Indukcja i monitorowanie aktywnej nadwrażliwości opóźnionej (DTH) u szczurów

Witam, nazywam się Christine Beaton. Pracuję w laboratorium George'a Chandiego w Katedrze Fizjologii i Biofizyki na UCI. Dzisiaj pokażę Państwu, jak indukować aktywną reakcję nadwrażliwości opóźnionej (DTH) u szczurów.

W tym celu przygotuję emulsję KLH, który jest moim antygenem, w adjuwancie Freonda. Następnie wstrzyknę tę emulsję w nasadę ogona szczurów linii Lewis. Spowoduje to immunizację szczurów przeciwko KLH. Po tygodniu podam szczurom dawkę przypominającą KLH i zmierzę reakcję DTH poprzez pomiar obrzęku.

Jest to miejsce wywołania reakcji i wykorzystujemy je w laboratorium, aby zaobserwować wpływ blokerów kanałów PO na reakcje zapalne, takie jak DTH. Oto niepełny adiuwant trans, którego użyję do przygotowania emulsji. Mogłabym również użyć pełnego adiuwanta trans.

Oto kwarc KLH, który jest dzisiaj moim antygenem, oraz roztwór o stężeniu 2 mg/ml w PBS. Użyję tej strzykawki 5 ml, aby pobrać niekompletny adjuwant Incomplete Freund's Adjuvant i przenieść go do probówki 15 ml. Następnie umieszczę probówkę na wortexie i podczas mieszania będę dodawać antygen kropla po kropli do adjuwantu.

Następnie będę mieszać próbkę w wirówce typu vortex przez kolejne pięć minut. Po zakończeniu tej czynności napełnię szklaną strzykawkę o pojemności 5 ml przygotowaną mieszaniną; musi to być strzykawka szklana, ponieważ adiuwant wykazuje tendencję do rozpuszczania plastiku. Ustaliliśmy, że strzykawki o pojemności 5 ml są najlepsze do przygotowania emulsji.

Mniejsze lub większe nie są tak dobre. Po napełnieniu strzykawki mieszaniną, użyję tego metalowego łącznika, aby połączyć szklaną strzykawkę z drugą szklaną strzykawką o pojemności 5 ml. Następnie będę wywierać nacisk na strzykawki, aby mieszanina przemieszczała się z jednej strzykawki do drugiej tak szybko, jak to możliwe, aż do momentu, gdy emulsja stanie się naprawdę gęsta, i wtedy będzie gotowa do wstrzyknięcia.

Wprowadzę 2,5 ml adiuwantu. Najpierw wstrzyknę powietrze, aby łatwiej było pobrać adiuwant, a następnie przeleję cały adiuwant do probówki. Teraz pobiorę 2,5 ml tej zawiesiny i dodam ją do probówki, mieszając na wortexie.

Ponieważ pobrałem 2,5 ml adiuwantu, pobiorę również 2,5 ml KLH. W miarę jak będę dodawać go kropla po kropli, zobaczą Państwo, że mieszanina zmieni kolor na biały. W ten sposób dodałem cały antygen do adiuwantu.

W związku z tym wymieszam zawiesinę w wirówce vortex przez kolejne pięć minut. Ponieważ nie chcę trzymać probówki w ręku przez cały ten czas, przymocuję ją do urządzenia taśmą. Należy ustawić szybkość wirowania tak, aby w probówce powstał wir, ale jednocześnie nie była ona zbyt duża, by zawartość nie wypłynęła. Pozostawię ją w ten sposób na pięć minut.

Pięć minut minęło. Teraz zatrzymuję wortex, a moja mieszanina ma biały kolor. Wyjmuję zatem probówkę. Ups.

Mieszanina jest już całkowicie biała, ale wciąż pozostaje dość płynna. Do iniekcji potrzebowałem gęstszej konsystencji, dlatego teraz przeleję całą mieszaninę do szklanej strzykawki o pojemności 5 ml.

Strzykawki zostały poddane autoklawowaniu. Łączę zatem kompletną strzykawkę z moim mostkiem, a z drugiej strzykawki podłączam tylko cylinder.

Zostawiam tłok wyjęty, a następnie wlewam mieszaninę do górnej strzykawki. Przenoszę całą zawartość do dolnej strzykawki. Następnie muszę usunąć pęcherzyk powietrza, który tutaj pozostał.

Odłączę teraz górną strzykawkę i usunę pęcherzyk powietrza. Pęcherzyk jest trudny do zauważenia, ale znajduje się tutaj. Zatem usuwam pęcherzyk powietrza.

Wypycham go również poza mostek, a następnie ponownie łączę górną strzykawkę. Upewniam się, że wszystkie elementy są szczelnie połączone, a potem przenoszę mieszaninę z jednej strzykawki do drugiej. Na początku jest to łatwe, ale wkrótce mieszanina zacznie twardnieć.

Zatem dzisiejszego wieczoru staje się to trudniejsze i nie chcę przerwać mostka, więc po prostu obracam strzykawki. Czasami zajmuje to więcej czasu. Różni się to w zależności od emulsji.

Prawdopodobnie zależy to również od temperatury i poziomu wilgotności. Myślę jednak, że moja emulsja jest już gotowa. Jest znacznie gęstsza niż w momencie, gdy ją wlewałem.

Jest całkowicie białe. Występuje tylko jedna faza. Nie powinno dojść do oddzielenia fazy ACO od oleju.

Roztwór jest teraz gotowy do wstrzyknięcia. Do aplikacji wykorzystam 200 µL na jedną sztukę.

W tym celu będę używać strzykawek o pojemności 3 ml. Stosuję strzykawki z systemem Luer-Lock, aby mieć pewność, że igła nie wysunie się, ponieważ emulsja może być bardzo gęsta i trudna do wstrzyknięcia. W kwestii igieł staram się używać najcieńszych możliwych, które wciąż pozwalają na przepływ emulsji.

Uznałem, że strzykawki 20 G są wystarczające dla tej emulsji. W przypadku gęstszych emulsji może być konieczne zastosowanie większych strzykawek. Obecnie wykonujemy to w taki sposób, że jedna osoba trzyma szczura, a druga wykonuje iniekcję.

Dla zapewnienia maksymalnego bezpieczeństwa osoba trzymająca szczury – mimo że są one bardzo spokojne i przyzwyczajone do kontaktu z człowiekiem – używa rękawic odpornych na ugryzienia gryzoni, aby uniknąć potencjalnego pogryzienia. Następnie wprowadzam całą emulsję do jednej szklanej strzykawki, a pustą szklaną strzykawkę odłączam od mostka. W jej miejsce wkładam plastikową strzykawkę 3 ml typu Luer-Lock.

Teraz przenoszę więcej materiału, niż jest wymagane dla jednej rynienki emulsji. Wypycham pęcherzyk powietrza. Ponieważ zamierzam wstrzyknąć 200 µL na rynienkę, pozostawiam w strzykawce 300 µL.

Odłączam mostek, nakładam igłę na plastikową strzykawkę, a następnie napełniam igłę i przesuwam tłok do poziomu 200 µL. W ten sposób upewniam się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza. Teraz jesteśmy gotowi do wstrzyknięcia.

Musimy upewnić się, że szczur się nie rusza. Chwytam zwierzę, kładąc jeden palec nad barkiem, a drugi pod nim, a drugą ręką trzymam tylne łapy i ogon. Wykonamy iniekcje w boki: 10 µL po jednej stronie i 10 µL po drugiej. W zeszłym tygodniu zimmunizowałem szczury emulsją zawierającą KLH jako antygen.

Dzisiaj wykonam u nich wewnątrzskórnie na grzbiecie challenge przy użyciu KLH, który jest moim antygenem, oraz albuminy jaja kurzego, która jest odpowiednim antygenem; aby jednak móc wykonać wstrzyknięcia wewnątrzskórne na grzbiecie, muszę je najpierw ogolić. W tym celu używam zwykłej golarki elektrycznej. Wymieniam igły pomiędzy poszczególnymi szczurami, aby upewnić się, że igła nie jest tępa.

Ułatwia to znacznie wstrzykiwanie wewnątrzskórne, szczególnie że wstrzykuję małe objętości, po 20 µL każdego antygenu. Wstrzyknęłam oba antygeny wszystkim szczurom i zostawię je w klatkach do jutra. Jutro będziemy mogli zaobserwować stan zapalny.

W miejscu wstrzyknięcia pojawi się zaczerwienienie i obrzęk, co pozwoli nam zmierzyć średnicę obszaru zapalnego jako miarę stanu zapalnego. Wczoraj podano szczurom do skóry grzbietu odpowiedni antygen, którym jest KLH, oraz antygen nieistotny, czyli albuminę. Teraz, 24 godziny później, sprawdzę szczury, aby ocenić, czy wystąpił stan zapalny.

Oczekuję zatem wystąpienia stanu zapalnego wyłącznie w miejscu wstrzyknięcia KLH, który objawi się zaczerwienieniem i obrzękiem. Po stwierdzeniu stanu zapalnego zmierzę obszar zapalny, mierząc po prostu średnicę tej strefy. Tutaj znajduje się miejsce wstrzyknięcia KLH i można wyraźnie zauważyć silny stan zapalny.

Jest ono bardzo czerwone w porównaniu do normalnej skóry i jest opuchnięte. Jeśli teraz spojrzymy na drugie miejsce, w które podano albuminę, można dostrzec miejsce wstrzyknięcia, ale nie występuje tu znaczące zaczerwienienie ani obrzęk. Zatem kontrola negatywna zadziałała.

Teraz zmierzę obszar stanu zapalnego. W tym celu użyję zwykłej linijki i wykonam pomiar w milimetrach. Ten obszar ma 6 mm, a następnie wykonuję drugi pomiar.

Ten obszar ma pięć milimetrów. Obrzęk jest niewielki, dokonam pomiaru, ale wynosi on ledwie jeden milimetr. Przedstawiłam zatem sposób przygotowania emulsji z antygenem, metodę immunizacji szczurów tą emulsją, a następnie sposób na ich stymulację po tygodniu za pomocą antygenu użytego do immunizacji oraz antygenu odpowiedniego, a także metodę wizualizacji i pomiaru stopnia stanu zapalnego w laboratorium Chan.

Stosujemy tę technikę rutynowo jako prosty test w celu pomiaru wpływu blokerów kanałów potasowych na stan zapalny u szczurów.