Name: Indukcja i monitorowanie aktywnej nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH) u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Poznaj metodę indukcji aktywnej nadwrażliwości typu opóźnionego u szczurów Lewis przy użyciu emulsji antygenu KLH z adiuwantem Freunda. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi zapalnej i dynamiki reakcji immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie emulsji
<ol>
<li>Emulsja jest mieszaniną w stosunku 1:1 antygenu (DTH można indukować za pomocą różnych antygenów: owalbuminy, toksoidu tężcowego, hemocjaniny z małży kluczowatego...) w roztworze wodnym dodanego do pełnego adiuwantu Freunda. Bardzo ważne jest, aby dodawać antygen do adiuwantu, a nie odwrotnie!!! </li>
<li>Przy przygotowywaniu i wstrzykiwaniu emulsji powstaje dużo odpadów, dlatego należy zawsze przygotować 1,5 lub 2 razy więcej niż jest potrzeba. </li>
<li>Rozpuścić antygen w soli fizjologicznej, aby przygotować roztwór o stężeniu 2 mg/ml. Nie filtrować, aby nie utracić agregatów!!! </li>
<li>Umieścić pełny adiuwant Freunda H37Ra (Difco, katalog nr 231131) w probówce i wymieszać na wortexie z dużą prędkością. Dodawać antygen kropla po kropli podczas wortexowania. Po dodaniu całego antygenu mieszać na wortexie przez kolejne 5 minut. Mieszanina powinna stać się biała. </li>
<li>Przenieść emulsję do szklanej strzykawki i połączyć ją z drugą szklaną strzykawką za pomocą łącznika 18G (katalog Fisher nr 14-825-17L). Przepompowywać emulsję z jednej strzykawki do drugiej, aż stanie się gęsta (5-10 min). Najlepiej użyć dwóch strzykawek o pojemności 5 ml. Jeśli wymagane jest więcej niż 5 ml emulsji, należy użyć kilku zestawów strzykawek 5 ml. </li>
<li>Emulsję można przechowywać w strzykawkach w temperaturze 4°C przez 3 tygodnie.</li>
</ol>
2. Immunizacja szczurów
<ol>
<li>Mieszać emulsję w strzykawkach przez kilka minut, a następnie przenieść ją do strzykawki przeznaczonej do iniekcji. Wstrzyknąć 200 ml podskórnie w 1-2 miejscach u nasady ogona, używając igieł 23G i strzykawki 3 ml z końcówką Luer-Lok.</li>
</ol>
3. Podanie antygenu w okolicy grzbietowej
<ol>
<li>Siedem dni po immunizacji należy ogolić dwa miejsca na grzbietach szczurów i wstrzyknąć śródskórnie 20 ml roztworu antygenu o stężeniu 1 mg/ml w jedno miejsce oraz sól fizjologiczną (lub nieistotny antygen) w drugie miejsce. NIE należy filtrować roztworu antygenu, ponieważ może to spowodować utratę agregatów nasilających reakcję zapalną. </li>
<li>Szczury powinny zostać poddane znieczuleniu, aby uniknąć ruchów. Roztwór należy wstrzyknąć śródskórnie, używając igieł 27G ½ i strzykawek 1 ml. Należy wymieniać igły pomiędzy iniekcjami. Uwaga: w celu uzyskania bardziej precyzyjnych pomiarów wyzwanie można przeprowadzić w małżowinie usznej zamiast na grzbiecie. Zobacz wideo pod adresem <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325</a> </li>
</ol>
4. Pomiar DTH
<ol>
<li>Miejsce wstrzyknięcia zacznie czerwienieć i puchnąć, co jest oznaką stanu zapalnego. Należy zmierzyć średnicę stanu zapalnego za pomocą linijki lub, najlepiej,&nbsp;suwmiarki. Maksymalny obrzęk powinien wystąpić między 24 a 72 godziną.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+monitoring+of+adoptive+delayed-type+hypersensitivity+in+rats.">Induction and monitoring of adoptive delayed-type hypersensitivity in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. 8, (2007).</li></ol>

Autorzy są współzałożycielami i konsultantami firmy Airmid Inc.

Aby uzyskać dokładniejszy pomiar reakcji DTH, zaleca się podanie antygenu szczurom do małżowiny usznej. Reakcję można następnie zmierzyć jako różnicę w obrzęku ucha między uchem poddanym działaniu odpowiedniego antygenu a uchem poddanym działaniu samego soli fizjologicznej lub nieistotnego antygenu. Demonstracja podania antygenu do ucha została przedstawiona w 1.

<table><tbody><tr><td>Kompletny adiuwant Freunda &amp;rsquo; H37Ra</td><td>Odczynnik</td><td>Difco Laboratories</td><td>231131</td><td>Dystrybuowane przez Fisher pod numerem katalogowym DF 311-360-5</td></tr><tr><td>Hemocyjanina z Keyhole Limpet</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-5654</td><td></td></tr><tr><td>Owalbumina</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5503</td><td></td></tr><tr><td>Szklane strzykawki 5 ml</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-10 B</td><td>Wymagane dwie strzykawki 5 ml dla każdej partii 5 ml emulsji</td></tr><tr><td>Metalny łącznik 18G</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-17L</td><td></td></tr><tr><td>Szczury rasy Lewis</td><td>Zwierzę</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td>Samice szczurów w wieku 7-9 tygodni</td></tr><tr><td>Igły 23G 1&quot;</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826 AA</td><td>Zaleca się wymianę igieł między szczurami</td></tr><tr><td>Strzykawki 3 ml Luer Lock</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-63</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki z końcówką standardową 1 ml</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-257-154</td><td></td></tr><tr><td>Igły 27G 1/2&quot;</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna bezprzewodowa maszynka do strzyżenia</td><td>Narzędzie</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>CLP-32130</td><td>Do golenia grzbietów szczurów przed podaniem antygenu.</td></tr><tr><td colspan="5">Należy stosować sterylne roztwory, odczynniki i strzykawki. Szklane strzykawki i łączniki 18G można autoklawować. Przed pierwszym użyciem odczynnika należy zapoznać się z kartą charakterystyki materiału i założyć odpowiedni sprzęt ochronny.</td></tr></tbody></table>

indukcja i monitorowanie aktywnej nadwrażliwości opóźnionej (dth) u szczurów

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

Nadwrażliwość opóźniona (DTH) to reakcja zapalna pośredniczona przez limfocyty T pamięci efektorowej wykazujące ekspresję CCR7, które infiltrują miejsce wstrzyknięcia antygenu, przeciwko któremu układ odpornościowy został uprzednio uwrażliwiony. Reakcja zapalna charakteryzuje się zaczerwienieniem i obrzękiem w miejscu podania antygenu. Jest to wygodny model do określania skuteczności in vivo leków immunosupresyjnych. skórną reakcję DTH można wywołać albo poprzez adoptywny transfer antygenowo swoistych limfocytów T, albo poprzez aktywne uodpornienie antygenem, a następnie wewnątrzskórne podanie tego antygenu w celu wywołania reakcji zapalnej w określonym obszarze skóry. Odpowiedzi DTH można indukować w stosunku do różnych antygenów, np. owalbuminy, tuberkuliny, toksoidu tężcowego lub hemocyjaniny z małża klucznika (KLH).
W niniejszej pracy demonstrujemy, jak wywołać aktywną reakcję DTH u szczurów linii Lewis. W pierwszej kolejności przygotujemy emulsję woda-w-oleju z KLH, będącego badanym antygenem, w pełnym adjuwancie Freunda, a następnie wstrzykniemy tę emulsję podskórnie szczurom. Pozwoli to uwrażliwić układ odpornościowy na wytworzenie komórek T pamięci skierowanych przeciwko KLH. Siedem dni później wykonamy próbę prowokacyjną poprzez wstrzyknięcie w skórę grzbietu szczurów KLH po jednej stronie oraz owalbuminy, będącej antygenem nieistotnym, po drugiej stronie. Reakcja zapalna będzie widoczna po 16–72 godzinach, a obszar zaczerwienienia i obrzęku zostanie zmierzony jako wskaźnik nasilenia reakcji DTH.

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez CCR7-efektorowe limfocyty T pamięci. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak indukować aktywną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie aktywnej nadwrażliwości opóźnionej (DTH) u szczurów

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez efektorowe limfocyty T pamięci wykazujące ekspresję CCR7, które naciekają miejsce wstrzyknięcia...

Witam, nazywam się Christine Beaton. Pracuję w laboratorium George'a Chandiego w Katedrze Fizjologii i Biofizyki na UCI. Dzisiaj pokażę Państwu, jak indukować aktywną reakcję nadwrażliwości opóźnionej (DTH) u szczurów.W tym celu przygotuję emulsję KLH, który jest moim antygenem, w adjuwancie Freonda. Następnie wstrzyknę tę emulsję w nasadę ogona szczurów linii Lewis. Spowoduje to immunizację szczurów przeciwko KLH. Po tygodniu podam szczurom dawkę przypominającą KLH i zmierzę reakcję DTH poprzez pomiar obrzęku.Jest to miejsce wywołania reakcji i wykorzystujemy je w laboratorium, aby zaobserwować wpływ blokerów kanałów PO na reakcje zapalne, takie jak DTH. Oto niepełny adiuwant trans, którego użyję do przygotowania emulsji. Mogłabym również użyć pełnego adiuwanta trans.Oto kwarc KLH, który jest dzisiaj moim antygenem, oraz roztwór o stężeniu 2 mg/ml w PBS. Użyję tej strzykawki 5 ml, aby pobrać niekompletny adjuwant Incomplete Freund's Adjuvant i przenieść go do probówki 15 ml. Następnie umieszczę probówkę na wortexie i podczas mieszania będę dodawać antygen kropla po kropli do adjuwantu.Następnie będę mieszać próbkę w wirówce typu vortex przez kolejne pięć minut. Po zakończeniu tej

induction-monitoring-active-delayed-type-hypersensitivity-dth

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Indukcja i monitorowanie czynnej opóźnionej hiperreaktywności typu IV (DTH) u szczurów

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez limfocyty T pamięci efektorowej (TEM) wykazujące ekspresję CCR7. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak aktywować swoiste dla antygenu komórki TEM, indukować adopcyjną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie adoptywnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

W niniejszym materiale prezentujemy metodę indukowania oraz rejestrowania przebiegu reakcji nadwrażliwości opóźnionej (DTH) w uchu szczura. Następnie demonstrujemy przygotowanie tkanki ucha szczura do obrazowania dwufotonowego odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T.

Obrazowanie limfocytów T pamięci efektorowej w uchu po indukcji adoptywnej reakcji nadwrażliwości opóźnionej

W niniejszym filmie przedstawiono sposób indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL oraz metodę oceny stopnia jego nasilenia za pomocą badania histopatologicznego.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL

Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Reakcje alergiczne, charakteryzujące się aktywacją komórek tucznych i bazofilów, są napędzane przez sieciowanie IgE i uwalnianie mediatorów prozapalnych. Ilościową ocenę reakcji alergicznych można uzyskać, stosując barwnik Evans Blue do monitorowania zmian przepuszczalności naczyń krwionośnych po prowokacji alergenem.

Pomiar miejscowej anafilaksji u myszy

Tutaj prezentujemy nową metodę dokładnego pomiaru różnic temperatur ciała w modelach myszy z pasywną anafilaksją układową (PSA) i alergią pokarmową za pomocą termometru na podczerwień. Procedura ta została dokładnie odwzorowana w poprzednich wynikach PSA.

Pomiar temperatury ciała myszy za pomocą termometru na podczerwień podczas pasywnej ogólnoustrojowej anafilaksji i oceny alergii pokarmowej

Opisujemy model immunizacji in vivo, translacyjnego zapalenia wątroby u myszy BALB/c, który może być wykorzystany do badania patogenezy indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby, w tym różnic płci obserwowanych w tej chorobie. Opiszemy, w jaki sposób model ten demonstruje powtarzalne analizy przy użyciu technik eksperymentalnych in vivo i in vitro.

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Nadwrażliwość kontaktowa (CHS) to mysi eksperymentalny model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry (ACD). CHS opiera się na uczuleniu na reaktywny hapten poprzez malowanie ogolonej skóry klatki piersiowej i brzucha, a następnie prowokację skóry ucha rozcieńczonym haptenem, powodując reakcję obrzęku, która jest oceniana na różne sposoby.

Nadwrażliwość kontaktowa jako mysi model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

Próby wyizolowania podjednostki katalitycznej telomerazy, TERT, w ilościach wystarczających do badań strukturalnych, przez ponad dekadę przynosiły ograniczone rezultaty. W niniejszej pracy przedstawiamy metody izolacji rekombinowanej białka TERT z Tribolium castaneum (TcTERT) oraz rekonstrukcji aktywnego kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) telomerazy T. castaneum in vitro.

In vitro Rekonstytucja aktywnej telomerazy T. castaneum

Poznaj metodę indukcji aktywnej nadwrażliwości typu opóźnionego u szczurów Lewis przy użyciu emulsji antygenu KLH z adiuwantem Freunda. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi zapalnej i dynamiki reakcji immunologicznej.

Indukcja i monitorowanie aktywnej nadwrażliwości opóźnionej (DTH) u szczurów

Przeglądaj więcej filmów