Name: Mechaniczna stymulacja komórek macierzystych za pomocą cyklicznego odkształcenia jednoosiowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 12 s
Description: Poznaj metodę mechanicznej stymulacji komórek macierzystych za pomocą cyklicznego odkształcenia jednoosiowego przy użyciu bioreaktora i mikrostrukturyzowanych podłoży. Protokół ten umożliwia badanie wpływu sił mechanicznych na zachowanie komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dzień 0 – Sterylizacja przed dniem eksperymentu
<ol>
<li>Umieścić materiały w plastikowym pojemniku i sterylizować 70% alkoholem przez 2 godziny: 
<ul>
<li>Komory</li>
<li>Pokrywy</li>
<li>Ramki (wszystkie 3 elementy)</li>
<li>Śruby</li>
<li>Uszczelki gumowe</li>
<li>Pincety</li>
<li>Nożyczki</li>
<li>Klucze imbusowe</li>
</ul>
</li>
<li>Oczyścić membrany mydłem Aquet i wodą destylowaną.</li>
<li>Poddać membrany sonikacji w 70% alkoholu przez 10 minut.</li>
<li>Umieścić czyste membrany w plastikowych kwadratowych naczyniach. W przypadku stosowania membran wzorcowanych należy upewnić się, że strona wzorcowana jest skierowana do góry (rozpylić alkohol na jedną stronę membrany i obserwować, czy ciecz spływa wzdłuż rowków).</li>
<li>Pozostawić membrany zanurzone w 70% alkoholu na 2 godziny.</li>
<li>Zapakować rękawiczki w folię aluminiową w celu autoklawowania jutro rano.</li>
<li>Przygotować 2% (masa/objętość) roztwór żelatyny (2g/100mL) w wodzie destylowanej do autoklawowania jutro.</li>
<li>Po 2-godzinnej sterylizacji w 70% alkoholu umieścić wszystkie materiały polimerowe oraz membrany (materiały nieautoklawowalne) w komorze z dyfuzorem UV na całą noc: 
<ul>
<li>Komory</li>
<li>Pokrywy</li>
<li>Ramki (wszystkie 3 elementy)</li>
<li>Membrany</li>
</ul>
</li>
<li>Zapakować pozostałe materiały do worka do autoklawowania: 
<ul>
<li>Śruby</li>
<li>Uszczelki gumowe</li>
<li>Pincety</li>
<li>Nożyczki</li>
<li>Klucze imbusowe</li>
</ul>
</li>
</ol>
Dzień 1 - Montaż komór rozciągania
<ol>
<li>Autoklawować pęsetę, nożyczki, klucze imbusowe, śruby, uszczelki, rękawiczki oraz żelatynę w małym autoklawie w temperaturze 240°F przez łącznie 20 minut</li>
<li>Wyjąć membrany z lampy UV i poddać działaniu plazmy O2 (stroną z wzorem do góry) przez około 1 minutę.</li>
<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza pokryć obszar z wzorem na membranach traktowanych plazmą żelatyną. Naświetlać promieniami UV przez 30 minut.</li>
<li>Przemyć każdą membranę dwa razy roztworem PBS. Po &nbsp;drugim przemyciu pozostawić na membranach niewielką ilość PBS, aby pozostały śliskie, co ułatwi montaż w komorach. (Tego samego PBS należy użyć do nasmarowania uszczelek w celu ułatwienia montażu).</li>
<li>Zmontować membrany w komorach (podczas montażu używać autoklawowanych rękawiczek) <ol>
<li>Połączyć dwa główne elementy ramy za pomocą jednej śruby.</li>
<li>Odwrócić &nbsp;ramę i położyć na niej membranę tak, aby strona pokryta żelatyną była skierowana w stronę ramy (obszar z wzorem powinien znajdować się w centrum).</li>
<li>Przymocować membranę do ramy za pomocą uszczelki z każdej strony.</li>
<li>Docisnąć uszczelki, stosując delikatny, równomierny nacisk, aby nie przerwać membrany.</li>
</ol></li>
<li>Przymocować zmontowaną ramę do poprzeczki w kształcie litery T.</li>
<li>Odwrócić ramę i włożyć ją do komory do góry dnem. Naświetlać promieniami UV tylną stronę ramy i membrany przez 30 minut</li>
<li>Ponownie odwrócić ramę i przykręcić do komory (brak zmian dla komory kontrolnej, ale dla komory rozciągającej należy użyć dwóch śrub do przymocowania końcowego elementu ramy do dna komory oraz wykręcić pojedynczą śrubę łączącą dwa elementy ramy). Naświetlać promieniami UV stronę przednią przez 30 min. Przed przejściem do następnego kroku upewnić się, że membrany są CAŁKOWICIE suche, w przeciwnym razie zawiesina komórek może spłynąć podczas wysiewania.</li>
<li>Wysiać komórki. Powierzchnia 1 płytki = powierzchnia 3 membran, zatem na jedną membranę należy użyć 1/3 konfluentnej płytki. Użyć 1 mL zawiesiny komórek na membranę. Przy ilości większej niż 1,5 mL trudno będzie utrzymać roztwór na powierzchni. Nanieść zawiesinę komórek wyłącznie na obszar z wzorem i za pomocą końcówki pipety rozprowadzić roztwór. Przykryć komory i pozostawić komórki do przytwierdzenia na 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
<li>Przenieść komory do inkubatora i pozostawić komórki do przytwierdzenia przez kolejną godzinę. Zachować SZCZEGÓLNĄ ostrożność podczas przenoszenia komór, aby nie dopuścić do spłynięcia zawiesiny komórek! Jeśli roztwór spłynie na tym etapie, komórki w danej komorze zostaną zniszczone.</li>
<li>Przenieść komorę do komory z laminarnym przepływem powietrza i dodać 20 mL pożywki.</li>
<li>Umieścić komory w oczyszczonej alkoholem kuwecie przykrytej folią aluminiową (również spryskaną alkoholem). Przenieść komory do inkubatora do rozciągania (10% CO2).</li>
<li>Zamocować komory w maszynie do rozciągania. Pozostawić komórki do dalszego przytwierdzenia przez noc i rozpocząć rozciąganie następnego dnia. (Uwaga: podczas wkładania komór do maszyny do rozciągania należy pamiętać o zablokowaniu maszyny w pozycji „zero” przed umieszczeniem komór, a następnie zaciśnięciu gumki wokół kół zębatych. Nie zapomnieć o odblokowaniu kół zębatych przed uruchomieniem maszyny).</li>
</ol>

<ol><li>Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vacuum-operated+stress-providing+instrument+that+applies+static+or+variable+duration+cyclic+tension+or+compression+to+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro.</a> J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).</li>
<li>Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+equiaxial+and+uniaxial+strain+on+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+mechanosensing+by+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).</li>
</ol>

Banes i współpracownicy po raz pierwszy opisali zastosowanie systemu do mechanicznej stymulacji komórek in vitro, wykorzystując elastyczny podłoże elastomerowe do przekazywania siły mechanicznej na komórki1. Od tego czasu opracowano i wykorzystano wiele modyfikacji tej konstrukcji. Kilka systemów rozciągania mechanicznego jest dostępnych komercyjnie pod nazwą „Flexercell” (Flexcell International Corp.), podczas gdy niektóre laboratoria korzystają z urządzeń budowanych na specjalne zamówienie. W niniejszym prot...

<table><tbody><tr><td>Fungizone</td><td>Odczynnik</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-836R</td><td>alikwot 250 ug/mL, 100x, przechowywany w -20C.</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15160-054</td><td>stężenie końcowe 50 ug/mL. Roztwór zapasowy przechowywać w stężeniu 10 mg/ml w -20C.</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Odczynnik</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-518Z</td><td>stężenie końcowe 50 ug/mL. Roztwory zapasowe 1000x przechowywać w stężeniu 50 mg/mL w -20C.</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>stężenie końcowe 1%. (Dostępne również od innych dostawców)</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">Uwagi dotyczące pożywek: Te eksperymenty z rozciąganiem jednowymiarowym są podatne na kontaminację ze względu na złożoność konfiguracji bioreaktora. Aby temu przeciwdziałać, przetestowano różne kombinacje antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych. Zazwyczaj niezbędne jest zastosowanie 1% fungizone wraz z kombinacją antybiotyków. Należy stosować albo kombinację Pen/Strep, ALBO kombinację kanamycyny i gentamycyny (NIE należy jednak stosować kombinacji/koktajlu trzech lub więcej antybiotyków jednocześnie, ponieważ może to prowadzić do powstania opornych szczepów bakterii i może być szkodliwe dla komórek).</td></tr></tbody></table>

mechaniczna stymulacja komórek macierzystych z wykorzystaniem cyklicznego odkształcenia jednowymiarowego

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

Rola sił mechanicznych w rozwoju i utrzymaniu tkanek biologicznych jest dobrze udokumentowana, w tym w przypadku kilku zjawisk regulowanych mechanicznie, takich jak przebudowa kości, hipertrofia mięśni oraz plastyczność komórek mięśni gładkich. Jednak siły zaangażowane w te procesy są często niezwykle złożone i trudne do monitorowania oraz kontrolowania in vivo. Aby lepiej zbadać wpływ sił mechanicznych na komórki, opracowaliśmy metodę in vitro do przykładania jednowymiarowego cyklicznego odkształcenia rozciągającego do komórek adherentnych hodowanych na elastycznych membranach. Metoda ta wykorzystuje bioreaktor o specjalnej konstrukcji z zmotoryzowanym systemem krzywka-wirnik do przyłożenia pożądanej siły. Przedstawiamy tutaj krok po kroku protokół wideo demonstrujący sposób montażu poszczególnych komponentów każdej „komory rozciągania”, w tym w tym przypadku silikonowej membrany z mikrowzorowaną topografią w celu zorientowania komórek zgodnie z kierunkiem odkształcenia. Opisujemy również procedury sterylizacji komór, wysiewania komórek na membranę, mocowania komory w bioreaktorze oraz regulacji parametrów mechanicznych (tj. wartości i szybkości odkształcenia). Procedury przedstawione w tym konkretnym protokole są specyficzne dla wysiewania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na membrany silikonowe z kanałami o szerokości 10 µm zorientowanymi równolegle do kierunku odkształcenia. Jednak metody i materiały zaprezentowane w tym systemie są na tyle elastyczne, że pozwalają na wprowadzenie wielu modyfikacji: szybkość, wartość i czas trwania odkształcenia, typ komórek, topografia membrany, powłoka membrany itp. mogą zostać dostosowane do pożądanej aplikacji lub celu. Jest to solidna metoda badania wpływu jednowymiarowego odkształcenia rozciągającego przykładanego do komórek in vitro.

Powszechnie wiadomo, że siły mechaniczne w organizmie mogą wpływać na różnicowanie i proliferację komórek. Przedstawiamy protokół wideo demonstrujący zastosowanie bioreaktora zbudowanego na zamówienie do przykładania jednowymiarowego cyklicznego odkształcenia rozciągającego do komórek macierzystych hodowanych na elastycznych podłożach z mikrowzorami.

Mechaniczna stymulacja komórek macierzystych z wykorzystaniem cyklicznego odkształcenia jednowymiarowego

Rola sił mechanicznych w rozwoju i utrzymaniu tkanek biologicznych jest dobrze udokumentowana, w tym w przypadku wielu procesów regulowanych mechanicznie...

mechanical-stimulation-of-stem-cells-using-cyclic-uniaxial-strain

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mechanizujące stymulacja komórek macierzystych przy użyciu cyklicznego jednoosiowego odkształcenia

Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.

Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Ten manuskrypt przedstawia technikę wywierania lub uwalniania sił na przylegające komórki lub tkanki za pomocą jednokierunkowego rozciągania.

Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Ten artykuł przedstawia proste podejście do dostarczania nieciągłych gradientowych naprężeń statycznych na koncentrycznym hydrożelu wypełnionym komórkami w celu regulacji wyrównania komórek w inżynierii tkankowej.

Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Trójwymiarowy jednoosiowy system bioreaktora do stymulacji mechanicznej jest idealnym bioreaktorem do specyficznego dla tenogenicznego różnicowania komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien i tworzenia neościęgien.

Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

Ten artykuł opisuje procedurę wytwarzania iTenocytów poprzez generowanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z iPSC z połączoną nadekspresją twardówki przy użyciu wektora lentiwirusowego i jednoosiowego rozciągania za pomocą bioreaktora 2D.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D

Przedstawiamy tutaj nowatorskie urządzenie, które stosuje fale izotropowe i jednoosiowe odkształcenia na komórkach, wspierając hodowlę na substratach o regulowanej sztywności i konfigurowalnych macierzach białkowych. Ta prosta, ekonomiczna platforma umożliwia badaczom badanie, jak mechaniczne sygnały regulują funkcjonowanie komórek zarówno w badaniach podstawowych, jak i w kontekstach związanych z chorobą.

Nowatorska platforma do rozciągania i obrazowania komórkowego in vitro

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę mechanicznej stymulacji komórek macierzystych za pomocą cyklicznego odkształcenia jednoosiowego przy użyciu bioreaktora i mikrostrukturyzowanych podłoży. Protokół ten umożliwia badanie wpływu sił mechanicznych na zachowanie komórek.

Mechaniczna stymulacja komórek macierzystych z wykorzystaniem cyklicznego odkształcenia jednowymiarowego

Przeglądaj więcej filmów