Name: Zoptymalizowana strategia transfekcji do ekspresji i elektrofizjologicznego zapisu rekombinowanych kanałów jonowych bramkowanych napięciem w komórkach HEK-293T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę transfekcji komórek HEK-293T do ekspresji kanałów jonowych bramkowanych napięciem. Technika poprawia przyczepność komórek i stabilność błony podczas inkubacji, umożliwiając niezawodne pomiary elektrofizjologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca była wspierana przez grant Discovery Operating Grant przyznany JDS przez Natural Science and Engineering Research Council (NSERC) w Kanadzie, stypendium doktoranckie NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarships (przyznane A. Senatore) oraz grant Heart and Stroke Foundation, Grant-In-Aid NA#6284.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Możliwość rejestracji prądów z całej komórki (whole-cell) przy użyciu opisanych protokołów i roztworów wskazuje na pomyślną transfekcję oraz obecność znaczących ilości pożądanych napięciowo zależnych kanałów jonowych lub kompleksów kanałów jonowych w błonie komórkowej. W przypadku, gdy komórki są pozytywnie przetransfekowane (tj. wykazują zieloną fluorescencję), ale nie rejestruje się w nich prądów, może być wymagany dodatkowy czas inkubacji w 28°C, aby białko kanału zostało prawidłowo zapakowane i wbudowane w błonę komó...

<table><tbody><tr><td>plazmid pIRES2-EGFP</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6029-1</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>Kółka nr 1 – grubość 0,13 do 0,17 mm, rozmiar: 12 mm</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Axon Instruments</td><td>Axopatch 200B lub Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do elektrofizjologii</td><td>Axon Instruments</td><td>pClamp10.1</td><td></td></tr><tr><td>Manipulatory pipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MPC-385-2</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Przedwzmacniacz (Headstage)</td><td>Axon Instruments</td><td>CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody przedwzmacniacza</td><td>Axon Instruments</td><td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt mikro&amp;#8211;elektrody dla elektrody uziemiającej</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MEH3RF 15</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary do elektrofizjologii</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF-150-86-15</td><td>Szkło borokrzemianowe z włóknem, średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica zewnętrzna 0,86 mm, długość 15 cm</td></tr><tr><td>Wytciągacz mikropipet Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Wypalacz końcówek mikropipet</td><td>Narishige International</td><td>Micro Forge MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosystem perfuzji leków</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>SmartSquirt8 Valvelink8.2</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzji leków</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>Valvelink8.2 z zaworami teflonowymi</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach hek-293t

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Ekspresja in vitro oraz rejestracja elektrofizjologiczna rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowanych ludzkich komórkach embrionalnej nerki (HEK-293T) jest powszechną strategią badawczą. Komórki HEK-293T muszą być wysiewane na szklane okładki przy wystarczająco niskiej gęstości, aby nie stykały się ze sobą, co umożliwia rejestrację elektrofizjologiczną bez zakłócających efektów wynikających z kontaktu z sąsiednimi komórkami. Przetransfekowane kanały muszą również wykazywać wysoką wydajność ekspresji w błonie plazmatycznej, aby podczas rejestracji metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell można było wykryć prądy powyżej poziomu szumów. Heterologiczne kanały jonowe często wymagają długich okresów inkubacji w 28°C po transfekcji w celu uzyskania odpowiedniej ekspresji błonowej, jednak w tej temperaturze wzrasta utrata adhezji komórek do okładki oraz stabilności błony. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy zoptymalizowaną strategię transfekcji i wysiewania komórek HEK-293T. Metoda ta wymaga przeprowadzenia transfekcji przy stosunkowo wysokiej konfluencji, a następnie inkubacji w 28°C przez różne okresy po transfekcji, aby umożliwić odpowiednią ekspresję białka kanału jonowego. Przetransfekowane komórki są następnie wysiewane na szklane okładki i inkubowane w 37°C przez kilka godzin, co pozwala na trwałe przytwierdzenie komórek do okładek i restabilizację błony. Rejestracja z komórek może odbywać się krótko po wysiewaniu lub mogą one zostać przeniesione do 28°C do dalszej inkubacji. Stwierdziliśmy, że wstępna inkubacja w 28°C, po transfekcji, ale przed wysiewaniem, jest kluczowa dla wydajnej ekspresji heterologicznych kanałów jonowych, które zazwyczaj nie wykazują dobrej ekspresji w błonie plazmatycznej. Pomyślnie przetransfekowane komórki hodowlane identyfikuje się za pomocą koekspresji eGFP lub eGFP wyrażanego z wektora bicistronowego (np. pIRES2-EGFP) zawierającego cDNA rekombinowanego kanału jonowego bezpośrednio powyżej wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu (IRES) i sekwencji kodującej eGFP. Rejestracja metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell wymaga specjalistycznego sprzętu oraz wykonania polerowanych elektrod rejestrujących i L-kształtnych elektrod uziemiających ze szkła borokrzemianowego. Podawanie leków w celu badania farmakologii kanałów jonowych można realizować poprzez bezpośrednie pipetowanie leków do naczynia rejestracyjnego lub przy użyciu systemów mikroperfuzji bądź systemów przepływu grawitacyjnego, które wytwarzają nieprzerwane strumienie roztworu leku nad rejestrowanymi komórkami.

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Ekspresja in vitro i rejestracja elektrofizjologiczna rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlanych ludzkich komórkach embrionalnej nerki (HEK-293T) ...

Elektrofizjologia jest powszechnie stosowana do badania aktywności rekombinowanych napięciowo bramkowanych kanałów jonowych w hodowlach komórek embrionalnej nerki człowieka. Pomyślny pomiar wymaga, aby komórki wykazywały ekspresję kanałów na błonie komórkowej na poziomie wystarczającym do detekcji oraz aby zostały wysiane z odpowiednio niską gęstością, umożliwiającą izolację pojedynczych komórek. Przeprowadzanie pomiarów komórkowych jest często utrudnione przez długie okresy inkubacji w temperaturze 28 °C niezbędne do takiej ekspresji, co zazwyczaj prowadzi do utraty adhezji komórek i stabilności błony.W niniejszym materiale zaprezentowano zoptymalizowaną metodę hodowli i transfekcji komórek, która pozwala uniknąć tych problemów. Komórki są transfekowane przy umiarkowanej wydajności, a następnie inkubowane w temperaturze 28 °C do momentu uzyskania odpowiedniej ekspresji kanałów jonowych. Następnie transfektowane komórki wysiewa się na szklane lamelle z niską gęstością i inkubuje w temperaturze 37 °C przez kilka godzin, aby umożliwić adhezję komórek i stabilizację błony.Po odpowiednim wysiewaniu komórki są identyfikowane na podstawie koekspresji EGFP oraz za pomocą techniki patch cl

optimized-transfection-strategy-for-expression-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Optymalizacja Strategii Transfekcji dla Ekspresji i Rejestracji Elektrofizjologicznej Rekombinowanych Napięciozależnych Kanałów Jonowych w Komórkach HEK-293T

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Opisano metodę obrazowania zmian potencjału błonowego za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników napięcia.

Obrazowanie potencjału błony za pomocą dwóch typów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych czujników napięcia

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Nowatorskie strategie terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej serca wymagają obszernych i szczegółowych badań na dużych przedklinicznych modelach zwierzęcych, zanim będą mogły być rozważane do zastosowania u ludzi. W tym miejscu demonstrujemy technikę przezskórnego wstrzykiwania domięśniowego do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii kontrastowej u królików, która jest cenna dla hipotezy testującej skuteczność takich nowatorskich terapii.

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Do badania reakcji komórek pobudliwych in vitro, protokół opisuje optyczne monitorowanie zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przez elektroporację na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie modyfikowanych komórek HEK z tet-on, jak również zmian napięcia transbłonowego z automatyczną ekstrakcją odpowiednich parametrów.

Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Poznaj zoptymalizowaną metodę transfekcji komórek HEK-293T do ekspresji kanałów jonowych bramkowanych napięciem. Technika poprawia przyczepność komórek i stabilność błony podczas inkubacji, umożliwiając niezawodne pomiary elektrofizjologiczne.

Zoptymalizowana strategia transfekcji do ekspresji i elektrofizjologicznego zapisu rekombinowanych kanałów jonowych bramkowanych napięciem w komórkach HEK-293T (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Przeglądaj więcej filmów