Szybkie termocyklowanie PCR z wykorzystaniem mikroskalowej konwekcji termicznej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie, w jaki sposób zasadę cyklicznych zmian temperatury w technice PCR opartą na konwekcji termicznej można zastosować do przeprowadzenia rzeczywistej reakcji. Zostanie to osiągnięte poprzez wprowadzenie w pierwszej kolejności koncepcji działania termocyklerów konwekcyjnych oraz podstawowych zasad ich konstrukcji. Drugim krokiem procedury jest przedstawienie sposobu przygotowania wkładu reaktora i wprowadzenia do niego odczynników.

Trzecim krokiem procedury jest zamontowanie wkładu reaktora w jednostce grzewczej i przeprowadzenie reakcji. Ostatnim etapem procedury jest usunięcie odczynników po zakończeniu reakcji i sprawdzenie wyników za pomocą elektroforezy w żelu. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące szybką replikację DNA poprzez termocyklowanie PCR z wykorzystaniem konwekcji naturalnej.

Witajcie, jestem Radha OU z laboratorium UGAs na Texas A&M University. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę szybkiego termocyklowania PCR z wykorzystaniem konwekcji naturalnej, podobnie jak w lampie lawowej. Stosujemy tę procedurę w laboratorium w celu badania konstrukcji i optymalizacji urządzeń do termocyklowania, które wykorzystują tę zasadę.

Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół rozpoczyna się od zaprojektowania i konstrukcji prostego konwekcyjnego urządzenia do termocyklowania. Urządzenie wykorzystane w tej demonstracji składa się z wymiennych plastikowych wkładów komory reakcyjnej, które są umieszczone pomiędzy dwiema płytami aluminiowymi o niezależnie kontrolowanej temperaturze.

cylindryczne otwory reaktora zostały wykonane poprzez obróbkę mechaniczną macierzy otworów w blokach z poliwęglanu, stosując różne kombinacje średnicy całkowitej i grubości arkusza tworzywa w celu uzyskania pożądanych stosunków kształtu. Optymalny projekt polega na wyborze odpowiedniej geometrii reaktora, która wygeneruje przepływ cyrkulacyjny zdolny do transportu odczynników przez kluczowe temperatury występujące w procesie PCR. Parametrami geometrycznymi, które mogą być zmieniane w rozważanych tutaj reaktorach cylindrycznych, są wysokość i średnica lub równoważnie stosunek kształtu.

Dolna powierzchnia reaktora jest podgrzewana za pomocą bloku aluminiowego zawierającego grzałki patronowe połączone z mikroprocesorowym regulatorem temperatury. Temperatura górnej powierzchni reaktora jest regulowana za pomocą bloku aluminiowego podłączonego do cyrkulacyjnej kąpieli wodnej. Cały zespół jest skręcony za pomocą nylonowych śrub w celu ograniczenia przewodnictwa cieplnego pomiędzy przeciwległymi blokami aluminiowymi.

Przygotuj każdą 100 µL reakcję PCR, mieszając 10x roztwór buforu, 25 mM chlorku magnezu, dwa dNTP, wodę destylowaną, sondę beta-aktyny, primer przedni i primer odwrotny, ludzki matrycowy DNA genomiczny oraz polimerazę K-O-D D-N-A. Przed naniesieniem odczynników uszczelnij dolną powierzchnię komory PCR cienkim paskiem taśmy aluminiowej, przepłucz studzienki reaktora wodnym roztworem albuminy surowicy bydlęcej o stężeniu 10 mg/mL, a następnie zastosuj środek przeciwmgielny Rain-X. Na koniec nanieś odczynniki do studzienek reaktora za pomocą końcówek do nakładania żeli i uszczelnij górną powierzchnię taśmą teflonową FEP.

Przed rozpoczęciem reakcji należy rozgrzać oba bloki aluminiowe do pożądanych temperatur górnej i dolnej powierzchni. Umieść plastikowy reaktor z odczynnikami do PCR pomiędzy aluminiowymi blokami grzejnymi i szybko zaciśnij cały zestaw za pomocą nylonowych śrub. Po upływie pożądanego czasu reakcji wyłącz grzejniki i umieść dolną, nagrzaną powierzchnię urządzenia na schłodzonym bloku metalowym, aby gwałtownie go ochłodzić i zatrzymać przepływ konwekcyjny.

Wyjmij plastikowy reaktor i pipetuj produkty z dołków w celu przeprowadzenia dalszych analiz. Przygotuj 2% żel agarozowy, podgrzewając 10 g agarozy w 500 ml buforu 1× na mieszadle magnetycznym z podgrzewaniem, aż roztwór stanie się przejrzysty. Wlej żel agarozowy do formy i włóż grzebień.

Pozostawić żel do zastygnięcia na około 30 minut. Wyjąć grzebień i dolać bufor TAE 1×, aż żel zostanie całkowicie zakryty. Przygotować próbki DNA barwione fluorescencyjnie, dodając 2 µL Cyber Green 100×.

Przygotuj roztwór składający się z 2 µL próbki DNA, 2 µL 6x pomarańczowego barwnika do ładowania oraz 4 µL buforu TAE. Nanieś marker wielkości DNA (drabinę 100 bp) oraz próbki DNA do zagłębień żelu. Rozdziel DNA, prowadząc elektroforezę żelu przy napięciu 60 V przez jedną godzinę.

Wyjmij żel i sfotografuj go w świetle UV, aby uzyskać wynik. Trójwymiarowe pola przepływu wewnątrz konwekcyjnych reaktorów PCR badano dla różnych stosunków wymiarów, wykorzystując obliczeniową dynamikę płynów (CFD). Dane te wykazały, że mogą powstawać złożone wzory i że pewna część tych złożonych pól przepływu może znacząco przyspieszyć reakcję.

Efekty geometryczne te można wyraźnie zaobserwować, porównując pola przepływu w reaktorach o wysokim i niskim stosunku wymiarów przy wysokim stosunku aspektowym. Elementy płynu są oddziaływane wzdłuż trajektorii, kreśląc ścieżki, które są w zasadzie zamkniętymi pętlami i są zablokowane tak, aby podążać tymi samymi ścieżkami przez długi czas. W konsekwencji istnieje niewielka szansa na wymianę między trajektoriami przepływu, które narażają odczynniki na optymalną sekwencję warunków termicznych dla PCR, a znacznie większym zbiorem pozostałych trajektorii, które nie przyczyniają się do amplifikacji.

Pole przepływu jest znacznie inne przy mniejszym stosunku wymiarów. Pole przepływu jest bardziej chaotyczne, ponieważ trajektorie elementów płynu nie tworzą już zamkniętych ścieżek. Chociaż reakcje podlegają bardziej złożonemu profilowi temperatury, elementy płynu mogą poruszać się po znacznie szerszym zakresie trajektorii, dzięki czemu większa część objętości odczynnika ma możliwość przejścia przez optymalne profile termiczne.

Wyniki te sugerują, że choć poszczególne trajektorie przepływu przy H/D równym 9 mogą wydawać się korzystniejsze dla PCR, generując profile temperatury zbliżone do tych stosowanych w konwencjonalnym termocyklerze, to chaotyczna natura pola przepływu przy H/D równym 3 ostatecznie dominuje w skali globalnej poprzez promowanie zwiększonej wymiany, dzięki czemu odczynniki nie zostają uwięzione w niekorzystnych trajektoriach na zbyt długo. Aby przetestować tę hipotezę i ustalić, która geometria reaktora jest korzystniejsza dla PCR, oba cylindry wykorzystano do przeprowadzenia replikacji PCR fragmentu docelowego o długości 295 par zasad związanego z genem beta-aktyny z matrycy ludzkiego DNA genomicznego; amplifikację prawidłowego produktu docelowego uzyskano wielokrotnie w zaledwie 10 minutach przy H/D równym 3.

I odwrotnie, w przypadku tej samej reakcji wymagano co najmniej 20 minut, zanim zaobserwowano wykrywalne produkty przy H over D równym dziewięciu. Specyficzność reakcji jest również znacznie większa przy H over D równym trzy, gdzie otrzymuje się pojedynczy produkt PCR. Podczas gdy przy H over D równym dziewięciu powstaje wiele niespecyficznych produktów, ponieważ pole przepływu więzi elementy płynu w niekorzystnych trajektoriach termicznych przez dłuższe okresy czasu.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia reakcji PCR przy użyciu termocyklera z przepływem konwekcyjnym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby szczelnie zamknąć odczynniki w komorze reaktora, unikając powstania pęcherzyków powietrza. Mogłyby one zakłócić pole przepływu wewnątrz komory i zahamować reakcję.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.