Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Inwazja i progresja nowotworu wiążą się z modalnym fenotypem komórkowym, który podlega złożonej regulacji przez czynniki wzrostu, cytokiny oraz komponenty macierzy zewnątrzkomórkowej w mikrośrodowisku guza. Kwas hialuronowy (HA) jest jednym z komponentów zewnątrzkomórkowej macierzy zrębu, o którym wiadomo, że ułatwia progresję nowotworu poprzez nasilanie inwazji, wzrostu i angiogenezy. Oddziaływanie HA z jego receptorem powierzchniowym CD44 indukuje zdarzenia sygnalizacyjne, które promują wzrost, przeżywalność i migrację komórek nowotworowych, zwiększając tym samym przerzuty; w celu zbadania adhezji, migracji i wzrostu komórek nowotworowych na egzogennym HA.

Do wykonania mikrostrukturyzowanej stempla elastomerowego wykorzystuje się standardową fotolitografię, która następnie służy do stworzenia wzorowanego układu cząsteczek aminosilanu na podłożach szklanych. Następnie przeprowadza się reakcję z użyciem karbodiimidu, aby kowalencyjnie przyłączyć HA do mikrostrukturyzowanego aminosilanu. W ten sposób powstają mikrostruktury HA. Na tych mikrostrukturach HA można następnie wysiać hodowlane komórki nowotworowe, a oddziaływania komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym można wizualizować za pomocą mikroskopii świetlnej, wysokorozdzielczych technik obrazowania, takich jak skaningowa mikroskopia elektronowa lub mikroskopia immunofluorescencyjna.

Metoda tworzenia powierzchni HA o mikrowzorze przedstawiona w tym artykule wideo może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, takie jak dalsze wyjaśnienie roli egzogennego kwasu hialuronowego w progresji nowotworu. Aby wykonać stempel z polimetakrylanu metylu lub PDMS, który posłuży do odciskania HA na szkiełkach przedmiotowych, należy rozpocząć od pobrania nowej płytki krzemowej za pomocą pęsety.

Następnie nad zlewozmywak laboratoryjny. Używając butelki myjącej, opłucz wafer etanolem i wysusz go strumieniem powietrza. Wyłącz światła w pomieszczeniu.

Następnie, używając pęsety, przenieś wafelek na powłokowy powlekacz wirówkowy, używając pipety transferowej; pokryj co najmniej 80% powierzchni wafelka negatywowym fotorezystem SU 2025, wirując przez 10 sekund przy prędkości 600 RPM. Następnie wiruj przez 30 sekund przy prędkości 3000 RPM, po czym przenieś powlekony fotorezystem wafelek na płytkę grzejną i przeprowadź wstępne wygrzewanie (soft bake) w temperaturze 95 °C przez trzy minuty. Następnie zdejmij go z płytki grzejnej i pozostaw do ostygnięcia na jedną minutę.

Należy umieścić prefabrykowaną maskę z pożądanym wzorem na wafelku pokrytym fotorezystem i naświetlić go promieniowaniem UV przez 20 sekund. Następnie wafelka należy przenieść na płytkę grzejną i poddać wygrzewaniu końcowemu (hard bake) w temperaturze 110 °C przez sześć minut.

Włącz oświetlenie i zdejmij podłoże krzemowe z płyty grzejnej. Na tym etapie powinny być widoczne wyraźne wzory przy użyciu pipety transferowej. Ostrożnie opłucz podłoże wywoływaczem do fotorezystu SU eight; po trzykrotnym opłukaniu roztworem wywoływacza, wypłucz etanolem.

Jeśli pojawi się biały osad, powtórz płukanie roztworem wywoływacza do fotorezystu lub po prostu zanurz wafelek w roztworze wywoływacza na dwie minuty, a następnie ponownie wypłucz go etanolem, przemyj wodą i wysusz strumieniem powietrza w dużym uchwycie typu „whey boat”. Wymieszaj roztwór elastomeru PDMS oraz czynnik sieciujący w stosunku wagowym 10:1; dla pokazanego tutaj wafla wystarczy 22 g. Przelej mieszaninę do probówki do wirowania i wiruj przy 900 RPM przez pięć minut.

Aby usunąć pęcherzyki powietrza, umieść wzorowany wafer w odpowiednio dobranej do rozmiaru płytce Petriego. Wlej na niego tyle roztworu PDMS, aby całkowicie pokryć wafer warstwą o grubości około ćwierci cala. Jeśli na powierzchni wafera znajdują się pęcherzyki powietrza, umieść go w desykatorze próżniowym aż do ich całkowitego zniknięcia.

Utwardzaj przez noc w temperaturze pokojowej, aby utworzyć dopełniającą stempel elastomerowy. Jeśli PDMS nie utwardzi się całkowicie po 12 godzinach, umieść wafelek w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 30 minut. Ostrożnie oddziel PDMS od wafla.

Następnie, używając żyletki, dotnij stempel do pożądanej wielkości. Umieść stempel w szklanym naczyniu z etanolem, najlepiej w plastikowym uchwycie, i poddaj sonikacji przez 15 minut. Wafle można wykorzystywać wielokrotnie do tworzenia nowych stempli elastomerowych w celu kowalencyjnej immobilizacji ha na powierzchniach szklanych w określonych obszarach.

Rozpocznij od oczyszczenia wszystkich szkiełek przedmiotowych, które będą użyte, w urządzeniu do czyszczenia plazmowego zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym tekście. Po oczyszczeniu szkiełek szklanych wyjmij je z urządzenia za pomocą pęsety. Umieść szkiełka w plastikowej szalce Petriego i odstaw do późniejszego użycia.

Następnie, w 15 mililitrowej polistyrenowej probówce do wirowania, należy przygotować roztwór aminoklinowy, który zostanie naniesiony na szkiełko przedmiotowe w celu związania HA. Przygotuj świeży 3% obj. roztwór aminopropylotrimetoksysilanu (APTMS) w 95% obj. etanolu do całkowitej objętości 5 ml; pozwól roztworowi reagować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

W tym czasie A-P-T-M-S ulega hydrolizie do odpowiedniego diolu. Następnie, trzymając próbkę wyłącznie za boki, umieść stempel PDMS wzorem do góry na uchwycie wirówki do nakładania warstw. Za pomocą pipety transferowej pokryj powierzchnię wzoru A-P-T-M-S.

Następnie pokryj powierzchnię stempla warstwą A-P-T-M-S metodą spin coatingu przy 3 500 RPM przez 30 sekund. Po zdjęciu stempla PDMS z urządzenia do spin coatingu, odwróć go tak, aby strona z wzorem była skierowana w dół, umieść jeden koniec stempla PDMS na środku szkiełka przedmiotowego i lekko dociśnij, aby cały stempel stykał się ze szkiełkiem przez jedną minutę. Następnie ostrożnie zdejmij stempel PDMS i pozostaw szkiełko przedmiotowe z naniesionym wzorem z A-P-T-M-S w temperaturze pokojowej.

Po 30 minutach opłucz powierzchnię wzoru etanolem i osusz strumieniem powietrza. Poddaj stempel PDMS sonikacji przez 15 minut, aby usunąć nadmiar A-P-T-M-S. Następnie umieść slajdy na płycie grzewczej na jedną godzinę w temperaturze 115 °C, aby podgrzać powierzchnie i usunąć nadmiar wody.

Przemyj etanolen i osusz strumieniem powietrza, używając pęsety. Przenieś preparat z wzorem do szklanej płytki Petriego. Za pomocą pipety transferowej całkowicie pokryj szkiełko świeżo przygotowanym roztworem glikolu polietylenowego (PEG) lub roztworem peg cline, który będzie służył jako region nieprzylegający otaczający wzory.

Po 45 minutowej inkubacji w temperaturze 75 °C odlać nadmiar soli PEG. Następnie, trzymając szkiełko przedmiotowe pęsetą, wypłukać jego powierzchnię toluenem, a następnie ponownie wodą i osuszyć strumieniem powietrza. Umieścić szkiełka w wilgotnej kasecie do szkiełek.

Następnie umieść pudełko w komorze laminarnej i włącz lampę UV na jedną godzinę, aby przeprowadzić naświetlanie bakteriobójcze. Od tego momentu kontynuuj pracę w komorze laminarnej. Aby zachować sterylność poza wyciągiem, przygotuj 1 mL wodnego sterylnego roztworu HA o stężeniu 10 mM.

1-etylo-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC) 5 mM oraz hydroksy-CIN aide w stężeniu 50 µg/ml. Sterylny HA znakowany fluoresceiną EDC jest czynnikiem sieciującym o zerowej długości, który reaguje z grupami karboksylowymi HA, tworząc reaktywne półprodukty aminowe. Ponieważ półprodukt ten jest podatny na hydrolizę, dodaje się NHS w celu zwiększenia wydajności reakcji karbodiimidowej.

Następnie nanosi się 200 µL alikwotów sterylnego roztworu HA na wzorowane szkło, aż obszar wzorowany zostanie pokryty. Następnie zamyka się pudełko na szkiełka, aby chronić je przed światłem. Podłoża wzorowane powinny pozostać w dygestorium niezakłócone przez 16 do 24 godzin; w tym czasie roztwór HA oddziałuje z mikro-wzorowanym A-P-T-M-S, tworząc trwałe wiązanie MI pomiędzy pośrednikiem HA a grupą aminową A-P-T-M-S.

Następnego dnia za pomocą pipety Pasteura odessać roztwór HA. Przemyć preparaty buforem PBS, a następnie pokryć powierzchnię 1% BSA w PBS na jedną godzinę. Powierzchnia jest teraz gotowa do hodowli komórkowej.

Umieść powierzchnie z mikrowzorcem HA w sterylnym naczyniu Petri w celu hodowli na powierzchniach z mikrowzorcem HA. Wysiej zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych o gęstości od 0,4 do 1 × 10⁶ komórek nowotworowych na 18,75 cm² powierzchni szkła w 1 ml pożywki komórkowej, aby pokryć powierzchnię szkiełka przedmiotowego; ostrożnie umieść komórki w inkubatorze z nawilżeniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Dbając o to, aby pożywka nie wylała się, należy pamiętać, że adhezja komórek powinna nastąpić w ciągu 24 godzin i może być obserwowana przy użyciu odwróconego mikroskopu świetlnego.

Powierzchnie hodowli komórkowych można utrzymywać do pięciu dni. W standardowych warunkach inkubacji należy wymieniać pożywkę co drugi dzień. Morfologię i wzrost komórek można obserwować za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego.

Następnie można zastosować dodatkowe testy komórkowe w celu analizy odpowiedzi na powierzchnię HA w przedstawionym przykładzie. Powierzchnia z wzorem HA zwizualizowana przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego i obraz. Analiza intensywności fluorescencji J wykazuje demobilizację wzoru ha.

Powierzchnie z mikrostrukturami HA umożliwiają badanie interakcji komórek nowotworowych z egzogennym HA. Przedstawiono tutaj adhezję komórek nowotworowych na powierzchniach z mikrostrukturami HA. Zarówno komórki raka jelita grubego, jak i raka piersi preferencyjnie adhezowały do plamek HA w ciągu 24 godzin hodowli. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej może być stosowane do analizy interakcji hodowlanych komórek z powierzchniami z unieruchomionym HA.

Na tym mikrografie z elektronowego mikroskopu skaningowego widoczna jest interakcja komórek raka jelita grubego z HA; po prawej stronie przedstawiono obraz przy większym powiększeniu. Tutaj ponownie pokazano komórki raka piersi hodowane na powierzchniach HA, przy czym po prawej stronie widoczne jest większe powiększenie. Analiza ta wyraźnie wykazuje obecność przydatków adhezyjnych, które zwiększają rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych na mikrostrukturach HA.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, w jaki sposób przygotować mikro-wzory z HA oraz jak wykorzystać je do badania odpowiedzi komórek nowotworowych.