Neurogeneza korowa: przejście od postępów w laboratorium do terapii komórkowych

Nazywam się Arnold Krickstein. Jestem dyrektorem Instytutu Medycyny Regeneracji na UCSF, a moim obszarem zainteresowań jest neurobiologia rozwojowa. W szczególności jesteśmy bardzo zainteresowani wczesnymi etapami rozwoju kory mózgowej i przyglądamy się neuronalnym komórkom macierzystym i progenitorowym oraz badamy sposób, w jaki generują neurony i jak te neurony migrują i zaczynają tworzyć obwody do rozwijającego się mózgu, zwłaszcza w korze

Cóż, pojawienie się elektroporacji in utero, myślę, że było jedną z tych transformacyjnych technologii wprowadzonych przez SDO i jego kolegów w zakresie badania wczesnych etapów rozwoju mózgu, ponieważ pozwala to na przeprowadzanie eksperymentów z zyskiem i utratą funkcji dla całej gamy genów. Można to zrobić w stosunkowo prosty sposób, wprowadzając te geny bezpośrednio do nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych, które tworzą neurony we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej. Technika ta polega po prostu na wstrzyknięciu DNA w postaci plazmidu do komór mózgowych u zwierzęcia w stadium embrionalnym, a następnie zastosowaniu krótkiego prądu elektrycznego, który kieruje te plazmidy do komórek wyściełających komorę, które są komórkami nabłonkowymi neuro GL radiowymi, które następnie wytwarzają neurony i ostatecznie komórki glejowe.

Może to obejmować użycie krótkich, interferujących RNA, które mogą obniżać lub obniżać ekspresję określonych genów, lub też można bezpośrednio nadekspresjonować określone produkty genowe. Oba te zestawy eksperymentów skupiają się na komplementarnych efektach na rozwijający się mózg. Cząsteczki docelowe mogą obejmować prawie wszystko, co jest zaangażowane we wczesnych stadiach rozwoju mózgu, a nawet później, jeśli chodzi o etapy rozwoju synaptycznego lub dojrzewania.

Pojawienie się tej techniki już wywarło duży wpływ na badania nad rozwijającym się mózgiem i obiecuje wywrzeć jeszcze większy wpływ w najbliższej przyszłości. Komórki wyściełające komorę I które ostatecznie tworzą wszystkie neurony w komórkach glejowych w mózgu, zaczynają się jako komórki nabłonka nerwowego. Ale mniej więcej w czasie, gdy neurony zaczynają się rozwijać, przekształcają się lub zaczynają przekształcać się w rodzaj komórki glejowej znanej jako promienista komórka glejowa.

Nawiązują wyspecjalizowane kontakty z naczyniami krwionośnymi i kierują migracją młodych neuronów. I mniej więcej w tym czasie zaczynają tworzyć ciekawy zestaw różnego rodzaju podziałów. Tworzą rodzaj symetrycznego podziału progenitorowego, gdy wytwarzają więcej kopii siebie, to znaczy wytwarzają dwie radiokomórkowe komórki glejowe za każdym razem, gdy się dzielą.

Dokonują również asymetrycznych podziałów neurogennych, w których dzielą się i samoodnawiają, a w każdym cyklu komórkowym generują komórkę potomną, która staje się neuronem. Okazuje się również, że tworzą one bardzo interesujący trzeci rodzaj podziału, w którym jest asymetryczny w tym sensie, że komórki potomne są różne. Jedna jest samoodnawiającą się radiokomórką glejową, a druga staje się innym rodzajem komórki progenitorowej.

Nazwalibyśmy go pośrednim progenitorem, który migruje z komory, a następnie dzieli się ogólnie w innej strefie proliferacyjnej znanej jako strefa podkomorowa. Metoda elektroporacji in utero jest wygodnym sposobem wprowadzania tych nokautujących lub nadekspresyjnych DNA do radiokomórkowych komórek glejowych na etapach, kiedy dokonują one różnych rodzajów podziałów. Używaliśmy również retrowirusa, który eksprymuje białko zielonej fluorescencji jako marker linii, sposób wstrzykiwania tego markera retrowirusa do komór w tym samym wieku, a następnie możemy śledzić losy tych indywidualnie znakowanych komórek, gdy dzielą się i generują klony komórek potomnych.

A dzięki obrazowaniu poklatkowemu, które wykonujemy w kulturach warstwowych, możemy śledzić lub śledzić ostateczne losy tych komórek podczas ich migracji do kory mózgowej. Chociaż od pewnego czasu sądzono, że strefa komorowa jest głównym źródłem neurogenezy w rozwijającym się mózgu, to jednak strefa podkomorowa stała się w zarodku co najmniej coraz bardziej doceniana jako źródło znacznych ilości neurogenezy. Odkryliśmy, że w strefie podkomorowej, pośrednie komórki progenitorowe, które same powstają z fal radiowych w strefie komorowej, migrują tam i dzielą się w symetryczny sposób, albo aby wytworzyć więcej samoodnawiających się pośrednich komórek progenitorowych, albo w symetrycznym podziale końcowym, aby wytworzyć pary neuronów, które następnie migrują do kory mózgowej.

Tak więc strefa podkomorowa okazuje się być bardzo ważną i interesującą strefą neurogenezy w embrionalnym lub rozwijającym się mózgu. Ponadto te pośrednie komórki progenitorowe, podczas gdy znajdują się w tej strefie podkomorowej, stają się komórkami wielobiegunowymi i mają zdolność, wydaje się, że poruszają się stycznie w tej strefie. A to może tłumaczyć rozproszenie klonów komórkowych, które zaobserwowano w poprzednich badaniach, na przykład przez Walsha i S Cepco jakiś czas temu w rozwijającej się korze mózgowej, również przy użyciu retrowirusów do oznaczania losów tych komórek.

Cóż, na przykład, istnieje wiele interesujących genów, które, jak się okazuje, są zaangażowane w neurogenezę lub migrację neuronów. W naszym laboratorium badaliśmy białka połączeń szczelinowych, połączenia, które leżą u podstaw tworzenia dobrze znanych kanałów połączeń szczelinowych. Ale co ciekawe, odkryliśmy, że komórki, które migrują wzdłuż promieniowego ggl, w rzeczywistości używają tych połączeń szczelinowych nie jako kanałów do komunikacji, ale jako cząsteczek adhezyjnych, aby fizycznie umożliwić tym neuronom i migrującym komórkom przyleganie do włókien promieniowych.

Badania te zostały przeprowadzone przy użyciu siRNA, które obniżyły ekspresję określonych połączeń. Na przykład połączenie 43, które jest bardzo silnie wyrażane przez radiowe ggl, a także przez ich neurony potomne i pośrednie komórki progenitorowe. Wiele z tak zwanych dorosłych komórek macierzystych, które pochodzą z mózgu płodu, w rzeczywistości jest prawdopodobnie radiokomórkami, które mogą być namnażane w hodowli, gdy są leczone odpowiednimi czynnikami wzrostu, takimi jak na przykład BFGF.

Ale oprócz tych radiowych ggl, pośrednie komórki progenitorowe mogą okazać się bardzo interesującym celem dla badań nad komórkami macierzystymi, ponieważ uważamy, że faktycznie produkują neurony o bardzo ograniczonym typie komórek. Tak więc, jeśli a, strategia polegająca na tym, na przykład, na tworzeniu dużej liczby bardzo specyficznych typów komórek neuronalnych w celu zidentyfikowania i wyizolowania pośrednich komórek progenitorowych, które są odpowiedzialne za generowanie tego konkretnego typu komórek, byłaby prawdopodobnie znacznie lepszym podejściem niż, na przykład, tworzenie rozszerzonej liczby komórek radiowych, które mogą wytworzyć całą gamę różnych typów komórek. W rzeczywistości, w badaniach, które zostały przeprowadzone in vitro, kiedy rozszerza się embrionalne linie komórek macierzystych, a następnie generuje się pojedyncze neurony z tych embrionalnych źródeł komórek macierzystych, wydaje się, że większość z tych linii przechodzi coś, co może być nawet obowiązkowym etapem nabłonkowym lub promieniowym podobnym do gleju przed faktycznym wygenerowaniem neuronów.

Na przykład, protokoły, które zostały użyte przez Austina Smitha do generowania neuronów lub nerwowych komórek macierzystych, są w rzeczywistości bardzo podobne do radiowego ggl. Przechodzą one w kinetyczną migrację jądrową. Wyrażają radioglialne czynniki transkrypcyjne i ekspresję markerów, a także generują neurony i astrocyty w taki sam sposób, jak robią to radio GL.

Podobnie, Loren Ser i inni wzięli ludzkie embrionalne komórki macierzyste i odkryli, że tworzą one rozety, w pewnym sensie samoorganizują się w strukturę typu neuro-nabłonkowego in vitro, zanim faktycznie wygenerują neurony. I znowu, te rozety składają się z komórek, które wyglądają bardzo podobnie do radiowego gl. Tak więc pomysł, że te radiowe GL są rodzajem nerwowych komórek macierzystych, myślę, że jest wspierany przez tego rodzaju dowody in vitro.

Tak więc przed rozpoczęciem neurogenezy istnieje już regionalny wzorzec, który występuje w całej strefie komorowej we wszystkich komorach, a właściwie przez cały rdzeń kręgowy. A te geny wzorcowe, które ulegają ekspresji w określonych regionach, prawdopodobnie już ograniczają losy komórek potomnych, które są tam produkowane. Na przykład, jeśli chcesz wygenerować pobudzające komórki parametaliczne, grzbietowy korowy radiowy GL wytwarza ten typ komórek, jeśli chcesz wytworzyć neurony pośrednie, być może będziesz musiał użyć komórek i wyniosłości zwojowej, ponieważ wytwarzają one te neurony lub oligodendrocyty i tak dalej.

Jeśli więc twoja strategia w badaniach nad komórkami macierzystymi, jeśli chodzi o leczenie choroby, obejmuje tworzenie dużej liczby komórek określonego typu, pewnego rodzaju interneuronów lub pewnego rodzaju pobudzających komórek projekcyjnych, to badania rozwojowe, które zaczynają ujawniać różnice między neurogenezą a tymi różnymi regionami mózgu, prawdopodobnie dostarczą wskazówek, które ostatecznie będą użyteczne w celu zaprojektowania strategii w celu rozszerzenia neuronów określonego typu komórek w celu, powiedzmy, zastępczych terapii komórkowych. Cóż, terminologia medycyny regeneracyjnej naprawdę sugeruje zdolność do regeneracji narządów. Myślę, że większość społeczeństwa myśli o komórkach macierzystych jako o metodzie zastępowania komórek i uszkodzonych tkanek.

Ale w rzeczywistości myślę, że najwcześniejsze terapie, które prawdopodobnie pojawią się w wyniku badań nad komórkami macierzystymi, będą obejmowały wykorzystanie komórek macierzystych w inny sposób, być może bardziej kreatywny. Na przykład wykorzystanie badań nad komórkami macierzystymi i laboratorium pozwalającego na badania przesiewowe pod kątem narkotyków za pomocą metod o wysokiej przepustowości, modelowania chorób przy użyciu komórek ludzkich zamiast powiedzmy komórek myszy w laboratorium. A jeśli chodzi o terapie komórkowe, to myślę, że w dużej mierze zacznie to być już wykorzystywane jako środek dostawczy, na przykład, wykorzystując zdolność niektórych komórek macierzystych do migracji w obszarach urazów lub chorób i dostarczania ładunku użytecznego lub genu lub produktu genowego, brakującego enzymu i tak dalej.

To zastosowanie, które nie obejmuje integracji komórek z istniejącymi wcześniej strukturami narządów, jest moim zdaniem niżej położonym owocem. I może się okazać, że niektóre z wcześniejszych przykładów terapii komórkowych będą obejmowały to podejście, a nie rzeczywistą wymianę komórek. Cóż, obecne federalne ograniczenia dotyczące wykorzystania funduszy NIH dla jakiejkolwiek innej liczby ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, z wyjątkiem niewielkiej, miały naprawdę mrożący wpływ na tę dziedzinę.

To sprawiło, że niektórzy młodzi badacze nie byli w terenie, a inni nie mogli zbadać potencjalnej użyteczności tych embrionalnych komórek macierzystych w laboratorium. Podejmowane są próby liberalizacji tych restrykcji. Jak większość widzów zapewne wie, prezydent zawetował jedną ustawę i prawdopodobnie, przepraszam, zaraz zawetuje inną.

Mamy nadzieję, że te zasady ulegną zmianie i że możliwe stanie się wykorzystanie funduszy NIH do badania całego szeregu nowo opracowanych linii komórek macierzystych, z których wiele ma przewagę nad pierwotną liczbą, która została stworzona przed 2001 rokiem. Ale nawet gdyby ten zakaz finansowania został zniesiony, prawdopodobnie nie pociągnęłoby to za sobą natychmiastowego przynajmniej zwiększenia finansowania tego rodzaju badań. A ponieważ ta ustawa, która na przykład została zaproponowana w Kongresie, nie jest ustawą o finansowaniu lub przywłaszczeniu, będzie miała wpływ na ułatwienie badaczom takim jak my włączania prac z tak zwanymi zatwierdzonymi i niezatwierdzonymi liniami w tej samej przestrzeni badawczej, w tym samym laboratorium, przy użyciu tego samego sprzętu lub przy użyciu tych samych zasobów.

Wszystko to byłoby znaczną poprawą, ale jest mało prawdopodobne, aby skutkowało dużym napływem rzeczywistego wsparcia, jakim są dolary na badania nad tego rodzaju działaniami. Myślę, że w tym celu nadal będziemy musieli polegać na prywatnych źródłach, w tym na funduszach stanowych, które tutaj w Kalifornii są naprawdę dobrodziejstwem dla naukowców zajmujących się komórkami macierzystymi. Inne stany, takie jak Nowy Jork, Connecticut i Massachusetts, również idą w ich ślady i wkrótce będą finansować własne inicjatywy stanowe w zakresie badań nad komórkami macierzystymi.

Myślę, że będzie to ważny motor napędzający badania w tej dziedzinie w dającej się przewidzieć przyszłości, niezależnie od tego, czy polityka NIH zmieni się wkrótce, czy nie.