogą nie być skutecznie ukierunkowane na błonę komórkową w linii komórkowej ssaków. Wreszcie, ponieważ różne gatunki wykazują różne częstotliwości użycia kodonów, heterologiczne CDNA mogą zawierać wysokie częstotliwości kodonów, które są rzadkie w komórkach ssaków, takich jak HEK 2 9 3 T, aby przezwyciężyć niektóre z tych trudności.

Po dwugodzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza po przemyciu transfektu, należy przenieść kolby do inkubatora o temperaturze 28 stopni Celsjusza na dwa do sześciu dni w celu przedłużenia okresu odciągania. Czas inkubacji musi być określony empirycznie dla każdego rodzaju kanału jonowego, który ulega ekspresji. Ponieważ inkubacja w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dłuższy czas prowadzi do oderwania komórek i słabej stabilności błony.

Przed wykonaniem badań elektrofizjologicznych konieczne jest dalsze przygotowanie komórek. Najpierw usuń pożywkę z transfekowanych komórek za pomocą pipety aspiracyjnej jeden mililitr roztworu trypsyny o temperaturze 37 stopni Celsjusza do odwróconej kolby. Następnie delikatnie przywróć kolbę do pozycji dolnej powierzchni komórki, aby trypsyna mogła delikatnie przepłynąć po komórkach.

Odwrócić kolbę z powrotem i usunąć trypsynę. Następnie dodaj 250 mikrolitrów ciepłej trypsyny bezpośrednio na komórki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut, aż komórki się oderwą. W międzyczasie umieść od trzech do ośmiu pokrywek pokrytych poli L lizyną w 60-milimetrowym naczyniu hodowlanym i dodaj pięć mililitrów ciepłej pożywki hodowlanej.

Gdy komórki oderwą się od resus, zawieś je w czterech mililitrach ciepłego podłoża, pipetując w górę iw dół około sześć razy, a następnie za pomocą końcówki mikropipety dociśnij szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że znajdują się na dnie naczynia. Następnie dodaj od 250 do 500 mikrolitrów zawieszonych komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby mogły przylgnąć do szkiełek nakrywkowych.

Pozostawienie komórek na zbyt długo w temperaturze 37 stopni spowoduje podział komórek i rozcieńczenie transfekowanych plazmidów. Transfekowane komórki powinny być posiane z wystarczająco małą gęstością, aby były odizolowane od siebie, jak pokazano tutaj. Ułatwi to zapis elektrofizjologiczny.

W przypadku komórek, które wymagają dodatkowych podjednostek, często konieczne jest przeniesienie komórek do 28 stopni Celsjusza i inkubacja ich przez dodatkowe trzy do czterech dni przed elektrofizjologicznością. Rejestracja jest przeprowadzana dla komórek, które nie wymagają dodatkowych podjednostek. Zapis można przeprowadzić bezpośrednio po tej inkubacji.

Zastosowane tutaj stanowisko do elektrofizjologii obejmuje wzmacniacz, zmotoryzowane, podwójne manipulatory pipet oraz mikroskop epifluorescencyjny i systemy perfuzyjne. Urządzenie zostało zamontowane na stole wibroizolacyjnym i zabłąkane. Szum elektryczny jest ograniczony przez 40-calowe elektroniczne systemy sterowania z dwiema klatkami Ferretta, w tym komputer wyposażony w dane cyfrowe 1440, interfejs przetwornika analogowo-cyfrowego w połączeniu z oprogramowaniem P clamp 10.1.

Wzmacniacz monitora komputerowego, zmotoryzowany manipulator i system kontroli rozpylenia łącznika zaworu są zamontowane na zewnątrz klatki Faradaya. Na wolnostojącej 19-calowej metalowej szafie elektrycznej wszystkie urządzenia elektryczne są uziemione do miedzianego dystrybutora i podłączone do transformatora izolacyjnego klasy medycznej, który zapewnia izolację linii, spójne uziemienie i tłumienie przepięć. Przygotuj się do eksperymentów, montując polerowane ogniowo mikropipety o rezystancji od dwóch do pięciu megaomów na uchwycie mikropipet na stoliku głowicy.

Pipety z plastrami są napełniane roztworem wewnętrznym w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a na koniec montowane na stopniu głowicy. Następnie, za pomocą kleszczy, przenieś jedno szkiełko nakrywkowe z platerowanymi komórkami na 35-milimetrową plastikową szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry zewnętrznego roztworu rejestrującego w temperaturze pokojowej. Objętość roztworu rejestrującego musi być dokładnie zmierzona podczas wykonywania eksperymentów z narkotykami, podczas których znane ilości leku dodaje się do naczynia za pomocą mikropipety, umieszcza się naczynie na stoliku mikroskopowym.

Następnie napełnij półogniwo uchwytu mikroelektrody trzema molowymi chlorkami cezu. Następnie włóż elektrodę referencyjną do półogniwa i umieść elektrodę masową w kąpieli za pomocą manipulatora mikrom, opuść pipetę z plastrem do roztworu kąpieli. Wizualizuj komórki w trybie fluorescencji i wyśrodkuj izolowaną dodatnio transfekowaną przylegającą zieloną komórkę w środku pola widzenia.

W trybie kąpieli należy umieścić pipetę plastrową w bliskiej odległości od kuwe. Wyzeruj ślad fali prostokątnej obserwowany na ekranie komputera. Dostosuj położenie pipety z plastrem tak, aby dotykała tylko komórki, a kwadratowy ślad prądu na ekranie zaczął się zmieniać.

Zastosuj delikatne ssanie za pomocą dołączonej strzykawki, aż utworzy się uszczelka giga omów. Po osiągnięciu uszczelnienia giga omów przełącz program w tryb łatania. Zastosuj szybki impuls ssania za pomocą strzykawki, aby przebić się przez błonę komórkową.

Następnie przełącz się w tryb ogniwa i użyj parametrów całego ogniwa na wzmacniaczu. Aby skompensować pojemnościowy stan przejściowy, konieczne jest zrównoważenie łatki tak, aby wewnątrzkomórkowy roztwór rejestrujący dializuje się z łataną komórką. Wprowadź tutaj protokoły cęgów napięcia napisane dla tego eksperymentu.

Eksperymentator zaprojektował protokół pomiaru prądów jonowych przez kanały jonowe bramkowane napięciem, które powstają, gdy napięcie na błonie komórkowej jest modulowane. W tym przypadku mamy do czynienia z protokołem IV, który określa, że oprogramowanie utrzymuje ogniwo na poziomie minus 110 miliwoltów, a następnie SEP do minus 70 miliwoltów przez 250 milisekund. Następnie z powrotem do minus 110 miliwoltów utrzymując potencjał za każdym razem, gdy krok wzrasta o 10 miliwoltów, tak aby kroki wynosiły minus 70 miliwoltów, minus 60 miliwoltów i tak dalej, aż ostatni krok wynosi plus 20 miliwoltów.

Przefiltruj zarejestrowane prądy o częstotliwości 10 kiloherców za pomocą dolnoprzepustowego filtra Bessela na wzmacniaczu i zdigitalizuj z częstotliwością próbkowania dwóch kiloherców za pomocą oprogramowania cęgowego X 10.1 używaj tylko nagrań z minimalnym wyciekiem mniejszym niż 10%Do analizy komórki T HEK 2 93 hodowano i transfekowano L Cav. Trzy kanały wapniowe, jak pokazano tutaj. Na udaną transfekcję heterologicznych kanałów jonowych CDNA wskazywała fluorescencja generowana z wektora P-I-R-E-S two eeg FP.

Tutaj pokazujemy udaną ekspresję bezkręgowca w trzynapięciowym kanale wapniowym. Gdy komórki nie są transfekowane, nie można wywołać prądów wapnia. Podczas gdy transfekowane ogniwa generują duże prądy, gdy do ogniw stosuje się protokoły cęgów napięcia całego ogniwa.

Eksperymentatorzy mogą korzystać z różnych warunków elektrofizjologicznych i schematów analizy danych w zależności od swoich wymagań. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby kierować się własnym osądem dotyczącym czasu eksperymentów. Ponieważ różne kanały wyrażają się z różną wydajnością na błonie komórkowej, to od Ciebie zależy, czy określisz optymalną strategię, którą zastosujesz w celu zwiększenia żywotności komórek, a także maksymalizacji ekspresji powierzchniowej kanałów, które Cię interesują.

Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze zrozumiesz, jak hodować i utrzymywać ludzką linię komórkową, a także jak transfekować heterologiczne kanały jonowe CDNA i podjednostki CDNA do tych komórek. Do zapisu elektrofizjologicznego.