Name: Mikrowzorzyste powierzchnie do badania interakcji kwasu hialuronowego z komórkami rakowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj metodę mikrowzorzystych powierzchni do badania interakcji kwasu hialuronowego z komórkami rakowymi. Technika ta umożliwia wizualizację adhezji i migracji komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują za możliwość korzystania z laboratorium analizy powierzchni na Johns Hopkins, finansowanego w ramach Materials Research Science and Engineering Center przez National Science Foundation. LED jest stażystą IGERT oraz stypendystą National Science Foundation Graduate Fellow. Niniejsze badania były częściowo finansowane z grantu NIH U54CA143868.

1. Standardowa fotolitografia do produkcji stempli z mikrowzorami
<ol>
<li>Przepłucz nowy wafelek krzemowy etanolem i wysusz strumieniem powietrza. Przez cały proces używaj pęsety do manipulowania wafelkiem, aby zapobiec powstaniu defektów powierzchniowych.</li>
<li>Przenieś wafelek do powlekarki rotacyjnej i pokryj jego powierzchnię negatywowym fotorezystem SU-2025. Pokryj fotorezystem co najmniej 80% powierzchni wafelka. Wykonaj powlekanie rotacyjne przez 10 sekund przy 600rpm, a następnie przez 30 sekund przy 3000rpm. Ze względu na światłoczułość fotorezystu, od tego momentu wyłącz światła w pomieszczeniu.</li>
<li>Przenieś pokryty fotorezystem wafelek krzemowy na płytkę grzejną w celu przeprowadzenia „wygrzewania wstępnego” (soft-bake) w temperaturze 95°C przez 3 minuty. Zdejmij z płytki grzejnej i odstaw na 1 minutę do ostygnięcia.</li>
<li>Umieść wcześniej wykonaną maskę z pożądanym wzorem na powierzchni pokrytego fotorezystem wafelka krzemowego i naświetlaj promieniowaniem ultrafioletowym (UV) (350-450 nm) przez 20 sekund.</li>
<li>Przenieś wafelek krzemowy na płytkę grzejną w celu przeprowadzenia „wygrzewania końcowego” (hard-bake) w temperaturze 110°C przez 6 minut.</li>
<li>Włącz światła i zdejmij wafelek z płytki grzejnej. Na tym etapie powinny być widoczne wyraźne wzory.</li>
<li>Ostrożnie przepłucz wafelek krzemowy wywoływaczem do fotorezystu SU-8. Po trzykrotnym przepłukaniu roztworem wywoływacza, przepłucz etanolem. W przypadku wystąpienia białych osadów powtórz płukanie roztworem wywoływacza lub zanurz wafelek w roztworze wywoływacza na 2 minuty, a następnie ponownie przepłucz etanolem. Umyj wodą i wysusz powietrzem.</li>
<li>Wymieszaj roztwór elastomeru polidimetylosiloksanu (PDMS) z utwardzaczem w stosunku wagowym 10:1. Wirowarkuj przy 900rpm przez 5 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Umieść wzorowany wafelek w szalce Petriego i wlej PDMS na wafelek krzemowy. Jeśli obecne są pęcherzyki, umieść próbkę w eksykatorze i poddaj działaniu próżni przez kilka minut, aż pęcherzyki znikną.</li>
<li>Utwardzaj przez noc w temperaturze pokojowej (RT), aby utworzyć komplementarną stempel elastomerowy. Jeśli PDMS nie utwardził się całkowicie po 12 godzinach, umieść go w piekarniku w temperaturze 60°C na 30 minut.</li>
<li>Ostrożnie oddziel PDMS od wafelka krzemowego. Użyj ostrza żyletki, aby dociąć stempel do pożądanego rozmiaru. Sonicuj w etanolu przez 15 minut. Wafelki można wykorzystywać wielokrotnie do tworzenia nowych stempli elastomerowych.</li>
</ol>
2. Mikrowzorcowanie HA
<ol>
<li>Oczyść szkiełka szklane w urządzeniu do czyszczenia plazmowego przez 5 minut. Umieść wszystkie szkiełka w komorze i poddaj próżni przez 5 minut. Następnie wpuść do komory niewielki strumień tlenu. Włącz urządzenie do czyszczenia plazmowego na 5 minut. Wyjmij szkiełka z urządzenia i za pomocą pęsety umieść je w szalce Petriego.</li>
<li>Podczas czyszczenia plazmowego poddaj stemple PDMS sonikacji w etanolu przez 15 minut.</li>
<li>Przygotuj świeży 3% v/v roztwór 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) w 95% v/v etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 15 mL. Pozostaw do reakcji przez 5 minut w RT w celu utworzenia silanoli.</li>
<li>Umieść stempel PDMS wzorem do góry na uchwycie wirówki i pokryj powierzchnię z wzorem roztworem APTMS. Wykonaj spincoating przy 3500rpm przez 30 sekund. Nie dotykaj powierzchni stempla, jedynie jego boków.</li>
<li>Przenieś roztwór APTMS na oczyszczone plazmowo powierzchnie szklane: ustaw stempel stroną z wzorem do dołu na jednym końcu i delikatnie przesuń, dociskając PDMS tak, aby był w pełnym kontakcie z powierzchnią szkła przez 1 minutę.</li>
<li>Delikatnie zdejmij stempel PDMS i pozostaw szkiełko szklane z wzorem do inkubacji w RT przez 30 minut. Przepłucz powierzchnie z wzorem etanolem i wysusz na powietrzu. Poddaj stempel PDMS sonikacji przez 15 minut, aby usunąć nadmiar APTMS.</li>
<li>Ogrzewaj powierzchnie w piekarniku lub na płycie grzejnej przez 1 godzinę w 115°C. Przepłucz etanolem i wysusz na powietrzu.</li>
<li>Przygotuj świeży roztwór PEG-silanu składający się z 20% v/v 2-[methoxy(polyethyleneoxy)propyl] trimethoxysilane w toluenie. Będzie on służył jako region nieadhezyjny otaczający wzory.</li>
<li>Przenieś szkiełko szklane z wzorem do szklanej szalki Petriego i inkubuj w roztworze PEG-silanu przez 45 minut w 75°C na płycie grzejnej. Przepłucz toluenem, wodą i wysusz na powietrzu.</li>
<li>Sterylizuj przez 1 godzinę za pomocą bakteriobójczego promieniowania UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Od tego momentu pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu zachowania sterylności.</li>
<li>Przygotuj sterylną wodną roztwór HA: 
10mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 
5mM N-hydroxysuccinimide 
50μg/ mL HA znakowanego fluoresceiną</li>
<li>Nanieś roztwór HA na wzorowane podłoża szklane w warunkach sterylnych i z osłonięciem od światła. Wzorowane podłoża powinny pozostać niezakłócone przez 16-24 godziny.</li>
<li>Odsajuj roztwór HA, przemyj solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i pokryj powierzchnię 1% albuminą wołową (BSA) w PBS na 1 godzinę. Powierzchnia jest teraz gotowa do hodowli komórkowej.</li>
</ol>
3. Hodowla komórek na mikrowzorowanych powierzchniach z HA
<ol>
<li>Namnożyć komórki raka piersi człowieka MDA-MB-231 oraz komórki raka jelita grubego LS174T zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Wysiać zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych w zagęszczeniu od 0,4 do 1x106 komórek na 18,75 cm2 szklanej powierzchni na powierzchnie z unieruchomionym HA. Inkubować w wilgotnym inkubatorze (37 °C) w atmosferze z 5% CO2. Adhezja komórek powinna nastąpić w ciągu 24 godzin i może być obserwowana za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego.</li>
<li>Kultury komórkowe na powierzchniach można utrzymywać do 5 dni w standardowych warunkach inkubacji. Wymieniać pożywkę co drugi dzień. Morfologię i wzrost komórek można obserwować za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego. Do analizy odpowiedzi na powierzchnię HA można zastosować dodatkowe testy komórkowe.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:


Chemia karbodiimidowa wykorzystana do kowalencyjnego unieruchomienia HA na szklanych płytkach wzorowanych APTMS została przedstawiona na Ryc. 1A. EDC jest czynnikiem sieciującym o zerowej długości, który reaguje z grupami karboksylowymi HA, tworząc reaktywne względem amin pośredniki. Ponieważ pośrednik ten jest podatny na hydrolizę, dodaje się NHS w celu zwiększenia wydajności reakcji karbodiimidowej. W wyniku oddziaływania roztworu HA z mikrowzorami APTMS powstaje stabilne wiązanie amidowe między pośrednikiem HA a aminą pierwszorzędową APTMS. Przykład powierzchni wzorowanej HA zwizualizowanej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego oraz analiza natężenia fluorescencji w programie ImageJ demonstrują wzorowane unieruchomienie HA (Ryc. 1B-C).
Powierzchnie z mikrowzorami HA umożliwiają badanie interakcji komórek nowotworowych z egzogennym HA. Zarówno ludzka linia komórkowa raka piersi MDA-MB-231, jak i ludzka linia komórkowa raka jelita grubego LS174t wykazują preferencyjne przyleganie do obszarów z mikrowzorami HA (Rysunek 2). Do analizy interakcji hodowlanych komórek z powierzchniami z immobilizowanym HA można wykorzystać obrazowanie o wysokiej rozdzielczości przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (Rysunek 3).
 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="Schemat wzorowania powierzchni; μCP, PEG, HA na podłożu szklanym; obraz mikroskopii fluorescencyjnej; dane 3D AFM." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 Powierzchnie z mikrowzorami HA (A) Schemat opisujący opracowanie funkcjonalnych powierzchni HA, (B) obraz fluorescencyjny powierzchni z mikrowzorami HA znakowanej fluoresceiną (zielony). (C) Mapa rozkładu pikseli 3D wykonana w oprogramowaniu ImageJ, demonstrująca dyskretne wzory HA. Pasek skali = 100μm. Zmodyfikowano na podstawie 9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.
 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="Mikroskopowe zdjęcie porównawcze wzrostu komórek, przedstawiające dwie kultury komórkowe o różnym stopniu konfluencji, eksperyment." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Adhezja komórek nowotworowych na mikrowzorowanych powierzchniach HA. Zarówno rak jelita grubego (A), jak i piersi (B) preferencyjnie przylegały do łat HA po 24 godzinach hodowli. Zmodyfikowano na podstawie 9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.
 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="Skaningowa mikroskopia elektronowa ukazująca morfologię komórek; dwa powiększenia A i B wskazują strukturę." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Interakcja komórek nowotworowych z HA. (A) Obrazy z skaningowej mikroskopii elektronowej komórek raka jelita grubego (A) hodowanych na powierzchniach HA, przedstawione przy niskim powiększeniu (lewo) i wysokim powiększeniu (prawo; obszary zaznaczone kwadratami po lewej) oraz komórek raka piersi (B) hodowanych na powierzchniach HA, przedstawione przy niskim powiększeniu (lewo) i wysokim powiększeniu (prawo; obszary zaznaczone kwadratami po lewej).

<ol><li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li>
<li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+%28CD168%29+Form+Complexes+with+ERK1%2C2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li>
<li>Götte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparanase%2C+Hyaluronan%2C+and+CD44+in+Cancers%3A+A+Breast+Carcinoma+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li>
<li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li>
<li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Gazz.+Chim.+Ital%22%5BJournal%5D)">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li>
<li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li>
<li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li>
<li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+%28HA%29+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li>
<li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li>
<li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li>
<li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease%3A+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li>
</ol>

Schemat wideo powielony za zgodą; Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 2010; Oct 21. [Epub ahead of print].

Przedstawiona metoda mikrowzorowania HA umożliwia badanie oddziaływań komórek z egzogennym HA. Znane jest, że HA odgrywa kluczową rolę w progresji nowotworów 1, jednak liczba badań dotyczących oddziaływania komórek nowotworowych na dwuwymiarowych powierzchniach z wzorami HA była ograniczona. Kontrolowane badanie mikrowzorów egzogennego HA pozwala na wysokorozdzielczą wizualizację adhezji, wzrostu i migracji komórek nowotworowych i może pomóc w dalszym wyjaśnieniu podstaw mechanizmów nowotworowych.
<p clas...

<table><tbody><tr><td>fotorezyst SU-2025</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>wywoływacz SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimetoksysilan (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2- [metoksy(polietylenooksy) propyl] trimetoksysilan (Peg-silane)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-etylo-3- (3-dimetyloaminopropyl) karbodiimid</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksysuccynimid (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>kwas hialuronowy znakowany fluoresceiną (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>Rekonstytuować w 10ml wody DI</td></tr><tr><td>komórki raka piersi MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>komórki raka jelita grubego LS174t</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Inwazja i progresja nowotworu wiążą się z motylnym fenotypem komórek, który podlega złożonej regulacji przez czynniki wzrostu/cytokiny oraz składniki macierzy pozakomórkowej (ECM) w mikrośrodowisku guza. Kwas hialuronowy (HA) jest jednym ze składników zrębowych ECM, o którym wiadomo, że ułatwia progresję nowotworu poprzez nasilenie inwazji, wzrostu i angiogenezy1. Oddziaływanie HA z jego receptorem powierzchniowym CD44 indukuje zdarzenia sygnałowe, które promują wzrost, przeżywalność i migrację komórek nowotworowych, zwiększając tym samym rozprzestrzenianie przerzutów2-3. HA jest anionowym, niesiarczanowanym glikozaminoglikanem składającym się z powtarzających się jednostek kwasu D-glukuronowego i D-N-acetyloglukozaminy. Ze względu na obecność grup karboksylowych i hydroksylowych w powtarzających się jednostkach disacharydowych, natywny HA jest w dużej mierze hydrofilowy i podatny na modyfikacje chemiczne wprowadzające grupy siarczanowe w celu unieruchomienia fotoreaktywnego 4-5. Poprzednie badania dotyczące unieruchamiania HA na powierzchniach wykorzystywały bioodporne właściwości HA i jego pochodnej siarczanowanej do kontrolowania adhezji komórek do powierzchni6-7. W badaniach tych adhezja komórek zachodzi preferencyjnie w obszarach nieopatronowanych HA.
Aby przeanalizować interakcje komórkowe z egzogennym HA, opracowaliśmy wzorcowane powierzchnie funkcjonalizowane, które umożliwiają kontrolowane badanie i wysokorozdzielczą wizualizację interakcji komórek nowotworowych z HA. Wykorzystaliśmy mikrostemplowanie (uCP) do zdefiniowania dyskretnych obszarów wzorców HA na powierzchniach szklanych. Zastosowano metodę „kotwiczenia”, wykorzystującą chemię wiązań karbodiimidowych do unieruchomienia HA 8. Powierzchnie szklane poddano mikrostemplowaniu aminosilanem, a następnie poddano reakcji z roztworem HA o zoptymalizowanych proporcjach EDC i NHS, aby umożliwić unieruchomienie HA w wzorcowanych macierzach. Połączenie chemii karbodiimidowej z mCP pozwoliło na unieruchomienie HA w zdefiniowanych obszarach, tworząc powierzchnie odpowiednie do zastosowań in vitro. Zarówno komórki raka jelita grubego, jak i komórki raka piersi wchodziły w interakcje z mikro-wzorcowanymi powierzchniami HA. Adhezja komórek nowotworowych nastąpiła w ciągu 24 godzin, a proliferacja do 48 godzin. Wykorzystując mikro-wzorcowane powierzchnie HA, wykazaliśmy, że adhezja komórek nowotworowych odbywa się poprzez receptor HA CD44. Ponadto wzorcowane powierzchnie HA były kompatybilne ze skaningową mikroskopią elektronową (SEM) i pozwoliły na obrazowanie z wysoką rozdzielczością adhezyjnych wypustek oraz rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych na wzorcach HA, co umożliwiło analizę motylości komórek nowotworowych na egzogennym HA.

Opisano nowatorskie podejście umożliwiające analizę wysokiej rozdzielczości interakcji komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym (HA). Powierzchnie wzorowane są wytwarzane poprzez połączenie chemii karbodiimidowej i mikrodruku kontaktowego.

Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Inwazja i progresja nowotworu wiążą się z fenotypem komórek ruchliwych, który podlega złożonej regulacji przez czynniki wzrostu/cytokiny oraz macierz zewnątrzkomórkową...

Inwazja i progresja nowotworu wiążą się z modalnym fenotypem komórkowym, który podlega złożonej regulacji przez czynniki wzrostu, cytokiny oraz komponenty macierzy zewnątrzkomórkowej w mikrośrodowisku guza. Kwas hialuronowy (HA) jest jednym z komponentów zewnątrzkomórkowej macierzy zrębu, o którym wiadomo, że ułatwia progresję nowotworu poprzez nasilanie inwazji, wzrostu i angiogenezy. Oddziaływanie HA z jego receptorem powierzchniowym CD44 indukuje zdarzenia sygnalizacyjne, które promują wzrost, przeżywalność i migrację komórek nowotworowych, zwiększając tym samym przerzuty; w celu zbadania adhezji, migracji i wzrostu komórek nowotworowych na egzogennym HA.Do wykonania mikrostrukturyzowanej stempla elastomerowego wykorzystuje się standardową fotolitografię, która następnie służy do stworzenia wzorowanego układu cząsteczek aminosilanu na podłożach szklanych. Następnie przeprowadza się reakcję z użyciem karbodiimidu, aby kowalencyjnie przyłączyć HA do mikrostrukturyzowanego aminosilanu. W ten sposób powstają mikrostruktury HA. Na tych mikrostrukturach HA można następnie wysiać hodowlane komórki nowotworowe, a oddziaływania komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym można

micropatterned-surfaces-to-study-hyaluronic-acid-interactions-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikrowzórkowane powierzchnie do badania interakcji kwasu hialuronowskiego z komórkami rakowymi

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Opisano metodę uzyskiwania nierównych nanowzorów na bazie dendrymerów, które pozwalają na nanoskalową kontrolę lokalnej gęstości powierzchni kwasu arginina-glicyna-asparaginowa (RGD) i zastosowano ją do badania adhezji komórek i różnicowania chondrogennego.

Nierówne nanowzorce na bazie dendrymerów do lokalnej kontroli adhezji powierzchni: metoda kierowania różnicowaniem chondrogennym

To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół trójwymiarowej hodowli komórek glejaka pochodzących od pacjenta w ortogonalnie przestrajalnych biomateriałach zaprojektowanych tak, aby naśladować matrycę mózgu. Podejście to zapewnia platformę eksperymentalną in vitro, która zachowuje wiele cech komórek glejaka in vivo, zwykle traconych w hodowli.

Hydrożele na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka wielopostaciowego pochodzących od pacjentów

Płyta obrazowania oparta na HMCA jest prezentowana do wykonania testu inwazji. Płytka ta ułatwia tworzenie trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych i pomiar inwazji komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Kwantyfikacja testu inwazji odbywa się za pomocą analizy półautomatycznej.

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

Składnik dopełniacza C1q jest cząsteczką prozapalną o wysokiej ekspresji w mikrośrodowisku tkankowym, która może wchodzić w interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową. W tym miejscu opisujemy metodę testowania, w jaki sposób C1q związany z kwasem hialuronowym wpływa na adhezję komórek.

Ocena wzajemnych oddziaływań między białkiem dopełniacza C1q a kwasem hialuronowym w promowaniu adhezji komórek

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Poznaj metodę mikrowzorzystych powierzchni do badania interakcji kwasu hialuronowego z komórkami rakowymi. Technika ta umożliwia wizualizację adhezji i migracji komórek nowotworowych.

Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Przeglądaj więcej filmów