Obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek zapośredniczonej przez leukotrien B₄ oraz oddziaływań BLT1 z β-arrestyną

Leukotrien B4 jest cząsteczką prozapalną, która pośredniczy w swoich działaniach poprzez receptory sprzężone z białkiem G, BLT1 i BLT2, znajdujące się na wielu komórkach zapalnych. Wykazano, że szlak LTB4/BLT1 odgrywa kluczową rolę w kilku chorobach zapalnych, w tym w astmie, zapaleniu stawów i miażdżycy. Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) pośredniczą w transdukcji sygnałów zewnatrzkomórkowych, które wywołują odpowiedzi wewnątrzkomórkowe, takie jak chemotaksja, uwalnianie wapnia wewnątrzkomórkowego oraz regulacja genów.

Wiązanie ligandu z receptorami zewnątrzkomórkowymi indukuje serię zmian konformacyjnych, które prowadzą do aktywacji heterotrymerycznych białek G. Białka G modulują następnie poziomy wtórnych przekaźników, takich jak cykliczny adenozynomonofosforan, trifosforan adenozyny i glicerolowy trójfosforan diacylglicerolu. Aby monitorować migrację komórek indukowaną przez leukotrien B₄ w czasie rzeczywistym, obrazowano komórki dendrytyczne pochodzące z szpiku kostnego (B MDCs), podczas gdy ligand był dostarczany poprzez kontrolowany przepływ z mikropipety. W celu oceny migracji wykonano obrazowanie poklatkowe.

Wykorzystując te techniki obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, nasze laboratorium odkryło, że receptor leukotrenowy B4, BT1, jest funkcjonalnie ekspresowany w komórkach dendrytycznych. Zidentyfikowaliśmy również zależne od fosforylacji i beta-arestyny mechanizmy internalizacji BT1. Dr Jla, adiunkt w naszym laboratorium, który opracował wiele z tych technik, zaprezentuje zarówno migrację żywych komórek, jak i internalizację receptorów. Aby przygotować komórki dendrytyczne pochodzące z szpiku kostnego (B MDCs) do testów migracji komórek, wysiać 0,5 miliona komórek w podłożu hodowlanym RPMI 1640 zawierającym FPS, rekombinowany G-M-C-S-F oraz rekombinowany FLT3 na szalku z dnem szklanym o średnicy 35 mm.

Po wysianiu inkubować komórki przez 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Po 16 godzinach dodać 3 mL PBS, a następnie odessać. Powtórzyć to płukanie co najmniej dwukrotnie; po ostatnim odessaniu dodać na płytkę 2 mL PBS.

Komórki są teraz gotowe do eksperymentu i powinny być utrzymywane w temperaturze 37 °C. System obrazowania wykorzystany w eksperymentach przedstawionych w tym filmie składa się z systemu epi-fluorescencyjnego A-T-E-F-M przymocowanego do odwróconego mikroskopu Nikon Eclipse TE 300, wyposażonego w podgrzewany stoлик oraz chłodzoną cyfrową czarno-białą kamerę CCD SNAP hq.

Długości fal wzbudzenia i emisji są kontrolowane za pomocą kół filtracyjnych i kontrolera kół filtracyjnych Lambda 10-2. Sterowanie sprzętem oraz akwizycja obrazów odbywa się za pomocą oprogramowania metamorph. Do stolika mikroskopu przymocowano dwa mikromanipulatory do utrzymania pipet, które można albo wykonać zgodnie z instrukcjami w dołączonym tekście, albo zakupić.

Przenieś 1,5 mililitra roztworu zapasu pro zapalnego ligandu leukotrien B4 lub LTB4 o stężeniu 100 nanomolarnym do probówki wirówki o pojemności 1,5 mililitra. Uzupełnij mikropipetę, zanurzając końcówkę w roztworze i pozwalając mu wpłynąć do środka; ta metoda pobierania zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza na końcu mikropipety. Następnie pobierz 1 mililitr LTB4 do strzykawki tuberkulinowej o objętości jednego centymetra sześciennego wyposażonej w igłę microfill.

Następnie należy go użyć do powolnego napełnienia mikropipety od góry, dołączając cewkę do czterech napełnionych mikropipet LTB. Następnie należy połączyć mikropipetę i cewkę z igłą 21G o długości 1,5 cala, przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 mL, która również jest napełniona ligandem. Teraz należy ostrożnie zamocować napełnioną ligandem mikropipetę do jednego z mikromanipulatorów na stoliku mikroskopu, aby przeprowadzić obrazowanie żywych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego.

W odpowiedzi na zastosowanie liganda LTB four, należy wyjąć wysiane niedojrzałe b MDCs z inkubatora i umieścić je na podgrzewanym stole mikroskopu. Komórki należy uwidocznić, korzystając z obiektywu imersyjnego 60 x. Należy znaleźć obszar, w którym komórki nie są zbyt gęsto rozmieszczone, aby można było prawidłowo monitorować ich migrację.

Zdejmij pokrywkę z naczynia fluorowego. Następnie, używając grubo regulowanego manipulatora manualnego, ostrożnie opuść pipetę załadowaną ligandem i zbliż ją do komórek, korzystając z hydraulicznego mikro-manipulatora precyzyjnego.

Ustaw ostrość pipety. Wywrzyj niewielki nacisk na strzykawkę, aby zainicjować powolne uwalnianie liganda LTB four z końcówki; ligand powinien powoli rozprzestrzeniać się w medium poprzez dyfuzję. Następnie, korzystając z oprogramowania Metamorph, ustaw parametry akwizycji obrazu tak, aby obraz w polu jasnym był rejestrowany co 15 sekund przez dwie godziny.

Kontynuuj monitorowanie co pięć minut w celu obserwacji postępu migracji w kierunku liganda. Metoda opisana w niniejszym protokole została zastosowana do wyznaczenia migracji komórek dendrytycznych w kierunku leukotrienu B4. W tym przypadku badano migrację komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy w kierunku 100.

W tym filmie z obrazowaniem poklatkowym przedstawiono migrację żywych komórek B MDCs w kierunku LTB4. Podobne metody można zastosować w celu określenia odpowiedzi chemotaktycznej wielu typów komórek na różnorodne chemoatraktanty. Ten rodzaj obrazowania w połączeniu z cząsteczkami znaczników białek fluorescencyjnych może być wykorzystany do śledzenia ruchów i oddziaływań cząsteczek w czasie rzeczywistym w żywych komórkach.

W niniejszym materiale demonstrujemy w czasie rzeczywistym oddziaływania fluorescencyjnie znakowanego receptora leukotrienu B4 typu 1 z beta-arestyną. RBL 2H3 to linia komórkowa białkretycznej białacmicznej szczura, wyizolowana ze szczurów Wistar, którą można pozyskać z ATCC. Komórki te nie wykazują ekspresji wielu receptorów chemokin, lecz posiadają komponenty komórkowe umożliwiające pośredniczenie w zależnych od chemokin szlakach sygnalizacyjnych.

Aby ocenić indukowaną ligandem internalizację BT1 w czasie rzeczywistym, komórki RBL 2H3 są transfekowane BT1 RFP oraz beta-arestyną GFP. Podczas obrazowania poklatkowego do płytki dodaje się ligand. Zmiany w lokalizacji tych białek można ocenić za pomocą analizy obrazu.

Aby badać internalizację G PCR R w czasie rzeczywistym, należy przeprowadzić transfekcję RBL two H three komórek wektorami B LT one RFP oraz beta arrest i GFP zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym tekście. Następnie należy przenieść 300 µL mieszaniny elektroporowanych komórek i regularnej pożywki wzrostowej do 35 mm płytek fluoro zawierających 2 mL regularnej pożywki wzrostowej. Komórki należy inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze składającej się z 95% powietrza i 5% carbon dioxide, aby umożliwić ich przyleganie do dna płytki.

Po jednej godzinie zastąp pożywkę do transfekcji zwykłą pożywką wzrostową i umieść komórki z powrotem w inkubatorze na kolejne 18 do 24 godzin. Po inkubacji przemyj komórki dwa lub trzy razy, dodając dwie mililitry ciepłego RPMI bez czerwieni fenolowej zawierającego 10 milimoli HEPES bezpośrednio na płytkę, a następnie odsysając pożywkę. Następnie dodaj kolejne 1,8 mililitra.

Następnie umieść naczynie hodowlane na podgrzewanym stoliku mikroskopu. Wykonaj zdjęcia przy 600-krotnym powiększeniu, używając obiektywu imersyjnego 60x. Następnie przełącz na odpowiedni filtr fluorescencyjny.

Wybierz zdrową komórkę wykazującą ekspresję HBL BT one RFP na powierzchni komórki i wykonaj zdjęcie. Korzystając z filtra RFP, przełącz na filtr GFP, upewniając się, że beta arrest i GFP są eksponowane w cytoplazmie, a następnie wykonaj zdjęcie. Następnie przeanalizuj połączone obrazy pseudokolorowe, aby upewnić się, że nie występuje przenikanie fluorescencji, które może pojawić się w wyniku błędów.

Celowanie receptorów nie zachodzi pomiędzy RFP a GFP. Następnie wprowadź parametry obrazowania poklatkowego tutaj. Obrazy 16-bitowe są pozyskiwane za pomocą kamery z ustawieniem akwizycji jeden po drugim.

Obrazy fluorescencji czerwonej i zielonej są rejestrowane sekwencyjnie przy użyciu filtrów fluorochromów RFP i GFP za pomocą rozdzielacza wiązki R-F-P-G-F-P. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rejestrowało obrazy w odstępach 32 sekund przez jedną godzinę. Ustaw czasy ekspozycji kamery w taki sposób, aby uzyskać podobne zakresy dynamiczne.

W celu pomiaru intensywności fluorescencji RFP i GFP. Należy gromadzić obrazy przez jedną minutę, a następnie w czasie t równym zero dodać 200 µL ligandu bezpośrednio do płytki, uważając, aby jej nie potrząsnąć.

Kontynuuj gromadzenie obrazów fluorescencyjnych przez 60 minut. Po dodaniu ligandu, w miarę pozyskiwania obrazów, będą one automatycznie zapisywane jako pliki TIFF z sekwencyjnymi nazwami. Pliki te można następnie przeglądać jako pojedyncze obrazy lub obrazy połączone za pomocą oprogramowania.

Na koniec, po zarejestrowaniu wszystkich obrazów komórek, należy zarejestrować obrazy samej pożywki bez komórek, korzystając z tych samych ustawień. Pliki te należy zapisać do wykorzystania jako obrazy tła podczas analizy. W programie Metamorph należy użyć funkcji odejmowania obrazów (image subtract), aby odjąć tło od faktycznych obrazów danych uzyskanych powyżej.

Pozwoli to uwzględnić jakiekolwiek tło lub autofluorescencję pochodzącą z medium. Następnie w menu pliku wybierz opcję otwierania wygenerowanego pliku stosu końcowego i otwórz poszczególne stosy obrazów. Następnie w pomiarach obszarów wybierz opcję obrysu obszaru eliptycznego i wyznacz obszary zainteresowania, wybierając obszary powierzchniowe oraz cytozolowe, aby zmierzyć intensywność fluorescencji RFP i GFP odpowiadającą translokacji BLT 1 oraz beta-arestyny.

Korzystając z opcji logowania danych, która automatycznie łączy się z programem Excel, nanieś wartości intensywności fluorescencji w funkcji czasu. Wykres ten dostarczy informacji o kinetyce translokacji danej cząsteczki. Analiza obrazu może ujawnić lokalizację białek G PCR R w cytozolu oraz jądrze komórkowym.

Tutaj widoczna jest ekspresja BT1 RFP na powierzchni komórki RBL2 H3. Ten obraz pokazuje lokalizację beta-rest i GFP w cytozolu tej samej komórki, a tutaj widoczny jest p nuke CFP w jądrze komórkowym. Przedstawiony tutaj obraz z połączonymi kolorami wskazuje na odrębną lokalizację komórkową każdego fluorochromu; tutaj można również ocenić indukowaną ligandem interakcję powierzchniowych GPCR z białkiem cytozolowym.

Ligandowo indukowana translokacja receptora BLT1 i beta-arestyny. W tym filmie przedstawiono obrazowanie na żywo komórki wykazującej ekspresję BLT1 RFP oraz beta-arestyny GFP. Po dodaniu 1 µM LTB4 ilościowe określenie wzorców translokacji może być monitorowane przy użyciu oprogramowania Metamorph.

Skan liniowy intensywności fluorescencji w reprezentatywnej komórce przedstawiono dla T równego zero. RFP dla BT1 widoczne jest w błonie, natomiast GFP dla beta-arestyny widoczne jest w cytosolu. Po dodaniu ligandu obserwuje się nakładanie się linii RFP i GFP, co sugeruje kolokalizację receptora i beta-arestyny.

Ponadto można tutaj określić kinetykę przemieszczania się białek. Zbadano kinetykę internalizacji receptorów oraz translokacji beta-arestyny po dodaniu 1 µM LTB₄.

Intensywność fluorescencji mierzono w funkcji czasu w obrębie błony oraz cytozolu komórki. Dodanie liganda LTB4 do komórek RRB2 H3 przetransfekowanych białkami BLT1 RFP i beta-arrestyna 1 GFP prowadzi do translokacji beta-arrestyny 1 GFP z cytozolu do błony, co objawia się jako powstanie żółtego pierścienia w ciągu jednej minuty. Po oddziaływaniu z beta-arrestyną 1 GFP, BLT1 RFP tworzy kompleks receptor-beta-arrestyna 1 GFP i przemieszcza się przez cytozol w formie endosomów, co jest widoczne jako pojawienie się żółtych punktów w ciągu pięciu minut. Wykorzystując te metody, można określić status aktywacji receptora zależny od liganda oraz krytyczne motywy lub procesy biorące udział w aktywacji receptora.

Najważniejszym elementem eksperymentu jest monitorowanie poziomu buforu w płytce podczas prowadzenia pomiarów, ponieważ czas trwania doświadczenia po jego uruchomieniu przekracza jedną godzinę. Technika ta została opracowana przez badaczy zajmujących się chemokinami i ich receptorami w celu badania migracji komórek oraz oddziaływań ligand-receptor w różnych typach komórek ssaków.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować eksperymenty obrazowania w czasie rzeczywistym z udziałem chemokin i ich receptorów oraz ich oddziaływań z białkami cytozolowymi, takimi jak beta-arestyny.