Tworzenie lepszego komara: Identyfikacja genów umożliwiających odporność na malarię i gorączkę dengi u komarów A. gambiae i A. aegypti

Nazywam się George Dimopoulos. Jestem adiunktem w Katedrze Mikrobiologii Molekularnej i Immunologii w Johns Hopkins School of Public Health w Instytucie Badań nad Malarią. Moja grupa badawcza pracuje nad komarami z rodzaju Anopheles gambiae, które przenoszą malarię; badamy biologię molekularną tych owadów, ze szczególnym uwzględnieniem wrodzonego układu odpornościowego komarów, który bierze udział w niszczeniu pasożytów malarii.

Chcemy zrozumieć, w jaki sposób funkcjonuje ten układ odpornościowy oraz które geny i cząsteczki są istotne dla zwalczania pasożyta. Wierzymy, że zrozumienie biologii tego układu pozwoli nam wykorzystać tę wiedzę do opracowania strategii kontroli malarii w przyszłości. Malaria jest jedną z najpoważniejszych chorób na świecie.

Towarzyszy ona ludzkości od zawsze i jest wielkim nieszczęściem, że wciąż z nią walczymy. Malaria dotyka 400 milionów ludzi każdego roku i powoduje śmierć 2 milionów osób, głównie w regionie Afryki Subsaharyjskiej, jednak występuje ona również w innych krajach rozwijających się w Ameryce Południowej i Azji. Malaria jest wywoływana przez pierwotniaka z rodzaju Plasmodium; istnieją cztery gatunki Plasmodium, które mogą powodować malarię u ludzi.

Najważniejszym z nich jest Plasmodium falciparum. Plasmodium falciparum jest przenoszone głównie przez komary należące do rodzaju Anopheles, a najważniejsze komary wektorowe w transmisji malarii w Afryce Subsaharyjskiej należą do kompleksu gatunków Anopheles gambiae i występują one głównie w regionie subsaharyjskim Afryki. Wirus dengi jest wirusem z grupy flawiwirusów i jest przenoszony głównie przez komara Aedes aegypti.

Jego rozmieszczenie geograficzne jest dość podobne do malarii. Występuje on w Amerykach, w Azji Południowo-Wschodniej oraz w Afryce. Wirus dengue wywołuje gorączkę krwotoczną.

Około 2,5 miliarda ludzi jest narażonych na zakażenie wirusem dengi, a wirus ten wywołuje gorączkę krwotoczną u milionów osób każdego roku. W ciągu ostatnich 10 lat krwotoczna gorączka dengi stała się jedną z najpoważniejszych chorób przenoszonych przez wektory. Z kolei pasożyt malarii posiada złożony cykl życiowy, przebiegający zarówno w wektorze, jakim jest komar przenoszący go między gospodarzami ludzkimi, jak i w samym organizmie człowieka.

Moja grupa badawcza zajmuje się biologią transmisji malarii u komarów. W momencie, gdy komar pobierze zakażony posiłek krwi, wchłonie również pasożyty Plasmodium falciparum. Gametocyty pasożyta zapłodnią się w jelicie środkowym i wytworzą ookystę mniej więcej od 18 do 35 godzin po pobraniu krwi.

Te ookinety muszą tutaj wniknąć do nabłonka jelita komara. Większość ookinetów zostaje zabita przez układ odpornościowy komara na tym etapie, a jest to właśnie obszar, na którym skupiamy nasze badania; przedstawiony obraz z mikroskopii konfokalnej pokazuje ookinety, które zdołały przedostać się przez jelito środkowe i utworzą tutaj cystę po stronie podstawnej. Wewnątrz tej cysty rozwiną się tysiące pasożytów w stadium sporozoitów, a stadia te, około 15 dni po pobraniu przez komara posiłku krwi, migrują do gruczołów ślinowych, skąd sporozoity mogą zostać przeniesione na nowego gospodarza. Układ odpornościowy komara bierze również udział w zabijaniu sporozoitów na tym etapie, gdy zostają one uwolnione do hemocelu komara.

Genom komarów został zsekwencjonowany w 2002 roku, co umożliwiło opracowanie nowych narzędzi biologii molekularnej i genomiki do badania ekspresji genów wszystkich komarów, obejmującej około 14 000 genów w różnych warunkach infekcji, z wykorzystaniem tzw. mikromacierzy. Przedstawiona tutaj mikromacierz, którą opracowaliśmy kilka lat temu, zawiera cały transkryptom komarów, czyli wszystkie znane w tamtym czasie geny komarów, a także geny pasożyta z rodzaju Plasmodium. Dzięki temu możemy jednocześnie badać aktywność genów zarówno komara, jak i pasożyta podczas infekcji.

Po zidentyfikowaniu genów aktywowanych podczas zakażenia komara pasożytami z rodzaju Plasmodium, musimy sprawdzić, czy geny te uczestniczą w eliminacji pasożyta, co realizujemy za pomocą metody zwanej wyciszaniem genów poprzez interferencję RNA. Wprowadzamy do organizmu RNA odpowiadające genom, które chcemy wycelować; to dwuniciowe RNA spowoduje degradację mRNA tych konkretnych genów u komara, w wyniku czego geny te nie będą produkować białka. Następnie zakażamy komara pasożytem.

Obecnie, jeśli wyciszymy lub unieczynnimy określony gen u komara i w wyniku tego wyciszenia pasożyt będzie w stanie wywołać infekcję o wyższym stopniu niż zwykle u komarów niepoddanych działaniu, będzie to sugerować, że gen ten jest w jakiś sposób wykorzystywany do zwalczania pasożytów malarii. Jest to główna metoda, której używamy do badania, czy dane geny są zaangażowane w eliminację pasożytów w organizmie komara.

Większość pasożytów z rodzaju Plasmodium ginie w organizmie komara, a silne dowody wskazują, że za ten proces odpowiada głównie wrodzony układ odpornościowy komara. Nasze laboratorium oraz laboratoria naszych współpracowników zidentyfikowały szereg genów zaangażowanych w to zjawisko. Istnieją również genetycznie wyselekcjonowane szczepy komarów, które nie przenoszą malarii, ponieważ eliminują wszystkie pasożyty w jelicie środkowym poprzez mechanizmy wrodzonej odpowiedzi immunologicznej.

Wydaje się, że komar posiada szereg różnych komponentów i mechanizmów służących do zwalczania pasożyta, a największym wyzwaniem jest obecnie zrozumienie tych funkcji oraz sposobu, w jaki możemy nimi manipulować, aby opracować komary odporne. Komar GTI wykorzystuje inne mechanizmy do kontrolowania infekcji wirusem dengi niż te, których używa Anopheles gambiae do kontrolowania infekcji odium. Komar aegypti, podobnie jak wszystkie eukarioty, posiada zależny od RNA mechanizm obronny nazywany interferencją RNA.

Jest to w zasadzie mechanizm obronny zdolny do celowania w RNA wirusa w celu jego degradacji, w ten sposób organizm chroni się przed infekcją wirusową. Staramy się zrozumieć ten mechanizm obronny oraz sposób, w jaki możemy nim manipulować, aby wyhodować komary odporne na wirusa. W ciągu ostatnich 10 lat biologia molekularna odnotowała spektakularne postępy, głównie w zakresie metodologii, co ogromnie przyspieszyło nasze badania.

Jednym z głównych osiągnięć są technologie sekwencjonowania, które umożliwiły wysokoprzepustowe sekwencjonowanie całych genomów. Dzięki tym technologiom dysponujemy obecnie całkowicie zsekwencjonowanymi genomami komarów z gatunków ous Gambia oraz A, this gyp. Pozwala nam to na znacznie łatwiejszą niż wcześniej identyfikację genów zaangażowanych w kontrolowanie infekcji.

Innym bardzo ważnym osiągnięciem w dziedzinie genomiki funkcjonalnej jest wysokoprzepustowa analiza ekspresji genów z wykorzystaniem mikromacierzy. Mikromacierze to niewielkie szkiełka, na których unieruchomiono tysiące fragmentów DNA; możemy wykorzystać te tak zwane chipy DNA do monitorowania ekspresji bardzo dużej liczby genów. Kolejnym niezwykle istotnym postępem w tej dziedzinie jest metodologia wyciszania genów za pomocą interferencji RNA, która pozwala nam celować w konkretne geny i dezaktywować je u komarów, co umożliwia zastosowanie tak zwanego podejścia genetyki odwrotnej w celu zbadania funkcji genów oraz tego, w jaki sposób interesujące nas geny biorą udział w zabijaniu pasożyta.

Komary, na których przeprowadziliśmy większość tych badań wraz z naszymi współpracownikami, pochodzą z kolonii utrzymywanych w warunkach laboratoryjnych od 30 lat. Te komary uległy ewidentnie znacznemu zróżnicowaniu w stosunku do osobników występujących w naturze. Komary w naturze podlegają ciągłej presji selekcyjnej ze strony różnych drobnoustrojów oraz innych parametrów, które w terenie wykazują znacznie większą zmienność niż w dość stabilnych warunkach laboratoryjnych.

Można zatem argumentować, że nasze badania byłyby prawdopodobnie znacznie bardziej informacyjne, gdyby zostały przeprowadzone bezpośrednio na komarach z terenu. Niestety nie jest to jednak tak łatwe do wykonania. Jak wspomniano, nie dysponujemy odpowiednią infrastrukturą w terenie, a ponadto zbieranie komarów z natury i tworzenie z nich kolonii jest bardzo skomplikowane.

Zatem najlepszymi modelami biologicznymi, jakimi obecnie dysponujemy, są modele laboratoryjne, jednak w pewnym momencie będziemy musieli udać się w teren, aby zweryfikować i potwierdzić główne wnioski wynikające z naszych odkryć przeprowadzonych na komarach laboratoryjnych. Wiemy, że systemy obronne komarów biorą udział w zwalczaniu ludzkich patogenów, które te owady przenoszą. Jeśli uda nam się zrozumieć, w jaki sposób dochodzi do tego zwalczania, które geny są w to zaangażowane i jakie mechanizmy działają, moglibyśmy potencjalnie nimi manipulować i wykorzystać tę manipulację do opracowania genetycznie zmodyfikowanych komarów, które nie będą w stanie przenosić patogenów.

Po opracowaniu takich genetycznie zmodyfikowanych komarów możemy zacząć rozważać, w jaki sposób wprowadzić je do środowiska naturalnego i uczynić gatunkiem dominującym nad komarami podatnymi. Jedną z szeroko dyskutowanych strategii służących do osiągnięcia tego celu jest w zasadzie rozpowszechnianie w naturalnych populacjach genów oporności, które czyniłyby komary odpornymi na patogeny; musi to zostać zrealizowane za pomocą tak zwanych mechanizmów napędu genetycznego (gene drive). Obecnie wiele badań koncentruje się na opracowaniu takich mechanizmów napędu genetycznego.

Oczywiście istnieje wiele kwestii etycznych, które należy rozważyć przed uwolnieniem jakiegokolwiek rodzaju organizmu zmodyfikowanego genetycznie do środowiska naturalnego. Ważne jest, aby pamiętać, że modyfikacje genetyczne zachodzą w naturze w sposób ciągły. Mało jest powodów, aby sądzić, że w wyniku tych trzech mutacji otrzymalibyśmy komara, który byłby sprawniejszy w przenoszeniu patogenów lub posiadałby jakąkolwiek inną niepożądaną cechę.

Najgorszym możliwym scenariuszem byłoby to, że patogen w pewnym momencie wykształciłby oporność na tego transgenicznego komara; oczywiście musielibyśmy przeprowadzić liczne testy terenowe i laboratoryjne, zanim w ogóle rozważylibyśmy wypuszczenie genetycznie zmodyfikowanego komara do środowiska. Musielibyśmy również wyedukować ludzi w zakresie tych kontrolowanych strategii i upewnić się, że wszyscy czują się z nimi komfortowo i akceptują taki rodzaj działań. Przed nami wciąż wiele przeszkód w osiągnięciu strategii zwalczania chorób opartej na blokowaniu patogenu w wektorze, jakim jest komar.

Niektóre z tych przeszkód wiążą się z kwestiami technicznymi oraz problemami eksperymentalnymi, które musimy rozwiązać. Jedną z przeszkód jest na przykład opracowanie mechanizmów napędu genetycznego (gene drive), które w sposób wydajny pozwoliłyby na rozprzestrzenianie się tych genów odporności w populacjach. Dziedzina biologii wektorów chorób przeszła w ciągu ostatnich 10 do 15 lat gwałtowny postęp, głównie dzięki uznaniu, że zrozumienie biologii interakcji między owadem a patogenem może w rzeczywistości pomóc nam w opracowaniu strategii kontroli.

Uznanie to doprowadziło do zwiększenia finansowania badań w tej dziedzinie. Niezwykle ważne jest, aby finansowanie i zaangażowanie zostały utrzymane, tak abyśmy mogli zachować osiągnięte tempo i zrealizować naszą misję poprzez zrozumienie biologii interakcji między wektorem a patogenem oraz tego, jak możemy wykorzystać tę biologię do opracowania strategii zwalczania chorób.