Name: Transfekcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych za pomocą Amaxa Nucleofector (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Poznaj metodę transfekcji ludzkich nerwowych komórek macierzystych za pomocą aparatu Amaxa Nucleofector. Protokół zapewnia wysoką wydajność transfekcji i żywotność komórek w badaniach nad funkcją genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Philipowi H. Schwartzowi z National Human Neural Stem Cell Resource w Children s Hospital, Orange County Research Institute za udostępnienie kultur hNSPC.

Uwaga: Należy zapoznać się z artykułem Passaging Human Neural Stem Cells (<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a>) oraz artykułem Counting Human Neural Stem Cells (<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a>), aby dowiedzieć się, jak resuspenderować i liczyć hNSPCs.
Przygotowanie
<ol>
<li>Upewnij się, że dostępna jest wystarczająca liczba komórek do transfekcji (kilka milionów komórek dla każdego transfekowanego DNA).</li>
<li>Przeddzień transfekcji pokryj naczynie do hodowli tkankowej, do którego zostaną wysiane transfektowane komórki, ludzką fibronektyną w stężeniu 10 µg/ml. Bezpośrednio przed rozpoczęciem protokołu transfekcji usuń fibronektynę, wypłucz naczynie PBS i wlej do niego pożywkę hodowlaną. Pozostaw naczynie w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C, aby podgrzać pożywkę. Dodatkowo umieść w inkubatorze 1 ml pożywki hodowlanej, aby wstępnie ogrzać ją do 37°C.</li>
<li>Umieść DNA przeznaczone do transfekcji oraz roztwór do transfekcji (firmy Amaxa) na lodzie.</li>
</ol>
Transfekcja
<ol>
<li>Przemyj określoną liczbę komórek roztworem PBS (zazwyczaj stosujemy ~ 5 x 106 komórek na jedną transfekcję). Odwiruj komórki w wirowarce (1000 rpm (~200xg) przez 5 minut), odlej jak największą ilość PBS i resuspender osad komórkowy w 100 µl roztworu do transfekcji dostarczonego w zestawie. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,7 ml.</li>
<li>Dodaj 5 µl DNA (~5-10 µg DNA na jedną transfekcję) do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj.</li>
<li>Za pomocą mini-pipety Amaxa przenieś mieszaninę komórek i DNA do kuwety do transfekcji Amaxa. Przygotuj 1 ml podgrzanej pożywki hodowlanej do następnego kroku. Wyjmij również z inkubatora naczynie z pożywką hodowlaną i umieść je w dygestorium do hodowli tkanek.</li>
<li>Włóż kuwetę do Nucleofektora, obróć pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara i wybierz program „A-033”. Naciśnij Enter.</li>
<li>O pomyślnym przebiegu transfekcji świadczy obecność bardzo gęstej warstwy pęcherzyków powietrza na powierzchni roztworu w kuwecie. Dodaj do kuwety 500 µl ciepłej pożywki, a następnie za pomocą mini-pipety Amaxa przenieś transfekowane komórki do naczynia z podgrzaną pożywką. Przepłucz kuwetę kolejną porcją ciepłej pożywki i dodaj płuczkę do tego samego naczynia. Umieść naczynie z komórkami w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C.</li>
</ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

Niniejszy protokół opisuje stosunkowo szybką i wydajną procedurę transfekcji hNSPCs. Stosując tę procedurę, uzyskaliśmy początkową wydajność transfekcji na poziomie ~35%. Komórki poddane transfekcji tą metodą mogą być wykorzystywane w badaniach krótkoterminowych (komórki przejściowo transfekowane) lub w badaniach długoterminowych, jeśli zastosowany zostanie czynnik selekcyjny w celu wytworzenia stabilnie transfekowanej populacji. Otrzymaliśmy stabilnie transfekowane komórki, w których ~70% populacji wykazuje ekspresję bi...

<table><tbody><tr><td>Urządzenie Nucleofector</td><td>Narzędzie</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do nukleofekcji mysich neuralnych komórek macierzystych</td><td>Odczynnik</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

transfekcja ludzkich neuralnych komórek macierzystych za pomocą nukleofektora amaxa

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfekcja pierwotnych komórek neuronalnych ssaków, takich jak ludzkie komórki macierzyste/prekursory neuronalne (hNSPCs), z użyciem powszechnie stosowanych kationowych lipidowych odczynników do transfekcji często skutkowała słabą żywotnością komórek i niską wydajnością transfekcji. Inne mechaniczne metody wprowadzania interesującego genu, takie jak „armatka genowa” (gene gun) lub mikroiniekcja, są również ograniczone przez niską żywotność komórek i niewielką liczbę przetransfekowanych komórek. Strategia wykorzystania konstruktów wirusowych do wprowadzania egzogennego genu do komórek pierwotnych była ograniczona zarówno nakładem czasu i pracy niezbędnym do stworzenia wektorów wirusowych, jak i potencjalnymi kwestiami bezpieczeństwa. Opisujemy tutaj szczegółowy protokół transfekcji hNSPCs przy użyciu urządzenia i technologii Nucleofector firmy Amaxa, z parametrami prądu elektrycznego i roztworami buforowymi zoptymalizowanymi specjalnie pod kątem transfekcji neuronalnych komórek macierzystych. Stosując ten protokół, osiągnęliśmy początkową wydajność transfekcji na poziomie ~35% oraz ~70% po transfekcji stabilnej. Protokół polega na połączeniu dużej liczby hNSPCs z DNA przeznaczonym do transfekcji w odpowiednim buforze, a następnie przeprowadzeniu elektroporacji za pomocą urządzenia Nucleofector.

Wprowadzenie interesującego genu do komórki jest potężną metodą wyjaśniania jego funkcji in vivo. Niniejszy protokół opisuje wydajną metodę transfekcji hodowli ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs) przy użyciu aparatu do elektroporacji Nucleofector firmy Amaxa.

Transfekcja ludzkich neuralnych komórek macierzystych za pomocą nukleofektora Amaxa

Transfekcja pierwotnych komórek nerwowych ssaków, takich jak ludzkie komórki macierzyste/prekursory neuronalne (hNSPCs), przy użyciu powszechnie stosowanej transfekcji kationowymi lipidami...

Cześć, jestem Steve. Pracuję w laboratorium dr. Flanagana w Departamencie Patologii na uc, Irvine. Dzisiaj pokażę wam, jak przeprowadzić transfekcję ludzkich prekursorowych komórek neuronalnych z wykorzystaniem czynnika jądrowego maxis.Na początek będzie potrzebna duża liczba komórek. Sugeruję wykorzystanie co najmniej jednej konfluentnej kolby T 25, ponieważ protokół ten wymaga bardzo wysokiej gęstości komórek, zatem niezbędny będzie co najmniej milion komórek. W pierwszej kolejności odseparuję komórki od powierzchni za pomocą buforu do dysocjacji komórek, a następnie je policzę.W kwestii tej procedury proszę odnieść się do mojego protokołu pakowania. Powodem, dla którego w eksperymentach z transfekcją preferuję system Amaxa, jest fakt, że firma Amaxa opracowuje dedykowane protokoły transfekcji dla konkretnych typów komórek, a w moim przypadku – dla neuronalnych komórek macierzystych. Rozwiązanie to sprawdza się znakomicie.Zapewnia bardzo wysoką wydajność transfekcji oraz bardzo wysoką żywotność komórek. Zacznijmy zatem. Jestem teraz gotowy do przeprowadzenia transfekcji.W ramach przygotowań do tej transfekcji, naczynie do hodowli tkankowej zostało uprzednio pokryte fibryną na noc

transfecting-human-neural-stem-cells-with-the-amaxa-nucleofector

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transfekcja ludzkich komórek macierzystych ośrodkowego układu nerwowego za pomocą urządzenia Amaxa Nucleofector

Pomimo niedawnych postępów w modyfikacjach genetycznych, transfekcja ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESCs) pozostaje procesem nieprzewidywalnym. Według naszej wiedzy, w literaturze nie opisano systematycznych i wydajnych metod transfekcji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). W niniejszej pracy opisujemy niezawodne protokoły wydajnej transfekcji i nukleofekcji ludzkich iPSCs.

Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film opisuje precyzyjną technikę edycji genomu w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC), wykorzystującą TALENy do tworzenia dwuniciowych pęknięć w docelowym locus, indukując ukierunkowaną homologię naprawę integracji genów białka fluorescencji.

Ukierunkowana integracja genów za pośrednictwem TALEN: wykorzystanie zmodyfikowanych nukleaz specyficznych dla sekwencji do precyzyjnej insercji genu białka fluorescencyjnego do hiPSC

Ten film pokazuje bezpośrednie przeprogramowanie genetycznie zmodyfikowanych hematopoetycznych komórek progenitorowych na neuronalne komórki macierzyste. Czynniki transkrypcyjne ulegające ekspresji przez krwiotwórcze komórki progenitorowe wywołują kaskadę zdarzeń molekularnych ułatwiających ich transformację. Dalsze specyficzne pożywki są używane do selekcji i wzrostu indukowanych neuronalnych komórek macierzystych.

Bezpośrednie przeprogramowanie hematopoetycznych komórek progenitorowych w neuronalne komórki macierzyste

Ten film pokazuje proces indukowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania się w neurony poprzez transfekcję ich zmodyfikowanymi lentiwirusami przenoszącymi gen neurogennego czynnika transkrypcyjnego pod kontrolą elementu reagującego na tetracyklinę, a następnie leczenie pochodną tetracykliny i pożywką do dojrzewania.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronach przy użyciu zmodyfikowanych lentiwirusów

Reporterowe linie komórkowe oferują sposób na wizualizację, śledzenie i izolowanie interesujących komórek z heterogenicznych populacji. Jednak celowanie w geny za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych jest wyjątkowo nieefektywne. W tym miejscu opisujemy celowanie w locus czynnika transkrypcyjnego PITX3 specyficznego dla OUN za pomocą EGFP przy użyciu rekombinacji homologicznej wzmocnionej nukleazą palca cynkowego.

Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Edycja genów za pośrednictwem TALEN-TALEN w locus AAVS1 umożliwia wysoce efektywną addycję transgenów w ludzkich iPSC. Protokół ten opisuje procedury przygotowania iPSC do dostarczania TALEN i wektora dawcy, transfekcji iPSC oraz selekcji i izolacji klonów iPSC w celu osiągnięcia ukierunkowanej integracji genu GFP w celu wygenerowania linii reporterowych.

Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Tutaj opisujemy protokół inżynierii chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych w celu osiągnięcia precyzyjnej modulacji neuronalnej poprzez różnicowanie tych komórek w dopaminergiczne komórki prekursorowe, przeszczepianie ich do mysich modeli choroby Parkinsona oraz ocenę wyników behawioralnych i elektrofizjologicznych w celu potwierdzenia udanej integracji i funkcjonalnej skuteczności przeszczepionych komórek.

Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Poznaj metodę transfekcji ludzkich nerwowych komórek macierzystych za pomocą aparatu Amaxa Nucleofector. Protokół zapewnia wysoką wydajność transfekcji i żywotność komórek w badaniach nad funkcją genów.

Transfekcja ludzkich neuralnych komórek macierzystych za pomocą nukleofektora Amaxa

Przeglądaj więcej filmów