Name: Obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek za pośrednictwem leukotrienu B4 i interakcji BLT1 z β-aresztiną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Poznaj techniki obrazowania żywych komórek do badania migracji leukocytów w odpowiedzi na leukotrien B4 i interakcji receptora BLT1 z β-aresztyną. Metoda ta pozwala na obserwację sygnalizacji GPCR w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania są finansowane z grantów National Institutes of Health nr AI-52381, CA138623 oraz Kentucky Lung Cancer Research Board, a także dzięki wsparciu instytucjonalnemu James Graham Brown Cancer Center.

Metodyka
Opis mikroskopu
Eksperymenty z obrazowaniem żywych komórek przeprowadzono przy użyciu systemu epi-fluorescencyjnego TE-FM przymocowanego do odwróconego mikroskopu Nikon Eclipse TE30. Mikroskop jest wyposażony w podgrzewany stolik. Do mikroskopu dołączono czarno-białą cyfrową kamerę CCD CoolSnap HQ (Roper Scientific) oraz optyczny zmieniacz filtrów LAMDA 10-2 (Sutter Instrument Company). Długości fal wzbudzenia i emisji są regulowane za pomocą kół filtracyjnych i sterowane kontrolerem kół filtracyjnych Lamba 10-2 (Sutter Instruments Co). Czas ekspozycji 50 ms powinien być wystarczający do obserwacji RFP lub GFP w żywych komórkach. Sterowanie sprzętem i akwizycja obrazów odbywają się za pomocą oprogramowania Metamorph. W niniejszym badaniu wybrano następujące zestawy filtrów: S480/20x, S525/40m oraz S565/25x, S620/60m odpowiednio dla GFP i RFP; podwójny dichroik EGFP/DsRed, Chroma Technology. To koło filtracyjne może pomieścić do sześciu zestawów filtrów. Mikroskop jest wyposażony w kontroler stolika Prior Proscan z joystickiem. Wszystkie te akcesoria sprzętowe mogą być sterowane za pomocą oprogramowania Metamorph. Mikroskop jest również wyposażony w mikromanipulatory do utrzymywania mikropipet.
A. Pomiar migracji komórek dendrytycznych indukowanej leukotrienem B4
Wykorzystując opisane powyżej ustawienia mikroskopu, opracowaliśmy metody śledzenia migracji komórek dendrytycznych kierowanej ligandem w czasie rzeczywistym. Do mikroskopu przymocowano dwa mikromanipulatory (Narishige). Zarejestrowano chemotaksję komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy (BMDCs) w kierunku gradientu LTB4. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przygotowania mikropipet przy użyciu wyciągacza mikropipet, napełniania mikropipety ligandem oraz konfiguracji eksperymentu chemotaksji na podgrzewanym stoliku mikroskopu w celu monitorowania kierunkowej migracji komórek. Metoda ta może być zastosowana do testowania skuteczności różnych chemoatraktantów w indukowaniu migracji, a także wpływu inhibitorów chemotaksji w żywych komórkach. Izolacja BMDCs21 z myszy została opisana w kilku publikacjach, w tym w JoVE2.
1. Przygotowanie BMDC
<ol>
	<li>Wysiać BMDC (po 10 dniach hodowli) na szalki Fluoro z dnem z dekilka i pozostawić do wzrostu na 16 h przed eksperymentem.</li>
	<li>Przemyć komórki 3 mL 1X PBS co najmniej 2 razy (poprzez dodanie 3 mL 1X PBS do szalki i odessanie buforu).</li>
	<li>Dodać 2 mL 1X PBS do szalki. Komórki są teraz gotowe do eksperymentu. Przed rozpoczęciem badania przechowywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
Przygotowanie mikropipety załadowanej ligandem:
<ol start="4">
	<li>Zamocuj szklane rurki kapilarne (Glass standard, 0.75 mm x 0.4 mm; 6", Cat# 62550, A.M. Systems, INC) w pionowym wyciągaczu do mikropipet (Narishige International USA, Inc).</li>
	<li>Utrzymaj temperaturę na poziomie 52 °C, aby szkło stopiło się i rozciągnęło, tworząc ostre końcówki.</li>
	<li>Zamocuj pipetę w uchwycie do mikro-pipet.</li>
	<li>Wygładź chropowate krawędzie mikro-pipety za pomocą Micro forge M-90 (Narishige International USA, Inc), obserwując proces pod mikroskopem.</li>
	<li>Przygotuj co najmniej 10-20 pipet dla każdego eksperymentu. 
Uwaga: Mikro-pipety można również zakupić w firmie World Precision Instruments (μ TIP, T1801TW1F).</li>
	<li>Przenieś pożądane stężenie ligandu (w obecnym eksperymencie 50 μL 10 nM LTB4) do probówki eppendorfowskiej o pojemności 1 mL, zanurz końcówkę mikro-pipety w roztworze i pozwól roztworowi wniknąć do mikro-pipety (napełnianie wsteczne).</li>
	<li>Pobierz 1 mL ligandu do strzykawki (strzykawka tuberkulinowa 1 cc) i powoli wprowadź ligand do mikro-pipety od góry, używając igły Micro-Fill (MF 28G-5, World Precision Instruments).</li>
	<li>Podłącz przewód, który ściśle przylega do pipety, łącząc go z pipetą oraz z igłą (21 G 1/2) przymocowaną do strzykawki 1 mL wypełnionej ligandem.</li>
	<li>Następnie ostrożnie przenieś wypełnioną ligandem mikro-pipetę na stolik mikroskopu i zamocuj ją w mikromanipulatorach.</li>
	<li>Wywrzyj lekki nacisk strzykawką, aby upewnić się, że ligand powoli uwalnia się z końcówki.</li>
	<li>Umieść płytkę z niedojrzałymi BMDCs pod mikroskopem, ustawiając je na podgrzewanym stoliku (37 °C).</li>
	<li>Zdejmij pokrywkę z naczynia fluorowego.</li>
	<li>Ustaw ostrość na komórkach, używając obiektywu immersyjnego 60X.</li>
	<li>Ostrożnie zbliż naładowaną ligandem pipetę do komórek, korzystając z manualnego manipulatora grubościanowego 'Coarse Manual Manipulator MN-18NE'.</li>
	<li>Ustaw precyzyjne położenie pipety za pomocą hydraulicznego mikromanipulatora precyzyjnego 'Hydraulic Fine Micromanipulator MN-18 NE'.</li>
	<li>Wywrzyj lekki nacisk strzykawką, aby upewnić się, że ligand uwalnia się do naczynia.</li>
	<li>Ustaw parametry akwizycji obrazu, aby rejestrować zdjęcia w jasnym polu (ekspozycja 10 ms) co 15 s przez 2 h, korzystając z oprogramowania Metamorph.</li>
	<li>Monitoruj postęp migracji w kierunku ligandu co 30 min.</li>
	<li>Jeśli komórki zgromadzą się zbyt gęsto przy końcówce pipety, zmień położenie końcówki na płytce, aby kontynuować eksperyment migracyjny.</li>
</ol>
B. Pomiar interakcji GPCR (BLT1) i białek cytozolowych (β-arrestyny) oraz ich translokacji w żywych komórkach
1. Przygotowanie konstruktów plazmidowego DNA
Szczegóły konstrukcji plazmidów DNA zostały opisane w pracy Jala et al. (205)18.
2. Transfekcja ludzkiego BLT1-RFP i β-Arrestyny-GFP do komórek RBL-2H3
<ol>
<li>Hodować komórki linii Rat Basophilic Leukemia (RBL-2H3) (konfluencja 60-70%) w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze składającej się z 95% powietrza i 5% CO2 jako kultury monowarstwy w pożywce wzrostowej (DMEM uzupełniony o 15% FBS, 2 mM L-glutaminy, 10 U/mL penicyliny i 10 μg/mL streptomycyny) w kolbach T75.</li>
<li>Odczepić komórki z naczyń/kolb, używając 6 mL trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny, 0,53 mM EDTA) i inkubując przez 5 min w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 95% powietrza i 5% CO2. Delikatnie potrząsać kolbami, aby monitorować stopień odczepienia komórek.</li>
<li>Dodać 6 mL pożywki wzrostowej do kolby zawierającej 6 mL trypsyny-EDTA i zebrać komórki, mieszając je poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół. Przenieść komórki do probówek Falcon 15 mL.</li>
<li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru, odmierzyć 4 x 106 komórek do probótek wirówkowych 15 mL, odwirować przy 480g przez 3 min i resuspendować w 20 μL pożywki do transfekcji (DMEM, 20% FBS, 50 mM HEPES). W przypadku planowania 3 transfekcji, odpowiednio przygotować komórki i pożywkę do transfekcji, zwiększając liczbę komórek oraz objętość pożywki.</li>
<li>Przygotować plazmidy do transfekcji w stężeniu co najmniej 1,5 μg/μL. Plazmid DNA przygotowujemy przy użyciu zestawu QIAGEN Maxi DNA plasmid kit. Dodać pojedyncze lub oba plazmidy DNA kodujące ludzkie BLT1-RFP (25 μg) i β-arrestin1-GFP (15 μg) do sterylnych kuwet do elektroforezy (Bio-Rad # 165208) z przerwhetherą między elektrodami wynoszącą 0,4 cm.</li>
<li>Odmierzyć 20 μL wyżej resuspendowanych komórek i umieścić je w kuwetach zawierających hBLT1-RFP, β-arrestin1-GFP lub oba plazmidy jednocześnie, a następnie delikatnie wymieszać sterylną pipetą 1 mL.</li>
<li>Pozostawić powyższe kuwety w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
<li>Przeprowadzić elektroporację komórek w urządzeniu Gene Pulser II przy napięciu 250 v i pojemności 50 μF.</li>
<li>Po elektroporacji pozostawić komórki w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
<li>Odmierzyć 1 mL zwykłej pożywki wzrostowej i wymieszać ją z elektroporowanymi komórkami w kuwetach.</li>
<li>Rozdzielić 30 μL tej mieszaniny do 35 mm szklanych naczyń hodowlanych z dnem (Fluoro dish, World Precision Instruments) zawierających 2 mL zwykłej pożywki wzrostowej i inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 95% powietrza i 5% CO2. Pozwolić komórkom przywrzeć do dna naczynia.</li>
<li>Po 1 h inkubacji wymienić pożywkę na zwykłą pożywkę wzrostową i pozwolić komórkom rosnąć w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżoną atmosferą 95% powietrza i 5% CO2 przez 18-24 h.</li>
</ol>
3. Obrazowanie żywych komórek
Pozyskiwanie obrazów
<ol>
<li>Po 18-24 godzinach przemyć komórki 2 lub 3 razy za pomocą 2 mL ciepłego medium RPMI bez czerwieni fenolowej zawierającego 10 mM HEPES, pH 7,5 (dodać 2 mL ciepłego medium bezpośrednio na płytkę, a następnie odessać medium; powtórzyć 2 lub 3 razy). Dodać 1,8 mL ciepłego medium RPMI bez czerwieni fenolowej zawierającego 10 mM HEPES.</li>
<li>Umieścić 30 mm naczynia hodowlane z przeszklonym dnem zawierające komórki RBL-2H3, przetransfekowane hBLT1-RFP i β-arrestin1-GFP, na podgrzewanym stoliku mikroskopu (37 °C).</li>
<li>Przechwycić obrazy komórek przy powiększeniu 60x, używając obiektywu 60X Nikon Plan Apo 60X/1.4 z aperturą numeryczną do imersji olejowej (dostępnego w naszym systemie mikroskopowym).</li>
<li>Nanieść jedną kroplę oleju na soczewkę obiektywu 60x i ustawić ostrość na komórkach w zwykłym jasnym polu prześwietlenia, dotykając dna płytki.</li>
<li>Aby monitorować fluorescencję przetransfekowanych białek, przełączyć z jasnego pola (światło przechodzące) na filtr fluorescencyjny (filtr RFP, aby zobaczyć receptor, lub GFP, aby zobaczyć β-arrestin1).</li>
<li>Wybrać jasną i zdrową komórkę wykazującą ekspresję hBLT1-RFP na powierzchni komórki przy użyciu filtra RFP i wykonać zdjęcie.</li>
<li>Następnie przełączyć na filtr GFP i upewnić się, że β-arrestin-GFP jest wykazany w cytoplazmie, a następnie wykonać zdjęcie. Następnie nadać pseudokolory obu obrazom przed wykonaniem obrazowania time-lapse żywych komórek, aby upewnić się, że między RFP a GFP nie występuje przenikanie fluorescencji.</li>
<li>Po wyborze komórki ustawić parametry zgodnie z celem badania za pomocą oprogramowania (w tym przypadku oprogramowania Metamorph).</li>
<li>W niniejszej demonstracji obrazy 16-bitowe są pozyskiwane przy binningu kamery ustawionym na 1 X 1 w połączeniu z obiektywem 60X Nikon Plan Apo 60X/1.4 z aperturą numeryczną do imersji olejowej.</li>
<li>Zbierać obrazy fluorescencyjne dla fluorochromów RFP i GFP jednocześnie w odstępach czasowych 30 s (jeśli translokacja/interakcje zachodzą zbyt szybko, można zmniejszyć odstępy czasowe), korzystając z kół filtrowych sterowanych przez oprogramowanie Metamorph.</li>
<li>Czas ekspozycji kamery ustawiono na 10 msec dla RFP i GFP (ustawić konkretne czasy ekspozycji zgodnie z intensywnością fluorescencji RFP i GFP).</li>
<li>Najpierw zebrać obrazy przez 1 min bez dodawania ligandu, co służy jako punkt czasowy 0.</li>
<li>Po 1 min dodać 20 μL ligandu (z roztworu stokowego 10 μM do stężenia końcowego 1 μM), nie naruszając płytki ani pozycji komórki.</li>
<li>Obrazy fluorescencyjne są zbierane przez 60 min po dodaniu ligandu i zapisywane jako obrazy TIFF z rosnącą kolejnością nazw plików.</li>
<li>Wszystkie te pliki mogą zostać przekształcone w pliki typu stack (stosy) z poszczególnymi lub połączonymi obrazami fluorescencyjnymi ze znacznikami czasu za pomocą oprogramowania.</li>
</ol>
Przetwarzanie obrazów oraz ilościowe określanie fluorescencji białek i ich lokalizacji
<ol>
<li>Należy wykonać zdjęcia samego medium (bez komórek) przy użyciu filtrów fluorescencyjnych RFP i GFP, a następnie zapisać je jako obrazy tła. Obrazy te posłużą do odjęcia tła od faktycznych obrazów danych uzyskanych powyżej.</li>
<li>Należy przygotować stosy obrazów oddzielnie dla kanałów RFP i GFP.</li>
<li>Należy wybrać/zdefiniować poszczególne obszary (powierzchniowe vs cytozolowe), aby zmierzyć intensywność fluorescencji RFP i GFP (translokacja BLT1 i β-arrestyny).</li>
<li>Należy wykreślić wartości intensywności fluorescencji jako funkcję czasu. Wykres ten dostarczy informacji o kinetyce translokacji danej cząsteczki.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
A. Pomiar migracji komórek dendrytycznych ukierunkowanej przez leukotrien B4
Metoda opisana w niniejszym protokole została zastosowana do określenia migracji komórek dendrytycznych w kierunku leukotrienu B4 (Rysunek 1 i załączony film 1)21. Podobną metodologię można zastosować w celu określenia zdolności chemotaktycznej żywych komórek w odpowiedzi na konkretny ligand.
<img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy procesu iniekcji komórkowej z igłą do mikroiniekcji w układzie eksperymentalnym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Migracja komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy w kierunku 10 nM LTB4.
Wideo 1. Migracja żywych komórek BMDC w kierunku LTB4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala%20and%20Boddulrui_Video1.AVI">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>.
B. Pomiar oddziaływań GPCR (BLT1) i białek cytozolowych (β-arrestyna) oraz ich translokacji w żywych komórkach
Po zakończeniu tej procedury można uzyskać następujące informacje na temat zdarzeń sygnałowych GPCR.
<ol class="lroman">
<li>Lokalizacja GPCR, białek cytozolowych oraz jądra komórkowego (Rysunek 2).</li>
<li>Indukowana ligandem interakcja powierzchniowych GPCR (w tym przypadku BLT1) z białkiem cytozolowym (w tym przypadku β-arrestyną) (Rys. 3).</li>
<li>Kinetyka internalizacji receptorów i translokacji β-arrestyny do błony, a następnie jej internalizacji wraz z receptorami (Rysunek 4) (Jala et al. 205)18.</li>
<li>Możliwe jest określenie stanu aktywacji receptorów zależnego od ligandu w żywych komórkach (załączony wideo 2) oraz zidentyfikowanie krytycznych motywów lub procesów zaangażowanych w aktywację receptora (Jala et al. 205)18.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej; czerwone, zielone i niebieskie barwniki na komórkach; badanie lokalizacji białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Ekspresja BLT1-RFP (A), β-arrestyny-GFP (B), pNuc-CFP (C) w komórkach RBL-2H3. Kolorowy obraz złożony przedstawiono w panelu D.
<img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="Wygaszanie fluorescencji komórek; analiza skanowania liniowego; obrazowanie time-lapse; wykres intensywności w skali szarości." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Indukowana ligandem translokacja receptora i β-arrestyny. Przedstawiono skan liniowy intensywności fluorescencji w komórkach.
<img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse oraz wykres śledzenia hBLT1 w ciągu 30 minut, analiza zaniku fluorescencji, badanie lokalizacji komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Kinetyka internalizacji receptora i translokacji β-arestyny po dodaniu 1 μM LTB4Intensywności fluorescencji mierzono w funkcji czasu w obrębie błony komórkowej oraz cytozolu komórki.
Wideo 2 Obrazowanie na żywo komórek wykazujących ekspresję BLT1-RFP i β-arrestin-GFP po dodaniu 1 μM LTB4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala%20and%20Bodduluri_Video2.AVI">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>

<ol><li>Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein-coupled+receptors%3A+molecular+mechanisms+involved+in+receptor+activation+and+selectivity+of+G-protein+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition.</a> FASEB J. 11, 346-354 (1997).</li>
<li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).</li>
<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven-transmembrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li>
<li>Lefkowitz, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptors.+III.+New+roles+for+receptor+kinases+and+beta-arrestins+in+receptor+signaling+and+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization.</a> J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).</li>
<li>Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+roles+of+beta-arrestins+in+the+regulation+of+seven-membrane-spanning+receptor+trafficking+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling.</a> Biochem J. 375, 503-515 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-arrest%09or%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Beta-arrest	or.</a> Nature. 383, 447-450 (1996).</li>
<li>Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+mediator+networks+in+cell+signaling%3A+update+and+impact+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines.</a> Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).</li>
<li>Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT1+and+BLT2%3A+the+leukotriene+B%284%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Leukot+Essent+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors.</a> Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).</li>
<li>Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukotriene+B4+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Leukotriene B4 receptors.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).</li>
<li>Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+leukotriene+B%284%29+receptor+in+mice+reveals+its+role+in+inflammation+and+platelet-activating+factor-induced+anaphylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis.</a> J Exp Med. 192, 433-438 (2000).</li>
<li>Subbarao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+leukotriene+B4+receptors+in+the+development+of+atherosclerosis%3A+potential+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).</li>
<li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukotrienes+and+atherosclerosis%3A+new+roles+for+old+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators.</a> Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).</li>
<li>Heller, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+atherogenesis+in+BLT1-deficient+mice+reveals+a+role+for+LTB4+and+BLT1+in+smooth+muscle+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment.</a> Circulation. 112, 578-586 (2005).</li>
<li>Miyahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+leukotriene+B4+receptor+1+in+allergen-induced+airway+hyperresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).</li>
<li>Terawaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+leukotriene+B4+receptor+1+confers+resistance+to+airway+hyperresponsiveness+and+Th2-type+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses.</a> J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).</li>
<li>Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+leukotriene+B4+receptors+BLT1+and+BLT2%3A+a+critical+role+for+BLT1+in+collagen-induced+arthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice.</a> J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).</li>
<li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J Exp Med. 203, 829-835 (2006).</li>
<li>Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-independent+beta-arrestin+translocation+and+internalization+of+leukotriene+B4+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors.</a> J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).</li>
<li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells.</a> Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).</li>
<li>Del Prete, A., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+and+adaptive+immune+response+by+leukotriene+B4+receptors%3A+a+role+for+LTB4+in+up-regulation+of+CCR7+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function.</a> Blood. 109, 626-631 (2007).</li>
<li>Salogni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+A+induces+dendritic+cell+migration+through+the+polarized+release+of+CXC+chemokine+ligands+12+and+14%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14.</a> Blood. 113, 5848-5856 (2009).</li>
<li>Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+myeloid+dendritic+cells+from+bone+marrow+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Obrazowanie żywych komórek jest potężnym narzędziem do demonstrowania funkcji i oddziaływań konkretnych białek w czasie rzeczywistym. Metody opisane w niniejszym opracowaniu wyraźnie pokazują, że LTB4 może indukować szybką migrację komórek dendrytycznych. Metody te nie tylko rozszerzają wiedzę na temat funkcji LTB4 w odniesieniu do różnych typów komórek, ale pozwalają również na zastosowanie podobnych procedur do wielu innych chemokin i badanie ich skuteczności jako czynników chemotaktycznych w różn...

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa białaczkowa bazofilowa szczura (RBL-2H3) lub komórki HEK293.</td><td>ATCC</td><td>CRL-2256</td><td></td></tr><tr><td>Delbecco&amp;rsquo;zmodyfikowane podłoże Eagle&amp;rsquo;pożywka DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI lub DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Invitrogen</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Płytka surowica płodowa bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (10 000 J/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, 0,05% (1X) z EDTA 4Na, roztwór</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>sterylne szalki Fluoro o średnicy 35 mm z denkiem z szkiełka podstawowego o grubości 0,17 mm (WillCo-dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna kuweta do elektroporatora Gene Pulser (odległość między elektrodami 0,4 cm) (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>16552088</td><td></td></tr><tr><td>elektroporator Gene Pulser II </td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System epi-fluorescencyjny TE-FM przymocowany do odwróconego mikroskopu Nikon Eclipse TE300</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Metamorph</td><td>Uniwersalne obrazowanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pionowy wyciągacz mikropipet</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Forge M-900</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrauliczny mikromanipulator MO-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grubościowy manipulator manualny, MN-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;konstrukcje cDNA:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cDNA receptora sprzężonego z białkiem G, znakowanego białkiem fluorescencyjnym o czerwonej barwie na C-końcu (hBLT1-RFP)</td><td>Jala i wsp. 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td> cDNA białka cytozolowego znakowanego GFP (&amp;#946;-arrestyna1-GFP w niniejszym badaniu).</td><td>Jala i wsp. 2005</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek zapośredniczonej przez leukotrien b4 oraz oddziaływań blt1 z β-arrestyną

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Receptory sprzężone z białkami G (GPCR) należą do rodziny białek siedmiokrotnie przebiegających przez błonę i pośredniczą w transdukcji sygnałów pozakomórkowych w odpowiedzi wewnątrzkomórkowe. GPCR kontrolują różnorodne funkcje biologiczne, takie jak chemotaksja, wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia oraz regulacja genów w sposób zależny od liganda za pośrednictwem heterotrymerycznych białek G1-2. Wiązanie liganda indukuje serię zmian konformacyjnych prowadzących do aktywacji heterotrymerycznych białek G, które modulują poziomy drugich przekaźników, takich jak cykliczny adenozynomonofosforan (cAMP), inozytolotrifosforan (IP3) i diacyloglicerol (DG). Równolegle z aktywacją receptora, wiązanie liganda inicjuje również szereg zdarzeń mających na celu osłabienie sygnalizacji receptorowej poprzez desensytyzację, sekwestrację i/lub internalizację. Proces desensytyzacji GPCR zachodzi poprzez fosforylację receptora przez kinazy receptorów sprzężonych z białkami G (GRK) i następujące po tym wiązanie β-arrestyn3. β-arrestyny są białkami cytozolowymi, które po aktywacji GPCR translokują się do błony, wiążąc się z fosforylowanymi receptorami (w większości przypadków), co ułatwia internalizację receptora 4-6.
Leukotrien B4 (LTB4) jest prozapalną cząsteczką lipidową pochodzącą ze szlaku kwasu arachidonowego, która przekazuje swoje działanie poprzez receptory GPCR: receptor LTB4 1 (BLT1; receptor o wysokim powinowactwie) oraz receptor LTB4 2 (BLT2; receptor o niskim powinowactwie)7-9. Wykazano, że szlak LTB4-BLT1 odgrywa kluczową rolę w kilku chorobach zapalnych, w tym w astmie, zapaleniu stawów i miażdżycy10-17. Niniejsza praca opisuje metodologie opracowane w celu monitorowania indukowanej przez LTB4 migracji leukocytów oraz oddziaływań BLT1 z β-arestyną i translokacji receptorów w żywych komórkach przy użyciu technik obrazowania mikroskopowego18-19.
Komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego myszy C57BL/6 zostały wyizolowane i hodowane zgodnie z wcześniej opisaną procedurą 20-21. Komórki te poddano badaniom z wykorzystaniem metod obrazowania żywych komórek, aby zademonstrować migrację komórek indukowaną przez LTB4. Ludzki receptor BLT1 został oznakowany czerwoną białkiem fluorescencyjnym (BLT1-RFP) na C-końcu, a β-arrestyna1 zielonym białkiem fluorescencyjnym (β-arr-GFP>; oba plazmidy transfekowano do linii komórkowej białaczkowej bazofilowej szczura (RBL-2H3)18-19. Kinetykę oddziaływań między tymi białkami oraz ich lokalizację monitorowano za pomocą wideo mikroskopii żywych komórek. Metodologie opisane w niniejszej pracy przedstawiają wykorzystanie technik mikroskopowych do badania odpowiedzi funkcjonalnych receptorów sprzężonych z białkiem G w żywych komórkach. Praca ta opisuje również zastosowanie oprogramowania Metamorph do kwantyfikacji intensywności fluorescencji w celu określenia kinetyki oddziaływań między receptorem a białkami cytozolowymi.

Niniejszy artykuł opisuje metodologię wyznaczania odpowiedzi chemotaktycznej leukocytów na specyficzne ligandy oraz identyfikacji oddziaływań między receptorami powierzchniowymi komórek a białkami cytozolowymi przy użyciu technik obrazowania żywych komórek.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek zapośredniczonej przez leukotrien B4 oraz oddziaływań BLT1 z β-arrestyną

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) należą do rodziny białek siedmioprzeponowych i pośredniczą w transdukcji sygnałów zewnątrzkomórkowych do...

Leukotrien B4 jest cząsteczką prozapalną, która pośredniczy w swoich działaniach poprzez receptory sprzężone z białkiem G, BLT1 i BLT2, znajdujące się na wielu komórkach zapalnych. Wykazano, że szlak LTB4/BLT1 odgrywa kluczową rolę w kilku chorobach zapalnych, w tym w astmie, zapaleniu stawów i miażdżycy. Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) pośredniczą w transdukcji sygnałów zewnatrzkomórkowych, które wywołują odpowiedzi wewnątrzkomórkowe, takie jak chemotaksja, uwalnianie wapnia wewnątrzkomórkowego oraz regulacja genów.Wiązanie ligandu z receptorami zewnątrzkomórkowymi indukuje serię zmian konformacyjnych, które prowadzą do aktywacji heterotrymerycznych białek G. Białka G modulują następnie poziomy wtórnych przekaźników, takich jak cykliczny adenozynomonofosforan, trifosforan adenozyny i glicerolowy trójfosforan diacylglicerolu. Aby monitorować migrację komórek indukowaną przez leukotrien B₄ w czasie rzeczywistym, obrazowano komórki dendrytyczne pochodzące z szpiku kostnego (B MDCs), podczas gdy ligand był dostarczany poprzez kontrolowany przepływ z mikropipety. W celu oceny migracji wykonano obrazowanie poklatkowe.Wykorzystując te techniki obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, nasze laboratorium odkryło, że receptor leukotrenowy B4, BT1, jest funkcjonalnie ekspresowany w komórkach dendrytycznych. Zidentyfikowaliśmy również zależne od fosforylacji i beta-arestyny mechanizmy internalizacji BT1. Dr Jla, adiunkt w naszym laboratorium, który opracował wiele z tych technik, zaprezentuje zarówno migrację żywych komórek, jak i internalizację receptorów. Aby przygotować komórki dendrytyczne pochodzące z szpiku kostnego (B MDCs) do testów migracji komórek, wysiać 0,5 miliona komórek w podłożu hodowlanym RPMI 1640 zawierającym FPS, rekombinowany G-M-C-S-F oraz rekombinowany FLT3 na szalku z dnem szklanym o średnicy 35 mm.Po wysianiu inkubować komórki przez 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Po 16 godzinach dodać 3 mL PBS, a następnie odessać. Powtórzyć to płukanie co najmniej dwukrotnie; po ostatnim odessaniu dodać na płytkę 2 mL PBS.Komórki są teraz gotowe do eksperymentu i powinny być utrzymywane w temperaturze 37 °C. System obrazowania wykorzystany w eksperymentach przedstawionych w tym filmie składa się z systemu epi-fluorescencyjnego A-T-E-F-M przymocowanego do odwróconego mikroskopu Nikon Eclipse TE 300, wyposażonego w podgrzewany stoлик oraz chłodzoną cyfrową czarno-białą kamerę CCD SNAP hq.Długości fal wzbudzenia i emisji są kontrolowane za pomocą kół filtracyjnych i kontrolera kół filtracyjnych Lambda 10-2. Sterowanie sprzętem oraz akwizycja obrazów odbywa się za pomocą oprogramowania metamorph. Do stolika mikroskopu przymocowano dwa mikromanipulatory do utrzymania pipet, które można albo wykonać zgodnie z instrukcjami w dołączonym tekście, albo zakupić.Przenieś 1,5 mililitra roztworu zapasu pro zapalnego ligandu leukotrien B4 lub LTB4 o stężeniu 100 nanomolarnym do probówki wirówki o pojemności 1,5 mililitra. Uzupełnij mikropipetę, zanurzając końcówkę w roztworze i pozwalając mu wpłynąć do środka; ta metoda pobierania zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza na końcu mikropipety. Następnie pobierz 1 mililitr LTB4 do strzykawki tuberkulinowej o objętości jednego centymetra sześciennego wyposażonej w igłę microfill.Następnie należy go użyć do powolnego napełnienia mikropipety od góry, dołączając cewkę do czterech napełnionych mikropipet LTB. Następnie należy połączyć mikropipetę i cewkę z igłą 21G o długości 1,5 cala, przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 mL, która również jest napełniona ligandem. Teraz należy ostrożnie zamocować napełnioną ligandem mikropipetę do jednego z mikromanipulatorów na stoliku mikroskopu, aby przeprowadzić obrazowanie żywych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego.W odpowiedzi na zastosowanie liganda LTB four, należy wyjąć wysiane niedojrzałe b MDCs z inkubatora i umieścić je na podgrzewanym stole mikroskopu. Komórki należy uwidocznić, korzystając z obiektywu imersyjnego 60 x. Należy znaleźć obszar, w którym komórki nie są zbyt gęsto rozmieszczone, aby można było prawidłowo monitorować ich migrację.Zdejmij pokrywkę z naczynia fluorowego. Następnie, używając grubo regulowanego manipulatora manualnego, ostrożnie opuść pipetę załadowaną ligandem i zbliż ją do komórek, korzystając z hydraulicznego mikro-manipulatora precyzyjnego.Ustaw ostrość pipety. Wywrzyj niewielki nacisk na strzykawkę, aby zainicjować powolne uwalnianie liganda LTB four z końcówki; ligand powinien powoli rozprzestrzeniać się w medium poprzez dyfuzję. Następnie, korzystając z oprogramowania Metamorph, ustaw parametry akwizycji obrazu tak, aby obraz w polu jasnym był rejestrowany co 15 sekund przez dwie godziny.Kontynuuj monitorowanie co pięć minut w celu obserwacji postępu migracji w kierunku liganda. Metoda opisana w niniejszym protokole została zastosowana do wyznaczenia migracji komórek dendrytycznych w kierunku leukotrienu B4. W tym przypadku badano migrację komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy w kierunku 100.W tym filmie z obrazowaniem poklatkowym przedstawiono migrację żywych komórek B MDCs w kierunku LTB4. Podobne metody można zastosować w celu określenia odpowiedzi chemotaktycznej wielu typów komórek na różnorodne chemoatraktanty. Ten rodzaj obrazowania w połączeniu z cząsteczkami znaczników białek fluorescencyjnych może być wykorzystany do śledzenia ruchów i oddziaływań cząsteczek w czasie rzeczywistym w żywych komórkach.W niniejszym materiale demonstrujemy w czasie rzeczywistym oddziaływania fluorescencyjnie znakowanego receptora leukotrienu B4 typu 1 z beta-arestyną. RBL 2H3 to linia komórkowa białkretycznej białacmicznej szczura, wyizolowana ze szczurów Wistar, którą można pozyskać z ATCC. Komórki te nie wykazują ekspresji wielu receptorów chemokin, lecz posiadają komponenty komórkowe umożliwiające pośredniczenie w zależnych od chemokin szlakach sygnalizacyjnych.Aby ocenić indukowaną ligandem internalizację BT1 w czasie rzeczywistym, komórki RBL 2H3 są transfekowane BT1 RFP oraz beta-arestyną GFP. Podczas obrazowania poklatkowego do płytki dodaje się ligand. Zmiany w lokalizacji tych białek można ocenić za pomocą analizy obrazu.Aby badać internalizację G PCR R w czasie rzeczywistym, należy przeprowadzić transfekcję RBL two H three komórek wektorami B LT one RFP oraz beta arrest i GFP zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym tekście. Następnie należy przenieść 300 µL mieszaniny elektroporowanych komórek i regularnej pożywki wzrostowej do 35 mm płytek fluoro zawierających 2 mL regularnej pożywki wzrostowej. Komórki należy inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze składającej się z 95% powietrza i 5% carbon dioxide, aby umożliwić ich przyleganie do dna płytki.Po jednej godzinie zastąp pożywkę do transfekcji zwykłą pożywką wzrostową i umieść komórki z powrotem w inkubatorze na kolejne 18 do 24 godzin. Po inkubacji przemyj komórki dwa lub trzy razy, dodając dwie mililitry ciepłego RPMI bez czerwieni fenolowej zawierającego 10 milimoli HEPES bezpośrednio na płytkę, a następnie odsysając pożywkę. Następnie dodaj kolejne 1,8 mililitra.Następnie umieść naczynie hodowlane na podgrzewanym stoliku mikroskopu. Wykonaj zdjęcia przy 600-krotnym powiększeniu, używając obiektywu imersyjnego 60x. Następnie przełącz na odpowiedni filtr fluorescencyjny.Wybierz zdrową komórkę wykazującą ekspresję HBL BT one RFP na powierzchni komórki i wykonaj zdjęcie. Korzystając z filtra RFP, przełącz na filtr GFP, upewniając się, że beta arrest i GFP są eksponowane w cytoplazmie, a następnie wykonaj zdjęcie. Następnie przeanalizuj połączone obrazy pseudokolorowe, aby upewnić się, że nie występuje przenikanie fluorescencji, które może pojawić się w wyniku błędów.Celowanie receptorów nie zachodzi pomiędzy RFP a GFP. Następnie wprowadź parametry obrazowania poklatkowego tutaj. Obrazy 16-bitowe są pozyskiwane za pomocą kamery z ustawieniem akwizycji jeden po drugim.Obrazy fluorescencji czerwonej i zielonej są rejestrowane sekwencyjnie przy użyciu filtrów fluorochromów RFP i GFP za pomocą rozdzielacza wiązki R-F-P-G-F-P. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rejestrowało obrazy w odstępach 32 sekund przez jedną godzinę. Ustaw czasy ekspozycji kamery w taki sposób, aby uzyskać podobne zakresy dynamiczne.W celu pomiaru intensywności fluorescencji RFP i GFP. Należy gromadzić obrazy przez jedną minutę, a następnie w czasie t równym zero dodać 200 µL ligandu bezpośrednio do płytki, uważając, aby jej nie potrząsnąć.Kontynuuj gromadzenie obrazów fluorescencyjnych przez 60 minut. Po dodaniu ligandu, w miarę pozyskiwania obrazów, będą one automatycznie zapisywane jako pliki TIFF z sekwencyjnymi nazwami. Pliki te można następnie przeglądać jako pojedyncze obrazy lub obrazy połączone za pomocą oprogramowania.Na koniec, po zarejestrowaniu wszystkich obrazów komórek, należy zarejestrować obrazy samej pożywki bez komórek, korzystając z tych samych ustawień. Pliki te należy zapisać do wykorzystania jako obrazy tła podczas analizy. W programie Metamorph należy użyć funkcji odejmowania obrazów (image subtract), aby odjąć tło od faktycznych obrazów danych uzyskanych powyżej.Pozwoli to uwzględnić jakiekolwiek tło lub autofluorescencję pochodzącą z medium. Następnie w menu pliku wybierz opcję otwierania wygenerowanego pliku stosu końcowego i otwórz poszczególne stosy obrazów. Następnie w pomiarach obszarów wybierz opcję obrysu obszaru eliptycznego i wyznacz obszary zainteresowania, wybierając obszary powierzchniowe oraz cytozolowe, aby zmierzyć intensywność fluorescencji RFP i GFP odpowiadającą translokacji BLT 1 oraz beta-arestyny.Korzystając z opcji logowania danych, która automatycznie łączy się z programem Excel, nanieś wartości intensywności fluorescencji w funkcji czasu. Wykres ten dostarczy informacji o kinetyce translokacji danej cząsteczki. Analiza obrazu może ujawnić lokalizację białek G PCR R w cytozolu oraz jądrze komórkowym.Tutaj widoczna jest ekspresja BT1 RFP na powierzchni komórki RBL2 H3. Ten obraz pokazuje lokalizację beta-rest i GFP w cytozolu tej samej komórki, a tutaj widoczny jest p nuke CFP w jądrze komórkowym. Przedstawiony tutaj obraz z połączonymi kolorami wskazuje na odrębną lokalizację komórkową każdego fluorochromu; tutaj można również ocenić indukowaną ligandem interakcję powierzchniowych GPCR z białkiem cytozolowym.Ligandowo indukowana translokacja receptora BLT1 i beta-arestyny. W tym filmie przedstawiono obrazowanie na żywo komórki wykazującej ekspresję BLT1 RFP oraz beta-arestyny GFP. Po dodaniu 1 µM LTB4 ilościowe określenie wzorców translokacji może być monitorowane przy użyciu oprogramowania Metamorph.Skan liniowy intensywności fluorescencji w reprezentatywnej komórce przedstawiono dla T równego zero. RFP dla BT1 widoczne jest w błonie, natomiast GFP dla beta-arestyny widoczne jest w cytosolu. Po dodaniu ligandu obserwuje się nakładanie się linii RFP i GFP, co sugeruje kolokalizację receptora i beta-arestyny.Ponadto można tutaj określić kinetykę przemieszczania się białek. Zbadano kinetykę internalizacji receptorów oraz translokacji beta-arestyny po dodaniu 1 µM LTB₄.Intensywność fluorescencji mierzono w funkcji czasu w obrębie błony oraz cytozolu komórki. Dodanie liganda LTB4 do komórek RRB2 H3 przetransfekowanych białkami BLT1 RFP i beta-arrestyna 1 GFP prowadzi do translokacji beta-arrestyny 1 GFP z cytozolu do błony, co objawia się jako powstanie żółtego pierścienia w ciągu jednej minuty. Po oddziaływaniu z beta-arrestyną 1 GFP, BLT1 RFP tworzy kompleks receptor-beta-arrestyna 1 GFP i przemieszcza się przez cytozol w formie endosomów, co jest widoczne jako pojawienie się żółtych punktów w ciągu pięciu minut. Wykorzystując te metody, można określić status aktywacji receptora zależny od liganda oraz krytyczne motywy lub procesy biorące udział w aktywacji receptora.Najważniejszym elementem eksperymentu jest monitorowanie poziomu buforu w płytce podczas prowadzenia pomiarów, ponieważ czas trwania doświadczenia po jego uruchomieniu przekracza jedną godzinę. Technika ta została opracowana przez badaczy zajmujących się chemokinami i ich receptorami w celu badania migracji komórek oraz oddziaływań ligand-receptor w różnych typach komórek ssaków.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować eksperymenty obrazowania w czasie rzeczywistym z udziałem chemokin i ich receptorów oraz ich oddziaływań z białkami cytozolowymi, takimi jak beta-arestyny.

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek pośredniczonej przez leukotrien B4 oraz interakcje BLT1 z β-arrestin

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Jest to metoda wizualizacji adhezji leukocytów do śródbłonka w pobranych naczyniach poddanym ciśnieniu. Technika ta umożliwia badanie adhezji naczyniowej w warunkach przepływu ścinającego przy różnych ciśnieniach wewnątrzświatłowych do 200 mmHg, co pozwala na naśladowanie patofizjologicznych warunków nadciśnienia tętniczego.

Obrazowanie adhezji leukocytów do śródbłonka naczyniowego przy wysokim ciśnieniu wewnątrzświatłowym

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Obrazowanie stawów in vivo to cenna technika wykrywająca migracyjne zachowania leukocytów oraz dynamikę molekularną w obrębie zapalonych stawów. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół obrazowania stawów in vivo z wykorzystaniem modelu myszego zapalenia stawów wywołanego kolagenem II (CIA).

In Vivo Obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach

Poznaj techniki obrazowania żywych komórek do badania migracji leukocytów w odpowiedzi na leukotrien B4 i interakcji receptora BLT1 z β-aresztyną. Metoda ta pozwala na obserwację sygnalizacji GPCR w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek zapośredniczonej przez leukotrien B₄ oraz oddziaływań BLT1 z β-arrestyną

Przeglądaj więcej filmów