Transfekcja ludzkich neuralnych komórek macierzystych za pomocą nukleofektora Amaxa

Cześć, jestem Steve. Pracuję w laboratorium dr. Flanagana w Departamencie Patologii na uc, Irvine. Dzisiaj pokażę wam, jak przeprowadzić transfekcję ludzkich prekursorowych komórek neuronalnych z wykorzystaniem czynnika jądrowego maxis.

Na początek będzie potrzebna duża liczba komórek. Sugeruję wykorzystanie co najmniej jednej konfluentnej kolby T 25, ponieważ protokół ten wymaga bardzo wysokiej gęstości komórek, zatem niezbędny będzie co najmniej milion komórek. W pierwszej kolejności odseparuję komórki od powierzchni za pomocą buforu do dysocjacji komórek, a następnie je policzę.

W kwestii tej procedury proszę odnieść się do mojego protokołu pakowania. Powodem, dla którego w eksperymentach z transfekcją preferuję system Amaxa, jest fakt, że firma Amaxa opracowuje dedykowane protokoły transfekcji dla konkretnych typów komórek, a w moim przypadku – dla neuronalnych komórek macierzystych. Rozwiązanie to sprawdza się znakomicie.

Zapewnia bardzo wysoką wydajność transfekcji oraz bardzo wysoką żywotność komórek. Zacznijmy zatem. Jestem teraz gotowy do przeprowadzenia transfekcji.

W ramach przygotowań do tej transfekcji, naczynie do hodowli tkankowej zostało uprzednio pokryte fibryną na noc. Następnie do naczynia wlano pożywkę wzrostową. Obecnie naczynie znajduje się w inkubatorze i oczekuje na wprowadzenie komórek.

Przygotowałem również wszystkie odczynniki, wektor DNA oraz roztwór do transfekcji. Wszystkie czekają tutaj w temperaturze lodowej. Jestem gotowy do rozpoczęcia transfekcji.

Oto czynnik jądrowy M max, a przed umieszczeniem go w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zdezynfekuję go 70% etanolem, a następnie wytrę ręcznikiem papierowym. Odliczyłem komórki, aby uzyskać łącznie 4 miliony komórek i je zawiesić. Teraz jestem gotowy do rozpoczęcia transfekcji.

Najpierw usunę pożywkę, w której znajdują się komórki. Mam tutaj osad komórkowy i odessam pożywkę, w której przebywały. Postaram się usunąć jak najwięcej pożywki, ponieważ nie chcę, aby w pożywce do transfekcji znajdowały się żadne białka ani inne substancje, gdyż mogłoby to wpłynąć na protokół transfekcji.

Usunąłem niemal całą pożywkę i teraz zawieszę ten osad komórkowy w 100 µL specjalnie sformułowanego roztworu czynnika jądrowego dla mysich neuronów macierzystych. Firma Mxa produkuje roztwór do transfekcji mysich neuronów macierzystych i nie oferuje takiego dla ludzkich neuronów macierzystych, jednak odkryliśmy, że roztwór przeznaczony dla komórek mysich działa bardzo dobrze. Zatem dodaję 100 µL tego roztworu czynnika jądrowego dla mysich neuronów macierzystych.

Następnie ponownie zawieszę osad komórkowy, dbając o to, aby nie pozostały w nim żadne grudki komórek, tak aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową. W tym celu będę pipetować ciecz w górę i w dół około 10 razy.

Sądzę, że mam teraz dość jednorodną mieszaninę, którą przeniosę do otwartej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Używam pipety P 1000 i upewniam się, że pobieram cały ten roztwór. Mam teraz 4 miliony komórek zawieszonych w nowym roztworze do transfekcji mysiej, a teraz dodam 5 µL wektora.

Przez cały ten czas przechowywałem to na lodzie. Teraz najpierw pobiorę 5 µL. Następnie dodam to do zawiesiny komórkowej.

Teraz użyję pipety P 200 ustawionej na około 50 µL i bardzo dokładnie wymieszam komórki z wektorem. W tym celu będę pipetować zawiesinę w górę i w dół 10 razy. Gotowe.

Jestem gotowy do transfekcji. Otworę zatem nową płytkę. Pobiorę również specjalną pipetę dostarczoną przez firmę Amaxa.

Zdejmuję teraz zatyczkę i delikatnie wyciągam tę mieszaninę. Wprowadzam pipetę do samego dna probówki i powoli wydmuchuję roztwór. Włączam teraz Max Nuclear Factor, ustawiam wartość na 33 0 3 3 i naciskam enter.

Następnie umieszczę probówkę w uchwycie i obrócę koło, po czym będę gotowy do transfekcji. Zanim jednak to zrobię, upewnię się, że mam przygotowane ciepłe medium, które zostanie bezzwłocznie dodane do transfekowanych komórek. Dodanie ciepłego medium do probówki bezpośrednio po transfekcji pomaga zwiększyć żywotność komórek.

Przygotuję zatem pipetę P 1000. Odbiorę również płytkę z pożywką, która znajduje się obecnie w inkubatorze, aby móc niezwłocznie przenieść komórki do medium. Teraz ponownie nacisnę enter i proces jest zakończony.

W przypadku udanej transfekcji, jak widać, pojawia się bardzo gruba warstwa pęcherzyków powietrza, która świadczy o powodzeniu procesu. Teraz dodam 500 µL podgrzanej wcześniej pożywki do probówki Vette. Dodaję więcej pożywki, której komórki bardzo potrzebują, a następnie użyję tej samej pipety MX, aby wyjąć komórki z probówki Vette.

Są one w tej chwili bardzo zestresowane. Dlatego przeniosę je bezpośrednio do ciepłej pożywki, dodając więcej ciepłej pożywki. I wreszcie, w ostatnim kroku, wypłuczę Q vete kolejną porcją podgrzanej wcześniej pożywki, aby upewnić się, że odzyskałam wszystkie te komórki, a następnie umieszczę wszystko w tej samej studzience L i niezwłocznie włożę płytkę do inkubatora.

Na tym obrazie widzimy ludzkie komórki prekursorowe neuronów, które zostały przetransfekowane czynnikiem jądrowym access i wysiane na kratkowanych szkiełkach przedmiotowych. Już dwa dni po transfekcji obserwujemy wydajność transfekcji na poziomie około 50%, co można stwierdzić na podstawie ekspresji GFP. W dzisiejszym materiale pokazałem Państwu, jak przeprowadzić transfekcję ludzkich komórek prekursorowych neuronów z wykorzystaniem czynnika jądrowego Xis.

Powodzenia w przeprowadzaniu transfekcji.