Name: Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-14T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną analizę Sholla morfologii neuronów przy użyciu programu Bonfire w MATLAB. Ta metoda pozwala badaczom obserwować lokalne zmiany w strukturze dendrytów i aksonów z większą wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była częściowo finansowana z grantu Busch Biomedical, grantu NSF IBN-0548543, grantu NSF IBN-0919747, grantu fundacji March of Dimes 1-FY04-107 oraz grantu fundacji March of Dimes 1-FY08-464 (przyznanego B.L.F). M.K.K. oraz C.G.L. otrzymali wsparcie z grantu szkoleniowego NIH Biotechnology Training Grant T32 GM008339-20, a C.G.L. otrzymał również stypendium przeddoktoranckie NJ Commission on Spinal Cord Research 08-2941-SCR-E-0.

1. Przed rozpoczęciem:
1) Disekcja szczura w 18. dniu embrionalnym (E18):
Standardowe metody preparowania neuronów hipokampa E18 zostały opisane wcześniej13. Aby wykorzystać program Bonfire do analizy cech morfologicznych neurytów, należy uzyskać 8-bitowe obrazy .tif pojedynczych neuronów. Można to osiągnąć na kilka sposobów, w zależności od stosowanego protokołu eksperymentalnego. Neurony można wysiać z odpowiednio niską gęstością, tak aby w polu widzenia mikroskopu pojawiły się pojedyncze komórki. Alternatywnie, w celu obrazowania pojedynczych neuronów hodowanych w gęstej kulturze, można przeprowadzić transfekcję neuronów za pomocą różnych metod z wykorzystaniem plazmidu kodującego białko fluorescencyjne.
2) Wymagania dotyczące oprogramowania i instalacja:
<ol class="ualpha">
<li>Aby uruchomić program Bonfire, należy zainstalować zarówno wtyczkę NeuronJ do oprogramowania ImageJ z NIH, jak i program NeuronStudio. Pakiety oprogramowania można znaleźć na następujących stronach internetowych: 

	ImageJ - <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> 
	NeuronJ - <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> 
	NeuronStudio - <a href="http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html</a>
</li>
<li>Program Bonfire znajduje się pod adresem http://lifesci.rutgers.edu/~firestein. Pod tym adresem dostępna jest również instrukcja obsługi Bonfire. Ponadto pierwotny opis programu Bonfire można znaleźć w publikacji Langhammer et al, Cytometry 2010. Wszystkie nasze dane zostały przeanalizowane z wykorzystaniem systemu operacyjnego Windows.</li>
</ol>
3) Regulacja rozdzielczości obrazu: 
Należy dostosować program Bonfire do rozdzielczości obrazów, które mają zostać poddane analizie. W sekcji bonfire_parameters programu Bonfire należy zastąpić aktualną wartość zmiennej pix_conv wartością rozdzielczości obrazu (μm/pixel) dla używanych obrazów.

2. Struktura plików:

Aby program Bonfire mógł przeanalizować dane, pliki muszą być zorganizowane zgodnie z następującą strukturą (Rysunek 2). Będziesz posiadać:
<ul>
<li>Folder główny</li>
<li>Podfoldery (zawierające każdą z Twoich różnych warunków</li>
<li>Pliki obrazów komórek (pliki filename.tif) znajdujące się w folderach poszczególnych warunków</li>
<li>Folder Bonfire zawierający pliki mfiles Bonfire Matlab (znajdujący się również w folderze głównym)</li>
</ul>
3. Śledzenie neuronów w programie NeuronJ:
<ol>
<li>Przygotowanie obrazu do obrysowywania
<ol class="lalpha">
<li>Otwórz obraz, klikając przycisk „Open” na pasku narzędzi NeuronJ i wybierając obraz, który chcesz obrysować.</li>
<li>Zmień rozmiar obrazu, wybierając przycisk „maximize”.</li>
<li>Dostosuj jasność i kontrast obrazu, aby umożliwić wizualizację wszystkich neurytów, wybierając opcję „Image” na pasku narzędzi NeuronJ, a następnie „Adjust brightness/contrast”.</li></ol></li>
<li>Obrysowanie ciała komórki w programie NeuronJ i zidentyfikowanie obrysu jako „Type 06”
<ol class="lalpha">
<li>Wybierz przycisk „Add Traces” na pasku narzędzi NeuronJ.</li>
<li>Obrysuj obwód ciała komórki.</li>
<li>Wybierz przycisk „Label Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.</li>
<li>Z rozwijanego menu „Tracing ID” wybierz „N1”.</li>
<li>W oknie NeuronJ: Attributes wybierz „Type 06”, a następnie kliknij „OK”.</li>
</ol></li>
<li>Obrysowywanie neurytów w programie NeuronJ
<ol class="lalpha">
<li>Wybierz przycisk „Add Traces” na pasku narzędzi NeuronJ.</li>
<li>Dodaj obrys wzdłuż każdej gałęzi neurytu. W zależności od eksperymentu można wybrać tylko dendryty lub akson.</li>
<li>Zaleca się, aby rysowane segmenty kończyły się na każdym punkcie rozgałęzienia, a każda gałąź potomna zaczynała się w tym punkcie jako nowy obrys.</li>
<li>Wybierz przycisk „Save Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.</li>
<li>Zapisz utworzony obrys w tym samym folderze, w którym znajduje się oryginalny plik obrazu.</li>
</ol></li>
<li>Eksport plików obrysów i pliku identyfikatora obrysu z programu NeuronJ 
Z programu NeuronJ należy wyeksportować dwa typy plików i zapisać je w odpowiednich folderach z warunkami, obok plików .tif i .ndf.
<ol class="lalpha">
<li>Wybierz przycisk „Export Trace” na pasku narzędzi NeuronJ.</li>
<li>W oknie dialogowym „NeuronJ: Export” wybierz opcję „Tab-deliminated text-files: separate file for each tracing”, a następnie kliknij „OK”.</li>
<li>Pozwól programowi NeuronJ wybrać nazwy plików oraz lokalizację zapisu.</li>
<li>Wybierz przycisk „Measure Tracings” na pasku narzędzi NeuronJ.</li>
<li>W oknie „NeuronJ: Measurements” wybierz opcję „Display tracing measurements”, a następnie kliknij „Run”.</li>
<li>W oknie „NeuronJ: Tracings” wybierz „File”.</li>
<li>Wybierz „Save As” i zapisz plik jako filename_info. „filename” musi być identyczny z nazwą oryginalnego pliku obrazu (w tym z wielkością liter), po której następuje _info; nazwa nie powinna zawierać 3-literowego rozszerzenia pliku. Na przykład dla oryginalnej nazwy obrazu Cell20.tif, plik ten zostanie nazwany „Cell20_info”. Upewnij się, że komputer nie dodaje automatycznie rozszerzenia pliku .xls. Jeśli tak się stanie, rozszerzenie pliku należy usunąć ręcznie.</li>
</ol></li>
</ol>
4. Użycie programu Bonfire do zbudowania wstępnych plików .swc na podstawie danych z NeuronJ:
<ol>
<li>Reorganizacja folderów za pomocą funkcji 'bonfire_load'
<ol class="lalpha">
<li>Otwórz program Matlab, klikając dwukrotnie w ikonę.</li>
<li>Kliknij przycisk ' ' w prawym górnym rogu okna poleceń.</li>
<li>W oknie „Browse For Folder” wybierz folder 'Bonfire' w folderze głównym.</li>
<li>Wpisz 'bonfire_load' w oknie poleceń Matlab i naciśnij enter.</li>
<li>W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z warunkiem, który chcesz przeanalizować, a następnie wybierz 'OK'.</li>
<li>Doprowadzi to do reorganizacji struktury folderów poprzez utworzenie podfolderów komórek zawierających wszystkie dane dla każdej poszczególnej komórki.</li>
</ol></li>
<li>Tworzenie plików filename_prelim.swc za pomocą funkcji 'bonfire_ndf2swc'
<ol class="lalpha">
<li>Wpisz 'bonfire_ndf2swc' w oknie poleceń i naciśnij enter.</li>
<li>W oknie „Browse For Folder” wybierz ten sam folder z warunkiem, który przed chwilą zreorganizowano za pomocą 'bonfire_load', a następnie wybierz 'OK'.</li>
<li>Spowoduje to utworzenie pliku .swc w każdym folderze komórki dla wybranego warunku. Każdy folder komórki będzie teraz zawierać 5 plików: oryginalny obraz .tif, plik .ndf, plik identyfikatora śladu _info, plik .txt oraz plik .swc.</li>
</ol></li></ol>
5. Użycie NeuronStudio do sfinalizowania plików .swc:
<ol>
<li>Otwieranie i kalibracja obrazów neuronów w programie NeuronStudio
<ol class="lalpha">
<li>Uruchom program NeuronStudio.</li>
<li>W pasku narzędzi NeuronStudio wybierz File→Open.</li>
<li>Znajdź obraz neuronu w formacie .tif, który chcesz edytować, i otwórz go.</li>
<li>Wybierz Run→Settings i wpisz „1” w każdym z 3 pól (X, Y, Z) w oknie „Voxel Size”.</li>
<li>Wybierz File→Import SWC. Wybierz odpowiedni plik .swc. Na obrazie pojawi się nałożony ślad (trace). Ciało komórki (soma) powinno być oznaczone czerwonym okręgiem.</li>
</ol></li>
<li>Użycie programu NeuronStudio do łączenia neurytów
<ol class="lalpha">
<li>Użyj narzędzi w NeuronStudio, aby prawidłowo zidentyfikować punkty rozgałęzień i punkty końcowe (zalecamy zapoznanie się z funkcjami i skrótami klawiszowymi NeuronStudio przed analizą danych).</li>
<li>W szczególności użyj narzędzia „neurite tool”, aby łączyć węzły w taki sposób, by:
<ul>
<li>każdy punkt rozgałęzienia (żółte węzły) tworzył tylko dwie gałęzie,</li>
<li>wszystkie ślady były ciągłe i połączone z somą (tylko jeden czerwony węzeł).</li>
</ul></li>
</ol></li>
<li>Eksport danych z NeuronStudio
<ol class="lalpha">
<li>Wybierz File→Save Neurites (zapisz pod domyślną nazwą).</li>
</ol></li>
<li>Sprawdzanie błędów w plikach .swc za pomocą funkcji „bonfire_trace_check”
<ol class="lalpha">
<li>Wpisz „bonfire_trace_check” w oknie poleceń programu Matlab i naciśnij enter.</li>
<li>W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z warunkiem zawierający dane, które właśnie przetworzyłeś, a następnie zatwierdź wybór przyciskiem „OK”.</li>
<li>Jeśli w którymkolwiek z obrazów w folderze wystąpią błędy, program wygeneruje obrazy wskazujące lokalizację błędu.</li>
<li>Naprawianie błędów w NeuronStudio:
<ol class="lroman">
<li>Otwórz plik obrazu zapisany na etapie eksportu.</li>
<li>Zlokalizuj i napraw problem(y).</li>
<li>Kliknij File→Save Neurites.</li>
<li>Powtórz czynność dla pozostałych obrazów wymagających poprawy.</li>
<li>Ponownie uruchom „bonfire_trace_check” (punkt 5.4).</li>
</ol></li></ol></li></ol>
6. Użycie programu „bonfire” do wyodrębnienia danych morfologicznych z plików .swc:
<ol class="lalpha">
<li>Wpisz polecenie 'bonfire' w oknie komend i naciśnij enter.</li>
<li>W oknie 'Browse For Folder' wybierz folder z warunkami zawierający dane, które chcesz przeanalizować, a następnie kliknij 'OK'.</li>
<li>Analiza Bonfire wygeneruje okno dla każdego z analizowanych neuronów, w którym zostanie przedstawiony wykres morfologii neuronalnej wraz z pierścieniami Sholla wykorzystanymi w analizie. Dodatkowo polecenie 'bonfire' utworzy plik .mat zawierający wszystkie informacje morfologiczne uzyskane z analizy.</li>
</ol>
7. Użyj 'bonfire_results', aby wyświetlić dane:
<ol class="lalpha">
<li>Wpisz 'bonfire_results' w oknie poleceń programu Matlab.</li>
<li>W oknie 'Browse For Folder' wybierz folder z warunkiem, który chcesz wyświetlić, a następnie zatwierdź przyciskiem 'OK'.</li> 
<li>Okno 'Browse for Folder' zostanie tymczasowo zamknięte i otworzy się ponownie, umożliwiając wybór dodatkowych warunków do wyświetlenia.</li>
<li>Po zakończeniu wyboru folderów z warunkami wybierz 'Cancel', aby wyjść z procesu selekcji.</li>
<li>Funkcja 'Bonfire_results' wygeneruje wykresy podsumowujące, zawierające dane z wybranych folderów z warunkami.</li>
</ol>
8. Użyj funkcji „bonfire_export”, aby wyeksportować dane do programu Excel:
<ol class="lalpha">
<li>Wpisz polecenie 'bonfire_export' w oknie wiersza poleceń.</li>
<li>W oknie „Browse For Folder” wybierz folder z warunkami zawierający dane, które chcesz wyeksportować, a następnie zatwierdź przyciskiem „OK”. Narzędzie Bonfire_export utworzy pliki Excel z danymi morfologicznymi i zapisze je w wybranym folderze z warunkami.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki:
Przykład danych wygenerowanych przez program Bonfire dla zestawu danych obejmującego dwa warunki przedstawiono w Rycina 3W tym przykładzie neurony w warunkach 1 (Condition 1) posiadają więcej neurytów dystalnie względem ciała komórki. Zjawisko to można zaobserwować na obrazach przykładów (Rysunek 3B) a także na krzywej Sholla całkowitego drzewa dendrytycznego (Rycina 3A) oraz na wykresie liczby punktów końcowych (Rysunek 3C). Ponadto, ponieważ program Bonfire przeprowadza również analizę Sholla w obrębie podregionów obrazów, jesteśmy w stanie dokładniej zidentyfikować rodzaj neurytów, których liczba uległa zwiększeniu. Zarówno całkowita liczba przecięć 3rd neurytów rzędu lub większego (Rycina 3F) oraz całkowita liczba neurytów pośrednich i końcowych (Rycina 3G) zwiększają się dystalnie w stosunku do ciała komórki. Tendencje te można zaobserwować również w Ryciny 3D i 3E.
<img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig1.jpg" alt="Schemat procesu śledzenia neuronów z użyciem NeuronJ, Bonfire i NeuronStudio; analiza morfologii komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat blokowy programu Bonfire. Neurony są śledzone przy użyciu ImageJ. Następnie dane są eksportowane i konwertowane przez program Bonfire do wstępnych plików .swc. Program NeuronStudio służy do definiowania łączności neurytów. Bonfire sprawdza występowanie błędów, a następnie oblicza krzywe Sholla, liczbę neurytów pierwotnych, wtórnych i wyższego rzędu oraz liczbę punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Na koniec dane są eksportowane do programu Excel w celu przeprowadzenia analizy statystycznej.
<img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig2.jpg" alt="Struktura katalogów plików dla przechowywania danych eksperymentalnych, pokazująca foldery i pliki .tif w systemie Windows." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Struktura plików wymagana do analizy w programie Bonfire. Struktura plików musi być zgodna z przedstawioną, w przeciwnym razie program nie będzie działał poprawnie. Nazwy folderów i plików oraz ich liczba mogą zostać zmienione.
<img src="/files/ftp_upload/2354/2354fig3.jpg" alt="Wykresy analizy Sholla, schematy rozgałęzień neuronów, porównanie danych, wyniki eksperymentalnej neuronauki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykładowe dane wyjściowe z programu Bonfire. A) Całkowite krzywe Sholla. B) Przykład odwróconych obrazów dla obu warunków. C) Średnia liczba punktów rozgałęzień i punktów końcowych na komórkę. D) Średnia liczba wypustek na komórkę dla neurytów pierwotnych, wtórnych oraz trzeciorzędowych lub wyższych. E) Średnia liczba wypustek na komórkę dla neurytów korzeniowych, pośrednich i końcowych. F) Krzywe analizy Sholla specyficzne dla tożsamości segmentów. Segmenty są pogrupowane jako pierwotne, wtórne lub trzeciorzędowe i wyższe. G) Krzywe analizy Sholla specyficzne dla tożsamości segmentów. Segmenty są pogrupowane jako segmenty korzeniowe, segmenty pośrednie lub segmenty końcowe.

<ol><li>Elston, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+cells+of+the+frontal+lobe%3A+all+the+more+spinous+to+think+with%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pyramidal cells of the frontal lobe: all the more spinous to think with.</a> J Neurosci. 20, (2000).</li>
<li>Koch, C., Segev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+single+neurons+in+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of single neurons in information processing.</a> Nat Neurosci. , Suppl 3. 1171-1177 (2000).</li>
<li>Poirazi, P., Mel, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+active+dendrites+and+structural+plasticity+on+the+memory+capacity+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Impact of active dendrites and structural plasticity on the memory capacity of neural tissue.</a> Neuron. 29, 779-796 (2001).</li>
<li>Schaefer, A. T., Larkum, M. E., Sakmann, B., Roth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+detection+in+pyramidal+neurons+is+tuned+by+their+dendritic+branching+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Coincidence detection in pyramidal neurons is tuned by their dendritic branching pattern.</a> J Neurophysiol. 89, 3143-3154 (2003).</li>
<li>Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+action+potentials+in+dendrites+depends+on+dendritic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology.</a> J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).</li>
<li>Hausser, M., Spruston, N., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+dynamics+of+dendritic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diversity and dynamics of dendritic signaling.</a> Science. 290, 739-744 (2000).</li>
<li>Brette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulation+of+networks+of+spiking+neurons%3A+a+review+of+tools+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Simulation of networks of spiking neurons: a review of tools and strategies.</a> J Comput Neurosci. 23, 349-398 (2007).</li>
<li>Arendt, T., Zvegintseva, H. G., Leontovich, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+changes+in+the+basal+nucleus+of+Meynert+and+in+the+diagonal+band+nucleus+in+Alzheimer%27s+disease--a+quantitative+Golgi+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic changes in the basal nucleus of Meynert and in the diagonal band nucleus in Alzheimer's disease--a quantitative Golgi investigation.</a> Neuroscience. 19, 1265-1278 (1986).</li>
<li>Harrison, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology+of+schizophrenia.+A+critical+review+of+the+data+and+their+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation.</a> Brain. 122, 593-624 (1999).</li>
<li>Lewis, D. A., Glantz, L. A., Pierri, J. N., Sweet, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cortical+glutamate+neurotransmission+in+schizophrenia%3A+evidence+from+morphological+studies+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Altered cortical glutamate neurotransmission in schizophrenia: evidence from morphological studies of pyramidal neurons.</a> Ann N Y Acad Sci. 1003, 102-112 (2003).</li>
<li>Kaufmann, W. E., Moser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+anomalies+in+disorders+associated+with+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation.</a> Cereb Cortex. 10, 981-991 (2000).</li>
<li>Georges, P. C., Hadzimichalis, N. M., Sweet, E. S., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+dendrite+morphology%3A+unity+of+actin+and+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of dendrite morphology: unity of actin and microtubules.</a> Mol Neurobiol. 38, 270-284 (2008).</li>
<li>Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cypin%3A+a+cytosolic+regulator+of+PSD-95+postsynaptic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cypin: a cytosolic regulator of PSD-95 postsynaptic targeting.</a> Neuron. 24, 659-672 (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów. Agencje finansujące nie brały udziału w opracowaniu Bonfire od strony naukowej.

Program Bonfire jest programem półautomatycznym służącym do analizy morfologii dendrytów i aksonów. Znacznie zwiększa on wydajność i dokładność analizy Sholla w porównaniu do przeprowadzania tej analizy ręcznie. Ponadto program Bonfire zapisuje dane na każdym etapie procesu, co umożliwia audyt danych oraz weryfikację dokładności analizy. Dzięki temu zadanie analizy danych można rozdzielić pomiędzy wiele osób bez utraty precyzji. Wreszcie, poprzez przeprowadzanie analizy w podregionach obrazów, program jest w stanie ziden...

<table><tbody><tr><td>Wtyczka NeuronJ</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Program Bonfire</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://lifesci.rutgers.edu/%7Efirestein">http://lifesci.rutgers.edu/~firestein&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>NeuronStudio</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html">http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Program MatLab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana analiza sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Morfologia neuronalna odgrywa istotną rolę w określaniu sposobu, w jaki neurony funkcjonują i komunikują się ze sobą1-3. W szczególności wpływa ona na zdolność neuronów do odbierania sygnałów z innych komórek2 oraz przyczynia się do propagacji potencjałów czynnościowych4,5. Morfologia neurytów wpływa również na sposób przetwarzania informacji. Różnorodność morfologii dendrytów ułatwia sygnalizację lokalną i dalekosiężną, umożliwiając pojedynczym neuronom lub grupom neuronów pełnienie wyspecjalizowanych funkcji w obrębie sieci neuronalnej6,7. Zmiany w morfologii dendrytów, w tym fragmentacja dendrytów oraz zmiany w wzorcach rozgałęzień, zostały zaobserwowane w wielu stanach chorobowych, w tym w chorobie Alzheimera8, schizofrenii9,10 oraz w opóźnieniu rozwoju intelektualnego11. Zdolność zarówno do zrozumienia czynników kształtujących morfologię dendrytów, jak i do identyfikacji zmian w tej morfologii, jest niezbędna dla zrozumienia funkcji i dysfunkcji układu nerwowego.
Morfologię neurytów często analizuje się za pomocą analizy Sholla oraz poprzez zliczanie liczby neurytów i liczby zakończeń gałęzi. Analizę tę stosuje się zazwyczaj do dendrytów, ale można ją również zastosować do aksonów. Przeprowadzanie tej analizy ręcznie jest czasochłonne i nieuchronnie wprowadza zmienność wynikającą z błędu eksperymentatora i braku spójności. Program Bonfire jest półautomatycznym podejściem do analizy morfologii dendrytów i aksonów, opartym na dostępnych narzędziach do analizy morfologicznej z otwartym kodem źródłowym. Nasz program umożliwia wykrywanie lokalnych zmian w zachowaniu rozgałęzień dendrytów i aksonów poprzez wykonywanie analizy Sholla w podregionach drzewa neurytów. Na przykład analiza Sholla jest przeprowadzana zarówno dla całego neuronu, jak i dla każdego podzbioru wypustek (pierwotnych, wtórnych, terminalnych, korzeniowych itp.). Na wzorce rozgałęzień dendrytów i aksonów wpływa szereg czynników wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, z których wiele działa lokalnie. W związku z tym wynikająca morfologia drzewa jest efektem specyficznych procesów oddziałujących na konkretne neuryty, co sprawia, że konieczne jest przeprowadzenie analizy morfologicznej w mniejszej skali, aby zaobserwować te lokalne wariacje12.
Program Bonfire wymaga użycia dwóch otwartoźródłowych narzędzi analitycznych: wtyczki NeuronJ do programu ImageJ oraz programu NeuronStudio. Neurony są śledzone w ImageJ, a NeuronStudio służy do definiowania łączności między neurytami. Bonfire zawiera szereg niestandardowych skryptów napisanych w języku MATLAB (MathWorks), które są wykorzystywane do konwersji danych do odpowiedniego formatu w celu dalszej analizy, sprawdzania błędów użytkownika, a ostatecznie do przeprowadzenia analizy Sholla. Na koniec dane są eksportowane do programu Excel w celu przeprowadzenia analizy statystycznej. Schemat blokowy programu Bonfire przedstawiono na Ryc. 1.

Opracowaliśmy program komputerowy do analizy morfologii neuronów. W połączeniu z dwoma istniejącymi narzędziami analitycznymi o otwartym kodzie źródłowym, nasz program przeprowadza analizę Sholla oraz określa liczbę neurytów, punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Analizy są wykonywane w taki sposób, aby można było obserwować lokalne zmiany w morfologii neurytów.

Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach

Morfologia neuronalna odgrywa istotną rolę w określaniu sposobu funkcjonowania i komunikacji neuronów1-3. W szczególności wpływa ona na zdolność neuronów do ...

W niniejszym materiale wideo przedstawiono procedurę analizy morfologii dendrytów i aksonów, określanych zbiorczo mianem neurytów, z wykorzystaniem programu półautomatycznego w celu obserwacji zmian lokalnych. W pierwszej kolejności wykorzystuje się oprogramowanie neuron J do śledzenia ośmiobitowych obrazów neuronów w formacie TIFF, aby zidentyfikować położenie segmentów neurytów. Następnie używa się oprogramowania Neuron studio do zdefiniowania informacji strukturalnych dotyczących połączeń między neurytami.Na koniec uruchamiany jest program bonfire w środowisku MATLAB w celu wyekstrahowania danych morfologicznych z komórek, w tym analizy shoal, a także liczby punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Wyniki wykazują lokalne zmiany w morfologii neurytów na podstawie analizy shoal przeprowadzanej na podregionach drzewa neurytowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ręczna analiza shoal, jest półautomatyczny charakter programu, co znacznie zwiększa wydajność analizy i umożliwia audyt danych w celu weryfikacji dokładności analizy.Procedurę zademonstruje Hirsch AWA, student studiów licencjackich pracujący latem w laboratorium Firesteina. Aby móc wykorzystać program bonfire do analizy cech morfologicznych neurytów na obrazach TIFF w formacie 8-bitowym, należy najpierw pobrać program bonfire, a następnie uzyskać obrazy pojedynczych neuronów. Ustawienia programu muszą zostać dostosowane do rozdzielczości obrazów przeznaczonych do analizy; w sekcji parametrów programu bonfire należy zastąpić aktualną wartość zmiennej picks conversion wartością rozdzielczości posiadanych obrazów.Aby program bonfire mógł przeanalizować dane, pliki muszą być zorganizowane według określonej struktury, obejmującej folder główny, folder bonfire zawierający pliki MATLAB M programu bonfire, podfoldery dla każdego z różnych wariantów badawczych oraz pliki obrazów komórek wewnątrz folderów poszczególnych wariantów. Należy rozpocząć od przygotowania obrazu do śledzenia. W tym eksperymencie śledzone będą wyłącznie dendryty w celu analizy zmian w morfologii dendrytycznej. Rozpocznij od przygotowania obrazu do śledzenia.Otwórz obraz, wybierając przycisk open na pasku narzędzi neuron J, a następnie wybierz obraz, który chcesz obrysować. Teraz zmień rozmiar obrazu, wybierając przycisk maximize, aby dostosować jasność i kontrast obrazu w taki sposób, by możliwe było zwizualizowanie wszystkich neurytów; wybierz image na pasku narzędzi neuron J, a następnie wybierz adjust brightness contrast. Aby rozpocząć obrysowywanie, wybierz przycisk add traces na pasku narzędzi neuron J. Obrysuj obwód ciała komórki.Następnie wybierz przycisk label tracings na pasku narzędzi neuron J i wybierz N one z rozwijanego menu tracing ID, wybierz typ zero six w oknie atrybutów neuron J i zatwierdź przyciskiem Okay. Aby rozpocząć śledzenie neurytów, wybierz przycisk add traces na pasku narzędzi neuron J i dodaj ślad wzdłuż każdej interesującej gałązki neurytu. Najlepiej jest, aby rysowane segmenty kończyły się w każdym punkcie rozgałęzienia, a każda gałąź potomna rozpoczynała się w tym punkcie jako nowy ślad.Wybierz przycisk zapisu obrysów (save tracings) na pasku narzędzi programu neuron J i zapisz utworzony właśnie obrys w tym samym folderze, w którym znajduje się oryginalny plik obrazu. Następnie wyeksportuj pliki obrysów oraz pliki identyfikatorów obrysów z programu neuron J. Wybierz przycisk eksportu obrysów (export trace) na pasku narzędzi neuron J. Teraz w oknie dialogowym eksportu neuron J wybierz opcję plików tekstowych rozdzielonych tabulatorami w osobnych plikach dla każdego obrysu (tab delimited text files separate file for each tracings) i zatwierdź przyciskiem OK, pozwalając programowi neuron J na automatyczny wybór nazw plików oraz miejsca zapisu.Wybierz przycisk measure tracings na pasku narzędzi neuron J, a następnie wybierz opcję display tracings measurements w oknie pomiarów neuron J i kliknij run. Wybierz Select file w oknie śladów neuron J, a następnie wybierz save as i zapisz plik. Nazwa pliku musi być dokładnie taka sama jak nazwa oryginalnego pliku obrazu, po której następuje podkreślnik info, i nie powinna zawierać trzyletniego rozszerzenia pliku. Upewnij się, że komputer nie dodaje automatycznie rozszerzenia pliku XLS.Jeśli tak, rozszerzenie pliku musi zostać usunięte ręcznie. Najpierw zreorganizuj foldery za pomocą funkcji bonfire load, otwierając program MATLAB i klikając przycisk trzech kropek w prawym górnym rogu okna poleceń. Wybierz folder bonfire w swoim folderze głównym w oknie przeglądania folderów, wpisz bonfire load w oknie poleceń i naciśnij enter.W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem, który chcesz przeanalizować, i zatwierdź wybór przyciskiem OK. Spowoduje to reorganizację struktury folderów poprzez utworzenie podfolderów komórek zawierających wszystkie dane dla każdej poszczególnej komórki. Aby teraz utworzyć pliki bonfire_NDF2sWC w formacie filename_premium.swc, wpisz bonfire_NDF2sWC w oknie poleceń i naciśnij enter.W oknie przeglądania folderów wybierz ten sam folder warunków, który został właśnie zreorganizowany za pomocą bonfire load, a następnie zatwierdź wybór. Spowoduje to utworzenie pliku WC w każdym folderze komórek dla wybranej warunki. Każdy folder komórek będzie zawierał pięć plików.Oryginalny obraz TIF, plik NDF, plik z informacjami podkreślenia, plik identyfikatora śladu, plik TXT oraz plik swc. Przed rozpoczęciem korzystania z programu Neuron Studio zalecamy zapoznanie się z jego funkcjami i skrótami klawiszowymi. Program posiada doskonałą internetową instrukcję obsługi, a znajomość skrótów klawiatury pozwoli zaoszczędzić dużo czasu.Aby rozpocząć, otwórz program Neuron Studio i wybierz opcję otwierania pliku na pasku narzędzi Neuron Studio, odszukaj obraz TIF neuronu, który chcesz edytować, i otwórz go. Wybierz ustawienia uruchamiania (run settings) i wprowadź wartość 1 w każdym z trzech pól.W oknie rozmiaru woksela wybierz opcję importu pliku s wc. Wybierz odpowiedni plik s WC, który odpowiada plikowi, nad którym chcesz pracować. Plik obrazu zostanie teraz nałożony na obraz śladu.Ciało komórki powinno zostać zaznaczone czerwonym okręgiem w celu powiązania neurytów. Użyj narzędzia do neurytów, aby połączyć węzły w taki sposób, aby każdy punkt rozgałęzienia reprezentowany przez żółte węzły tworzył tylko dwie gałęzie. Wszystkie ślady muszą być ciągłe i połączone z ciałem komórki.Aby wyeksportować dane z programu Neuron Studio, należy wybrać plik, zapisać neuryty i zapisać je pod domyślną nazwą, aby sprawdzić błędy w plikach typu swc za pomocą polecenia bonfire trace. Wpisz to polecenie w oknie wiersza poleceń i naciśnij enter. W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem zawierający dane, które zostały właśnie przetworzone, a następnie zatwierdź wybór przyciskiem OK, aby sprawdzić, czy w którymkolwiek z obrazów w folderze występują błędy.Program wygeneruje obrazy wskazujące lokalizację błędu w celu wyekstrahowania danych morfologicznych z plików dot S WC. Wpisz bonfire w oknie poleceń i naciśnij enter. W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem, który chcesz przeanalizować, a następnie zatwierdź wybór dla każdego z interesujących nas neuronów.Analiza bonfire wygeneruje wykres morfologii neuronów wraz z pierścieniami ramion wykorzystanymi w analizie. Dodatkowo polecenie bonfire wygeneruje plik MAT zawierający wszystkie informacje morfologiczne uzyskane z analizy. Aby wyświetlić wstępne wykresy danych, wpisz bonfire w oknie poleceń MATLAB, wybierz w oknie przeglądania folderów folder z warunkiem, który chcesz przejrzeć, a następnie kliknij OK.Okno przeglądania folderów zamknie się tymczasowo, a następnie otworzy ponownie, umożliwiając wybór dodatkowych warunków. Po wybraniu warunków należy kliknąć przycisk anuluj, aby wyjść z procesu wyboru. Program Bonfire wyświetli wykresy podsumowujące, zawierające dane z wybranych folderów z warunkami; aby wyeksportować dane morfologiczne do programu Excel, należy wpisać polecenie bonfire Export w oknie poleceń programu MATLAB.W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem zawierający dane, które chcesz wyeksportować, i zatwierdź wybór przyciskiem OK. Funkcja eksportu programu bonfire utworzy pliki Excel z danymi morfologicznymi i umieści je w wybranym folderze z warunkiem. Teraz przedstawimy przykład danych wygenerowanych przez program bonfire dla zbioru danych zawierającego dwa warunki.Poniżej przedstawiono przykładowe odwrócone obrazy dla obu warunków. Na obrazach tych widać, że w warunku pierwszym znajduje się więcej dendrytów niż w warunku drugim. Zjawisko to można zaobserwować również na szeregu wykresów generowanych przez program bonfire.Ponieważ program bonfire przeprowadza analizę w podregionach dendrytów, zwiększoną liczbę dendrytów w warunkach pierwszych można łatwo zidentyfikować; wykreślenie krzywej Sholl dla całkowitego drzewa dendrytycznego wykazuje, że neurony w warunkach pierwszych mają więcej dendrytów w obszarach dystalnych względem ciała komórki. Wykreślenie średniej liczby punktów rozgałęzień i punktów końcowych na komórkę pokazuje, że w warunkach pierwszych występuje więcej zarówno punktów rozgałęzień, jak i punktów końcowych niż w warunkach drugich. Przedstawiono średnią liczbę wypustek na komórkę dla dendrytów rzędu pierwszego, drugiego, trzeciego lub wyższych. W warunkach pierwszych stwierdzono więcej dendrytów trzeciego i wyższych rzędów; wykreślenie średniej liczby wypustek na komórkę dla dendrytów korzeniowych, pośrednich i końcowych wykazuje, że w warunkach pierwszych znajduje się więcej wypustek pośrednich lub końcowych niż w warunkach drugich.Przedstawiono tutaj krzywe analizy shoal specyficzne dla tożsamości segmentów, w których segmenty zostały pogrupowane jako pierwotne, wtórne lub trzeciorzędne i wyższe. Wzrost liczby dendrytów trzeciorzędnych występuje dystalnie względem ciała komórki dla neuronów w warunkach pierwszych. Przedstawiono krzywe analizy shoal specyficzne dla tożsamości segmentów, w których segmenty zostały pogrupowane jako segmenty korzeniowe, segmenty pośrednie lub segmenty końcowe.Wzrost liczby dendrytów pośrednich i końcowych w wariancie pierwszym występuje dystalnie w stosunku do ciała komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania analizy shoal przy użyciu programu bonfire w celu obserwacji lokalnych zmian w neuromorfologii.

automated-sholl-analysis-digitized-neuronal-morphology-at-multiple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zautomatyzowana analiza Sholl skanowania zdigityzowanej morfologii neuronów w wielu skalach

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Tutaj pokazujemy, jak analizować dendrytyczne kierowanie neuronów rdzenia Drosophila w kolumnach i warstwach. Przepływ pracy obejmuje technikę obrazowania w podwójnym widoku w celu poprawy jakości obrazu oraz narzędzia obliczeniowe do śledzenia, rejestrowania trzpieni dendrytycznych do układu kolumn referencyjnych oraz do analizy struktur dendrytycznych w przestrzeni 3D.

Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach

Opisany potok jest przeznaczony do segmentacji zestawów danych mikroskopii elektronowej większych niż gigabajty, w celu wyodrębnienia morfologii całych komórek. Po zrekonstruowaniu komórek w 3D, dostosowane do indywidualnych potrzeb oprogramowanie może być wykorzystane do przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej bezpośrednio w 3D, wykorzystując również rzeczywistość wirtualną do pokonania okluzji widoku.

Metoda rekonstrukcji 3D i analizy w wirtualnej rzeczywistości komórek glejowych i neuronalnych

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Presented to narzędzie obliczeniowe, które umożliwia prosty i bezpośredni automatyczny pomiar orientacji gałęzi dendrytycznych neuronów na podstawie obrazów fluorescencyjnych 2D.

Automatyczna identyfikacja gałęzi dendrytycznych i ich orientacji

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Kolce dendrytyczne są postsynaptycznymi przedziałami większości synaps pobudzających. Zmiany w morfologii kolców dendrytycznych występują podczas rozwoju neurologicznego, starzenia się, uczenia się oraz wielu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, co podkreśla znaczenie wiarygodnej analizy kręgosłupa dendrytycznego. Protokół ten opisuje ilościowe określanie morfologii kolców dendrytycznych w sposób dokładny i powtarzalny przy użyciu oprogramowania do automatycznej trójwymiarowej...

Kwantyfikacja dendrytycznego kręgosłupa za pomocą automatycznego oprogramowania do trójwymiarowej rekonstrukcji neuronów

Testy wzrostu neurytów dostarczają ilościowej wartości na temat regeneracyjnych procesów neuronalnych. Zaletą tego półautomatycznego oprogramowania jest to, że segmentuje ciała komórek i neuryty oddzielnie, tworząc maskę i mierzy różne parametry, takie jak długość neurytów, liczba punktów rozgałęzień, obszar klastra komórka-ciało i liczba klastrów komórek.

Standaryzacja nowatorskiego półautomatycznego oprogramowania do pomiaru przyrostu neurytów

Poznaj zautomatyzowaną analizę Sholla morfologii neuronów przy użyciu programu Bonfire w MATLAB. Ta metoda pozwala badaczom obserwować lokalne zmiany w strukturze dendrytów i aksonów z większą wydajnością.

Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach

Przeglądaj więcej filmów