Name: Western Blotting: przygotowanie próbki do wykrycia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj technikę Western blotting do wykrywania białek w próbkach tkanek, obejmującą przygotowanie próbki, elektroforezę i transfer na membranę. Metoda ta umożliwia badaczom analizę białek z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie próbek
Pierwszym krokiem w metodzie Western blotting jest przygotowanie próbek. Aby przygotować próbki do elektroforezy w żelu, komórki i tkanki muszą zostać poddane lizie w celu uwolnienia białek będących przedmiotem analizy.
<ul>
	<li>Wygodnym, gotowym do użycia odczynnikiem, który jest wszechstronny i łatwy w zastosowaniu do ekstrakcji białek rozpuszczalnych, jest CytoBuster lub PhosphoSafe. Bufory ekstrakcyjne te zawierają detergenty zoptymalizowane pod kątem wydajnej ekstrakcji białek rozpuszczalnych z komórek ssaków i owadów. Łagodny, niejonowy skład odczynnika do ekstrakcji białek CytoBuster umożliwia izolację funkcjonalnie aktywnych białek endogennych lub ekspresyjnych bez konieczności stosowania wtórnej obróbki, takiej jak sonikacja czy zamrażanie/rozmrażanie. PhosphoSafe posiada dodatkową zaletę w postaci zawartości czterech inhibitorów fosfataz.
<ol>
	<li>Osadź komórki poprzez wirowanie z niską prędkością (np. 5 min przy 2500 x g), a następnie dokładnie odlej nadsącz z osadu komórkowego.</li>
	<li>Resuspenduj komórki w odczynniku do ekstrakcji białek CytoBuster, stosując 150 μL na 106 komórek (optymalna ilość odczynnika do ekstrakcji białek CytoBuster może się różnić w zależności od wielkości komórek).</li>
	<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Przenieś do odpowiedniej probówki i wiruj przez 5 min przy 16,000 x g w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Przenieś klarowny nadsącz (ekstrakt komórkowy) do nowej probówki i przystąp do analizy.</li>
</ol>
</li>
	<li>Do specjalistycznej ekstrakcji białek zalecamy stosowanie naszych wysokiej jakości zestawów ProteoExtract. EMD oferuje ponad tuzin zestawów do izolacji mitochondriów, ekstrakcji proteomu subkomórkowego, ekstrakcji białek transbłonowych i wielu innych. Więcej szczegółów można znaleźć na naszej stronie głównej poświęconej metodzie Western blot.</li>
	<li>EMD sprzedaje również szeroką gamę zestawów koktajli inhibitorów proteaz i fosfataz. Zaraz po wystąpieniu lizy rozpoczynają się procesy proteolizy, defosforylacji i denaturacji. Zjawiska te można znacznie spowolnić, jeśli próbki są przez cały czas przechowywane w lodzie lub w temperaturze 4°C, a do buforu do lizy dodaje się świeże, odpowiednie inhibitory. Więcej szczegółów można znaleźć na naszej stronie głównej poświęconej metodzie Western blot.</li>
</ul>
2. SDS-PAGE
Drugim etapem analizy Western blotting jest rozdział białek. Białka są rozdzielane na podstawie masy cząsteczkowej.
<ul>
	<li>Można przygotować własny żel PAGE, jednak w tym przypadku będziemy korzystać z gotowego żelu w sprzedaży. 
	<ol>
		<li>Po przygotowaniu próbki można przystąpić do oznaczenia stężenia białek. EMD oferuje dwa zestawy do pomiaru stężenia: Non-Interfering Protein Assay Kit oraz BCA Protein Assay Kit.</li>
		<li>Po oznaczeniu stężenia białka próbka jest gotowa do nałożenia na żel. Przeciwciała zazwyczaj rozpoznają niewielką część interesującego nas białka (zwaną epitopem), a domena ta może znajdować się wewnątrz konformacji 3D białka. Aby umożliwić przeciwciałom dostęp do tej części, konieczne jest rozfałdowanie białka.</li>
		<li>W celu denaturacji należy użyć buforu do nakładania próbek z anionowym detergentem denaturującym – dodecylosiarczanem sodu (SDS), a następnie gotować mieszaninę w temperaturze 95-100°C przez 5 minut. Wygodnym i łatwym w użyciu buforem jest 4X Sample Buffer.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>W pierwszej studni należy nanieść marker białek Trail Mix Protein Marker. Marker ten posiada trzy pasma referencyjne, które pozwalają monitorować przebieg elektroforezy. Po zabarwieniu żelu widocznych jest 10 pasm w zakresie 10-225 kDa.</li>
	<li>Wypełnij komorę elektroforetyczną buforem do prowadzenia elektroforezy. W przypadku żeli PAGE jest to zazwyczaj 1X Tris-glycine. Szczegółowe przepisy na bufory znajdują się na stronie dotyczącej Western blottingu. EMD oferuje wysokiej jakości odczynniki buforowe w ramach linii chemicznej OmniPur. Prowadź elektroforezę przy napięciu 220V przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po rozdzieleniu białek zabarw żel błękitem Coomassie, aby upewnić się, że białka migrowały równomiernie i jednorodnie. RAPIDstain to ultrasensytywny barwnik gotowy do użycia, który nie wymaga odbarwiania.</li>
</ul>
3. Transfer białek
Podobnie jak białka posiadające ładunek elektryczny mogą być indukowane do przemieszczania się przez żel w polu elektrycznym, tak samo białka mogą być przenoszone w polu elektrycznym z żelu na membranę, wykonaną z PVDF lub nitrocelulozy.
<ul>
	<li>Dzisiaj przeprowadzimy transfer mokry. W transferze mokrym żel i membranę umieszcza się pomiędzy gąbką a papierem (gąbka/papier/żel/membrana/papier/gąbka), a następnie całość mocno zaciska, upewniając się, że między żelem a membraną nie powstały pęcherzyki powietrza. Tak przygotowany zestaw zanurza się w buforze do transferu, w którym przykłada się pole elektryczne. Ujemnie naładowane białka wędrują w kierunku dodatnio naładowanej elektrody, jednak membrana je zatrzymuje, wiąże i uniemożliwia dalszy ruch.</li>
	<li>Dostępne są dwa rodzaje membran: nitrocelulozowa oraz PVDF. Obie sprawdzają się dobrze. Dzisiaj będziemy używać PVDF. Membrany PVDF wymagają namoczenia w metanolu przez kilka minut, a następnie w lodowatym buforze do transferu przez 5 minut. Żel również musi być równoważony przez kilka minut w lodowatym buforze do transferu. Pominięcie tego kroku może spowodować skurczenie się żelu podczas transferu.</li>
	<li>Bufor do transferu mokrego to 1X Tris-glicyna z 20% metanolu. Szczegółowe instrukcje przygotowania buforów są dostępne na naszej stronie internetowej.</li>
	<li>Po zakończeniu transferu warto przeprowadzić wizualizację białek, aby upewnić się, że transfer przebiegł równomiernie i bez pęcherzyków powietrza. Można to łatwo zrobić za pomocą barwnika RedAlert Western Blot Stain. Barwnik ten jest gotowy do użycia, a proces odbarwiania można łatwo przeprowadzić w wodzie.</li>
</ul>
4. Przeciwciała i odczynniki pomocnicze
<ul>
	<li>Pierwszym krokiem w procesie wykrywania i wiązania przeciwciał z antygenem jest blokowanie membrany. Blokowanie membrany zapobiega niespecyficznemu wiązaniu w tle.</li>
	<li>Jako roztwór blokujący można zastosować mleko odtłuszczone lub BSA. Jednakże przy użyciu przeciwciał fosfospecyficznych nie zaleca się stosowania mleka, ponieważ powoduje ono wysokie tło.</li>
	<li>Firma EMD oferuje kilka wysokiej jakości odczynników blokujących, w tym SeaBlock, który jest niemammalicznym czynnikiem blokującym, oraz BLOT QuickBlocker, który jest gotowym do użycia czynnikiem blokującym. Oferujemy również wysokiej jakości BSA (frakcja V).
<ol>
	<li>Inkubuj membranę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym wytrząsaniu.</li>
	<li>Po inkubacji przemyj membranę trzy razy w TBST lub PBST. Łatwym i wygodnym sposobem przygotowania TBST lub PBST jest zastosowanie naszych tabletek (PBS TWEEN Tablets/TBS TWEEN Tablets).</li>
</ol>
</li>
	<li>Po zablokowaniu membrany można przystąpić do inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Od ponad 30 lat firma EMD oferuje kompleksowe portfolio wyjątkowych przeciwciał z najlepszą w branży gwarancją. Pamiętaj, że dla wszystkich przeciwciał EMD oferujemy pełną, 100% gwarancję bez ryzyka. Kup przeciwciało i zastosuj je dla dowolnej specyficzności gatunkowej lub w dowolnej aplikacji. Jeśli przeciwciało nie zadziała w sposób satysfakcjonujący, zapewnimy pełną kwotę kredytu do wykorzystania na dowolny inny produkt. Więcej szczegółów znajduje się na naszej stronie internetowej poświęconej Western blottingowi.
 <ol>
		<li>Dzisiaj inkubujemy przeciwciało pierwszorzędowe z użyciem roztworu 1 SignalBoost. SignalBoost to doskonały produkt, który pozwala na znaczne wzmocnienie sygnału. Wystarczy inkubować przeciwciało pierwszorzędowe w Roztworze 1 przez 1 godzinę lub zgodnie ze standardową procedurą. Nie ma potrzeby dodawania dalszych czynników blokujących. Alternatywnie można zastosować BSA lub odtłuszczone mleko w proszku jako czynnik blokujący.</li>
		<li>Przemyj membranę w TBST. Przygotowujemy TBST przy użyciu gotowych do rozpuszczenia tabletek TBST.</li>
		<li>Inkubuj przeciwciało drugorzędowe z użyciem roztworu 2 SignalBoost. Inkubuj przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym przez 1 godzinę. Ponownie przemyj membranę kilka razy w TBST.</li>
 </ol>
</li>
</ul>
5. Detekcja
W przypadku przeciwciał wtórnych koniugowanych z HRP tradycyjnie stosuje się ECL. Doskonałym odczynnikiem ECL, który oferujemy, jest RapidStep. Zaletą RapidStep jest brak konieczności mieszania luminoforu lub wzmacniacza. Wystarczy kilka razy spryskać membranę, a następnie przeprowadzić wywoływanie za pomocą filmu rentgenowskiego. RapidStep charakteryzuje się niską czułością pikoświetlną oraz emituje światło przez maksymalnie 2 godziny po dodaniu substratu.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

Autorzy Anna Eslami i Jesse Lujan są zatrudnieni przez firmę EMD Chemicals Inc, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.

W tej prezentacji wideo omówiliśmy główne etapy techniki Western blotting, którymi są: przygotowanie próbek, SDS-PAGE, blokowanie membrany/wykrywanie za pomocą przeciwciał oraz detekcja. Na każdym etapie procesu należy stosować odpowiednie protokoły i właściwe odczynniki, aby uzyskać wyniki wysokiej jakości.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; Odczynnik do ekstrakcji białek</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; Odczynnik do ekstrakcji</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Analiza białek bez wpływu substancji interferujących&amp;#8482; Zestaw</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania stężenia białek metodą BCA </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4X bufor do próbek SDS </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mieszanka studencka&amp;#8482; Markery białkowe</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Białko&amp;#8211;ekstrakt&amp;#8482; Zestawy do ekstrakcji białek</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;ekstrakt&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;ekstrakt&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;ekstrakt&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;ekstrakt&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; Produkty</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; Barwnik do Western blotting 10X</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; Odczynnik, osocze łososia</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego. Wykorzystuje ona elektroforezę żelową do rozdzielania białek natywnych lub zdenaturowanych na podstawie długości polipeptydu (w warunkach denaturujących) lub trójwymiarowej struktury białka (w warunkach natywnych/niedenaturujących). Następnie białka są przenoszone na membranę (zazwyczaj nitrocelulozową lub PVDF), gdzie są wykrywane przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka docelowego.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Odczynnik BLOT-QuickBlocker</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; Tabletki</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; Tabletki</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; Zestaw do wzmacniania immunoreakcji</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; Odczynnik ECL</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

western blotting: od przygotowania próbki do detekcji

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego. Wykorzystuje ona elektroforezę żelową do rozdzielania białek natywnych lub zdenaturowanych na podstawie długości polipeptydu (w warunkach denaturujących) lub trójwymiarowej struktury białka (w warunkach natywnych/niedenaturujących). Następnie białka są przenoszone na membranę (zazwyczaj nitrocelulozową lub PVDF), gdzie są wykrywane za pomocą przeciwciał specyficznych dla białka docelowego.

Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego.

Western blotting: od przygotowania próbki do detekcji

Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego. Wykorzystuje ona żel...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykazanie łatwości wykonywania analizy Western blot przy użyciu odpowiednich produktów. Po przygotowaniu próbek białka są rozdzielane na podstawie wielkości, a następnie przenoszone na fazę stałą. Następnie białka są wykrywane za pomocą przeciwciał; zastosowanie właściwych protokołów oraz wysokiej jakości, ekonomicznych odczynników pozwala na uzyskanie ulepszonych wyników analizy Western blot.Witajcie, jestem Jesse Luhan, naukowiec ds. badań i rozwoju w EMD Chemicals w San Diego w Kalifornii. EMD jest filią firmy Merck, KGaA w Darmstadt w Niemczech. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę western blottingu.Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem w western blottingu jest przygotowanie próbek. Rozpocznij przygotowanie próbek od wirowania komórek w celu ich osadzenia, stosując niską prędkość wirowania, na przykład przez pięć minut przy 2 500 ×g.Po wirowaniu odlej nadsącz z osadów komórkowych. Dokładnie resuspenduj komórki w odczynniku do ekstrakcji białek cyto buster, stosując 150 µL na 10⁶ komórek. Inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie, po odwirowaniu, wiruj próbkę przez pięć minut przy 16 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś oczyszczone SNA do nowej probówki i przystąp do analizy. Po oznaczeniu stężenia białka w próbce, przygotuj ją do nałożenia na żel w celu denaturacji białka.Należy użyć buforu do próbek zawierającego jonowy detergent denaturujący, taki jak dodecylosiarczan sodu lub SDS. Mieszaninę należy gotować w temperaturze od 95 do 100 °C przez pięć minut. Dzięki zastosowaniu dostępnego komercyjnie gotowego żelu białka mogą zostać szybko rozdzielone na podstawie masy cząsteczkowej.Napełnij układ elektroforetyczny buforem do prowadzenia, który można przygotować z odczynników dostępnych w linii chemicznej Omni PU. Na pierwszą ścieżkę w dołku nałóż marker białkowy trail mix. Marker ten posiada trzy pasma referencyjne, które umożliwiają monitorowanie przebiegu elektroforezy.Po zabarwieniu żelu widocznych jest 10 prążków o masach od 10 do 225 kilo Daltons. Należy nanieść zdenaturowaną próbkę do pozostałych oczek. Elektroforezę należy prowadzić przy napięciu 220 volt przez jedną godzinę.Po rozdzieleniu białek należy zabarwić żel błękitem Coomassie, aby upewnić się, że białka migrowały równomiernie i jednorodnie, wykorzystując szybki barwnik oraz barwnik ultrasensytywny, który jest gotowy do użycia bez dodatku SDS. Barwienie jest niezbędne, ponieważ białka posiadające ładunek elektryczny mogą być indukowane do przemieszczania się przez żel w polu elektrycznym, dzięki czemu mogą zostać przeniesione w polu elektrycznym z żelu na membranę, taką jak nitrocelulozowa lub PVDF. W przypadku stosowania membran PVDF, należy namoczyć membranę w metanolu przez kilka minut, a następnie przeprowadzić równoważenie w lodowatym buforze do transferu przez pięć minut. Żel należy również namoczyć przez kilka minut w lodowatym buforze do transferu; równoważenie zapobiega kurczeniu się żelu podczas transferu.W przypadku transferu mokrego należy przygotować układ warstwowy („sandwich”) składający się z żelu i membrany umieszczonych pomiędzy gąbkami i papierem. Następnie, upewniając się, że między żelem a membraną nie powstały pęcherzyki powietrza, należy ściśle zacisnąć cały układ. Układ warstwowy należy zanurzyć w buforze do transferu i przyłożyć pole elektryczne.Ujemnie naładowane białka będą przemieszczać się w stronę dodatnio naładowanej elektrody. Membrana następnie je zatrzymuje, wiąże i zapobiega ich dalszemu przemieszczaniu się. Po zakończeniu transferu należy przeprowadzić wizualizację białek, aby upewnić się, że transfer przebiegł równomiernie i bez powstania pęcherzyków powietrza.Można to łatwo przeprowadzić z wykorzystaniem barwnika do Western blot red alert. Barwnik ten jest gotowy do użycia, a odbarwianie można łatwo wykonać w wodzie. Przedstawiony jest żel po odbarwieniu poprzez płukanie w wodzie; przed inkubacją membrany z przeciwciałami, membrana zostaje zablokowana.Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, należy zablokować membranę wysokiej jakości odczynnikami blokującymi. Aby uniknąć zwiększenia tła, inkubuj membranę w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu, a następnie po inkubacji przemyj membranę trzy razy w TBST lub PBST. Bufor te można łatwo i wygodnie przygotować, stosując odpowiednio tabletki TBS tween i tabletki PBS tween.Po zablokowaniu i przemyciu membrany można przystąpić do inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Należy nanieść przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze, w tym jeden z zestawów do wzmacniania sygnału (signal boost), co pozwala na znaczne zwiększenie intensywności sygnału. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze pierwszym i inkubować membranę przez jedną godzinę.Po inkubacji nie ma potrzeby dodawania kolejnych czynników blokujących. Przemyć membranę buforem TBST. Następnie inkubować membranę przez jedną godzinę z przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym w roztworze dwa signal boost.Na koniec ponownie przemyj membranę kilka razy buforem TBST przed naniesieniem koniugatów HRP. W tym etapie tradycyjnie stosuje się detekcję przeciwciał wtórnych za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji (ECL). Wykorzystano odczynnik ECL typu rapid step, który nie wymaga mieszania luminolu z wzmacniaczem.Wystarczy spryskać membranę kilka razy, inkubować przez dwie minuty, a następnie wywołać ją za pomocą filmu rentgenowskiego. Metoda Rapid Step oferuje czułość na poziomie niskich pikogramów oraz mniejszą intensywność sygnału do dwóch godzin po dodaniu substratu. Markery białkowe Trail mix umożliwiają śledzenie białek podczas elektroforezy w porównaniu ze standardowymi protokołami Western blot.Wzmocnienie sygnału (Signal Boost) pozwala na uzyskanie większego zakresu dynamicznego i czułości. Wreszcie, wyższą czułość można osiągnąć, stosując odczynnik Rapid zamiast tradycyjnych odczynników ECL. Przedstawiliśmy właśnie sposób wydajnego i kosztowo efektywnego przeprowadzania Western blindingu z wykorzystaniem kompleksowej gamy produktów.Pamiętajcie, że jakość otrzymanych wyników zależy od jakości użytych odczynników. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

western-blotting-sample-preparation-to-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Western Blotting: przygotowanie próbki do wykrycia

Niniejszy artykuł techniczny opisuje standardową procedurę western-blottingu z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego systemu elektroforezy Mini-Gel NuPAGE firmy Invitrogen.

Western blotting z wykorzystaniem żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Immunoblotting (western blotting) to szybka i czuła metoda detekcji i charakterystyki białek, która wykorzystuje specyficzność rozpoznawania antygen-przeciwciało. Niniejsze wideo przedstawia protokoły rozdziału białek, transferu białek na membrany, immunodetekcji oraz wizualizacji z wykorzystaniem substratów chromogennych lub chemiluminescencyjnych.

Analiza immunoblottingowa

Ten film demonstruje ilościową technikę punktowej plamy (QDB) do bezwzględnej kwantyfikacji interesujących białek w próbce tkanki. Białka w próbce są unieruchomione na membranie nitrocelulozowej wewnątrz studzienek płytki QDB. Wykorzystując przeciwciała specyficzne dla białka docelowego znakowane enzymem peroksydazy, substrat chemiluminescencyjny jest utleniany w celu wytworzenia światła, które jest mierzone w celu określenia stężenia białka w próbce.

Ilościowa plama punktowa w celu oszacowania docelowych białek w lizacie tkankowym

Film demonstruje technikę western blottingu opartą na normalizacji całkowitego białka do ilościowego określania docelowej ekspresji białka w próbce. Wykorzystując całkowite barwienie białka w próbce, przeprowadza się analizę ratiometryczną w celu określenia względnego poziomu ekspresji białka docelowego.

Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

Ten film opisuje oparte na chemiluminescencji western blot immunoprecypitowanych lizatów. Technika ta pomaga określić przetwarzanie i aktywację białek. Wykryty sygnał chemiluminescencyjny jest proporcjonalny do poziomu przetworzenia białka podczas jego aktywacji.

Chemiluminescencyjny test Western Blot do przetwarzania białek

Ten protokół bada najnowsze osiągnięcia w przeprowadzaniu analiz Western blot. Te nowatorskie modyfikacje wykorzystują system żelowy Bis-Tris z 35-minutowym czasem trwania elektroforezy, 7-minutowy system suchego transferu blottingu oraz wykrywanie i obrazowanie białek fluorescencyjnych w podczerwieni, które generują wyższą rozdzielczość, jakość, czułość i lepszą dokładność danych zachodnich.

Najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy Western Blot

Postęp western blottingu za pomocą fluorescencji pozwolił na wykrycie subtelnych zmian w ekspresji białek, umożliwiając analizy ilościowe. W tym miejscu opisujemy solidną metodologię wykrywania szeregu białek w różnych gatunkach i typach tkanek. Zapewniona jest również strategia przezwyciężania typowych problemów technicznych.

Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

Ta metoda opisuje solidne i powtarzalne podejście do porównywania poziomów białek w różnych tkankach i w różnych punktach czasowych rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego podejścia western blotting.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Archiwalne próbki kliniczne z utrwalonego formaliny i zatopionej w parafinie (FFPE) są cennym materiałem do badania chorób. W tym miejscu demonstrujemy proces przygotowania próbki, który pozwala na dogłębną analizę proteomiczną mikrowypreparowanej tkanki FFPE.

Przygotowanie próbki proteomicznej z tkanki utrwalonej formaliną i zatopionej w parafinie

Poznaj technikę Western blotting do wykrywania białek w próbkach tkanek, obejmującą przygotowanie próbki, elektroforezę i transfer na membranę. Metoda ta umożliwia badaczom analizę białek z wysoką czułością.

Western blotting: od przygotowania próbki do detekcji

Przeglądaj więcej filmów