Wewnątrzkomorowe wstrzykiwanie i elektroporacja in utero embrionów szczura w 16. dniu rozwoju (E16)

Witam, nazywam się William Ti. Pochodzę z laboratorium Arnold Creek Stein Lab. Dzisiaj wraz z zespołem zaprezentujemy metodę wewnątrzmacicznej iniekcji embrionów szczura w 16. dniu rozwoju (E16). Witam, nazywam się Laura Elias.

Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować pipety do mikroiriekcji oraz jak napełnić pipety do inwentrykularnych wstrzykiwań i elektroporacji, które będziemy dziś przeprowadzać. Pokażę również, jak wykonać inwentrykularne wstrzykiwania i elektroporację u embrionów szczura w 16. dniu rozwoju (E16). In utero wstrzykiwania i elektroporacja u szczura są szczególnie użyteczne, ponieważ szczur jest systemem, w którym nie można łatwo przeprowadzać manipulacji genetycznych.

W tej procedurze wykorzystujemy szereg narzędzi chirurgicznych. Używamy kurety, dwóch par pęset – jednej ząbkowanej i drugiej z małym ząbkiem na końcówce – oraz pary kleszczyków hemostatycznych.

To są nożyczki, a następnie używamy tych dwóch zszywaczy. Ten większy jest używany do szczurów. Ten mniejszy jest używany do myszy, wykorzystuje zszywki rozmiaru 7, a ten drugi wykorzystuje zszywki rozmiaru 9; oba są sprężynowe.

Niektóre z narzędzi, których używamy podczas operacji, to proste źródło światła światłowodowego z podwójną głowicą. Stosujemy podgrzewaną podkładkę, w której krąży ciepła woda w celu utrzymania temperatury. Jako powierzchnię roboczą wykorzystujemy system elektroporacji firmy BTX.

Dysponujemy kilkoma różnymi rozmiarami łopatek, których używamy w zależności od tego, jak duże są zarodki. Niebieska strona to strona dodatnia. Dobrze, teraz będziemy ściinać końcówki pipet do iniekcji.

Jest to bardzo ważne, aby pipeta miała odpowiednio szeroki otwór, umożliwiający wprowadzenie DNA, a jednocześnie była bardzo ostra, aby nie uszkodzić zarodka podczas iniekcji. Uszkodzenie zarodka w trakcie tego procesu znacznie zwiększa wskaźnik śmiertelności, co jest niepożądane.

Jest to w rzeczywistości bardzo ważny etap w ramach tej operacji. Najpierw polejemy wodą ten obracający się kamień do fazowania. Następnie weźmiemy, sprawdźmy tutaj, po prostu patyczek.

Następnie przymocujemy taśmą pipetę, którą właśnie wyciągnęliśmy, do tego pręta. Użyjemy jednego z tych mikromanipulatorów, aby utrzymać pipetę pod odpowiednim kątem i umożliwić jej ścięcie. Umieścimy ją w ten sposób, korzystając z mikroskopu w celu wizualizacji końcówki pipety.

Następnie umieścimy go bezpośrednio w wodzie, na wcześniej przygotowanej fazie, aby wywrzeć niewielki nacisk. Można zauważyć, że końcówka przylega do kamienia. Pozostawiamy do fazowania na pewien czas, przez co najmniej 15 minut.

Lubię pozostawić je nawet na, wiecie, godzinę. Czasami stają się naprawdę bardzo ostre, ale długość fazowania pipet z pewnością zależy od każdego z osobna. Dobrze, tutaj mamy, jak widzicie na górze, wypromieniowaną pipetę, która nie została jeszcze sfazowana.

Zatem mimo że końcówka jest ostra, nie posiada ona otworu, przez który można by wprowadzić DNA. Dolna pipeta została natomiast ścięta, co tworzy widoczny otwór pod kątem. Pozwoli to na załadowanie DNA, a jednocześnie zachowana została ostra końcówka, aby wstrzykiwanie odbywało się bez powodowania uszkodzeń. Dobrze, teraz wypełnimy pipety do wstrzykiwania DNA.

Ważne jest zatem, aby przygotować DNA w sposób wolny od endotoksyn, aby nie wstrzyknąć lipopolisacharydów podczas podawania DNA. Teraz weźmiemy nasze DNA, a w tym miejscu przygotujemy parafilm. Należy przygotować parafilm, a następnie pobrać DNA i nanieść je w postaci małej kropelki na powierzchnię parafilmu.

Następnie pobieram – zazwyczaj na każde 10 µL mojego DNA, którego używam w stężeniu około 1,5 do 1,7 µg/µL – około 1 µL tego barwnika Fast Green. Służy on nam do lokalizacji miejsca iniekcji i upewnienia się, że udało się pomyślnie wstrzyknąć preparat do komory mózgu.

Następnie zmieszam ten barwnik fast green z moim DNA. Potem weźmiemy elektrodę wtryskową i napełnimy pipetę, odciągając tłok. Tutaj widać, że jeśli pipeta jest prawidłowa i ma wystarczająco szeroki otwór, DNA powinno załadować się dość łatwo.

Czasami należy kilkakrotnie przesunąć tłok w przód i w tył, aby ułatwić prawidłowe pobranie cieczy. Następnie można napełnić pipetę w ten sposób. W ten sposób DNA zostało w pełni pobrane do pipety i jest gotowe do wstrzyknięcia.

W porządku, teraz znieczulę zwierzę. Używamy do tego stożków decapicone. Po prostu odginam ich krawędź, aby łatwiej było je trzymać.

Zacznijmy zatem. Zazwyczaj kładę to po prostu na krawędzi klatki, aby stworzyć dla niego taki mały tunel, w który mógłby wejść. Dobrze, wygląda na to, że zwierzę jest już w środku.

Przystąpimy teraz do ucisku palca stopy, aby to potwierdzić; wystarczy chwycić palec i mocno go ucisnąć. Nie za mocno – nie chcemy zranić zwierzęcia, a jedynie upewnić się, że jest ono w narkozie.

To zwierzę jest już całkowicie znieczulone. Przystępuję zatem do golenia brzucha. Chcę uniknąć okolic sutków, aby nie odciąć ich końców.

Sądzę, że mogłoby to być bardzo bolesne dla zwierzęcia. Dlatego zwierzę zostaje wygolone. Teraz umieszczę je w komorze z wyciągiem.

Umyjemy zwierzę i rozpoczniemy procedurę. Dobrze, potwierdziliśmy, że zwierzę ponownie znajduje się w narkozie i jesteśmy gotowi do jego umycia. W pierwszej kolejności chcę nałożyć niewielką ilość maści do oczu w każde oko, aby zapobiec ich wysychaniu.

Następnie będziemy naprzemiennie przemywać próbki za pomocą gazików nasączonych alkoholem i gazików z jodynem. Powtarzamy tę czynność trzy razy, wykonując trzy naprzemienne przetarcia. Należy robić to bardzo delikatnie, aby nie uszkodzić embrionów podczas tej procedury.

Należy przesunąć rękę bezpośrednio w dół, prosto do tyłu. To pierwszy krok. Muszę najpierw dokładnie ją zwilżyć, aby móc wykonać przecieranie. Dobrze.

To dwa i to trzy. Dobrze, nałożyliśmy tę osłonę, aby pomóc w sterylizacji, a teraz przystąpię do otwarcia zwierzęcia. Zatem tniemy.

Dobrze, pierwszą rzeczą, którą muszę zrobić, jest założenie sterylnych rękawiczek. Zakładamy sterylne rękawiczki i jesteśmy gotowi do otwarcia. Zawsze należy potwierdzić, czy zwierzę nadal znajduje się pod wpływem narkozy.

Zastosuję zatem kolejne uciśnięcie palca stopy; będziemy powtarzać tę czynność w trakcie całego zabiegu. Zazwyczaj najpierw delikatnie chwytam fragment tkanki pęsetą. Wykonuję szybkie nacięcie, chwytam tkankę u góry i przecinam ją w dół, a następnie używam drugiej pęsety, aby rozsunąć brzegi tkanki.

Następnie chwytamy wybrany mięsień i wykonujemy cięcie dokładnie w linii środkowej, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych ani nerwów. Należy uważać, aby nie chwycić zbyt mocno. Wygląda na to, że uzyskaliśmy tutaj satysfakcjonującą ilość materiału.

Chcę mieć pewność, że tkanka pozostanie dobrze nawilżona, aby nie uległa wysuszeniu. Wykonam jeszcze jedną próbę, aby upewnić się, że wszystko jest w porządku, i wygląda na to, że tak jest. Zawsze pozycjonuję je w ten sposób dla Laury; zazwyczaj ustawiam je tak, aby głowa embrionu znajdowała się po prawej stronie matki szczura, dla zachowania jednolitości.

Zaczynam zatem teraz. Tutaj możemy zobaczyć zarodek. Widzimy ogon i kończyny tylne w tym miejscu, a głowę nieco wyżej.

Tutaj przyglądamy się głowie tego zarodka. Linia środkowa jest widoczna jako ta ciemna kreska. Można dostrzec lewą i prawą półkulę, a także móżdżek.

Teraz wykonam wstrzykiwanie do lewej półkuli. Wprowadzam pipetę, lekko ją odsuwam i wstrzykuję barwnik. Widać teraz, że rozprowadza się on w lewym komorze bocznej.

I wygląda to na udaną iniekcję. Dobrze, teraz widzimy, że komory wypełniły się prawidłowo. Barwnik przeszedł z lewej do prawej komory.

Zatem mamy DNA w obu komorach. W tym momencie wezmę elektrody do elektroporacji i umieszczę je w poprzek mózgu, z elektrodą dodatnią po lewej stronie. Tutaj, w taki sposób, aby DNA wniknęło do komórek progenitorowych i ściany korowej lewej półkuli.

A teraz przepuszczam prąd. Kiedy zaczynamy przepuszczać prąd elektryczny, na ujemnym końcu elektrody pojawia się piana. Jest to sygnał potwierdzający, że kontakty zostały nawiązane prawidłowo.

Dobrze, teraz gdy przeprowadziliśmy elektroporację tych embrionów, zamierzam umieścić je z powrotem i zaszyć otwór. Podam teraz 10 ml antybiotyku i wykonam szew chirurgiczny. Preferuję stosowanie szwów przerywanych.

Następnie zszyjemy skórę za pomocą zszywacza chirurgicznego. Dobrze? Dobrze. Podałem jej dawkę buprenorfiny, aby mieć pewność, że nie odczuje bólu po wybudzeniu. Teraz umieszczę ją w inkubatorze, aby utrzymać jej ciepłotę podczas wybudzania i zapobiec wystąpieniu hipotermii.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wykonywania wstrzyknięć domięśniowych do komór mózgowych oraz elektroporacji in utero. U szczura można wstrzyknąć szereg różnych substancji. Można w prosty sposób wstrzyknąć wirusa, w tym lentiwirusa lub retrowirusa, bezpośrednio do komory.

W takim przypadku nie będzie konieczności przeprowadzania elektroporacji, ponieważ wirus zintegruje się z komórkami. Jeśli jednak wstrzykniecie plazmidy DNA, tak jak zrobiliśmy to dzisiaj, musicie wykonać elektroporację, aby wprowadzić plazmidy do komórek wyściełających komorę. Zatem możecie wykorzystać te wektory w wielu różnych scenariuszach.

Można ich używać po prostu do śledzenia komórek i ekspresji GFP, co pozwala obserwować podziały i migrację tych progenitorów. Wektory te można również wykorzystać do manipulacji komórkami; umożliwiają one ekspresję spinek shRNA, a tym samym wyciszanie specyficznych genów.

Można również nadekspresować specyficzne geny, a w ten sposób manipulować komórkami, które poddano elektroporacji lub zainfekowano wirusem. Może to być bardzo potężna technika do badania roli konkretnych białek w procesie, który jest przedmiotem zainteresowania. Jest to szczególnie istotne w badaniach na szczurach, ponieważ manipulacje genetyczne u szczura nie są tak łatwe do przeprowadzenia, jak w przypadku myszy.