Urządzenie mikroprzepływowe do odtwarzania mikrośrodowiska guza in vitro
November 20th, 2011
Przedstawiamy procedurę wytwarzania i działania urządzenia mikroprzepływowego, które odtwarza heterogeniczne mikrośrodowiska guza in vitro. Zmienność apoptozy w tkance nowotworowej określono ilościowo za pomocą barwienia fluorescencyjnego i oceniono efektywny współczynnik dyfuzji leku chemioterapeutycznego doksorubicyny do tkanki nowotworowej.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie produkcji i działania urządzenia mikroprzepływowego, które odtwarza mikrośrodowiska guza in vitro i może być wykorzystywane do testowania leków chemioterapeutycznych. To jest urządzenie mikroprzepływowe. To urządzenie może być przydatne w następujących obszarach, łatwe testowanie leków chemioterapeutycznych in vitro.
Zapewnia spójne i dokładne wyniki badania trójwymiarowej tkanki nowotworowej, a to urządzenie zapewnia bardzo dokładne odwzorowanie guza in vivo. Mikrośrodowiska guzy istnieją w mikrośrodowiskach 3D, a możliwość testowania w jednym z nich jest znacząca. Pierwszym krokiem procedury jest montaż urządzenia, który polega na wytworzeniu chipa mikroprzepływowego za pomocą miękkiej litografii, wybiciu otworów na wlotach i wylotach, połączeniu ze szklanym szkiełkiem i podłączeniu rurki do wlotu i wylotu przepływu.
Następnie generowane są jednolite wielokomórkowe steroidy nowotworowe do stosowania w urządzeniu metodą wiszącej kropli. Sferoidy są następnie wprowadzane do urządzenia, a następnie podawana jest apoptoza, środki wykrywające i leki chemioterapeutyczne. Na koniec przeprowadzana jest mikroskopia poklatkowa, a następnie matematyczna ocena współczynników dyfuzyjności leku w celu ilościowego określenia zdolności przenikania środka chemioterapeutycznego.
Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują wzrost tkanki w urządzeniu, tworzenie niejednorodnych mikrośrodowisk w tkance i dyfuzję leku do tkanki za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Ograniczona penetracja leków przeciwnowotworowych do guzów litych jest ważną przyczyną ich niepowodzenia. Większość obecnych modeli testowania leków przeciwnowotworowych nie naśladuje trójwymiarowej natury guzów litych.
Opracowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe składające się z ciągłych perfuzji trójwymiarowych tkanek nowotworowych. Model ten dokładniej odzwierciedla dostarczanie leków do guzów litych i ich ogólnoustrojowy klirens. Wielokomórkowe steroidy nowotworowe są dobrze ugruntowanym modelem trójwymiarowych tkanek nowotworowych.
W tej procedurze metoda wiszącej kropli jest stosowana do tworzenia sterydów do stosowania w urządzeniu mikroprzepływowym. Ta metoda pozwala na tworzenie spójnych sterydów w krótkim czasie. Testowanie leków chemioterapeutycznych in vitro w trójwymiarowej tkance może pomóc w bardziej efektywnym badaniu przesiewowym leków w porównaniu z monowarstwami komórek.
Wymieszaj PDMS i utwardzacz z elastomeru krzemowego w stosunku wagowym dziewięć do jednego. Następnie wylej tę mieszaninę na mistrza, aby utworzyć odblask Degasa o grubości czterech milimetrów. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, utwardzaj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez pięć godzin.
Oderwij utwardzony PDMS od formy, aby uzyskać pieczęć cech płynięcia na elastomerze. Następnie za pomocą półtoramilimetrowego stempla do biopsji zamontowanego na wiertarce, wciśnij otwory na wloty i wyloty. Wyciągnij wszelkie zanieczyszczenia.
Poddaj stronę charakterystyczną stempla i czyste szkiełko plazmie tlenowej przez osiem minut. W wytrawiaczu plazmowym tlenowym należy natychmiast zetknąć obrabiane powierzchnie, aby utworzyć między nimi wiązanie. Utrzymuj zespół w temperaturze 60 stopni Celsjusza na podgrzewaczu do szkiełka przez co najmniej pięć godzin.
Aby wzmocnić wiązanie, podłącz rurkę PTFE o średnicy wewnętrznej 0,032 cala do wlotów i wylotów urządzenia mikroprzepływowego. Korzystając z interfejsu męskich łączników zamka przynęty przymocowanych do zadziorowych żeńskich łączników zamka przynęty, te specyficzne łączniki są używane, aby umożliwić łatwe przejście przez nie bez pękania. Na koniec ustaw zespół przepływu za pomocą zaworów odcinających i złącza Y, zamontuj urządzenie na mikroskopie Po zamontowaniu urządzenia podłącz rurki do odpowiednich wlotów i wylotów, aby zakończyć konfigurację przepływu.
Jak pokazano na tym rysunku, taka konfiguracja pozwala na łatwość i wszechstronność pakowania sferoidy do urządzenia lub tworzenia przepływu medium przez urządzenie w celu zapakowania. Otwórz zawór wlotowy uszczelnienia VPN i zawór wylotowy uszczelnienia VP na zewnątrz guza. OID może następnie przejść przez wlot i przepłynąć do komory hodowlanej, gdzie słupek w tej komorze utrzyma guz na miejscu, aby przepływać pożywkę.
Zamknij zawory uszczelniające i otwórz zawór wlotowy przepływu VF do środka i zawór wylotowy przepływu VF na zewnątrz, aby zainicjować tworzenie jednolitego PHE. Za pomocą metody wiszącej kropli trypsyna komórki lodu pod kapturem hodowlanym. Weź powstałe komórki trypsyny z wirówki.
Rozcieńczyć roztwór podstawowy do pożądanego stężenia, odwołując się do tabeli pierwszej. Następnie zdejmij pokrywę płytki 48-dołkowej i umieść ją do góry nogami. W wysterylizowanym kapturze napełnij każdą studzienkę płytki jednym mililitrem wysterylizowanej wody.
Aby utrzymać wilgotność, umieść 20 mikrolitrów kropli rozcieńczonego roztworu komórkowego w każdym okrągłym obszarze na pokrywie. Za pomocą mikropipety ostrożnie odwróć pokrywę i umieść ją na płytce, upewniając się, że krople Nie dotykaj krawędzi studzienek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Zapoznaj się z tabelą pierwszą, aby uzyskać informacje na temat czasu trwania inkubacji w oparciu o konkretną użytą komórkę, steryd utworzy się w każdej wiszącej kropli. Zacznij od wysterylizowania urządzenia, przepłukując je 70% etanolem przez wlot przepływu. Następnie przepłukać każdą z PBS, a następnie buforowaną pożywką do hodowli komórkowych H-E-P-E-S.
Pozostawić średnią strzykawkę, przymocować do rurki. Następnie, narysuj dwa do trzech sterydów do strzykawki z kranem strzykawka. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, przymocuj strzykawkę do wlotu uszczelnienia urządzenia.
Otwórz zawór wlotowy VPN i zamknij VFN, otwórz zawór wylotowy VP na zewnątrz i zamknij VF. Trzymać strzykawkę do pakowania pionowo z igłą skierowaną w dół. Obserwuj, jak steryd osiada na dnie strzykawki do łącznika blokady przynęty igły.
Wciśnij tłok na strzykawkę do pakowania i obserwuj, jak PHE wchodzi do rurki i przepływa do urządzenia, ponieważ otwarty jest tylko zawór wylotowy uszczelnienia. Steryd wejdzie do komory urządzenia i zostanie zatrzymany przez słupki z tyłu. Po wejściu do komory sferoida S dopasowuje się do kształtu komory i uzyskuje prostokątną geometrię.
Zamknij zawór wlotowy VPN i wyjściowy zawór wylotowy VP na zewnątrz zamontuj strzykawkę przepływową SF na pompie strzykawkowej. Ta pompa jest uruchamiana przez komputer za pomocą pompy strzykawkowej pro, otwartego zaworu wlotowego VFN i zaworu wylotowego VF na zewnątrz. Rozpocznij przepływ pożywki do urządzenia z prędkością trzech mikrolitrów na minutę.
Po inkubacji sferoidy przez 24 godziny wprowadza się środki wykrywające apoptozę. Przed wprowadzeniem apoptozy, środków wykrywających lub terapeutycznych należy pozostawić równowagę sferoidy przez okres do 24 godzin, aby ustalić gradienty składników odżywczych i mikrośrodowiska. Następnie odciąć zawór VFN.
Zatrzymać pompę strzykawkową. Wyjąć strzykawkę z pompy i zastąpić ją strzykawką zawierającą pożywkę o stężeniu 0,25 mikrolitra na promil CASP świecącego na czerwono aktywnego markera kaspazy trzy. Umyj urządzenie roztworem, ręcznie przepłukując 0,7 mililitra przez urządzenie.
Następnie zamontuj strzykawkę na pompie. Uruchom ponownie przepływ i otwórz zawór VFN. W okresie od pięciu do ośmiu godzin czerwona aktywna faza cph w rękawicy beczkowej dyfunduje do tkanki i fluoryzuje jaśniej w regionach apoptozy, środek wykrywający apoptozę w tym stężeniu utrzymuje się we wszystkich kolejnych roztworach przepływu.
Doksorubicyna Wprowadza się od pięciu do ośmiu godzin po wprowadzeniu środków wykrywających apoptozę. Zabieg ten jest usuwany z systemu przez płukanie. Aby dodać chemioterapeutyki, postępuj zgodnie z procedurą wykrywania apoptozy, aby wprowadzić 10 mikromolowy chlorowodorek doksorubicyny.
Następnie zastrzykać strzykawkę leczniczą strzykawką o objętości 0,7 mililitra pożywki. Kontynuuj przepływ środka terapeutycznego przez określony czas. Następnie zamknij zawór VFN i wyłącz pompę strzykawkową.
Wyjąć strzykawkę leczniczą z pompy strzykawkowej i zastąpić strzykawką 0,7 mililitra pożywki. Pozwól na przepływ świeżej pożywki przez 24 do 36 godzin, stale monitorując tkankę pod mikroskopem. Cały proces akwizycji dla mikroskopii poklatkowej został zautomatyzowany za pomocą niestandardowego skryptu w laboratorium IP, pozyskuj obrazy światła przechodzącego i fluorescencji PAX Foid przy 10-krotnym powiększeniu co 30 minut W celu matematycznego oszacowania współczynników dyfuzyjności leków, pierwszym krokiem jest wygenerowanie średnich profili intensywności liniowej fluorescencji docs za pomocą obrazu J.Wybierz prostokątny obszar zainteresowania, lub ROI obejmujący tkankę w komorze.
Polecenie wykreśl profil służy do generowania profilu średnich intensywności w funkcji odległości od kanału przepływu. Powtórz tę czynność dla maksymalnie trzech różnych punktów czasowych. Następnie odejmij średnią intensywność fluorescencji tła od uzyskanych profili intensywności i znormalizuj każdy profil przy użyciu odpowiedniej maksymalnej intensywności, aby uzyskać C w funkcji X i T. Gdzie C jest znormalizowanym stężeniem doksorubicyny, wartość C waha się od zera do jednego.
Następnym krokiem jest ocena efektywnego współczynnika dyfuzji docs w obrębie docs tkanki nowotworowej. Dyfuzję można przedstawić za pomocą następującego równania, gdzie ERFC jest funkcją błędu komplementarnego. X to odległość w tkance od kanału, a T to czas po wprowadzeniu doksorubicyny.
Użyj następującego schematu iteracyjnego w każdym rozważanym punkcie czasowym. Odgadnij wartość dla D.Oblicz prawą stronę równania w każdym miejscu. X.Oblicz sumę kwadratów błędów między dwiema stronami, zmodyfikuj D, aby zminimalizować średnią resztkową.
Optymalne wartości D uzyskane w każdym punkcie czasowym w celu oszacowania średniego efektywnego współczynnika dyfuzji doksorubicyny w tkance. Urządzenia mikroprzepływowe zapewniły optycznie dostępne komory hodowlane o wymiarach 1 milimetr na 0,3 milimetra na 0,15 milimetra do wzrostu trójwymiarowej tkanki nowotworowej. Metoda wiszącej kropli pozwoliła na szybkie wytworzenie guza PHE o stałej wielkości i kształcie z kilku linii komórkowych.
PHE były z powodzeniem hodowane na urządzeniu przez okres do trzech dni. Wzrost w komorach był związany z powtarzalną modyfikacją mikrośrodowisk. W obrębie phe apoptoza występowała rzadziej w komórkach znajdujących się w bliskiej odległości od kanału przepływowego, a wyżej i głębiej w tkance.
Urządzenie posłużyło do oszacowania współczynnika dyfuzji doksorubicyny i tkanki nowotworowej. Eksperymentalnie skażona wartość zgadzała się z wartością zgłoszoną wcześniej w ludzkim raku piersi podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby zachować szczególną ostrożność przy utrzymywaniu sterylności podczas wprowadzania PHE do urządzenia, ponieważ musi to być wykonywane poza hodowlą komórkową.
Kaptur obficie spryskaj strzykawki i końce rurek etanolem, aby zapewnić sterylność. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć zrozumienie roli ograniczonej penetracji leków do nowotworów. Pokazaliśmy technikę naśladowania dostarczania i ogólnoustrojowego usuwania leków na trójwymiarowe tkanki nowotworowe oraz ilościowego określania ich penetracji.
Wyeliminowanie słabo penetrujących leków znacznie usprawni proces opracowywania leków przeciwnowotworowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia procedurę produkcji i działania urządzenia mikrofluidycznego zaprojektowanego w celu odtworzenia heterogenicznych mikrośrodowisk nowotworowych in vitro. Urządzenie umożliwia testowanie leków chemioterapeutycznych, zapewniając bardziej dokładne przedstawienie warunków nowotworowych in vivo.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Mikrofluidyka
- Onkologia
- Testowanie leków
Tło
- Urządzenia mikrofluidyczne mogą symulować złożone środowiska biologiczne.
- Heterogeniczne mikrośrodowiska nowotworowe są kluczowe dla dokładnego testowania leków.
- Zrozumienie dyfuzji leków w nowotworach jest istotne dla skutecznego leczenia.
- Barwienie fluorescencyjne może służyć do ilościowego określenia procesów komórkowych, takich jak apoptoza.
Cel badania
- Aby pokazać produkcję urządzenia mikrofluidycznego.
- Aby odtworzyć mikrośrodowiska nowotworowe do testów in vitro.
- Aby ocenić dyfuzję środków chemioterapeutycznych, takich jak doksorubicyna.
Stosowane metody
- Produkcja mikroczipu mikrofluidycznego za pomocą litografii miękkiej.
- Wycinanie otworów dla wlotów i wylotów płynów.
- Przyczepienie chipu do szklanej szklanki.
- Podłączenie przewodów dla przepływu płynu.
Główne wyniki
- Urządzenie zapewnia spójne i dokładne wyniki testów leków.
- Efektywnie symuluje 3D strukturę tkanek nowotworowych.
- Osiągnięto ilościowe określenie zmienności apoptozy w tkance nowotworowej.
- Oceniony został współczynnik efektywnej dyfuzji doksorubicyny.
Wnioski
- Urządzenie mikrofluidyczne jest cennym narzędziem do badań nad rakiem.
- Ulepsza zrozumienie interakcji leków w nowotworach.
- To podejście może prowadzić do ulepszonych strategii terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Recreating the tumor microenvironment in vitro addresses a critical gap in oncology drug discovery by enabling predictive assessment of drug penetration and efficacy in heterogeneous, three-dimensional tissues. This microfluidic platform supports early de-risking of candidate compounds by modeling nutrient gradients and cellular heterogeneity that drive therapeutic resistance. Integrating such physiologically relevant models into the discovery pipeline enhances translational confidence and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of drug penetration and retention in 3D tumor-like tissues.
- Supports functional validation of targets under physiologically relevant gradients.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling viable, quiescent, and necrotic cell zones.
- Improves predictive confidence for compound triage and prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for quantitative drug diffusion and apoptosis assays.
- Standardizes 3D spheroid formation for consistent assay outputs across cell lines.
- Enables time-lapse microscopy and automated image analysis for high-content screening.
- Supports scalable evaluation of compound efficacy in complex tissue contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro drug response with in vivo tumor heterogeneity for translational continuity.
- Enables estimation of diffusion coefficients relevant to human tumor tissues.
- Supports risk-adjusted advancement by modeling drug clearance and microenvironmental effects.
- Facilitates biomarker discovery linked to spatial apoptosis patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic model bridges early discovery and preclinical validation by providing a physiologically relevant assay for drug penetration and efficacy. It is positioned for integration from target validation through lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Quantifies drug diffusion and apoptosis gradients to clarify mechanistic barriers to efficacy.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound comparison in 3D tissue contexts.
- Analytics: Enables mathematical estimation of diffusion coefficients and spatial intensity profiles.
- Translational Research: Models clinically relevant microenvironments to inform preclinical decisions.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, reusable platform for oncology drug development workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in drug response.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and scalability for 3D models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by modeling key resistance mechanisms early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, 3D cell culture, and quantitative imaging.
- Needs access to soft lithography, time-lapse microscopy, and image analysis infrastructure.
- Demands rigorous sterility and cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptation across cancer cell lines is supported by the hanging drop spheroid method.
- Practical limitations include device handling outside of sterile hoods and short-term culture duration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Introduction
2:52
Microfluidic Device Fabrication
5:45
Formation of Uniform Tumor Spheroids using the Hanging Drop Method
7:04
Introduction of Spheroids into the Microfluidic Device
9:18
Introduction of Apoptosis-detecting Agent into the Microfluidic Device
10:50
Introduction of Therapeutic Agents into the Microfluidic Device
11:59
Time Lapse Microscopy and Estimation of Drug Diffusivity Coefficients
14:25
Representative Results
15:30
Concluding Remarks
