Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronalnej w wielu skalach

W tym filmie przedstawiono procedurę analizy morfologii dendrytów i aksonów, określanych wspólnie jako neuryty, z wykorzystaniem programu półautomatycznego w celu obserwacji zmian lokalnych. Najpierw używa się oprogramowania Neuron J do śledzenia ośmiobitowych obrazów neuronów w formacie TIFF, aby zidentyfikować położenie segmentów neurytów. Następnie wykorzystuje się oprogramowanie Neuron Studio do zdefiniowania informacji strukturalnych dotyczących połączeń między neurytami.

Na koniec uruchamia się program bonfire w środowisku MATLAB, aby wyekstrahować dane morfologiczne z komórek, w tym analizę shoal, a także liczbę punktów rozgałęzień neurytów i końcówek neurytów. Wyniki wykazują lokalne zmiany w morfologii neurytów na podstawie przeprowadzonej analizy shoal w podregionach drzewa neurytowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ręczna analiza shoal, jest półautomatyczny charakter programu, co znacznie zwiększa efektywność analizy i umożliwia audyt danych w celu weryfikacji dokładności przeprowadzonej analizy.

Procedurę zaprezentuje Hirsch AWA, student studiów licencjackich pracujący latem w laboratorium Firesteina. Aby móc wykorzystać program Bonfire do analizy charakterystyki morfologicznej neurytów na obrazach TIFF 8-bitowych, po pobraniu programu należy uzyskać obrazy poszczególnych neuronów. Ustawienia programu muszą zostać dostosowane do rozdzielczości obrazów, które zamierzają Państwo analizować; w sekcji parametrów programu Bonfire należy zastąpić aktualną wartość zmiennej picks conversion wartością rozdzielczości używanych obrazów.

Aby program bonfire mógł przeanalizować dane, pliki muszą być zorganizowane w określonej strukturze, obejmującej folder główny, folder bonfire zawierający pliki MATLAB M programu bonfire oraz podfoldery dla każdego z różnych warunków, przy czym pliki obrazów komórek powinny znajdować się w folderach poszczególnych warunków. Należy rozpocząć od przygotowania obrazu do śledzenia. W tym eksperymencie śledzone będą jedynie dendryty w celu analizy zmian w morfologii dendrytycznej. Rozpocznij od przygotowania obrazu do śledzenia.

Otwórz obraz, wybierając przycisk open na pasku narzędzi neuron J, a następnie wybierz obraz, który chcesz obrysować. Teraz zmień rozmiar obrazu, wybierając przycisk maximize, aby dostosować jasność i kontrast obrazu w taki sposób, aby wszystkie neuryty były widoczne; wybierz image na pasku narzędzi neuron J, a następnie wybierz adjust brightness contrast. Aby rozpocząć obrysowywanie, wybierz przycisk add traces na pasku narzędzi neuron J. Obrysuj obwód ciała komórki.

Następnie wybierz przycisk label tracings na pasku narzędzi neuron J, wybierz N jeden z rozwijanego menu tracing ID, wybierz typ zero six w oknie atrybutów neuron J i zatwierdź przyciskiem Okay. Aby rozpocząć kreślenie neurytów, wybierz przycisk add traces na pasku narzędzi neuron J i dodaj ślad wzdłuż każdej interesującej Cię gałęzi neurytu. Zaleca się, aby rysowane segmenty kończyły się w każdym punkcie rozgałęzienia, tak aby każda gałąź potomna zaczynała się od tego punktu jako nowy ślad.

Wybierz przycisk zapisu obrysów na pasku narzędzi programu NeuronJ i zapisz utworzony przed chwilą obrys w tym samym folderze, w którym znajduje się oryginalny plik obrazu. Następnie wyeksportuj pliki obrysów oraz pliki identyfikatorów obrysów z programu NeuronJ. Wybierz przycisk eksportu obrysów na pasku narzędzi NeuronJ. Teraz w oknie dialogowym eksportu NeuronJ wybierz opcję plików tekstowych rozdzielonych tabulatorami (osobny plik dla każdego obrysu) i zatwierdź przyciskiem OK, pozwalając programowi NeuronJ na wybranie nazw plików oraz lokalizacji zapisu.

Wybierz przycisk measure tracings na pasku narzędzi neuron J, a następnie wybierz opcję display tracings measurements w oknie pomiarów neuron J i kliknij run. Wybierz Select file w oknie śladów (tracings) neuron J, a następnie wybierz save as i zapisz plik. Nazwa pliku musi być dokładnie taka sama jak nazwa oryginalnego pliku obrazu, po której następuje podkreślnik oraz słowo info i nie powinna zawierać trzeliterowego rozszerzenia pliku. Upewnij się, że komputer nie dodaje automatycznie rozszerzenia pliku XLS.

Jeśli tak, rozszerzenie pliku należy usunąć ręcznie. W pierwszej kolejności zreorganizuj foldery za pomocą polecenia bonfire load, uruchamiając program MATLAB i klikając przycisk z trzema kropkami w prawym górnym rogu okna poleceń. W oknie przeglądania folderów wybierz folder bonfire w folderze głównym, wpisz bonfire load w oknie poleceń i naciśnij enter.

W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkami, które chcesz przeanalizować, i zatwierdź wybór przyciskiem OK. Spowoduje to reorganizację struktury folderów poprzez utworzenie podfolderów komórek zawierających wszystkie dane dla każdej poszczególnej komórki. Aby utworzyć pliki swc w formacie file name underscore premium, wpisz bonfire underscore NDF two s WC w oknie poleceń i naciśnij enter.

W oknie przeglądania folderów wybierz ten sam folder z warunkami, który został przed chwilą zreorganizowany za pomocą bonfire load, a następnie zatwierdź wybór przyciskiem OK. Spowoduje to utworzenie pliku WC w każdym folderze komórki dla wybranego warunku. Każdy folder komórki będzie zawierał pięć plików.

Oryginalny obraz TIF, plik NDF, informacje podkreślenia (underscore info), plik identyfikatora śladu, plik TXT oraz plik swc. Przed rozpoczęciem pracy z programem Neuron Studio zalecamy zapoznanie się z jego funkcjami i skrótami. Program posiada doskonałą internetową instrukcję obsługi, a znajomość skrótów klawiszowych pozwoli zaoszczędzić znaczną ilość czasu.

Aby rozpocząć, należy uruchomić program Neuron Studio i wybrać opcję otwórz plik na pasku narzędzi Neuron Studio, a następnie odnaleźć i otworzyć obraz TIF neuronu, który ma zostać poddany edycji. Wybierz ustawienia uruchamiania i wprowadź wartość 1 w każdym z trzech pól.

W oknie rozmiaru woksela wybierz opcję importu pliku s wc. Wybierz odpowiedni plik s WC, który odpowiada plikowi, nad którym chcesz pracować. Plik obrazu zostanie teraz nałożony na obraz śladu.

Ciało komórki (soma) powinno zostać pokryte czerwonym okręgiem w celu połączenia neurytów. Użyj narzędzia do neurytów, aby połączyć węzły w taki sposób, by każdy punkt rozgałęzienia reprezentowany przez żółte węzły tworzył tylko dwie odnogi. Wszystkie ślady muszą być ciągłe z somą.

Aby teraz wyeksportować dane z programu Neuron Studio, wybierz plik, zapisz neuryty i zapisz je pod domyślną nazwą, aby sprawdzić błędy w plikach typu swc za pomocą bonfire trace. Przejdź do okna poleceń i naciśnij enter. W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem zawierający dane, które zostały właśnie przetworzone, a następnie kliknij okay, jeśli w którymkolwiek z obrazów w folderze wystąpiły błędy.

Program wygeneruje obrazy wskazujące lokalizację błędów przy wyodrębnianiu danych morfologicznych z plików dot S WC. Wpisz bonfire w oknie wiersza poleceń i naciśnij enter. W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkami, które chcesz przeanalizować, a następnie zatwierdź wybór dla każdego z interesujących Cię neuronów.

Analiza bonfire wygeneruje wykres morfologii neuronów wraz z pierścieniami barkowymi wykorzystanymi w analizie. Dodatkowo, polecenie bonfire wygeneruje plik MAT zawierający wszystkie informacje morfologiczne uzyskane z analizy. Aby wyświetlić wstępne wykresy danych, wpisz bonfire w oknie poleceń MATLAB, a następnie w oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem, który chcesz wyświetlić, i kliknij OK.

Okno przeglądania folderów zostanie tymczasowo zamknięte i ponownie otwarte, umożliwiając wybór dodatkowych warunków. Po wybraniu warunków należy kliknąć przycisk anuluj, aby wyjść z procesu selekcji. Wyniki Bonfire wyświetlą wykresy podsumowujące, zawierające dane z wybranych folderów z warunkami; aby wyeksportować dane morfologiczne do programu Excel, należy wpisać polecenie bonfire Export w oknie poleceń programu MATLAB.

W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem zawierający dane, które chcesz wyeksportować, a następnie zatwierdź wybór. Program Bonfire Export utworzy pliki Excel z danymi morfologicznymi i umieści je w wybranym folderze warunku. Teraz przedstawimy przykład danych wygenerowanych przez program Bonfire dla zestawu danych zawierającego dwa warunki.

Są to przykładowe odwrócone obrazy dla obu warunków. Na obrazach tych widać, że warunek pierwszy zawiera więcej dendrytów niż warunek drugi. Zjawisko to można również zaobserwować na różnych wykresach generowanych przez program Bonfire.

Ponieważ program bonfire przeprowadza analizę w obrębie podregionów dendrytów, zwiększoną liczbę dendrytów w warunku pierwszym można łatwo zidentyfikować; wykreślenie krzywej Sholl dla całkowitego drzewa dendrytycznego wykazuje, że w neuronach z warunku pierwszego znajduje się więcej dendrytów oddalonych od ciała komórki. Wykres średniej liczby punktów rozgałęzień i punktów końcowych na komórkę pokazuje, że w warunku pierwszym występuje więcej zarówno punktów rozgałęzień, jak i punktów końcowych niż w warunku drugim. Przedstawiono średnią liczbę wypustek na komórkę dla dendrytów pierwotnych, wtórnych, trzeciorzędnych lub wyższych rzędów. W warunku pierwszym występuje więcej dendrytów trzeciorzędnych i wyższych rzędów; wykreślenie średniej liczby wypustek na komórkę dla dendrytów korzeniowych, pośrednich i końcowych wykazuje, że w warunku pierwszym znajduje się więcej wypustek pośrednich lub końcowych niż w warunku drugim.

Przedstawiono tutaj krzywe analizy shoal specyficzne dla tożsamości segmentów, w których segmenty pogrupowano jako pierwotne, wtórne lub trzeciorzędne bądź wyższe. Wzrost liczby dendrytów trzeciorzędnych występuje dystalnie względem ciała komórki dla neuronów w warunkach pierwszych. Przedstawiono krzywe analizy shoal specyficzne dla tożsamości segmentów, w których segmenty pogrupowano jako segmenty korzeniowe, segmenty pośrednie lub segmenty końcowe.

Wzrost liczby dendrytoków pośrednich oraz końcowych w stanie pierwszym zachodzi dystalnie względem ciała komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat przeprowadzania analizy shoal przy użyciu programu bonfire w celu obserwacji lokalnych zmian w neuromorfologii.