Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie wykonania i działania urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza mikrośrodowiska nowotworowe in vitro i może być wykorzystywane do testowania leków chemioterapeutycznych. Jest to urządzenie mikrofluidyczne. Urządzenie to może być przydatne w następujących obszarach: łatwe testowanie leków chemioterapeutycznych in vitro.

Zapewnia ono spójne i dokładne wyniki w badaniach trójwymiarowej tkanki nowotworowej, a urządzenie to stanowi bardzo wierną reprezentację guza in vivo. Nowotwory występują w trójwymiarowych mikrośrodowiskach, dlatego możliwość prowadzenia testów w takim środowisku ma istotne znaczenie. Pierwszym krokiem procedury jest montaż urządzenia, który obejmuje wykonanie chipa mikrofluidycznego metodą miękkiej litografii, wykonanie otworów w wlotach i wylotach, przytwierdzenie do szkiełka przedmiotowego oraz podłączenie rurek dla wlotu i wylotu przepływu.

Następnie, z wykorzystaniem metody wiszącej kropli, generowane są jednorodne wielokomórkowe sferoidy nowotworowe do użycia w urządzeniu. Sferoidy są następnie wprowadzane do urządzenia, po czym dodaje się środki indukujące apoptozę, czynniki detekcyjne oraz leki chemioterapeutyczne. Na koniec przeprowadzana jest mikroskopia time-lapse, a następnie matematyczna ocena współczynników dyfuzji leków w celu określenia zdolności penetracji środka chemioterapeutycznego.

W rezultacie, dzięki zastosowaniu fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, można uzyskać wyniki wykazujące wzrost tkanki w urządzeniu, tworzenie heterogenicznych mikrootoczeń w obrębie tkanki oraz dyfuzję leków do tkanki. Ograniczona penetracja leków przeciwnowotworowych do guzów litych jest istotną przyczyną ich nieskuteczności. Większość obecnych modeli testowania leków przeciwnowotworowych nie odwzorowuje trójwymiarowej natury guzów litych.

Opracowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe składające się z stale perfundowanych trójwymiarowych tkanek nowotworowych. Model ten dokładniej odwzorowuje dostarczanie leków do guzów litych oraz ich usuwanie systemowe. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe stanowią uznany model trójwymiarowych tkanek nowotworowych.

W niniejszej procedurze zastosowano metodę wiszącej kropli do tworzenia sferoidów przeznaczonych do wykorzystania w urządzeniu mikrofluidycznym. Metoda ta umożliwia formowanie jednolitych sferoidów w krótkim czasie. Testowanie leków chemioterapeutycznych in vitro w trójwymiarowej tkance pozwala na bardziej efektywny screening leków w porównaniu do monowarstw komórek.

Wymieszaj PDMS i czynnik sieciujący z elastomeru silikonowego w stosunku wagowym dziewięć do jednego. Następnie wlej tę mieszaninę na matrycę, aby utworzyć warstwę o grubości czterech milimetrów. Odgazuj mieszaninę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie utwardzaj w temperaturze 60 °C przez pięć godzin.

Oderwij utwardzony PDMS z formy, aby uzyskać stempel z naniesionymi na elastomer strukturami przepływowymi. Następnie, używając wycinaka do biopsji o średnicy 1,5 mm zamontowanego na wiertarce, wykonaj otwory wlotowe i wylotowe. Usuń wszelkie pozostałości materiału.

Poddać stronę z wzorem stempla oraz czystą szkiełko przedmiotowe działaniu plazmy tlenowej przez osiem minut. W urządzeniu do trawienia plazmowego tlenem natychmiast doprowadzić do kontaktu przetworzonych powierzchni, aby utworzyć między nimi wiązanie. Przechowywać zespół w temperaturze 60 °C na podgrzewaczu do szkiełek przez co najmniej pięć godzin.

Aby wzmocnić połączenie, podłącz rurkę PTFE o średnicy wewnętrznej 0,032 cala do wlotów i wylotów urządzenia mikrofluidycznego. Wykorzystując interfejs składający się z męskich złączy typu lure lock przymocowanych do żeńskich złączy typu lure lock z karbem, zastosowano te konkretne łączniki, aby umożliwić ich łatwe przechodzenie bez ryzyka uszkodzenia. Na koniec przygotuj układ przepływowy, używając zaworów odcinających i łącznika w kształcie litery Y, a następnie zamontuj urządzenie na mikroskopie. Po zamontowaniu urządzenia podłącz rurki do odpowiednich wlotów i wylotów, aby dokończyć konfigurację przepływu.

Jak pokazano na tej figurze, taka konfiguracja umożliwia łatwe i wszechstronne umieszczanie sferoidu w urządzeniu lub stworzenie przepływu medium przez urządzenie w celu jego unieruchomienia. Otwórz zawór wlotowy do pakowania VPN oraz zawór wylotowy do pakowania VP out. Tumoroid może następnie przejść przez wlot i wpłynąć do komory hodowlanej, gdzie znajdujący się w niej trzpień utrzyma guz na miejscu podczas przepływu medium.

Zamknąć zawory pakowania i otworzyć zawór wlotowy przepływu VF in oraz zawór wylotowy przepływu VF out, aby rozpocząć tworzenie jednorodnego PHE. Przy użyciu metody wiszącej kropli potraktować komórki trypsyną w komorze laminarno-opływowej. Wyjąć uzyskane komórki z trypsyną z wirówki.

Rozcieńcz roztwór zapasowy do pożądanej koncentracji, korzystając z tabeli 1. Następnie zdejmij pokrywkę płytki 48-dołkowej i połóż ją do góry dnem. W sterylnej komorze laminarnej napełnij każdy dołek płytki jednym mililitrem sterylnej wody.

Aby utrzymać wilgotność, nanieś 20 µL kroplę rozcieńczonego roztworu komórek w każdym okrągłym obszarze na przykryciu. Używając mikropipety, ostrożnie odwróć przykrycie i umieść je nad płytką, upewniając się, że krople nie dotykają krawędzi dołków. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C.

Czas inkubacji w zależności od zastosowanego rodzaju komórek znajduje się w tabeli 1; w każdej wiszącej kropli utworzy się steroid. Rozpocząć należy od wysterylizowania urządzenia poprzez przepłukanie go 70% ethanol poprzez wlot przepływu. Następnie należy przepłukać urządzenie najpierw PBS, a następnie pożywką do hodowli komórkowej buforowaną H-E-P-E-S.

Pozostaw strzykawkę z medium, podłączając ją do drenu. Następnie nabierz od dwóch do trzech Steroids do kranika strzykawki. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, podłącz strzykawkę do wlotu pakującego urządzenia.

Otwórz zawór wlotowy VPN i zamknij VFN, otwórz zawór wylotowy VP out i zamknij VF out. Trzymaj strzykawkę z materiałem pionowo, z igłą skierowaną w dół. Obserwuj, aż steroid opadnie na dno strzykawki, do złączki luer lock igły.

Naciśnij tłok strzykawki do upakowywania i obserwuj, jak PHE wpływa do rurki i przepływa do urządzenia, ponieważ otwarty jest jedynie zawór wylotowy upakowywania. Steroid wpłynie do komory urządzenia i zostanie zatrzymany przez słupki z tyłu. Po znalezieniu się wewnątrz komory, sferoid S dopasuje się do jej kształtu i przyjmie geometrię prostokątną.

Zamknij zawór wlotowy VPN oraz zawór wylotowy VP out i zamontuj strzykawkę przepływową SF w pompie strzykawkowej. Pompa ta jest sterowana przez komputer za pomocą oprogramowania syringe pump pro. Otwórz zawór wlotowy VFN i zawór wylotowy VF out. Rozpocznij przepływ medium do urządzenia z prędkością 3 µL/min.

Po inkubacji sferoidów przez 24 godziny wprowadzane są odczynniki wykrywające apoptozę. Przed wprowadzeniem czynników wykrywających apoptozę lub czynników terapeutycznych należy odczekać do 24 godzin, aby sferoid osiągnął stan równowagi i wytworzyły się gradienty składników odżywczych oraz mikrośrodowiska. Następnie należy zamknąć zawór VFN.

Zatrzymaj pompę strzykawkową. Wyjmij strzykawkę z pompy i zastąp ją strzykawką zawierającą medium z 0,25 µL/ml markera Caspase-3 CASPglow red. Przepłucz urządzenie tym roztworem, ręcznie przepuszczając przez nie 0,7 ml cieczy.

Następnie zamontuj strzykawkę na pompie. Przywróć przepływ i otwórz zawór VFN. W ciągu od pięciu do ośmiu godzin czynnik wykrywający apoptozę w fazie trzeciej (cask glove red active cph phase three) dyfunduje do tkanki i fluorescuje intensywniej w obszarach apoptotycznych. Czynnik wykrywający apoptozę w tym stężeniu jest utrzymywany we wszystkich kolejnych roztworach przepływowych.

Doksorubicynę podaje się od pięciu do ośmiu godzin po wprowadzeniu czynników wykrywających apoptozę. Preparat ten jest usuwany z układu poprzez przepłukiwanie. Aby dodać środki chemioterapeutyczne, należy postępować zgodnie z procedurą wykrywania apoptozy, aby wprowadzić 10 µM chlorowodorku doksorubicyny.

Następnie zastąp strzykawkę z preparatem strzykawką zawierającą 0,7 milliliters medium. Kontynuuj przepływ czynnika terapeutycznego przez określony czas. Następnie zamknij zawór VFN i wyłącz pompę strzykawkową.

Wyjąć strzykawkę z preparatem z pompy strzykawkowej i zastąpić ją strzykawką zawierającą 0,7 milliliters medium. Pozostawić przepływ świeżego medium przez 24 do 36 hours, stale monitorując tkankę pod mikroskopem. Cały proces akwizycji dla mikroskopii time-lapse został zautomatyzowany za pomocą dostosowanego skryptu w programie IP lab; należy pozyskiwać obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym PAX Foid przy powiększeniu 10 x co 30 minutes. W celu matematycznego oszacowania współczynników dyfuzji leku, pierwszym krokiem jest wygenerowanie średnich liniowych profilów intensywności fluorescencji docs za pomocą programu ImageJ. Wybrać prostokątny obszar zainteresowania, ROI, obejmujący tkankę w komorze.

Użyj polecenia plot profile, aby wygenerować profil średnich intensywności w funkcji odległości od kanału przepływu. Powtórz tę czynność dla maksymalnie trzech różnych punktów czasowych. Następnie od uzyskanych profili intensywności odejmij średnią intensywność fluorescencji tła i znormalizuj każdy profil, używając odpowiadającej mu maksymalnej intensywności, aby otrzymać C w funkcji X i T. Gdzie C to znormalizowane stężenie doksorubicyny, a wartość C zmienia się w przedziale od zera do jeden.

Kolejnym krokiem jest ocena efektywnego współczynnika dyfuzji doxorubicyny w obrębie tkanki nowotworowej. Dyfuzję można przedstawić za pomocą następującego równania, w którym ERFC oznacza dopełniającą funkcję błędu. X to odległość od kanału w głąb tkanki, a T to czas po wprowadzeniu doxorubicyny.

W każdym rozważanym punkcie czasowym należy zastosować następujący schemat iteracyjny. Przyjmij wartość szacunkową dla D. Oblicz prawą stronę równania w każdym punkcie X. Oblicz sumę kwadratów błędów między obiema stronami, a następnie zmodyfikuj D w celu zminimalizowania średniej różnicy.

Optymalne wartości D uzyskane dla każdego punktu czasowego służyły do oszacowania średniego efektywnego współczynnika dyfuzji doksorubicyny w tkance. Urządzenia mikroprzepływowe zapewniały optycznie dostępne komory hodowlane o wymiarach 1 mm x 0,3 mm x 0,15 mm do wzrostu trójwymiarowej tkanki nowotworowej. Metoda wiszącej kropli pozwoliła na szybkie tworzenie PHE nowotworu o spójnej wielkości i kształcie z kilku linii komórkowych.

Komórki PHE pomyślnie hodowano na urządzeniu przez okres do trzech dni. Wzrost w komorach wiązał się z powtarzalną modyfikacją mikrośrodowisk. W obrębie PHE apoptoza występowała rzadziej w komórkach znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie kanału przepływowego, a częściej w głębszych warstwach tkanki.

Urządzenie zostało wykorzystane do oszacowania współczynnika dyfuzji doksorubicyny w tkance nowotworowej. Wartość uzyskana doświadczalnie była zgodna z wartością zgłoszoną wcześniej dla raka piersi u ludzi. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie szczególnej ostrożności w utrzymaniu sterylności podczas wprowadzania PHE do urządzenia, ponieważ czynność ta musi być przeprowadzona poza hodowlą komórkową.

Obficie spryskaj etanolem strzykawki oraz końce rurek wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, aby zapewnić sterylność. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć rolę ograniczonej penetracji leków do guzów nowotworowych. Przedstawiliśmy technikę naśladującą dostarczanie i systemowe usuwanie leków z trójwymiarowych tkanek nowotworowych oraz sposób ilościowego pomiaru ich penetracji.

Wyeliminowanie leków o słabej przenikalności znacząco usprawni proces opracowywania leków przeciwnowotworowych.