Mechaniczna stymulacja komórek macierzystych z wykorzystaniem cyklicznego odkształcenia jednowymiarowego

Witajcie, nazywam się Song Li. Jestem profesorem adiunktem w Departamencie Bioinżynierii na UC Berkeley. A ja jestem Kyle Kapinsky, doktorant, również w dziedzinie bioinżynierii na UC Berkeley.

Dzisiaj przedstawimy protokół mechanicznej stymulacji komórek macierzystych przy użyciu cyklicznego odkształcenia jednowymiarowego. Badania w naszym laboratorium koncentrują się na inżynierii komórkowej i tkankowej, w szczególności w obrębie układu sercowo-naczyniowego. Interesujemy się biologią mechaniczną komórek macierzystych, ponieważ istnieją w tym obszarze liczne potencjalne zastosowania.

Po pierwsze, chcemy zrozumieć wpływ czynników mechanicznych na rozwój, na przykład na rozwój embrionalny. Po drugie, interesuje nas kontrolowanie różnicowania komórek macierzystych in vitro lub w bioreaktorach. Po trzecie, interesuje nas, w jaki sposób komórki macierzyste reagują na naczyniowe czynniki mechaniczne in vivo, na przykład po transplantacji.

Aby zbadać wszystkie te kwestie, wykorzystujemy bioreaktor o specjalnej konstrukcji, w którym możemy wysiewać komórki na elastyczne membrany, a następnie rozciągać te membrany axialnie przez określony czas, przy określonym odkształceniu i określonej prędkości odkształcania. Teraz przeprowadzimy Państwa przez wszystkie procesy niezbędne do przygotowania tego protokołu. Używając mydła laboratoryjnego – dowolny detergent będzie odpowiedni – nałóżcie mydło na obie strony membrany i dokładnie ją wyszorujcie, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia znajdujące się na membranie. Usuwamy wszystko, co mogłoby zakłócić wzrost komórek.

Wykonuję to ręcznie. Gdy uznam, że obie strony zostały odpowiednio oczyszczone, jeszcze raz płuczę je wodą. Następnie chcę upewnić się, że próbka jest naprawdę sterylna i pozbyć się wszelkich mikrocząsteczek.

Przenoszę tę membranę do zlewki z 70% alkoholem. Wkładam ją całkowicie do środka. Następnie całą zlewkę umieszczam w myjce ultradźwiękowej i poddaję sonikacji przez 10 minut.

Teraz, gdy mamy membranę z mikrowzorcem w kwadratowej szalce, chcemy zweryfikować, czy strona z wzorem jest skierowana do nas. Użyję rozpylacza z alkoholem i spryskam górną stronę tej membrany. Widać teraz, jak ciecz spływa, uwidaczniając te rowki.

Potwierdza to, że strona z wzorem jest skierowana do góry i znajduje się ona w prawidłowej orientacji. Zakończyliśmy zatem nocny etap naświetlania promieniami UV; wszystkie komory, ramki do komór oraz same membrany znajdują się w dygestorium, w którym pozostawały przez noc pod wpływem promieniowania UV. Jest to nasz końcowy etap sterylizacji.

Teraz chcę poddać wszystkie membrany obróbce plazmowej; będę wyjmować po jednej lub dwie membrany na raz, utrzymując je w sterylnych naczyniach i przenosząc do urządzenia plazmowego. Ciśnienie próżni zostało już zwolnione, więc mogę zdjąć komorę. Ponownie zaznaczam, że nie jest to całkowicie sterylne, ale wysterylizujemy to później.

Pracując stosunkowo szybko, aby plazma pozostała na membranie, należy użyć pęsety. Ponownie podkreślam, że jest to krytyczne: należy upewnić się, że membrana nie zostanie upuszczona ani nie zmieni swojej orientacji.

Obecnie tylko górna powierzchnia została poddana działaniu plazmy, więc umieszczę ją z powrotem w stosunkowo sterylnej płytce stroną traktowaną plazmą do góry, nałożę pokrywkę, a następnie przeniosę ją do komory z laminarnym przepływem powietrza. Teraz, gdy membrana została poddana działaniu plazmy, przeniosę ją z powrotem do komory i potraktuję 2% żelatyną. Stężenie to odnosi się do masy w objętości.

Widać, że roztwór nadal wypływa zgodnie ze schematem. Jest on również bardzo hydrofilowy dzięki traktowaniu plazmą. W związku z tym roztwór rozlewa się, zamiast zbierać w krople; gdyby przypadkowo obrócić membranę drugą stroną do góry, roztwór zebrałby się w krople, co zasygnalizowałoby użycie niewłaściwej strony.

Należy upewnić się, że roztwór rozprzestrzenił się równomiernie. Po wykonaniu tej czynności dla wszystkich membran, wystarczy zamknąć komorę i włączyć lampę UV na 30 minut. W tym momencie membrana była eksponowana na działanie promieniowania UV z żelatyną na powierzchni przez pół godziny, co jest czasem wystarczającym do absorpcji żelatyny na powierzchni.

Na tym etapie chcę dwukrotnie przemyć membranę sterylnym PBS; zazwyczaj wlewam około 10 ml do kwadratowego naczynia i delikatnie płuczę ją, poruszając naczyniem w dłoni, starając się nie dotykać powierzchni membrany, a następnie odsysam PBS. Powtórzę tę czynność jeszcze raz, a po drugim razie pozostawię membranę w PBS, co pomoże ją nawilżyć i ułatwi montaż w komorze. W przypadku pozostawienia membrany suchej istnieje większe prawdopodobieństwo, że ulegnie ona rozerwaniu lub uszkodzeniu.

Jest to drugie płukanie. Ponownie odessaj ciecz raz, aby upewnić się, że cała żelatyna została usunięta z membrany. Następnie pozostaw membranę w około 10 ml sterylnego PBS.

Jeśli pracują Państwo z więcej niż jedną membraną, należy powtórzyć ten proces dla każdej z nich. Po tym etapie można przystąpić do montażu. Należy wziąć jedną z ramek; składa się ona właściwie z dwóch części, ale zazwyczaj są one wstępnie zmontowane.

Jednym z elementów jest tutaj trójnik, a drugim element ramy, który będzie utrzymywał samą membranę. Rama składa się z drugiej części, która wygląda w ten sposób. Widać, że posiada ona taki rowek.

W tym miejscu zostanie włożona uszczelka, która utrzyma membranę na miejscu. Drugi element posiada drugi rowek na kolejną uszczelkę, tak aby obie strony membrany były zamocowane. Biorąc ten element, należy umieścić go na ramce w ten sposób, odwrócić ramkę i wziąć jedną ze śrub do autoklawu.

Włóż śrubę u góry, możesz ją najpierw lekko dokręcić ręką, a następnie użyj jednego z kluczy imbusowych, aby całkowicie ją dokręcić. W tym momencie mam zmontowaną ramkę; membrana zostanie umieszczona od spodu w ten sposób, jak gdyby moja dłoń była membraną. Oznacza to, że stroną aktywną ma być ta, która jest wzorcowana i/lub poddana obróbce plazmą oraz obróbce żelatyną.

Chcę, aby było to skierowane w górę. Jeśli przypadkowo je odwrócę i strona z żelatyną znajdzie się na dole, będzie to poważny problem dla eksperymentu. Dlatego podczas montażu chcę, aby strona z wzorem była skierowana w górę, ale zmontuję to do góry nogami.

W związku z tym, wyjmując membranę, należy upewnić się, że strona z wzorem jest skierowana do dołu. Biorąc jedną membranę – pamiętajmy, że obecnie strona z wzorem jest skierowana do góry – wyjmuję ją z PBS i kładę na ramce w ten sposób.

Obie strony są obecnie w przybliżeniu równe. Krawędzie membrany można dotykać palcami, jednak należy starać się nie dotykać przeciwległej strony. Po obróceniu membrany w ten sposób strona z wzorem jest skierowana w dół, co ma na celu ułatwienie montażu; należy teraz wziąć dwie uszczelki i umieścić je w PBS.

Zwykle turlam go w przód i w tył. Namaczam więc całą uszczelkę, co smaruje ją w taki sam sposób, w jaki nasmarowałem membranę w PBS. W przypadku użycia suchych uszczelek i suchej membrany znacznie bardziej prawdopodobne jest przemieszczenie się elementów.

Zaczynam od tego, że wyciągam jedną stronę nieco bardziej niż drugą, ponieważ podczas wkładania uszczelki – jeśli włożę ją z tej strony – membrana zostanie pociągnięta w tym kierunku, przez co ta strona stanie się nieco krótsza. Dlatego zaczynam od pozostawienia tutaj krótszego końca. Następnie biorę jedną uszczelkę i kładę ją tak, aby była rozmieszczona równomiernie po obu stronach.

Następnie, wywierając równomierny nacisk, dociśnij błonę, używając kciuków lub ich opuszków, ale nie paznokci, ponieważ istnieje ryzyko przypadkowego przecięcia i rozerwania membrany. Po jej włożeniu używam w rzeczywistości grzbietowej części pęsety, aby ją docisnąć. Ponownie, należy uważać, aby nie naciskać zbyt mocno i nie ześlizgnąć się, dotykając błony, ponieważ na tym etapie można ją przypadkowo przeciąć lub przerwać, co wymusi użycie nowej membrany i rozpoczęcie procedury od początku.

W ten sposób jedna strona została włożona, ale druga nadal pozostaje luźna. Należy więc obrócić preparat, wziąć drugą uszczelkę, upewnić się, że jest wilgotna i umieścić ją na górze, tak jak poprzednio. Następnie zazwyczaj używam pęsety, aby chwycić tę błonę i nieco ją rozciągnąć, ponieważ jeśli będzie zbyt luźna, powstanie w niej zbyt wiele fałd, co uniemożliwi obserwację komórek.

Zależy nam zatem, aby membrana była napięta, ale nie nadmiernie, by nie uległa rozciągnięciu. Jeśli zostanie rozciągnięta wstępnie, wpłynie to na eksperyment, ponieważ sama membrana będzie już pod naprężeniem, co może doprowadzić do jej przerwania podczas dociskania uszczelki. W tym momencie wygląda ona na odpowiednio napiętą.

Z jednej strony jest może nieco luźno, ale zaraz to poprawię. Ponownie, stosując dość równomierny nacisk, dociskaj kciukami lub opuszkami palców. W tym momencie widać, że jedna strona jest już dość mocno napięta.

Jest prosto przez całą szerokość drugiej strony. W tym miejscu membrana jest nieco luźna i lekko się zwija. Dlatego docisnę tę stronę do końca, dokładnie tak jak wcześniej, robiąc to powoli i równomiernie wzdłuż całej uszczelki.

Jak widać, pozwoliło to usunąć większość luzu. Właśnie zakończyliśmy 30-minutowe naświetlanie UV tylnych stron ramek i membran, a teraz chcemy odwrócić wszystkie membrany, aby można było naświetlić ich stronę przednią, co zapewni całkowitą sterylność. Na tym etapie wyznaczymy również określone komory jako komory rozciągania lub kontrolne.

Jak widać, oznaczyłem już komory jako control stretch, control stretch. Komory rozciągania wymagają jednej dodatkowej śruby, dlatego umieściłem dodatkową śrubę do komory rozciągania na górnej części spodu pokrywy.

Należy po prostu wziąć ramkę i ją obrócić. W przypadku komory rozciągającej konieczna jest wymiana kilku śrub. Jeśli natomiast jest to komora kontrolna, wszystko pozostaje bez zmian.

Kiedy ten pręt porusza się w przód i w tył, sama membrana nie ulega rozciąganiu, lecz porusza się wraz z prętem. Jeśli chcę, aby membrana się rozciągała, muszę przymocować drugą część ramki na tym końcu do dna komory, tak aby pozostała nieruchoma. Wtedy, gdy pręt będzie się poruszał, tylko ta część ramki będzie przesuwać się w przód i w tył.

Aby to zrobić, weź dodatkową śrubę i umieść ją w otworze na śrubę w tym elemencie ramy. Użyj klucza imbusowego i dokręć śrubę. Nie dokręcaj jej zbyt mocno, ponieważ komory polistyrenowe są dość kruche i nie należy dopuścić do pęknięcia komory; dokręć ją tylko na tyle, aby ten element ramy pozostał nieruchomy.

Po wkręceniu pierwszej śruby można wykręcić tę śrubę, która łączyła dwie części ramy; należy przy tym uważać, aby nie upuścić jej na membranę, ponieważ mogłoby to uszkodzić naniesioną na nią żelatynę. Gdy śruba zostanie poluzowana, należy użyć klucza imbusowego, chwycić śrubę pęsetą i umieścić ją w drugim otworze na śrubę. Następnie ponownie używamy klucza imbusowego i dokręcamy drugą śrubę.

Po przykręceniu tego elementu ramy za pomocą dwóch śrub, komora jest gotowa do rozciągania. Gdy ten pręt porusza się w przód i w tył w maszynie do rozciągania, można zauważyć, że sama membrana ulega rozciągnięciu. Zwyczajowo powtarzam tę czynność kilka razy, aby upewnić się, że membrana nie jest uszkodzona.

Jeśli z jakiegoś powodu pojawiło się pęknięcie, a następnie membrana ulegnie rozerwaniu, dowiem się o tym przed rozpoczęciem eksperymentu i będę mógł wstawić inną membranę. Należy więc odsunąć ten element na bok i wziąć kolejny, który w tym przypadku jest oznaczony jako komora kontrolna. W przypadku komory kontrolnej wystarczy ją po prostu obrócić.

Po umieszczeniu w urządzeniu, będzie ono poruszać się w przód i w tył bez rozciągania. Następnie należy powtórzyć ten proces dla wszystkich posiadanych komór i membran. Każda z nich jest poddawana kontroli rozciągania, a następnie należy zamknąć komorę i naświetlać górne strony membran lampą UV przez 30 minut.

Właśnie zakończyliśmy naświetlanie promieniami UV wszystkich komór oraz górnych części ramek z membranami przez 30 minut. Wszystko jest teraz wysterylizowane i złożone, zatem jesteśmy gotowi do wysiewu komórek. W tym przypadku wysiewam mezenchymalne komórki macierzyste, które pobieram z szalek o średnicy 10 cm.

Zatem w przypadku każdej membrany, szczególnie jeśli używam membrany z wzorem, tak jak w tym przypadku, można wysiać komórki w kwadratowym obszarze, w którym znajduje się wzór. Chcę wysiać komórki wyłącznie na tym obszarze z wzorem. Jeśli używasz membrany bez wzoru, nadal należy wysiać komórki w przybliżeniu w tym samym obszarze, aby ciecz nie znajdowała się zbyt blisko krawędzi.

Jeśli ciecz znajduje się zbyt blisko krawędzi, może wypłynąć, co doprowadzi do śmierci komórek przed ich właściwym wysianiem. W obszarze, w którym wysiewasz komórki, należy umieścić odpowiednią ich liczbę. Przeprowadzając eksperyment, dążę do uzyskania wysokiej konfluencji w tym obszarze.

Zatem jeśli używam szalki o średnicy 10 cm, dążę do uzyskania około jednej trzeciej konfluencji w tym obszarze. W przypadku mezenchymalnych komórek macierzystych jest to około 250 000 komórek. Wartość ta będzie się zmieniać w zależności od użytego typu komórek.

Komórki zostały już odseparowane od płytki i zawieszone w odpowiedniej objętości. Na każdą membranę chcę nanieść 1 mL roztworu komórkowego. W tym przypadku mam około 250 000 mezenchymalnych komórek macierzystych na 1 mL roztworu.

Używam pipety P 1000, upewniając się, że roztwór jest jednorodny. Pipetuję go kilkakrotnie w górę i w dół, aby pobrać 1 mL do pipety, a następnie dbam o to, by wysiać komórki wyłącznie na tym obszarze. Wysiewam je bardzo powoli, nakładając małe kropelki na ten wzorowany obszar.

Można to zauważyć, ponieważ ze względu na ten wzór tworzą się małe owale w tym kierunku, gdyż system faktycznie wykrywa te rowki. Nie są to więc pełne okręgi. W tym przypadku mają one raczej kształt owalny.

Następnie obserwuję cały ten obszar, nie zbliżając się jednak jeszcze zbyt mocno do krawędzi. Nie chcę przesadzić i zużyć całego roztworu z pipety. Potem używam pipety, aby faktycznie rozprowadzić roztwór blisko krawędzi, starając się nie przekroczyć ich linii.

Nie chcę, aby na obszarze nieprzepuszczalnym znajdowały się żadne komórki, a uzyskanie krawędzi znajdującej się najbliżej badacza jest nieco trudne. Dlatego zazwyczaj ostrożnie obracam naczynie, aby pokryć tę ostatnią krawędź. Dzięki temu komórki powinny rozprzestrzenić się dość równomiernie.

Wszystkie komórki zostały osadzone. Należy jednak uważać, aby ich nie zmyć. Prosimy zatem nie przesuwać dłoni bezpośrednio nad próbką i nie wykonywać gwałtownych ruchów.

Następnie odsuwam go z powrotem. Chcę to teraz przykryć i po prostu unieść wysiane komórki na górę. Aby to przykryć, należy użyć tej pokrywki, w której znajdują się dwa różne otwory.

Po tej stronie znajduje się głębszy otwór, a po drugiej płytszy, który umożliwia dopływ gazów. Należy upewnić się, że ten głębszy otwór pokrywa się z tym elementem w kształcie litery T. W przeciwnym razie, w przypadku użycia otworu płytkiego, połączenie będzie zbyt ciasne.

Umieszczając go w ten sposób, zostanie pokryta cała komora. Następnie należy powtórzyć ten proces we wszystkich pozostałych komorach i pozostawić je w dygestorium na 30 minut, aby komórki mogły osiąść na dnie i zacząć przylegać do membran. Po tym czasie wszystkie komory zaklejamy taśmą i przenosimy je z dygestorium do inkubatora, aby mogły tam pozostać przez kolejną godzinę i całkowicie osiąść na membranach.

Dobrze, właśnie minęło pół godziny od pozostawienia komórek na membranach. Teraz chcę poddać komórki działaniu temperatury 37 °C i 5% CO2, co zapewni sam inkubator. Muszę zatem przenieść je z dygestorium do inkubatora.

Aby to osiągnąć, należy zachować szczególną ostrożność i nie przechylać komór w żadnym kierunku, w przeciwnym razie zawiesina komórek może spłynąć. W takiej sytuacji konieczne będzie rozpoczęcie procedury od nowa. Po pozostawieniu komór w inkubatorze przez godzinę, są one już trwale przytwierdzone do powierzchni.

W tym momencie wyjąłem komorę z inkubatora i ostrożnie umieściłem ją z powrotem w dygestorium, transportując ją bardzo uważnie, tak jak poprzednio, aby nie rozlać pożywki z membrany. Następnie należy dodać 20 ml pożywki do komory rozciągania.

W tym przypadku stosuję specjalną kombinację pożywek, ponieważ próbki są nieco podatne na zanieczyszczenia, a ten skład został opracowany tak, aby zapobiegać ich występowaniu. Używam DMEM z dodatkiem 10% FBS, 1% penicyliny i streptomycyny oraz dodatkowego 1% fungizonu, aby zapobiec rozwojowi grzybów. Pobieram 20 ml pożywki i ostrożnie dodaję ją do komory rozciągania.

Widać, że pożywka nie spłynęła z samej membrany i została dodana na koniec komory, tak aby pożywka najpierw przeszła pod membraną, a następnie nad nią. Należy to robić powoli, aby nie zakłócić całkowicie stanu komórek. Następnie należy ponownie przykryć całość i mocno docisnąć pokrywkę.

W tym momencie nie trzeba już obawiać się naruszenia komórek ani ich oddzielenia od membrany. Można zatem obchodzić się z nią nieco mniej ostrożnie. Należy pobrać odpowiednią ilość szczepu.

Zasada działania tej maszyny polega na zastosowaniu obrotowego koła, do którego przymocowane jest ramię; długość tego ramienia może ulegać zmianie w zależności od wkładki z prefabrykowanego elementu umieszczonego w centrum koła. Podczas obrotu ramię to porusza się w przód i w tył, co z kolei powoduje ruch platformy w tym samym kierunku. Do platformy tej przymocowane są komory.

W związku z tym one również poruszają się w przód i w tył. Jeśli chcę uzyskać 5% odkształcenia, używam prefabrykowanego elementu z oznaczeniem „five”, który ma konkretną, wcześniej obliczoną długość, aby ramię znalazło się w odpowiedniej pozycji. Wkładam go zatem do środka koła, następnie mocuję ramię, upewniam się, że jest stabilnie osadzone i dokręcam je kluczem imbusowym, aby uzyskać ostateczne mocowanie.

Gdy wszystko zostanie już ustawione, znajdzie się w pozycji zerowej i zostanie zablokowane, możemy przystąpić do umieszczenia komór. Są to komory, które przed chwilą przetransportowałem.

Komórki znajdują się na górze, ostrożnie umieść je w jednej pozycji i upewnij się, że rygiel zablokował się na miejscu. Należy upewnić się, że jest on przesunięty w tym kierunku, aby został zablokowany w pozycji zerowej. Nie przesuwaj go całkowicie do tyłu, ponieważ może to doprowadzić do wstępnego naprężenia membrany.

Następnie należy zablokować go za pomocą tego mocowania, aby nie przemieścił się. Potem przełącza się włącznik, aby uruchomić urządzenie. Można zauważyć niewielki skok na początku.

Czasami tak się dzieje, że urządzenie się zacina, ale potem zazwyczaj zaczyna działać dość płynnie. Wszystkie słupki poruszają się teraz w przód i w tył z częstotliwością 60 cykli na sekundę. Tutaj na dole widnieje wartość 600.

Właściwie powinno to być 60,0. Częstotliwość można zmienić według uznania. Zazwyczaj, gdy komórki zostały już poddane stresowi mechanicznemu w systemie, utrzymujemy ten stan przez około dwa do pięciu dni, ale można to skrócić lub wydłużyć w zależności od potrzeb.

Po zakończeniu procesu i osiągnięciu zdefiniowanego punktu końcowego można wyjąć komory, a następnie wykorzystać komórki na tych membranach do przeprowadzenia różnych analiz. Zazwyczaj stosujemy szereg technik, w tym mikromacierze oraz dwuwymiarową elektroforezę żelową. Badamy również ekspresję genów za pomocą PCR lub ekspresję białek za pomocą western blottingu.

Oprócz samej lizy komórek, można je również barwić bezpośrednio na membranie, aby np. zbadać immunofluorescencję konkretnych białek, lub można nawet uwolnić komórki z membrany, a następnie je zabarwić i poddać analizie w cytometrze przepływowym. Istnieje zatem wiele różnych możliwości i parametrów, które można badać. Oczywiście dostępne są również różne modyfikacje urządzenia, jeśli chcieliby Państwo zastosować inne rodzaje membran z mikrowzorami lub po prostu inne materiały, powłoki i wszelkie inne rozwiązania służące do modyfikacji tego układu.