Name: Szybki termocykl PCR z wykorzystaniem konwekcji termicznej w mikroskali (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Odkryj szybką metodę PCR z wykorzystaniem konwekcji termicznej w mikroskali. Technika ta przyspiesza replikację DNA poprzez ciągły ruch reagentów między strefami temperaturowymi, oferując prostszą i bardziej efektywną alternatywę dla tradycyjnego termocyklowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong oraz B. Wallek z firmy Lynntech, Inc. za pomoc techniczną i liczne pomocne dyskusje. Praca ta była wspierana przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (NSF) w ramach grantu CBET-0933688.

1. Podstawowa konstrukcja konwekcyjnego termocyklera
<ol>
<li>Zbudowaliśmy proste urządzenie do konwekcyjnego termocyklingu, składające się z wymiennych plastikowych „wkładów” z komorami reakcyjnymi, które są umieszczone pomiędzy dwiema płytami aluminiowymi o niezależnie sterowanych temperaturach7 (Rysunek 2).</li>
<li>cylindryczne studzienki reaktora wykonano poprzez nawiercanie otworów w blokach poliwęglanowych, stosując różne kombinacje średnicy otworu i grubości arkusza tworzywa w celu uzyskania pożądanych proporcji (wysokość/średnica = h/d). W przedstawionych tutaj wynikach rozważono dwie różne geometrie reaktora: h/d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, objętość 38,2 μL; h/d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, objętość 18,5 μL.</li>
<li>Dolna powierzchnia reaktora jest ogrzewana za pomocą bloku aluminiowego zawierającego grzałki patronowe połączone z regulatorem temperatury sterowanym przez mikroprocesor.</li>
<li>Temperaturę górnej powierzchni reaktora reguluje blok aluminiowy podłączony do cyrkulacyjnej kąpieli wodnej.</li>
<li>Cały zespół jest skręcony nylonowymi śrubami w celu ograniczenia przewodzenia cieplnego pomiędzy przeciwstawnymi blokami aluminiowymi.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i ładowanie mieszaniny reakcyjnej PCR
<ol>
<li>Typowa 100 μL mieszanina reakcyjna zawiera 10 μL 10x roztworu buforu, 6 μL 25 mM MgCl2, 10 μL dNTPs (po 2 mM każdego), 41,2 μL wody DI, 10 μL sondy β-actin, 10 μL przedniego primera β-actin, 10 μL tylnego primera β-actin, 2 μL ludowego matrycowego DNA genomicznego (10 ng/μL) oraz 0,8 μL polimerazy DNA KOD (2,5 units/ μL).</li>
<li>Przed naniesieniem odczynników uszczelnij dolną powierzchnię komory PCR, używając cienkiego paska taśmy aluminiowej.</li>
<li>Przepłucz studzienki reaktora wodnym roztworem albuminy surowicy bydlęcej o stężeniu 10 mg/mL, a następnie Rain-X Anti-Fog.</li>
<li>Nanieś odczynniki do studzienek reaktora za pomocą długich końcówek do pipetowania do żeli i uszczelnij górną powierzchnię taśmą teflonową FEP.</li>
</ol>
3. Prowadzenie reakcji w konwekcyjnym termocyklerze
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem reakcji należy wstępnie rozgrzać oba bloki aluminiowe do pożądanych temperatur górnej i dolnej powierzchni.</li>
<li>Plastikowy reaktor wypełniony odczynnikami do PCR należy umieścić pomiędzy aluminiowymi blokami grzejnymi, a następnie szybko zaciśnąć cały zespół za pomocą nylonowych śrub.</li>
<li>Po przebiegu reakcji w wyznaczonym czasie należy wyłączyć grzejniki i umieścić dolną (gorącą) powierzchnię urządzenia na schłodzonym bloku metalowym, aby szybko go ochłodzić i zatrzymać przepływ konwekcyjny.</li>
<li>Należy wyjąć plastikowy reaktor i wypipetować produkty z otworów (używając długich końcówek do nakładania żelu) w celu przeprowadzenia dalszej analizy.</li>
</ol>
4. Wykonywanie analizy za pomocą elektroforezy w żelu
<ol>
<li>Przygotuj żel agarozy o stężeniu 2% wag., podgrzewając 10 g agarozy z 500 mL buforu 1x na mieszalce z podgrzewaniem, aż roztwór stanie się klarowny.</li>
<li>Wlej żel agarozowy do formy odlewniczej i włóż grzebień. Pozostaw żel do zastygnięcia na ok. 30 min.</li>
<li>Wyjmij grzebień i dolej bufor 1x TAE, aż żel zostanie całkowicie zanurzony.</li>
<li>Próbki DNA barwione fluorescencyjnie zawierają 2 μL roztworu 100x SYBR Green I, 2 μL próbki DNA, 2 μL barwnika do ładowania 6x Orange Loading Dye oraz 4 μL buforu TAE.</li>
<li>Naniesienie próbek DNA do dołków i przeprowadź elektroforezę przy napięciu 60 V przez 1 h, stosując marker wielkości DNA 100 bp.</li>
<li>Wyjmij żel i sfotografuj go w świetle UV w celu uzyskania wyniku.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Optymalna konstrukcja konwekcyjnych termocyklerów polega na wyborze odpowiedniej geometrii reaktora, która wygeneruje przepływ cyrkulacyjny zdolny do transportu odczynników przez kluczowe temperatury biorące udział w procesie PCR. Parametrami geometrycznymi, które mogą być zmieniane w rozważanych tutaj reaktorach cylindrycznych, są wysokość (h) i średnica (d), lub równoważnie stosunek wysokości do średnicy (h/d). Za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów (CFD) zbadaliśmy trójwymiarowe pola przepływu wewnątrz konwekcyjnych reaktorów PCR dla różnych stosunków wysokości do średnicy i stwierdzono, że mogą pojawić się nieoczekiwanie złożone wzory. Co ważniejsze, nasza analiza ujawniła podzbiór tych złożonych pól przepływu, które znacząco przyspieszają reakcję12.
Efekty geometryczne te można wyraźnie zaobserwować, porównując pola przepływu w reaktorach o wysokim i niskim stosunku wysokości do średnicy. W przypadku wysokiego stosunku (h/d = 9; wysoki, wąski cylinder) elementy płynu są adwekcyjnie przenoszone wzdłuż trajektorii tworzących w zasadzie zamknięte pętle i są one uwięzione na tych samych ścieżkach przez długi czas (Rysunek 3a). W konsekwencji istnieje niewielka szansa na wymianę między trajektoriami przepływu, które wystawiają odczynniki na optymalną sekwencję warunków termicznych dla PCR (oscylując między ekstremami temperatury przyłączania i denaturacji przy górnej i dolnej powierzchni reaktora), a znacznie większą grupą pozostałych trajektorii, które nie przyczyniają się do amplifikacji (zlokalizowanych bliżej centrum reaktora).
Pole przepływu jest znacznie inne przy mniejszym stosunku wymiarów (h/d = 3; krótszy, szerszy cylinder), stając się bardziej chaotycznym w tym sensie, że trajektorie elementów płynu nie tworzą już zamkniętych ścieżek (Rysunek 3b). W związku z tym, mimo że odczynniki są poddane bardziej złożonemu profilowi temperatury, elementy płynu mogą poruszać się po znacznie szerszym zakresie trajektorii, dzięki czemu większa część objętości odczynników ma możliwość przejścia przez optymalne profile termiczne. Wyniki te sugerują w sposób nieintuicyjny, że choć poszczególne trajektorie przepływu przy h/d = 9 mogą wydawać się korzystniejsze dla PCR, tworząc profile temperatury, które „wyglądają” podobnie do tych stosowanych w konwencjonalnym termocyklerze, to chaotyczny charakter pola przepływu przy h/d = 3 ostatecznie dominuje w skali globalnej poprzez promowanie zwiększonej wymiany, dzięki czemu odczynniki nie pozostają uwięzione w niekorzystnych trajektoriach przez zbyt długi czas.
Aby przetestować tę hipotezę i określić, która geometria reaktora jest korzystniejsza dla PCR, wykorzystaliśmy oba warianty do przeprowadzenia replikacji PCR docinkowego fragmentu o długości 295 bp powiązanego z genem β-aktyny z matrycy ludzkiego DNA genomowego. Co zdumiewające, rutynowo uzyskiwaliśmy amplifikację właściwego produktu docelowego w zaledwie 10 min przy h/d = 3 (Rysunek 4a), podczas gdy ta sama reakcja wymagała co najmniej 20 min, zanim zaobserwowano wykrywalne produkty przy h/d = 9 (Rysunek 4b). Specyficzność reakcji jest również znacznie większa przy h/d = 3, gdzie otrzymuje się pojedynczy produkt PCR, podczas gdy przy h/d = 9 powstaje wiele niespecyficznych produktów, ponieważ pole przepływu więzi elementy płynu w niekorzystnych trajektoriach termicznych przez dłuższy czas.

 <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej; temperatury procesu PCR; siła grawitacji; słowa kluczowe dla celów edukacyjnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Konwekcja termiczna w komorze cylindrycznej, której górna i dolna powierzchnie są utrzymywane w różnych stałych temperaturach. Jeśli temperatura dolnej powierzchni jest wyższa niż górnej, w zamkniętym płynie powstaje pionowy gradient gęstości, który jest w stanie wygenerować cyrkulacyjny wzorzec przepływu. Przy odpowiednim doborze parametrów geometrycznych (wysokość h i średnica d), pole przepływu konwekcyjnego może zostać wykorzystane do sterowania termocyklingiem PCR, gdy górna i dolna powierzchnie są utrzymywane odpowiednio w temperaturach bliskich temperaturze przyłączania i denaturacji (grawitacja działa pionowo w dół).
 <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Układ termocyklera PCR; schemat przedstawia montaż, dozowanie odczynników, uszczelnianie i termocyklowanie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. (a) Kluczowe elementy termocyklera PCR z przepływem konwekcyjnym. Wkład reaktora składa się z bloku poliwęglanowego zawierającego układ cylindrycznych komór. Blok znajduje się pomiędzy górną płytką, przeznaczoną do podłączenia do cyrkulującej kąpieli wodnej, a dolną płytką z wbudowanymi grzałkami. (b) Odczynniki do PCR są ładowane i uszczelniane wewnątrz wkładu reaktora, po czym urządzenie jest montowane w celu przeprowadzenia reakcji. Po zakończeniu procesu produkty można łatwo pobrać pipetą do dalszej analizy.
 <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Trójwymiarowa trajektoria przepływu i profil termiczny, schemat; analiza temperatury w układzie dynamiki płynów" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Symulacje komputerowe trójwymiarowych pól przepływu konwekcyjnego generowanych w reaktorach cylindrycznych z temperaturami 53 i 96 °C wymuszonymi odpowiednio na powierzchni górnej i dolnej. Wyniki przedstawiono dla stosunków wymiarowych (a) h/d = 9 (objętość reaktora 38,2 μL) oraz (b) h/d = 3 (objętość reaktora 18,5 μL). Po lewej stronie pokazano reprezentatywną trajektorię elementu płynu poruszającego się w trójwymiarowym polu przepływu wraz z projekcjami ścieżki w rzucie z góry i z boku; po prawej stronie przedstawiono odpowiadający im wykres zależności temperatury od czasu dla śledzonego elementu płynu. Profil termiczny przy h/d = 9 wydaje się zbliżony do profilu w konwencjonalnym termocyklerze, jednak chaotyczne pole przepływu przy h/d = 3 jest wbrew intuicji bardziej korzystne dla PCR.
 <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Wyniki elektroforezy żelowej, rozdział DNA, porównanie ścieżek, widoczne markery masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wyniki replikacji DNA uzyskane w geometriach reaktora przedstawionych na Rycini 3 (powierzchnie górna i dolna były utrzymywane odpowiednio w temperaturach 53 i 96 °C). (a) Reakcja PCR jest znacznie przyspieszona przy h/d = 3, co potwierdzają intensywne produkty widoczne już po 10 min czasu reakcji (M: drabinka 100 bp, ścieżki 1-4: produkty z równoległych reakcji w 4 różnych komorach cylindrycznych). (b) Ta sama reakcja przeprowadzona przy h/d = 9 wymaga co najmniej 20 min przed zaobserwowaniem widocznych produktów, a obecność wielu prążków wskazuje na replikację nieswoistego docelowego DNA oprócz pożądanego produktu (M: drabinka 100 bp, ścieżki 1-2: produkty z równoległych reakcji w 2 różnych komorach cylindrycznych).

<ol><li>Spitzack, K. D., Ugaz, V. M. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpitzack%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Minteer, S. D. , Humana Press. Vol. 321 (2005).</li>
<li>Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+in+a+Rayleigh-B%C3%A9nard+convection+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PCR in a Rayleigh-Bénard convection cell.</a> Science. 298, 793-793 (2002).</li>
<li>Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential+DNA+replication+by+laminar+convection%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Exponential DNA replication by laminar convection.</a> Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).</li>
<li>Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermosiphon-based+PCR+reactor%3A+experiment+and+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling.</a> Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).</li>
<li>Wheeler, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convectively+driven+polymerase+chain+reaction+thermal+cycler%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler.</a> Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).</li>
<li>Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+and+fluidics+in+miniaturized+natural+convection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems.</a> Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).</li>
<li>Ugaz, V. M., Krishnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+convective+flow+based+approaches+for+high-throughput+PCR+thermocycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Laboratory+Automation+%28JALA%29%22%5BJournal%5D)">Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling.</a> Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).</li>
<li>Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-Rayleigh-Benard+convection+polymerase+chain+reaction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micro-Nanolithography+MEMS+and+MOEMS%22%5BJournal%5D)">Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system.</a> Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).</li>
<li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pocket-sized+Convective+PCR+Thermocycler%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).</li>
<li>Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+in+natural+convection+systems%3A+A+convection-diffusion-reaction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Europhysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model.</a> Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).</li>
<li>Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+flow+and+reaction+during+natural+convection+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Coupled flow and reaction during natural convection PCR.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).</li>
<li>Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Biochemistry+by+Chaotic+Stirring%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring.</a> , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Wzajemne oddziaływanie między przepływem a reakcją chemiczną może ulec gwałtownej zmianie pod wpływem chaotycznej adwekcji. Te złożone stany przepływu są jednak trudne do zbadania, zwłaszcza w realistycznych geometriach, w których istotne stają się efekty trójwymiarowe. Konwekcja Rayleigha-Bénarda przy h/d &gt; 1 nie tylko stanowi wygodną platformę do badania tych zjawisk, ale jej zastosowanie w reakcji PCR umożliwia również analizę sprzężenia między przepływem a reakcjami chemicznymi. Ta wyjątkowa możliwość pozwala na wybór optymalnych stanów przepływu, w których efekty chaotyczne (kontrintuicyjnie) przyspieszają tempo replikacji DNA.

<table><tbody><tr><td>Zestaw KOD DNA Polymerase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników kontrolnych TaqMan &amp;#946;-actin</td><td>Applied Biosystems</td><td>401846</td><td></td></tr><tr><td>Taśma aluminiowa</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X Anti-Fog</td><td>SOPUS Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wydłużone końcówki do pipet do nakładania próbek na żel</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-151</td><td></td></tr><tr><td>Taśma teflonowa FEP</td><td>McMaster-Carr</td><td>7562A17</td><td></td></tr><tr><td>Żel agarozy</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3107</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy TAE</td><td>Bio-Rad</td><td>141-0743</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>6x Pomarańczowy barwnik do nakładania próbek</td><td>Fermentas</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>Marker wielkości DNA 100 bp</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8202</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie termocyklowanie pcr z wykorzystaniem mikroskalowej konwekcji termicznej

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Wiele testów biologii molekularnej w pewien sposób opiera się na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu namnożenia początkowo rozcieńczonej próbki docelowego DNA do poziomu stężenia umożliwiającego detekcję. Jednak konstrukcja konwencjonalnego sprzętu do termocyklingu PCR, oparta głównie na masywnych metalowych blokach grzewczych, których temperatura jest regulowana przez grzejniki termoelektryczne, znacznie ogranicza osiągalną szybkość reakcji1. Do wielokrotnego ogrzewania i chłodzenia mieszaniny reagentów wymagana jest również znaczna moc elektryczna, co ogranicza możliwość zastosowania tych urządzeń w formacie przenośnym.
Konwekcja termiczna wyłoniła się jako obiecująca alternatywna metoda termocyklowania, która ma potencjał do przezwyciężenia tych ograniczeń2-9. Przepływy konwekcyjne występują powszechnie w różnorodnych środowiskach, od atmosfery, oceanów i wnętrza Ziemi, po dekoracyjne i kolorowe lampy lawowe. Ruch płynu jest inicjowany w ten sam sposób w każdym przypadku: niestabilność napędzana wypornością pojawia się, gdy ograniczona objętość płynu zostaje poddana przestrzennemu gradientowi temperatury. Te same zjawiska oferują atrakcyjny sposób prowadzenia termocyklowania w reakcji PCR. Poprzez zastosowanie statycznego gradientu temperatury w odpowiednio zaprojektowanej geometrii reaktora, można ustanowić ciągły przepływ cyrkulacyjny, który będzie wielokrotnie transportował odczynniki PCR przez strefy temperatury związane z etapami denaturacji, przyłączania starterów i elongacji reakcji (Rysunek 1). Termocyklowanie może zatem przebiegać w sposób pseudoizotermiczny poprzez proste utrzymywanie dwóch przeciwległych powierzchni w stałych temperaturach, co całkowicie eliminuje konieczność wielokrotnego ogrzewania i chłodzenia urządzenia.
Jednym z głównych wyzwań w projektowaniu konwekcyjnych termocyklerów jest konieczność precyzyjnego kontrolowania przestrzennych rozkładów prędkości i temperatury wewnątrz reaktora, aby zapewnić, że odczynniki sekwencyjnie zajmują odpowiednie strefy temperaturowe przez wystarczający czas10,11. W niniejszej pracy opisujemy wyniki naszych działań mających na celu zbadanie pełnych trójwymiarowych rozkładów prędkości i temperatury w mikroskalowych konwekcyjnych termocyklerach12. Nieoczekiwanie odkryliśmy podzbiór złożonych trajektorii przepływu, które są wysoce korzystne dla PCR dzięki synergicznemu połączeniu (1) ciągłej wymiany między ścieżkami przepływu, co stwarza zwiększoną możliwość próbkowania przez odczynniki pełnego zakresu optymalnych profili temperaturowych, oraz (2) wydłużenia czasu spędzonego w strefie temperatury elongacji, która jest etapem limitującym szybkość reakcji PCR. W reaktorach zaprojektowanych do generowania takich przepływów możliwe jest osiągnięcie niezwykle szybkich czasów amplifikacji DNA (poniżej 10 min).

Opisujemy nową metodę przeprowadzania replikacji DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Wykorzystano konwekcję termiczną do ciągłego przemieszczania odczynników między warunkami denaturacji, przyłączania i elongacji poprzez utrzymywanie przeciwległych powierzchni reaktora w stałej temperaturze. Ta naturalnie prosta konstrukcja obiecuje zwiększenie dostępności szybkich testów PCR.

Szybkie termocyklowanie PCR z wykorzystaniem mikroskalowej konwekcji termicznej

Wiele testów biologii molekularnej w pewien sposób opiera się na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby namnożyć początkowo rozcieńczoną próbkę docelowego DNA do poziomu wykrywalnego...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie, w jaki sposób zasadę cyklicznych zmian temperatury w technice PCR opartą na konwekcji termicznej można zastosować do przeprowadzenia rzeczywistej reakcji. Zostanie to osiągnięte poprzez wprowadzenie w pierwszej kolejności koncepcji działania termocyklerów konwekcyjnych oraz podstawowych zasad ich konstrukcji. Drugim krokiem procedury jest przedstawienie sposobu przygotowania wkładu reaktora i wprowadzenia do niego odczynników.Trzecim krokiem procedury jest zamontowanie wkładu reaktora w jednostce grzewczej i przeprowadzenie reakcji. Ostatnim etapem procedury jest usunięcie odczynników po zakończeniu reakcji i sprawdzenie wyników za pomocą elektroforezy w żelu. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące szybką replikację DNA poprzez termocyklowanie PCR z wykorzystaniem konwekcji naturalnej.Witajcie, jestem Radha OU z laboratorium UGAs na Texas A&amp;M University. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę szybkiego termocyklowania PCR z wykorzystaniem konwekcji naturalnej, podobnie jak w lampie lawowej. Stosujemy tę procedurę w laboratorium w celu badania konstrukcji i optymalizacji urządzeń do termocyklowania, które wykorzystują tę zasadę.Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół rozpoczyna się od zaprojektowania i konstrukcji prostego konwekcyjnego urządzenia do termocyklowania. Urządzenie wykorzystane w tej demonstracji składa się z wymiennych plastikowych wkładów komory reakcyjnej, które są umieszczone pomiędzy dwiema płytami aluminiowymi o niezależnie kontrolowanej temperaturze.cylindryczne otwory reaktora zostały wykonane poprzez obróbkę mechaniczną macierzy otworów w blokach z poliwęglanu, stosując różne kombinacje średnicy całkowitej i grubości arkusza tworzywa w celu uzyskania pożądanych stosunków kształtu. Optymalny projekt polega na wyborze odpowiedniej geometrii reaktora, która wygeneruje przepływ cyrkulacyjny zdolny do transportu odczynników przez kluczowe temperatury występujące w procesie PCR. Parametrami geometrycznymi, które mogą być zmieniane w rozważanych tutaj reaktorach cylindrycznych, są wysokość i średnica lub równoważnie stosunek kształtu.Dolna powierzchnia reaktora jest podgrzewana za pomocą bloku aluminiowego zawierającego grzałki patronowe połączone z mikroprocesorowym regulatorem temperatury. Temperatura górnej powierzchni reaktora jest regulowana za pomocą bloku aluminiowego podłączonego do cyrkulacyjnej kąpieli wodnej. Cały zespół jest skręcony za pomocą nylonowych śrub w celu ograniczenia przewodnictwa cieplnego pomiędzy przeciwległymi blokami aluminiowymi.Przygotuj każdą 100 µL reakcję PCR, mieszając 10x roztwór buforu, 25 mM chlorku magnezu, dwa dNTP, wodę destylowaną, sondę beta-aktyny, primer przedni i primer odwrotny, ludzki matrycowy DNA genomiczny oraz polimerazę K-O-D D-N-A. Przed naniesieniem odczynników uszczelnij dolną powierzchnię komory PCR cienkim paskiem taśmy aluminiowej, przepłucz studzienki reaktora wodnym roztworem albuminy surowicy bydlęcej o stężeniu 10 mg/mL, a następnie zastosuj środek przeciwmgielny Rain-X. Na koniec nanieś odczynniki do studzienek reaktora za pomocą końcówek do nakładania żeli i uszczelnij górną powierzchnię taśmą teflonową FEP.Przed rozpoczęciem reakcji należy rozgrzać oba bloki aluminiowe do pożądanych temperatur górnej i dolnej powierzchni. Umieść plastikowy reaktor z odczynnikami do PCR pomiędzy aluminiowymi blokami grzejnymi i szybko zaciśnij cały zestaw za pomocą nylonowych śrub. Po upływie pożądanego czasu reakcji wyłącz grzejniki i umieść dolną, nagrzaną powierzchnię urządzenia na schłodzonym bloku metalowym, aby gwałtownie go ochłodzić i zatrzymać przepływ konwekcyjny.Wyjmij plastikowy reaktor i pipetuj produkty z dołków w celu przeprowadzenia dalszych analiz. Przygotuj 2% żel agarozowy, podgrzewając 10 g agarozy w 500 ml buforu 1× na mieszadle magnetycznym z podgrzewaniem, aż roztwór stanie się przejrzysty. Wlej żel agarozowy do formy i włóż grzebień.Pozostawić żel do zastygnięcia na około 30 minut. Wyjąć grzebień i dolać bufor TAE 1×, aż żel zostanie całkowicie zakryty. Przygotować próbki DNA barwione fluorescencyjnie, dodając 2 µL Cyber Green 100×.Przygotuj roztwór składający się z 2 µL próbki DNA, 2 µL 6x pomarańczowego barwnika do ładowania oraz 4 µL buforu TAE. Nanieś marker wielkości DNA (drabinę 100 bp) oraz próbki DNA do zagłębień żelu. Rozdziel DNA, prowadząc elektroforezę żelu przy napięciu 60 V przez jedną godzinę.Wyjmij żel i sfotografuj go w świetle UV, aby uzyskać wynik. Trójwymiarowe pola przepływu wewnątrz konwekcyjnych reaktorów PCR badano dla różnych stosunków wymiarów, wykorzystując obliczeniową dynamikę płynów (CFD). Dane te wykazały, że mogą powstawać złożone wzory i że pewna część tych złożonych pól przepływu może znacząco przyspieszyć reakcję.Efekty geometryczne te można wyraźnie zaobserwować, porównując pola przepływu w reaktorach o wysokim i niskim stosunku wymiarów przy wysokim stosunku aspektowym. Elementy płynu są oddziaływane wzdłuż trajektorii, kreśląc ścieżki, które są w zasadzie zamkniętymi pętlami i są zablokowane tak, aby podążać tymi samymi ścieżkami przez długi czas. W konsekwencji istnieje niewielka szansa na wymianę między trajektoriami przepływu, które narażają odczynniki na optymalną sekwencję warunków termicznych dla PCR, a znacznie większym zbiorem pozostałych trajektorii, które nie przyczyniają się do amplifikacji.Pole przepływu jest znacznie inne przy mniejszym stosunku wymiarów. Pole przepływu jest bardziej chaotyczne, ponieważ trajektorie elementów płynu nie tworzą już zamkniętych ścieżek. Chociaż reakcje podlegają bardziej złożonemu profilowi temperatury, elementy płynu mogą poruszać się po znacznie szerszym zakresie trajektorii, dzięki czemu większa część objętości odczynnika ma możliwość przejścia przez optymalne profile termiczne.Wyniki te sugerują, że choć poszczególne trajektorie przepływu przy H/D równym 9 mogą wydawać się korzystniejsze dla PCR, generując profile temperatury zbliżone do tych stosowanych w konwencjonalnym termocyklerze, to chaotyczna natura pola przepływu przy H/D równym 3 ostatecznie dominuje w skali globalnej poprzez promowanie zwiększonej wymiany, dzięki czemu odczynniki nie zostają uwięzione w niekorzystnych trajektoriach na zbyt długo. Aby przetestować tę hipotezę i ustalić, która geometria reaktora jest korzystniejsza dla PCR, oba cylindry wykorzystano do przeprowadzenia replikacji PCR fragmentu docelowego o długości 295 par zasad związanego z genem beta-aktyny z matrycy ludzkiego DNA genomicznego; amplifikację prawidłowego produktu docelowego uzyskano wielokrotnie w zaledwie 10 minutach przy H/D równym 3.I odwrotnie, w przypadku tej samej reakcji wymagano co najmniej 20 minut, zanim zaobserwowano wykrywalne produkty przy H over D równym dziewięciu. Specyficzność reakcji jest również znacznie większa przy H over D równym trzy, gdzie otrzymuje się pojedynczy produkt PCR. Podczas gdy przy H over D równym dziewięciu powstaje wiele niespecyficznych produktów, ponieważ pole przepływu więzi elementy płynu w niekorzystnych trajektoriach termicznych przez dłuższe okresy czasu.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia reakcji PCR przy użyciu termocyklera z przepływem konwekcyjnym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby szczelnie zamknąć odczynniki w komorze reaktora, unikając powstania pęcherzyków powietrza. Mogłyby one zakłócić pole przepływu wewnątrz komory i zahamować reakcję.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybkie termocylowanie PCR za pomocą mikroskalowowej konwekcji termicznej

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

PCR stał się powszechną techniką w wielu laboratoriach biologii molekularnej. Niniejszym przedstawiamy krótki przewodnik po kilku konwencjonalnych protokołach PCR. Ponieważ każda reakcja jest unikalnym eksperymentem, optymalne warunki niezbędne do otrzymania produktu są zmienne. Zrozumienie zmiennych w reakcji znacznie zwiększy efektywność rozwiązywania problemów, zwiększając tym samym szansę na uzyskanie pożądanego wyniku.

Reakcja łańcuchowa polimerazy: podstawowy protokół oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek (PMCA) jest testem in vitro służącym do badania konwersji prionów oraz barier szczepowych i gatunkowych. Może być również wykorzystywana jako test detekcji prionów.

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek prionów

Pirosekwencjonowanie to wszechstronna technika, która ułatwia sekwencjonowanie genomu drobnoustrojów, które może być używane do identyfikacji gatunków bakterii, rozróżniania szczepów bakteryjnych i wykrywania mutacji genetycznych, które nadają odporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. W tym filmie zostanie zademonstrowana procedura generowania amplikonów drobnoustrojów, pirosekwencjonowania amplikonów i analizy sekwencji DNA.

Pirosekwencjonowanie w celu identyfikacji i charakterystyki drobnoustrojów

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Ten protokół opisuje, jak zbudować system łańcucha polimerazy o ciągłym przepływie oparty na mikroprzepływowym chipie i jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawiono w nim prostą metodę analizy kwasów nukleinowych w laboratorium.

Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Pełne genotypowanie próbki ogona myszy, obejmujące trawienie tkanki i odczyt PCR, wykonuje się w półtorej godziny przy użyciu zestawu Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR.

Szybkie genotypowanie tkanek mysich z wykorzystaniem zestawu Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Zestawy do analizy ekspresji genów Solaris qPCR to nowoczesne, gotowe kombinacje starterów i sond qPCR, opracowane w celu uproszczenia procesu qPCR bez utraty specyficzności i odporności analizy.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem zestawu Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Odkryj szybką metodę PCR z wykorzystaniem konwekcji termicznej w mikroskali. Technika ta przyspiesza replikację DNA poprzez ciągły ruch reagentów między strefami temperaturowymi, oferując prostszą i bardziej efektywną alternatywę dla tradycyjnego termocyklowania.

Szybkie termocyklowanie PCR z wykorzystaniem mikroskalowej konwekcji termicznej

Przeglądaj więcej filmów