Name: Mikrowzorzyste powierzchnie do badania interakcji kwasu hialuronowego z komórkami rakowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj metodę mikrowzorzystych powierzchni do badania interakcji kwasu hialuronowego z komórkami rakowymi. Technika ta umożliwia wizualizację adhezji i migracji komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za możliwość korzystania z laboratorium analizy powierzchni na Johns Hopkins, finansowanego w ramach Materials Research Science and Engineering Center przez National Science Foundation. LED jest stażystą IGERT oraz stypendystą National Science Foundation Graduate Fellow. Niniejsze badania były częściowo finansowane z grantu NIH U54CA143868.

1. Standardowa fotolitografia do produkcji stempli z mikrowzorami
<ol>
<li>Przepłucz nowy wafelek krzemowy etanolem i wysusz strumieniem powietrza. Przez cały proces używaj pęsety do manipulowania wafelkiem, aby zapobiec powstaniu defektów powierzchniowych.</li>
<li>Przenieś wafelek do powlekarki rotacyjnej i pokryj jego powierzchnię negatywowym fotorezystem SU-2025. Pokryj fotorezystem co najmniej 80% powierzchni wafelka. Wykonaj powlekanie rotacyjne przez 10 sekund przy 600rpm, a następnie przez 30 sekund przy 3000rpm. Ze względu na światłoczułość fotorezystu, od tego momentu wyłącz światła w pomieszczeniu.</li>
<li>Przenieś pokryty fotorezystem wafelek krzemowy na płytkę grzejną w celu przeprowadzenia „wygrzewania wstępnego” (soft-bake) w temperaturze 95°C przez 3 minuty. Zdejmij z płytki grzejnej i odstaw na 1 minutę do ostygnięcia.</li>
<li>Umieść wcześniej wykonaną maskę z pożądanym wzorem na powierzchni pokrytego fotorezystem wafelka krzemowego i naświetlaj promieniowaniem ultrafioletowym (UV) (350-450 nm) przez 20 sekund.</li>
<li>Przenieś wafelek krzemowy na płytkę grzejną w celu przeprowadzenia „wygrzewania końcowego” (hard-bake) w temperaturze 110°C przez 6 minut.</li>
<li>Włącz światła i zdejmij wafelek z płytki grzejnej. Na tym etapie powinny być widoczne wyraźne wzory.</li>
<li>Ostrożnie przepłucz wafelek krzemowy wywoływaczem do fotorezystu SU-8. Po trzykrotnym przepłukaniu roztworem wywoływacza, przepłucz etanolem. W przypadku wystąpienia białych osadów powtórz płukanie roztworem wywoływacza lub zanurz wafelek w roztworze wywoływacza na 2 minuty, a następnie ponownie przepłucz etanolem. Umyj wodą i wysusz powietrzem.</li>
<li>Wymieszaj roztwór elastomeru polidimetylosiloksanu (PDMS) z utwardzaczem w stosunku wagowym 10:1. Wirowarkuj przy 900rpm przez 5 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Umieść wzorowany wafelek w szalce Petriego i wlej PDMS na wafelek krzemowy. Jeśli obecne są pęcherzyki, umieść próbkę w eksykatorze i poddaj działaniu próżni przez kilka minut, aż pęcherzyki znikną.</li>
<li>Utwardzaj przez noc w temperaturze pokojowej (RT), aby utworzyć komplementarną stempel elastomerowy. Jeśli PDMS nie utwardził się całkowicie po 12 godzinach, umieść go w piekarniku w temperaturze 60°C na 30 minut.</li>
<li>Ostrożnie oddziel PDMS od wafelka krzemowego. Użyj ostrza żyletki, aby dociąć stempel do pożądanego rozmiaru. Sonicuj w etanolu przez 15 minut. Wafelki można wykorzystywać wielokrotnie do tworzenia nowych stempli elastomerowych.</li>
</ol>
2. Mikrowzorcowanie HA
<ol>
<li>Oczyść szkiełka szklane w urządzeniu do czyszczenia plazmowego przez 5 minut. Umieść wszystkie szkiełka w komorze i poddaj próżni przez 5 minut. Następnie wpuść do komory niewielki strumień tlenu. Włącz urządzenie do czyszczenia plazmowego na 5 minut. Wyjmij szkiełka z urządzenia i za pomocą pęsety umieść je w szalce Petriego.</li>
<li>Podczas czyszczenia plazmowego poddaj stemple PDMS sonikacji w etanolu przez 15 minut.</li>
<li>Przygotuj świeży 3% v/v roztwór 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) w 95% v/v etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 15 mL. Pozostaw do reakcji przez 5 minut w RT w celu utworzenia silanoli.</li>
<li>Umieść stempel PDMS wzorem do góry na uchwycie wirówki i pokryj powierzchnię z wzorem roztworem APTMS. Wykonaj spincoating przy 3500rpm przez 30 sekund. Nie dotykaj powierzchni stempla, jedynie jego boków.</li>
<li>Przenieś roztwór APTMS na oczyszczone plazmowo powierzchnie szklane: ustaw stempel stroną z wzorem do dołu na jednym końcu i delikatnie przesuń, dociskając PDMS tak, aby był w pełnym kontakcie z powierzchnią szkła przez 1 minutę.</li>
<li>Delikatnie zdejmij stempel PDMS i pozostaw szkiełko szklane z wzorem do inkubacji w RT przez 30 minut. Przepłucz powierzchnie z wzorem etanolem i wysusz na powietrzu. Poddaj stempel PDMS sonikacji przez 15 minut, aby usunąć nadmiar APTMS.</li>
<li>Ogrzewaj powierzchnie w piekarniku lub na płycie grzejnej przez 1 godzinę w 115°C. Przepłucz etanolem i wysusz na powietrzu.</li>
<li>Przygotuj świeży roztwór PEG-silanu składający się z 20% v/v 2-[methoxy(polyethyleneoxy)propyl] trimethoxysilane w toluenie. Będzie on służył jako region nieadhezyjny otaczający wzory.</li>
<li>Przenieś szkiełko szklane z wzorem do szklanej szalki Petriego i inkubuj w roztworze PEG-silanu przez 45 minut w 75°C na płycie grzejnej. Przepłucz toluenem, wodą i wysusz na powietrzu.</li>
<li>Sterylizuj przez 1 godzinę za pomocą bakteriobójczego promieniowania UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Od tego momentu pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu zachowania sterylności.</li>
<li>Przygotuj sterylną wodną roztwór HA: 
10mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 
5mM N-hydroxysuccinimide 
50μg/ mL HA znakowanego fluoresceiną</li>
<li>Nanieś roztwór HA na wzorowane podłoża szklane w warunkach sterylnych i z osłonięciem od światła. Wzorowane podłoża powinny pozostać niezakłócone przez 16-24 godziny.</li>
<li>Odsajuj roztwór HA, przemyj solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i pokryj powierzchnię 1% albuminą wołową (BSA) w PBS na 1 godzinę. Powierzchnia jest teraz gotowa do hodowli komórkowej.</li>
</ol>
3. Hodowla komórek na mikrowzorowanych powierzchniach z HA
<ol>
<li>Namnożyć komórki raka piersi człowieka MDA-MB-231 oraz komórki raka jelita grubego LS174T zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Wysiać zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych w zagęszczeniu od 0,4 do 1x106 komórek na 18,75 cm2 szklanej powierzchni na powierzchnie z unieruchomionym HA. Inkubować w wilgotnym inkubatorze (37 °C) w atmosferze z 5% CO2. Adhezja komórek powinna nastąpić w ciągu 24 godzin i może być obserwowana za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego.</li>
<li>Kultury komórkowe na powierzchniach można utrzymywać do 5 dni w standardowych warunkach inkubacji. Wymieniać pożywkę co drugi dzień. Morfologię i wzrost komórek można obserwować za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego. Do analizy odpowiedzi na powierzchnię HA można zastosować dodatkowe testy komórkowe.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:


Chemia karbodiimidowa wykorzystana do kowalencyjnego unieruchomienia HA na szklanych płytkach wzorowanych APTMS została przedstawiona na Ryc. 1A. EDC jest czynnikiem sieciującym o zerowej długości, który reaguje z grupami karboksylowymi HA, tworząc reaktywne względem amin pośredniki. Ponieważ pośrednik ten jest podatny na hydrolizę, dodaje się NHS w celu zwiększenia wydajności reakcji karbodiimidowej. W wyniku oddziaływania roztworu HA z mikrowzorami APTMS powstaje stabilne wiązanie amidowe między pośrednikiem HA a aminą pierwszorzędową APTMS. Przykład powierzchni wzorowanej HA zwizualizowanej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego oraz analiza natężenia fluorescencji w programie ImageJ demonstrują wzorowane unieruchomienie HA (Ryc. 1B-C).
Powierzchnie z mikrowzorami HA umożliwiają badanie interakcji komórek nowotworowych z egzogennym HA. Zarówno ludzka linia komórkowa raka piersi MDA-MB-231, jak i ludzka linia komórkowa raka jelita grubego LS174t wykazują preferencyjne przyleganie do obszarów z mikrowzorami HA (Rysunek 2). Do analizy interakcji hodowlanych komórek z powierzchniami z immobilizowanym HA można wykorzystać obrazowanie o wysokiej rozdzielczości przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (Rysunek 3).
 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="Schemat wzorowania powierzchni; μCP, PEG, HA na podłożu szklanym; obraz mikroskopii fluorescencyjnej; dane 3D AFM." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 Powierzchnie z mikrowzorami HA (A) Schemat opisujący opracowanie funkcjonalnych powierzchni HA, (B) obraz fluorescencyjny powierzchni z mikrowzorami HA znakowanej fluoresceiną (zielony). (C) Mapa rozkładu pikseli 3D wykonana w oprogramowaniu ImageJ, demonstrująca dyskretne wzory HA. Pasek skali = 100μm. Zmodyfikowano na podstawie 9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.
 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="Mikroskopowe zdjęcie porównawcze wzrostu komórek, przedstawiające dwie kultury komórkowe o różnym stopniu konfluencji, eksperyment." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Adhezja komórek nowotworowych na mikrowzorowanych powierzchniach HA. Zarówno rak jelita grubego (A), jak i piersi (B) preferencyjnie przylegały do łat HA po 24 godzinach hodowli. Zmodyfikowano na podstawie 9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.
 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="Skaningowa mikroskopia elektronowa ukazująca morfologię komórek; dwa powiększenia A i B wskazują strukturę." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Interakcja komórek nowotworowych z HA. (A) Obrazy z skaningowej mikroskopii elektronowej komórek raka jelita grubego (A) hodowanych na powierzchniach HA, przedstawione przy niskim powiększeniu (lewo) i wysokim powiększeniu (prawo; obszary zaznaczone kwadratami po lewej) oraz komórek raka piersi (B) hodowanych na powierzchniach HA, przedstawione przy niskim powiększeniu (lewo) i wysokim powiększeniu (prawo; obszary zaznaczone kwadratami po lewej).

<ol><li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li>
<li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+%28CD168%29+Form+Complexes+with+ERK1%2C2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li>
<li>Götte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparanase%2C+Hyaluronan%2C+and+CD44+in+Cancers%3A+A+Breast+Carcinoma+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li>
<li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li>
<li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Gazz.+Chim.+Ital%22%5BJournal%5D)">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li>
<li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li>
<li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li>
<li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+%28HA%29+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li>
<li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li>
<li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li>
<li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease%3A+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li>
</ol>

Schemat wideo powielony za zgodą; Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 2010; Oct 21. [Epub ahead of print].

Przedstawiona metoda mikrowzorowania HA umożliwia badanie oddziaływań komórek z egzogennym HA. Znane jest, że HA odgrywa kluczową rolę w progresji nowotworów 1, jednak liczba badań dotyczących oddziaływania komórek nowotworowych na dwuwymiarowych powierzchniach z wzorami HA była ograniczona. Kontrolowane badanie mikrowzorów egzogennego HA pozwala na wysokorozdzielczą wizualizację adhezji, wzrostu i migracji komórek nowotworowych i może pomóc w dalszym wyjaśnieniu podstaw mechanizmów nowotworowych.
<p clas...

<table><tbody><tr><td>fotorezyst SU-2025</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>wywoływacz SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimetoksysilan (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2- [metoksy(polietylenooksy) propyl] trimetoksysilan (Peg-silane)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-etylo-3- (3-dimetyloaminopropyl) karbodiimid</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksysuccynimid (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>kwas hialuronowy znakowany fluoresceiną (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>Rekonstytuować w 10ml wody DI</td></tr><tr><td>komórki raka piersi MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>komórki raka jelita grubego LS174t</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Inwazja i progresja nowotworu wiążą się z motylnym fenotypem komórek, który podlega złożonej regulacji przez czynniki wzrostu/cytokiny oraz składniki macierzy pozakomórkowej (ECM) w mikrośrodowisku guza. Kwas hialuronowy (HA) jest jednym ze składników zrębowych ECM, o którym wiadomo, że ułatwia progresję nowotworu poprzez nasilenie inwazji, wzrostu i angiogenezy1. Oddziaływanie HA z jego receptorem powierzchniowym CD44 indukuje zdarzenia sygnałowe, które promują wzrost, przeżywalność i migrację komórek nowotworowych, zwiększając tym samym rozprzestrzenianie przerzutów2-3. HA jest anionowym, niesiarczanowanym glikozaminoglikanem składającym się z powtarzających się jednostek kwasu D-glukuronowego i D-N-acetyloglukozaminy. Ze względu na obecność grup karboksylowych i hydroksylowych w powtarzających się jednostkach disacharydowych, natywny HA jest w dużej mierze hydrofilowy i podatny na modyfikacje chemiczne wprowadzające grupy siarczanowe w celu unieruchomienia fotoreaktywnego 4-5. Poprzednie badania dotyczące unieruchamiania HA na powierzchniach wykorzystywały bioodporne właściwości HA i jego pochodnej siarczanowanej do kontrolowania adhezji komórek do powierzchni6-7. W badaniach tych adhezja komórek zachodzi preferencyjnie w obszarach nieopatronowanych HA.
Aby przeanalizować interakcje komórkowe z egzogennym HA, opracowaliśmy wzorcowane powierzchnie funkcjonalizowane, które umożliwiają kontrolowane badanie i wysokorozdzielczą wizualizację interakcji komórek nowotworowych z HA. Wykorzystaliśmy mikrostemplowanie (uCP) do zdefiniowania dyskretnych obszarów wzorców HA na powierzchniach szklanych. Zastosowano metodę „kotwiczenia”, wykorzystującą chemię wiązań karbodiimidowych do unieruchomienia HA 8. Powierzchnie szklane poddano mikrostemplowaniu aminosilanem, a następnie poddano reakcji z roztworem HA o zoptymalizowanych proporcjach EDC i NHS, aby umożliwić unieruchomienie HA w wzorcowanych macierzach. Połączenie chemii karbodiimidowej z mCP pozwoliło na unieruchomienie HA w zdefiniowanych obszarach, tworząc powierzchnie odpowiednie do zastosowań in vitro. Zarówno komórki raka jelita grubego, jak i komórki raka piersi wchodziły w interakcje z mikro-wzorcowanymi powierzchniami HA. Adhezja komórek nowotworowych nastąpiła w ciągu 24 godzin, a proliferacja do 48 godzin. Wykorzystując mikro-wzorcowane powierzchnie HA, wykazaliśmy, że adhezja komórek nowotworowych odbywa się poprzez receptor HA CD44. Ponadto wzorcowane powierzchnie HA były kompatybilne ze skaningową mikroskopią elektronową (SEM) i pozwoliły na obrazowanie z wysoką rozdzielczością adhezyjnych wypustek oraz rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych na wzorcach HA, co umożliwiło analizę motylości komórek nowotworowych na egzogennym HA.

Opisano nowatorskie podejście umożliwiające analizę wysokiej rozdzielczości interakcji komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym (HA). Powierzchnie wzorowane są wytwarzane poprzez połączenie chemii karbodiimidowej i mikrodruku kontaktowego.

Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Inwazja i progresja nowotworu wiążą się z fenotypem komórek ruchliwych, który podlega złożonej regulacji przez czynniki wzrostu/cytokiny oraz macierz zewnątrzkomórkową...

Inwazja i progresja nowotworu wiążą się z modalnym fenotypem komórkowym, który podlega złożonej regulacji przez czynniki wzrostu, cytokiny oraz komponenty macierzy zewnątrzkomórkowej w mikrośrodowisku guza. Kwas hialuronowy (HA) jest jednym z komponentów zewnątrzkomórkowej macierzy zrębu, o którym wiadomo, że ułatwia progresję nowotworu poprzez nasilanie inwazji, wzrostu i angiogenezy. Oddziaływanie HA z jego receptorem powierzchniowym CD44 indukuje zdarzenia sygnalizacyjne, które promują wzrost, przeżywalność i migrację komórek nowotworowych, zwiększając tym samym przerzuty; w celu zbadania adhezji, migracji i wzrostu komórek nowotworowych na egzogennym HA.Do wykonania mikrostrukturyzowanej stempla elastomerowego wykorzystuje się standardową fotolitografię, która następnie służy do stworzenia wzorowanego układu cząsteczek aminosilanu na podłożach szklanych. Następnie przeprowadza się reakcję z użyciem karbodiimidu, aby kowalencyjnie przyłączyć HA do mikrostrukturyzowanego aminosilanu. W ten sposób powstają mikrostruktury HA. Na tych mikrostrukturach HA można następnie wysiać hodowlane komórki nowotworowe, a oddziaływania komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym można wizualizować za pomocą mikroskopii świetlnej, wysokorozdzielczych technik obrazowania, takich jak skaningowa mikroskopia elektronowa lub mikroskopia immunofluorescencyjna.Metoda tworzenia powierzchni HA o mikrowzorze przedstawiona w tym artykule wideo może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, takie jak dalsze wyjaśnienie roli egzogennego kwasu hialuronowego w progresji nowotworu. Aby wykonać stempel z polimetakrylanu metylu lub PDMS, który posłuży do odciskania HA na szkiełkach przedmiotowych, należy rozpocząć od pobrania nowej płytki krzemowej za pomocą pęsety.Następnie nad zlewozmywak laboratoryjny. Używając butelki myjącej, opłucz wafer etanolem i wysusz go strumieniem powietrza. Wyłącz światła w pomieszczeniu.Następnie, używając pęsety, przenieś wafelek na powłokowy powlekacz wirówkowy, używając pipety transferowej; pokryj co najmniej 80% powierzchni wafelka negatywowym fotorezystem SU 2025, wirując przez 10 sekund przy prędkości 600 RPM. Następnie wiruj przez 30 sekund przy prędkości 3000 RPM, po czym przenieś powlekony fotorezystem wafelek na płytkę grzejną i przeprowadź wstępne wygrzewanie (soft bake) w temperaturze 95 °C przez trzy minuty. Następnie zdejmij go z płytki grzejnej i pozostaw do ostygnięcia na jedną minutę.Należy umieścić prefabrykowaną maskę z pożądanym wzorem na wafelku pokrytym fotorezystem i naświetlić go promieniowaniem UV przez 20 sekund. Następnie wafelka należy przenieść na płytkę grzejną i poddać wygrzewaniu końcowemu (hard bake) w temperaturze 110 °C przez sześć minut.Włącz oświetlenie i zdejmij podłoże krzemowe z płyty grzejnej. Na tym etapie powinny być widoczne wyraźne wzory przy użyciu pipety transferowej. Ostrożnie opłucz podłoże wywoływaczem do fotorezystu SU eight; po trzykrotnym opłukaniu roztworem wywoływacza, wypłucz etanolem.Jeśli pojawi się biały osad, powtórz płukanie roztworem wywoływacza do fotorezystu lub po prostu zanurz wafelek w roztworze wywoływacza na dwie minuty, a następnie ponownie wypłucz go etanolem, przemyj wodą i wysusz strumieniem powietrza w dużym uchwycie typu „whey boat”. Wymieszaj roztwór elastomeru PDMS oraz czynnik sieciujący w stosunku wagowym 10:1; dla pokazanego tutaj wafla wystarczy 22 g. Przelej mieszaninę do probówki do wirowania i wiruj przy 900 RPM przez pięć minut.Aby usunąć pęcherzyki powietrza, umieść wzorowany wafer w odpowiednio dobranej do rozmiaru płytce Petriego. Wlej na niego tyle roztworu PDMS, aby całkowicie pokryć wafer warstwą o grubości około ćwierci cala. Jeśli na powierzchni wafera znajdują się pęcherzyki powietrza, umieść go w desykatorze próżniowym aż do ich całkowitego zniknięcia.Utwardzaj przez noc w temperaturze pokojowej, aby utworzyć dopełniającą stempel elastomerowy. Jeśli PDMS nie utwardzi się całkowicie po 12 godzinach, umieść wafelek w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 30 minut. Ostrożnie oddziel PDMS od wafla.Następnie, używając żyletki, dotnij stempel do pożądanej wielkości. Umieść stempel w szklanym naczyniu z etanolem, najlepiej w plastikowym uchwycie, i poddaj sonikacji przez 15 minut. Wafle można wykorzystywać wielokrotnie do tworzenia nowych stempli elastomerowych w celu kowalencyjnej immobilizacji ha na powierzchniach szklanych w określonych obszarach.Rozpocznij od oczyszczenia wszystkich szkiełek przedmiotowych, które będą użyte, w urządzeniu do czyszczenia plazmowego zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym tekście. Po oczyszczeniu szkiełek szklanych wyjmij je z urządzenia za pomocą pęsety. Umieść szkiełka w plastikowej szalce Petriego i odstaw do późniejszego użycia.Następnie, w 15 mililitrowej polistyrenowej probówce do wirowania, należy przygotować roztwór aminoklinowy, który zostanie naniesiony na szkiełko przedmiotowe w celu związania HA. Przygotuj świeży 3% obj. roztwór aminopropylotrimetoksysilanu (APTMS) w 95% obj. etanolu do całkowitej objętości 5 ml; pozwól roztworowi reagować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.W tym czasie A-P-T-M-S ulega hydrolizie do odpowiedniego diolu. Następnie, trzymając próbkę wyłącznie za boki, umieść stempel PDMS wzorem do góry na uchwycie wirówki do nakładania warstw. Za pomocą pipety transferowej pokryj powierzchnię wzoru A-P-T-M-S.Następnie pokryj powierzchnię stempla warstwą A-P-T-M-S metodą spin coatingu przy 3 500 RPM przez 30 sekund. Po zdjęciu stempla PDMS z urządzenia do spin coatingu, odwróć go tak, aby strona z wzorem była skierowana w dół, umieść jeden koniec stempla PDMS na środku szkiełka przedmiotowego i lekko dociśnij, aby cały stempel stykał się ze szkiełkiem przez jedną minutę. Następnie ostrożnie zdejmij stempel PDMS i pozostaw szkiełko przedmiotowe z naniesionym wzorem z A-P-T-M-S w temperaturze pokojowej.Po 30 minutach opłucz powierzchnię wzoru etanolem i osusz strumieniem powietrza. Poddaj stempel PDMS sonikacji przez 15 minut, aby usunąć nadmiar A-P-T-M-S. Następnie umieść slajdy na płycie grzewczej na jedną godzinę w temperaturze 115 °C, aby podgrzać powierzchnie i usunąć nadmiar wody.Przemyj etanolen i osusz strumieniem powietrza, używając pęsety. Przenieś preparat z wzorem do szklanej płytki Petriego. Za pomocą pipety transferowej całkowicie pokryj szkiełko świeżo przygotowanym roztworem glikolu polietylenowego (PEG) lub roztworem peg cline, który będzie służył jako region nieprzylegający otaczający wzory.Po 45 minutowej inkubacji w temperaturze 75 °C odlać nadmiar soli PEG. Następnie, trzymając szkiełko przedmiotowe pęsetą, wypłukać jego powierzchnię toluenem, a następnie ponownie wodą i osuszyć strumieniem powietrza. Umieścić szkiełka w wilgotnej kasecie do szkiełek.Następnie umieść pudełko w komorze laminarnej i włącz lampę UV na jedną godzinę, aby przeprowadzić naświetlanie bakteriobójcze. Od tego momentu kontynuuj pracę w komorze laminarnej. Aby zachować sterylność poza wyciągiem, przygotuj 1 mL wodnego sterylnego roztworu HA o stężeniu 10 mM.1-etylo-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC) 5 mM oraz hydroksy-CIN aide w stężeniu 50 µg/ml. Sterylny HA znakowany fluoresceiną EDC jest czynnikiem sieciującym o zerowej długości, który reaguje z grupami karboksylowymi HA, tworząc reaktywne półprodukty aminowe. Ponieważ półprodukt ten jest podatny na hydrolizę, dodaje się NHS w celu zwiększenia wydajności reakcji karbodiimidowej.Następnie nanosi się 200 µL alikwotów sterylnego roztworu HA na wzorowane szkło, aż obszar wzorowany zostanie pokryty. Następnie zamyka się pudełko na szkiełka, aby chronić je przed światłem. Podłoża wzorowane powinny pozostać w dygestorium niezakłócone przez 16 do 24 godzin; w tym czasie roztwór HA oddziałuje z mikro-wzorowanym A-P-T-M-S, tworząc trwałe wiązanie MI pomiędzy pośrednikiem HA a grupą aminową A-P-T-M-S.Następnego dnia za pomocą pipety Pasteura odessać roztwór HA. Przemyć preparaty buforem PBS, a następnie pokryć powierzchnię 1% BSA w PBS na jedną godzinę. Powierzchnia jest teraz gotowa do hodowli komórkowej.Umieść powierzchnie z mikrowzorcem HA w sterylnym naczyniu Petri w celu hodowli na powierzchniach z mikrowzorcem HA. Wysiej zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych o gęstości od 0,4 do 1 × 10⁶ komórek nowotworowych na 18,75 cm² powierzchni szkła w 1 ml pożywki komórkowej, aby pokryć powierzchnię szkiełka przedmiotowego; ostrożnie umieść komórki w inkubatorze z nawilżeniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Dbając o to, aby pożywka nie wylała się, należy pamiętać, że adhezja komórek powinna nastąpić w ciągu 24 godzin i może być obserwowana przy użyciu odwróconego mikroskopu świetlnego.Powierzchnie hodowli komórkowych można utrzymywać do pięciu dni. W standardowych warunkach inkubacji należy wymieniać pożywkę co drugi dzień. Morfologię i wzrost komórek można obserwować za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego.Następnie można zastosować dodatkowe testy komórkowe w celu analizy odpowiedzi na powierzchnię HA w przedstawionym przykładzie. Powierzchnia z wzorem HA zwizualizowana przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i obraz. Analiza intensywności fluorescencji J wykazuje demobilizację wzoru ha.Powierzchnie z mikrostrukturami HA umożliwiają badanie interakcji komórek nowotworowych z egzogennym HA. Przedstawiono tutaj adhezję komórek nowotworowych na powierzchniach z mikrostrukturami HA. Zarówno komórki raka jelita grubego, jak i raka piersi preferencyjnie adhezowały do plamek HA w ciągu 24 godzin hodowli. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej może być stosowane do analizy interakcji hodowlanych komórek z powierzchniami z unieruchomionym HA.Na tym mikrografie z elektronowego mikroskopu skaningowego widoczna jest interakcja komórek raka jelita grubego z HA; po prawej stronie przedstawiono obraz przy większym powiększeniu. Tutaj ponownie pokazano komórki raka piersi hodowane na powierzchniach HA, przy czym po prawej stronie widoczne jest większe powiększenie. Analiza ta wyraźnie wykazuje obecność przydatków adhezyjnych, które zwiększają rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych na mikrostrukturach HA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, w jaki sposób przygotować mikro-wzory z HA oraz jak wykorzystać je do badania odpowiedzi komórek nowotworowych.

micropatterned-surfaces-to-study-hyaluronic-acid-interactions-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikrowzórkowane powierzchnie do badania interakcji kwasu hialuronowskiego z komórkami rakowymi

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Opisano metodę uzyskiwania nierównych nanowzorów na bazie dendrymerów, które pozwalają na nanoskalową kontrolę lokalnej gęstości powierzchni kwasu arginina-glicyna-asparaginowa (RGD) i zastosowano ją do badania adhezji komórek i różnicowania chondrogennego.

Nierówne nanowzorce na bazie dendrymerów do lokalnej kontroli adhezji powierzchni: metoda kierowania różnicowaniem chondrogennym

To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół dla nanolitografii sond skanujących na dużym obszarze, który jest możliwy dzięki iteracyjnemu dostosowaniu układów sond, a także wykorzystaniu wzorów litograficznych do badań interakcji komórka-powierzchnia.

Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi

Tutaj prezentujemy protokół trójwymiarowej hodowli komórek glejaka pochodzących od pacjenta w ortogonalnie przestrajalnych biomateriałach zaprojektowanych tak, aby naśladować matrycę mózgu. Podejście to zapewnia platformę eksperymentalną in vitro, która zachowuje wiele cech komórek glejaka in vivo, zwykle traconych w hodowli.

Hydrożele na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka wielopostaciowego pochodzących od pacjentów

Płyta obrazowania oparta na HMCA jest prezentowana do wykonania testu inwazji. Płytka ta ułatwia tworzenie trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych i pomiar inwazji komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Kwantyfikacja testu inwazji odbywa się za pomocą analizy półautomatycznej.

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

Składnik dopełniacza C1q jest cząsteczką prozapalną o wysokiej ekspresji w mikrośrodowisku tkankowym, która może wchodzić w interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową. W tym miejscu opisujemy metodę testowania, w jaki sposób C1q związany z kwasem hialuronowym wpływa na adhezję komórek.

Ocena wzajemnych oddziaływań między białkiem dopełniacza C1q a kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Poznaj metodę mikrowzorzystych powierzchni do badania interakcji kwasu hialuronowego z komórkami rakowymi. Technika ta umożliwia wizualizację adhezji i migracji komórek nowotworowych.

Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Przeglądaj więcej filmów