Western Blotting: przygotowanie próbki do wykrycia

Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie łatwości wykonania Western blot przy użyciu odpowiednich produktów. Po przygotowaniu próbki białka są rozdzielane na podstawie wielkości, a następnie przenoszone do fazy stałej. Białka są następnie badane za pomocą przeciwciał i wykrywane przy użyciu odpowiednich protokołów i wysokiej jakości opłacalnych odczynników dają lepsze wyniki western blotting.

Cześć, nazywam się Jesse Luhan, jestem naukowcem w EMD Chemicals w San Diego w Kalifornii. EMD jest spółką zależną Merck, KGAA w Dharm stat Germany. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę western blot.

Więc zacznijmy. Pierwszym krokiem w western blotting jest przygotowanie próbki. Przygotowanie próbki należy rozpocząć od granulowania komórek za pomocą wirowania na niskiej prędkości, np. przez pięć minut przy 2 500-krotności grawitacji.

Po odwirowaniu odcedź granulki komórek. Dobrze zawieś komórki w odczynniku do ekstrakcji białek cyto buster za pomocą 150 mikrolitrów na 10 do sześciu komórek. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie wiruj próbkę przez pięć minut przy 16 000 razy grawitacji w czterech stopniach Celsjusza po odwirowaniu. Przenieś oczyszczony SNA do nowej probówki i kontynuuj analizę. Po ocenie stężenia białka w próbce należy przygotować próbkę do napełnienia żelem w celu denaturacji białka.

Użyj buforu do próbek zawierającego oniczny, denaturujący detergent, taki jak siarczan sodu lub SDS. Gotuj mieszaninę w temperaturze od 95 do 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Korzystając z dostępnych na rynku prefabrykatów żelowych, białka można szybko oddzielić na podstawie masy cząsteczkowej.

Napełnij jednostkę do elektroforezy działającym buforem, który może być wykonany z odczynników oferowanych przez linię chemiczną Omni PU. Załaduj pierwszy pas studni markerem białkowym mieszanki szlaków. Marker ten posiada trzy pasma referencyjne, które pozwalają na monitorowanie podczas elektroforezy.

Po zabarwieniu żelu widocznych jest 10 pasm o wadze od 10 do 225 kilogramów daltonów. Załadować zdenaturowaną próbkę do pozostałych studzienek. Uruchom żel pod napięciem 220 woltów przez godzinę.

Po oddzieleniu białek wybarwić żel błękitem kumasi, aby upewnić się, że białka migrowały równomiernie i równomiernie, używając szybkiego barwienia i ultrawrażliwego barwnika, który jest gotowy do użycia bez DS. Barwienie jest wymagane, tak jak białka z ładunkiem elektrycznym mogą być indukowane do przemieszczania się przez żel w polu elektrycznym, tak więc białka mogą być przenoszone w polu elektrycznym z żelu na membranę, taką jak NITROCELULOZA lub PVDF. W przypadku stosowania membran PVDF należy zanurzyć membranę w metanolu na kilka minut, a następnie wyrównać w lodowatym buforze transferowym przez pięć minut. Namocz również żel przez kilka minut w lodowatym buforze transferowym, równowaga E zapobiega kurczeniu się żelu podczas przenoszenia.

Aby uzyskać transfer na mokro, złóż kanapkę z żelu i membrany między gąbką a papierem. Następnie mocno zaciśnij zespół razem, upewniając się, że między żelem a membraną nie utworzyły się pęcherzyki powietrza. Zanurz kanapkę w buforze transferowym i zastosuj pole elektryczne.

Ujemnie naładowane białka będą przemieszczać się w kierunku dodatnio naładowanej elektrody. Membrana następnie zatrzymuje je, wiąże i uniemożliwia im kontynuowanie. Po zakończeniu transferu wizualizuj białka, aby zapewnić równomierny transfer bez kieszeni powietrznych.

Można to łatwo zrobić za pomocą czerwonej plamy Western blot. Ta plama jest gotowa do użycia, a barwienie można łatwo wykonać za pomocą wody. Jest to żel, który po odcięciu przez mycie w wodzie, zanim będzie można udowodnić, że membrana ma przeciwciała, membrana jest zablokowana.

Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, zablokuj membranę wysokiej jakości odczynnikami blokującymi. Aby uniknąć zwiększonego tła, inkubuj ją w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem, a następnie po inkubacji umyj membranę trzykrotnie w TBST lub PBST. te można łatwo i wygodnie utworzyć za pomocą tabletów z klatkami pośrednimi TBS i PBS.

Po zablokowaniu i umyciu błony można ją inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym. Zastosuj przeciwciało pierwszorzędowe za pomocą roztworu, jednego ze wzmocnień sygnału, co pozwala na znaczne wzmocnienie sygnału. Przygotuj przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze pierwszym i inkubuj błonę przez godzinę.

Nie ma potrzeby dodawania kolejnych środków blokujących po inkubacji. Umyj membranę za pomocą TBST. Następnie inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze drugim wzmocnienia sygnału przez jedną godzinę.

Na koniec ponownie przemyj membranę kilka razy TBST dla sprzężonego HRP. Tradycyjnie stosuje się tu wykrywanie przeciwciał wtórnych za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji lub ECL. Stosuje się odczynnik ECL w szybkim kroku, ponieważ nie wymaga mieszania luminolu ani wzmacniacza.

Wystarczy spryskać membranę kilka razy, inkubować przez dwie minuty i wywołać ją za pomocą kliszy rentgenowskiej. Rapid Step oferuje niską czułość pikogramu, a także lżejszą misję do dwóch godzin po dodaniu substratu. Markery białkowe Trail Mix pozwalają na śledzenie białek podczas elektroforezy w porównaniu ze standardowymi protokołami Western blot.

Signal Boost pozwala na uzyskanie większego zakresu dynamiki i czułości. Wreszcie, lepszą czułość można uzyskać, stosując odczynniki Rapid step zamiast tradycyjnych odczynników ECL. Właśnie pokazaliśmy, jak skutecznie i ekonomicznie wykonać zachodnie zaślepienie za pomocą szerokiej gamy produktów.

Pamiętaj, że jakość Twoich wyników zależy od jakości Twoich odczynników. Otóż to. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.