Name: Urządzenie mikroprzepływowe do odtwarzania mikrośrodowiska guza in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 18 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania mikroprzepływowego urządzenia do odtwarzania mikrośrodowiska guza in vitro. Technika ta umożliwia testowanie leków cytostatycznych w trójwymiarowej tkance nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu National Institute of Health nr 1R01CA120825-01A1, programu Collaborative Biomedical Research (CBR) na University of Massachusetts Amherst oraz stypendium Isenberg dla Bhushana J. Toleya. Jesteśmy wdzięczni za cenny wkład Jamesa Schafera, operatora wideo, narratora i montażysty tego filmu.

1. Wytwarzanie urządzenia
Replikacja elementów mikroprzepływowych w materiałach elastomerowych została przeprowadzona w oparciu o metodę opisaną przez Duffy i wsp.1
<ol>
	<li>Wymieszać elastomer (polidimetylosiloksan; PDMS) oraz czynnik sieciujący z zestawu Silicone Elastomer Kit (Dow Corning, Midland, MI) w stosunku wagowym 9:1 i wylać na matrycę, tworząc warstwę o grubości 4 mm. Odgazować w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie utwardzać mieszaninę w temperaturze 60°C przez 5 godzin. Oddzielić utwardzony PDMS od formy, aby uzyskać stempel z naniesionymi strukturami przepływowymi na elastomerze.</li>
	<li>Wyciąć otwory wlotowe i wylotowe za pomocą wycinaka do biopsji o średnicy 1.5 mm (Miltex, York, PA) zamontowanego na wiertarce stołowej. Usunąć wszelkie pozostałości materiału.</li>
	<li>Poddać stronę ze strukturami stempla oraz czyste szkiełko przedmiotowe działaniu plazmy tlenowej przez 8 minut w trawaczu plazmowym. Bezzwłocznie zetknąć ze sobą potraktowane powierzchnie, aby utworzyć między nimi wiązanie. Przechowywać zmontowany układ w temperaturze 60°C na podgrzewaczu do szkiełek przez co najmniej 5 godzin w celu wzmocnienia wiązania.</li>
	<li>Podłączyć rurki PTFE o średnicy wewnętrznej (ID) 0.032" (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) do wlotów i wylotów, korzystając z interfejsu złożonego z męskich złączy luer lock przymocowanych do żeńskich złączy luer lock z kolcami (Qosina, Edgewood, NY).</li>
	<li>Przygotować układ przepływowy, wykorzystując zawory odcinające i łącznik w kształcie litery Y (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Rysunek 1). Zamontować urządzenie na mikroskopie. Podłączyć strzykawki do rurek za pomocą igieł 20G 1.5" (BD Bioscience, Rockville, MD).</li>
</ol>
2. Formowanie jednorodnych sferoidów
Sferoidy utworzono metodą wiszącej kropli2,3.
<ol>
	<li>Przeprowadź trypsynizację komórek pod sterylnym dygestorium do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Odwiruj trypsynizowane komórki przy 2000 rpm przez 5 minut i resuspenduj w 6 ml świeżej pożywki. Rozcieńcz roztwór zapasowy do pożądanego stężenia końcowego (Tabela 1).</li>
	<li>Zdejmij pokrywkę płytki 48-dołkowej i umieść ją odwróconą do góry dnem w sterylnym dygestorium. Na pokrywce widoczne są obszary koliste odpowiadające każdemu dołkowi. Napełnij każdy dołek płytki 1 ml sterylnej wody w celu utrzymania wilgotności. Za pomocą mikropipety nanieś 20 μl kropli rozcieńczonego roztworu komórek w każdym obszarze kolistym. Ostrożnie odwróć pokrywkę i nałóż ją na płytkę z dołkami, upewniając się, że krople nie dotykają krawędzi dołków.</li>
	<li>Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez określoną liczbę dni (Tabela 1). W każdej wiszącej kropli uformuje się sferoid.</li>
</ol>
3. Wprowadzenie sferoidów do urządzenia
W tej sekcji należy odnieść się do rysunku 1 i tabeli 2.
<ol>
	<li>Sterylizujemy urządzenie, przepłukując je 70% ethanolem wprowadzonym przez wlot przepływu. Następnie przepłukujemy PBS, a potem pożywką do hodowli komórkowej buforowaną HEPES. Pozostawiamy strzykawkę z pożywką SF podłączoną do rurek.</li>
	<li>Pobieramy 2-3 sferoidy do strzykawki SP, opukujemy strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i podłączamy ją do wlotu pakującego urządzenia.</li>
	<li>Otwieramy zawór wlotowy VPin i zamykamy VFin. Otwieramy zawór wylotowy VPout i zamykamy VFout. Trzymamy strzykawkę pakującą pionowo z igłą skierowaną w dół; obserwujemy, aż sferoidy opadną na dno strzykawki do złącza luer-lock igły. Naciskamy tłok strzykawki pakującej i obserwujemy, jak sferoidy wpływają do rurek i przedostają się do urządzenia. Ponieważ otwarty jest tylko zawór wylotowy pakowania, sferoid wpłynie do komory urządzenia i zostanie zatrzymany przez słupki z tyłu (Rys. 2).</li>
	<li>Zamykamy zawór wlotowy VPin i zawór wylotowy VPout. Montujemy strzykawkę SF w pompie strzykawkowej. Otwieramy zawór VFin oraz zawór VFout. Wprowadzamy pożywkę do urządzenia z przepływem 3 μl/min.</li>
</ol>
4. Wprowadzenie czynnika wykrywającego apoptozę (CaspGLOW)
Po wypełnieniu komór sferoidami, należy pozostawić je na okres do 24 godzin w celu równowagi, aby ustanowić gradienty składników odżywczych i mikrośrodowiska przed wprowadzeniem czynników terapeutycznych lub wykrywających apoptozę. Ponieważ tkanki w komorach stykają się z nieprzepuszczalnymi ściankami od góry i od dołu, wzdłuż grubości tkanki (0.15mm) nie występują gradienty składników odżywczych. Po 24 godzinach inkubacji wszystkie warstwy komórek wzdłuż grubości tkanki są zatem równoważne, a jedyna heterogeniczność występuje w kierunku oddalenia od kanału przepływowego.
<ol>
	<li>Zamknij zawór VFin, zatrzymaj pompę strzykawkową, wyjmij strzykawkę SF z pompy i zastąp ją strzykawką zawierającą medium z markerem aktywnej kaspazy-3 CaspGLOW Red w stężeniu 0.25 μl/ml (Red-DEVD-FMK; Biovision, Mountain View, CA). </li>
	<li>Ręcznie przepłucz urządzenie 0,7 ml tego roztworu, aby zapewnić usunięcie starego medium. Zamontuj strzykawkę na pompie, wznowij przepływ i otwórz VFin. W ciągu 5–8 godzin czynnik wykrywający apoptozę dyfunduje do tkanki i fluorescencyjnie rozjaśnia regiony apoptotyczne. Czynnik wykrywający apoptozę w tym stężeniu jest utrzymywany we wszystkich kolejnych roztworach przepływowych wprowadzanych do urządzenia.</li>
</ol>
Uwaga:
<ol class="lroman">
	<li>Heterogenność tkanki można potwierdzić, uzyskując liniowe profile intensywności fluorescencji, zgodnie z opisem w sekcji 6. Profile powinny wykazywać gradienty przestrzenne apoptozy, co potwierdza, że tkanka jest heterogenna pod kątem żywotności komórek.</li>
	<li>Do wykrywania apoptozy można również zastosować marker CaspGLOW Green Active Caspase-3 (Fluorescein-DEVD-FMK; Biovision). Marker ten zawiera zielony fluorofor fluoresceinę zamiast czerwonego fluoroforu rodaminy.</li>
</ol>
5. Wprowadzenie czynnika terapeutycznego
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1-4.2, aby wprowadzić 10 μM chlorowodorku doksorubicyny (Dox; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zawierającego czynnik wykrywający apoptozę.</li>
	<li>Kontynuuj przepływ roztworu czynnika terapeutycznego przez określony czas. Zamknij zawór VFin i wyłącz pompę strzykawkową. Zastąp strzykawkę z lekiem strzykawką z nowym medium zawierającym czynnik wykrywający apoptozę. Pozostaw przepływ nowego medium przez 24–36 godzin, stale monitorując tkankę pod mikroskopem.</li>
</ol>
6. Mikroskopia time-lapse i szacowanie współczynników dyfuzji leków
Aby uzyskać najczystsze dane fluorescencyjne, należy wykonywać wszystkie obrazy, ustawiając ostrość mikroskopu na dolnych warstwach tkanek. Ze względu na brak gradientów składników odżywczych w kierunku pionowym (patrz Sekcja 4), dolne warstwy komórek są reprezentatywne dla wszystkich pozostałych warstw znajdujących się powyżej.
<ol>
	<li>Cały proces akwizycji został zautomatyzowany przy użyciu spersonalizowanego skryptu w programie IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Należy pozyskać obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjne upakowanego sferoidu przy powiększeniu 10x co 30 minut (Rys. 3A). Przed wprowadzeniem Dox należy pozyskać obraz fluorescencji tła. Aby uwzględnić duży rozmiar komory (1000 μm x 300 μm), należy pozyskać dwa sąsiadujące obrazy i połączyć je w mozaikę4.</li>
	<li>W celu matematycznego oszacowania współczynników dyfuzyjności leku, pierwszym krokiem jest wygenerowanie uśrednionych liniowych profili intensywności fluorescencji Dox za pomocą programu ImageJ. Należy zaznaczyć prostokątny obszar zainteresowania (ROI) obejmujący tkankę w komorze. Należy użyć polecenia Plot Profile, aby wygenerować profil średnich intensywności jako funkcji odległości od kanału przepływowego. Czynność tę należy powtórzyć dla maksymalnie 3 różnych punktów czasowych.</li>
	<li>Przed wprowadzeniem Dox należy pozyskać obraz fluorescencji tła, aby zmierzyć autofluorescencję tkanki. Od uzyskanych profili intensywności należy odjąć średnią intensywność fluorescencji tła, a następnie znormalizować każdy profil przez odpowiadającą mu intensywność maksymalną, aby uzyskać <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="Diagram równowagi statycznej ΣFx=0, analiza bilansu sił, koncepcja fizyczna, reprezentacja wektorowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="c">(x,t)(Rys. 3B).</li>
	<li>Kolejnym krokiem jest ocena efektywnego współczynnika dyfuzji D dla Dox w tkance nowotworowej. Dyfuzję Dox można przedstawić za pomocą następującego równania5 
	<img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Równanie dyfuzji \( \tilde{c}(x,t) = \text{erfc}\left(\frac{x}{2\sqrt{D \cdot t}}\right) \)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie erfc to dopełniająca funkcja błędu, x to odległość w głąb tkanki od kanału, a t to czas po wprowadzeniu Dox (patrz Rys. 3). W każdym rozważanym punkcie czasowym należy zastosować następujący schemat iteracyjny:
		<ul>
			<li>Przyjąć wartość szacunkową dla D</li>
			<li>Obliczyć prawą stronę równania dla każdego położenia x</li>
			<li>Obliczyć sumę kwadratów błędów (residuum) między obiema stronami</li>
			<li>Zmodyfikować D, aby zminimalizować residuum</li>
		</ul>
	</li>
	<li>Należy wyciągnąć średnią z optymalnych wartości D uzyskanych w każdym punkcie czasowym, aby oszacować średni efektywny współczynnik dyfuzji Dox w tkance.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Zastosowane urządzenia mikroprzepływowe zapewniły optycznie dostępne komory hodowlane o wymiarach 1mm x 0.3mm x 0.15mm do wzrostu trójwymiarowej tkanki nowotworowej. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe zostały wprowadzone do tych komór i zatrzymane przez dwa filtry w postaci słupków z tyłu. Metoda wiszącej kropli pozwoliła na szybkie formowanie sferoidów o spójnym rozmiarze i kształcie z kilku linii komórkowych. Sferoidy pomyślnie hodowano w urządzeniu przez maksymalnie 3 dni. Wzrost w komorach wiązał się z powtarzalną modyfikacją mikrootoczenia wewnątrz sferoidów. Apoptoza występowała rzadziej w komórkach znajdujących się w pobliżu kanału przepływowego, a częściej głębiej w tkance. Urządzenie wykorzystano do oszacowania współczynnika dyfuzji doksorubicyny w tkance nowotworowej. Uzyskana wartość 8.75 x 10-7 cm2s-1 jest zgodna z wartością 9.1 x 10-7 cm2s-1 zgłaszaną wcześniej6 dla raka piersi u ludzi.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Linia komórkowa</td>
			<td>Wymagane stężenie komórek</td>
			<td>Czas inkubacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS174T</td>
			<td>300 komórek/μL</td>
			<td>2-3 dni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T47D</td>
			<td>750 komórek/μL</td>
			<td>3-4 dni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>150 komórek/μL</td>
			<td>5–6 dni</td>
		</tr>
	</tbody>
</table> 
Tabela 1. Parametry dla sferoidów w metodzie wiszącej kropli
<table border="1">
	<tbody
	>
		<tr>
			<td>Część</td>
			<td>Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SF</td>
			<td>Strzykawka przepływowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP</td>
			<td>Strzykawka do upakowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VFin</td>
			<td>Zawór wlotowy przepływu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VPin</td>
			<td>Zawór wlotowy upakowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VFout</td>
			<td>Zawór wylotowy przepływu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VPout</td>
			<td>Zawór wylotowy upakowania</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Strzykawki i zawory w układzie przepływowym
<img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Schemat przepływu komory hodowlanej, przedstawiający konfigurację dynamiki płynów z zaworami i złączami rurek dla wzrostu komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat układu przepływu VFin i VFout: zawory wlotowe i wylotowe przepływu; VPin i VPout: zawory wlotowe i wylotowe pakowania; SF i SP: strzykawki przepływowe i pakujące. Strzykawka pakująca oraz zawory wlotowe i wylotowe pakowania są wykorzystywane podczas wprowadzania sferoidu do komory. Strzykawka przepływowa oraz zawory wlotowe i wylotowe przepływu służą do późniejszego doprowadzania medium.
<img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Schemat komory sferoidu z filtrującymi słupkami, wskazujący kierunek przepływu medium." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat sferoidu uwięzionego w komorze urządzenia. Sferoid jest wprowadzany do komory w urządzeniu, gdzie zostaje zatrzymany przez dwa filtrujące słupki znajdujące się w tylnej części komory.
<img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Urządzenie mikrofluidyczne pokazujące dyfuzję doksorubicyny oraz wykres intensywności fluorescencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Dyfuzja doksorubicyny w tkance nowotworowej na urządzeniu. A. Nałożony obraz światła przechodzącego i fluorescencji czerwonej tkanki, pokazujący lokalizację i stężenie doksorubicyny (na czerwono). Pasek skali odpowiada 250 μm. B. Znormalizowany liniowy profil intensywności fluorescencji doksorubicyny.

<ol><li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li>
<li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li>
<li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li>
<li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma%3A+branching+patterns+and+vessel+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li>
<li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+physiology+of+solid+tumors%3A+opportunities+%28and+problems%29+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li>
<li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Unaczynienie w guzach nowotworowych jest rzadkie i słabo rozwinięte7,8. Istnieją obszary położone daleko (>100 μm) od naczyń krwionośnych, które są niedostępne dla substancji odżywczych i leków dostarczanych poprzez układ naczyniowy9. Powstałe w ten sposób heterogeniczne mikrośrodowisko przyczynia się do ograniczonej skuteczności wielu środków chemioterapeutycznych10. Opracowane w niniejszej pracy urządzenie mikrofluidyczne odtwarza in vitro heterogeniczne mikrośrodowisko guza, charaktery...

<table><tbody><tr><td>Zestaw do elastomeru silikonowego</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Zestaw Sil Elast 184</td><td></td></tr><tr><td>wyci Nowak Miltex</td><td>MedexSupply</td><td>MTX-33-31AA</td><td>1,5 mm</td></tr><tr><td>przewód PTFE</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-31</td><td>0.032&quot; Identyfikacja</td></tr><tr><td>Złącze Luer Lock męskie</td><td>Qosina</td><td>65111</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Luer Lock żeńska z rąbkiem</td><td>Qosina</td><td>11556</td><td></td></tr><tr><td>Zawór odcinający</td><td>Idex Health and Science</td><td>P-721</td><td></td></tr><tr><td>Łącznik w kształcie litery Y</td><td>Idex Health and Science</td><td>P-513</td><td></td></tr><tr><td>20G 1,5&quot; igły</td><td>BD Biosciences</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>CaspGLOW Fluorescein</td><td>Biovision Inc.</td><td>K183-25</td><td></td></tr><tr><td>CaspGLOW Red</td><td>Biovision Inc.</td><td>K193-25</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek doksorubicyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44583</td><td></td></tr><tr><td>LS174T</td><td>ATCC</td><td>CCL-188</td><td>Linia komórkowa raka jelita grubego człowieka</td></tr><tr><td>T47D</td><td>ATCC</td><td>HTB-133</td><td>linia komórkowa raka przewodowego człowieka</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Linia komórkowa gruczolakoraka piersi człowieka</td></tr></tbody></table>

urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Opracowaliśmy urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje dostarczanie i systemowe usuwanie leków z heterogenicznych trójwymiarowych tkanek nowotworowych in vitro. Składniki odżywcze dostarczane przez naczynia krwionośne nie docierają do wszystkich części guzów, co prowadzi do powstania heterogenicznych mikrośrodowisk składających się z komórek żywotnych, spoczynkowych i nekrotycznych. Wiele leków przeciwnowotworowych nie przenika skutecznie i nie leczy wszystkich typów komórek właśnie ze względu na tę heterogeniczność. Monowarstwy komórek nowotworowych nie oddają tej heterogeniczności, co utrudnia testowanie leków przeciwnowotworowych przy użyciu odpowiedniego modelu in vitro. Nasze urządzenia mikrofluidyczne zostały wykonane z PDMS metodą miękkiej litografii. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe, utworzone metodą wiszącej kropli, zostały umieszczone i unieruchomione w prostokątnych komorach urządzenia i utrzymywane przy ciągłej perfuzji medium z jednej strony. Prostokątny kształt komór w urządzeniu wytworzył liniowe gradienty w obrębie tkanki. Barwniki fluorescencyjne wykorzystano do ilościowego określenia zmienności apoptozy w tkance. Guzy w urządzeniu leczono fluorescencyjnym lekiem chemioterapeutycznym doksorubicyną, a do monitorowania jego dyfuzji do tkanki wykorzystano mikroskopię poklatkową, co pozwoliło na oszacowanie efektywnego współczynnika dyfuzji. Metoda wiszącej kropli umożliwiła szybkie tworzenie jednorodnych sferoidów z kilku linii komórek nowotworowych. Urządzenie umożliwiło wzrost sferoidów do 3 dni. Komórki znajdujące się w pobliżu płynącego medium wykazywały minimalną apoptozę, natomiast komórki oddalone od kanału były w większym stopniu apoptotyczne, co precyzyjnie naśladowało obszary w guzach sąsiadujące z naczyniami krwionośnymi. Oszacowana wartość współczynnika dyfuzji doksorubicyny była zgodna z wcześniej raportowaną wartością dla raka piersi u ludzi. Ponieważ penetracja i retencja leków w guzach litych wpływają na ich skuteczność, uważamy, że urządzenie to jest ważnym narzędziem w rozumieniu zachowania leków oraz w opracowywaniu nowych terapii przeciwnowotworowych.

Przedstawiamy procedurę wykonania i obsługi urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza heterogeniczne mikrośrodowiska nowotworowe in vitro. Zmienność apoptozy w obrębie tkanki nowotworowej została określona ilościowo przy użyciu barwników fluorescencyjnych, a następnie oceniono efektywny współczynnik dyfuzji leku chemioterapeutycznego, doksorubicyny, do tkanki nowotworowej.

Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

Opracowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe, które naśladuje dostarczanie oraz systemiczne usuwanie leków z heterogenicznych trójwymiarowych tkanek nowotworowych w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie wykonania i działania urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza mikrośrodowisko nowotworowe in vitro i może być wykorzystywane do testowania leków chemioterapeutycznych. Jest to urządzenie mikrofluidyczne. Urządzenie to może być przydatne w następujących obszarach: łatwe testowanie leków chemioterapeutycznych in vitro.Urządzenie to zapewnia spójne i dokładne wyniki w badaniach trójwymiarowej tkanki nowotworowej, stanowiąc bardzo precyzyjne odwzorowanie guza in vivo. Nowotwory występują w mikrośrodowiskach 3D, a możliwość przeprowadzania testów w takim środowisku ma istotne znaczenie. Pierwszym krokiem procedury jest montaż urządzenia, który obejmuje wykonanie chipa mikroprzepływowego metodą miękkiej litografii, wykonanie otworów w wlotach i wylotach, przyklejenie chipa do szkiełka przedmiotowego oraz podłączenie rurek doprowadzających i odprowadzających ciecz.Następnie, z wykorzystaniem metody wiszącej kropli, generowane są jednorodne wielokomórkowe sferoidy nowotworowe do użycia w urządzeniu. Sferoidy są następnie wprowadzane do urządzenia, po czym dodaje się czynniki indukujące apoptozę, odczynniki detekcyjne oraz leki chemioterapeutyczne. Na koniec przeprowadzana jest mikroskopia poklatkowa, a następnie matematyczna estymacja współczynników dyfuzji leku w celu ilościowego określenia zdolności penetracji środka chemioterapeutycznego.Ostatecznie, dzięki zastosowaniu fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, można uzyskać wyniki obrazujące wzrost tkanki w urządzeniu, tworzenie się heterogenicznych mikrośrodowisk w obrębie tkanki oraz dyfuzję leku do tkanki. Ograniczona penetracja leków przeciwnowotworowych do guzów litych jest istotną przyczyną ich nieskuteczności. Większość obecnych modeli testowania leków przeciwnowotworowych nie oddaje trójwymiarowej natury guzów litych.Opracowaliśmy urządzenie mikrofluidyczne składające się z stale perfundowanych trójwymiarowych tkanek nowotworowych. Model ten dokładniej odwzorowuje dostarczanie leków do guzów litych oraz ich klirens systemowy. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe stanowią dobrze ugruntowany model trójwymiarowych tkanek nowotworowych.W niniejszej procedurze zastosowano metodę wiszącej kropli w celu wytworzenia sferoidów do wykorzystania w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda ta pozwala na uformowanie jednolitych sferoidów w krótkim czasie. Testowanie leków chemioterapeutycznych in vitro w trójwymiarowych tkankach może pomóc w bardziej efektywnym przesiewaniu leków w porównaniu do monowarstw komórek.Wymieszać PDMS i czynnik sieciujący z elastomeru silikonowego w stosunku wagowym dziewięć do jednego. Następnie wylać tę mieszaninę na matrycę, aby utworzyć warstwę o grubości 4 mm. Odgazować, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie utwardzać w temperaturze 60 °C przez pięć godzin.Oddziel utwardzony PDMS od formy, aby uzyskać stempel z odwzorowaniem struktur przepływu na elastomerze. Następnie, używając wycinaka do biopsji o średnicy 1,5 mm zamontowanego na wiertarce, wyciśnij otwory wlotowe i wylotowe. Usuń wszelkie pozostałości materiału.Stronę z wzorem stempla oraz czystą lamelkę szklaną poddaj działaniu plazmy tlenowej przez osiem minut. W urządzeniu do trawienia plazmą tlenową natychmiast doprowadź do kontaktu potraktowanych powierzchni, aby utworzyć między nimi wiązanie. Przechowuj tak przygotowany zespół w temperaturze 60 °C na podgrzewaczu do lamelek przez co najmniej pięć godzin.Aby wzmocnić połączenie, podłącz rurkę PTFE o średnicy wewnętrznej 0,032 inches do wlotów i wylotów urządzenia mikrofluidycznego. W celu zapewnienia łatwego przepływu bez ryzyka uszkodzenia, zastosowano interfejs składający się z męskich złączy lure lock przymocowanych do żeńskich złączy lure lock z karbem. Na koniec przygotuj układ przepływowy, używając zaworów odcinających i łącznika w kształcie litery Y, a następnie zamontuj urządzenie na mikroskopie. Po zamontowaniu urządzenia podłącz rurki do odpowiednich wlotów i wylotów, aby ukończyć konfigurację przepływu.Jak pokazano na tej rycinie, taka konfiguracja zapewnia łatwość i wszechstronność umieszczania sferoidu w urządzeniu lub tworzenia przepływu pożywki przez urządzenie w celu jego unieruchomienia. Należy otworzyć zawór wlotowy do pakowania VPN oraz zawór wylotowy do pakowania VP out. Sferoid może następnie przejść przez wlot i wpłynąć do komory hodowlanej, gdzie słupek w tej komorze utrzyma guz na miejscu podczas przepływu pożywki.Zamknij zawory upakowania i otwórz zawór wlotowy przepływu VF in oraz zawór wylotowy przepływu VF out, aby zainicjować tworzenie jednorodnych PHE. Wykorzystując metodę wiszącej kropli, poddaj komórki lodu trypsynizacji w komorze laminarnej. Wyjmij otrzymane komórki po trypsynizacji z wirówki.Rozcieńcz roztwór stokowy do pożądanego stężenia, korzystając z tabeli 1. Następnie zdejmij pokrywkę płytki 48-dołkowej i połóż ją do góry dnem. W sterylnej komorze przepływu laminarnego napełnij każdy dołek płytki 1 mL sterylnej wody.Aby utrzymać wilgotność, nanieś 20 µL kropli rozcieńczonego roztworu komórek w każdym okrągłym obszarze na przykrywce. Używając mikropipety, ostrożnie odwróć przykrywkę i umieść ją na płytce, upewniając się, że krople nie dotykają krawędzi dołków. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C.Czas inkubacji w zależności od rodzaju użytych komórek określono w tabeli 1; w każdej wiszącej kropli uformuje się steroid. Należy rozpocząć od wysterylizowania urządzenia poprzez przepłukanie go 70% ethanol poprzez wlot przepływu. Następnie należy przepłukać urządzenie kolejno PBS, a potem pożywką do hodowli komórkowej buforowaną H-E-P-E-S.Pozostaw strzykawkę z pożywką, podłącz ją do drenu. Następnie nabierz od dwóch do trzech jednostek Steroids do strzykawki. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, podłącz strzykawkę do wlotu pakowania urządzenia.Otwórz zawór wlotowy VPN i zamknij VFN, otwórz zawór wylotowy VP out i zamknij VF out. Trzymaj strzykawkę do pakowania pionowo, z igłą skierowaną w dół. Obserwuj, aż steroid opadnie na dno strzykawki do złącza luer-lock igły.Naciśnij tłok strzykawki do upakowania i obserwuj, jak PHE wpływa do rurki i przepływa do urządzenia, ponieważ otwarty jest tylko zawór wylotowy upakowania. Steroid wpłynie do komory urządzenia i zostanie zatrzymany przez słupki z tyłu. Po dostaniu się do komory sferoid S dopasuje się do jej kształtu i przyjmie geometrię prostokątną.Zamknąć zawór wlotowy VPN i zawór wylotowy VP out, a następnie zamocować strzykawkę przepływową SF na pompie strzykawkowej. Pompa ta jest sterowana komputerowo za pomocą programu syringe pump pro; otworzyć zawór wlotowy VFN oraz zawór wylotowy VF out. Rozpocząć przepływ medium do urządzenia z prędkością 3 µL/min.Po 24-godzinnej inkubacji sferoidów wprowadza się odczynniki do wykrywania apoptozy. Przed podaniem czynników wykrywających apoptozę lub czynników terapeutycznych należy odczekać do 24 godzin, aż sferoidy osiągną stan równowagi i ustanowią się gradienty składników odżywczych oraz mikrośrodowiska. Następnie należy zamknąć zawór VFN.Zatrzymaj pompę strzykawkową. Wyjmij strzykawkę z pompy i zastąp ją strzykawką zawierającą medium z 0,25 µL/ml markera aktywności kaspazy 3 CASPglow red. Przepłucz urządzenie tym roztworem, ręcznie przepuszczając przez nie 0,7 ml cieczy.Następnie zamontuj strzykawkę w pompie. Wznów przepływ i otwórz zawór VFN. W ciągu od pięciu do ośmiu godzin czynnik wykrywający apoptozę Cask Glove Red Active CPH Phase Three dyfunduje do tkanki i fluorescuje jaśniej w obszarach apoptotycznych. Odczynnik wykrywający apoptozę w tym stężeniu jest utrzymywany we wszystkich kolejnych roztworach przepływowych.Doksorubicynę wprowadza się od pięciu do ośmiu godzin po wprowadzeniu czynników wykrywających apoptozę. Preparat ten jest usuwany z układu poprzez przepłukiwanie. Aby dodać środki chemioterapeutyczne, należy postępować zgodnie z procedurą wykrywania apoptozy, aby wprowadzić 10 µM chlorowodorku doksorubicyny.Następnie zastąp strzykawkę z preparatem strzykawką zawierającą 0,7 milliliters medium. Kontynuuj przepływ środka terapeutycznego przez ustalony czas. Następnie zamknij zawór VFN i wyłącz pompę strzykawkową.Zdejmij strzykawkę z preparatem z pompy strzykawkowej i zastąp ją strzykawką zawierającą 0,7 milliliters pożywki. Pozostaw przepływ świeżej pożywki przez 24 do 36 hours, stale monitorując tkankę pod mikroskopem. Cały proces akwizycji dla mikroskopii time-lapse został zautomatyzowany za pomocą dostosowanego skryptu w programie IP lab; obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjne PAX Foid pozyskiwano przy powiększeniu 10 x co 30 minutes. W celu matematycznego oszacowania współczynników dyfuzyjności leku, pierwszym krokiem jest wygenerowanie średnich liniowych profili intensywności fluorescencji za pomocą programu ImageJ. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania, lub ROI, obejmujący tkankę w komorze.Użyj polecenia plot profile, aby wygenerować profil średnich intensywności w funkcji odległości od kanału przepływowego. Powtórz tę czynność dla maksymalnie trzech różnych punktów czasowych. Następnie od otrzymanych profili intensywności odejmij średnią intensywność fluorescencji tła i znormalizuj każdy profil, korzystając z odpowiadającej mu intensywności maksymalnej, aby otrzymać C w funkcji X i T. Gdzie C to znormalizowane stężenie doksorubicyny, a wartość C zmienia się w zakresie od zera do jeden.Kolejnym krokiem jest ocena efektywnego współczynnika dyfuzji doxorubicyny w tkance nowotworowej. Dyfuzję można przedstawić za pomocą następującego równania, w którym ERFC jest dopełniającą funkcją błędu. X to odległość w głąb tkanki od kanału, a T to czas po wprowadzeniu doxorubicyny.W każdym rozważanym punkcie czasowym należy zastosować następujący schemat iteracyjny. Przyjmij wartość szacunkową dla D. Oblicz prawą stronę równania w każdym położeniu X. Oblicz sumę kwadratów błędów między obiema stronami, a następnie zmodyfikuj D, aby zminimalizować średnią wartość residuum.Optymalne wartości D uzyskane w każdym punkcie czasowym służą do oszacowania średniego efektywnego współczynnika dyfuzji doksorubicyny w tkance. Urządzenia mikroprzepływowe zapewniły optycznie dostępne komory hodowlane o wymiarach 1 mm x 0,3 mm x 0,15 mm do wzrostu trójwymiarowej tkanki nowotworowej. Metoda wiszącej kropli pozwoliła na szybkie formowanie PHE nowotworowych o spójnym rozmiarze i kształcie z kilku linii komórkowych.PHE były z powodzeniem hodowane na urządzeniu do trzech dni. Wzrost w komorach wiązał się z powtarzalną modyfikacją mikrośrodowisk. W obrębie PHE apoptoza występowała rzadziej w komórkach znajdujących się w bliskim sąsiedztwie kanału przepływowego, a częściej w głębszych warstwach tkanki.Urządzenie zostało wykorzystane do oszacowania współczynnika dyfuzji doxorubicyny w tkance nowotworowej. Wartość uzyskana eksperymentalnie była zgodna z wartością zgłoszoną wcześniej dla raka piersi u ludzi. Podczas przeprowadzania tej procedury należy zachować szczególną ostrożność w utrzymaniu sterylności podczas wprowadzania PHE do urządzenia, ponieważ czynność ta musi być wykonana poza inkubatorem do hodowli komórkowych.Strzykawki w dygestorium oraz końcówki rurek obficie spryskać etanolem, aby zapewnić sterylność. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo zrozumieć rolę ograniczonej penetracji leków do guzów. Przedstawiliśmy technikę pozwalającą na symulację dostarczania i systemowego usuwania leków z trójwymiarowych tkanek nowotworowych oraz ilościowe określenie ich penetracji.Wyeliminowanie leków o słabej przenikalności znacząco usprawni proces opracowywania leków przeciwnowotworowych.

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworowego in Vitro

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

W tym filmie generujemy mikroguzy z komórek nowotworowych pochodzących od pacjentów za pomocą ludzkiego biożelu 3D. Te mikroguzy bardzo przypominają mikrośrodowisko guza in vivo i służą jako potencjalne platformy do testowania leków.

Generowanie mikroguzów: technika hodowli in vitro do hodowli mikroguzów 3D w celu analizy odpowiedzi na leczenie farmakologiczne

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Prezentujemy mikroprzepływowy model raka na chipie, technologię "Akcelerator Ewolucji", która zapewnia kontrolowaną platformę do długoterminowych badań ilościowych dynamiki raka w czasie rzeczywistym w dobrze zdefiniowanych warunkach środowiskowych na poziomie pojedynczej komórki. Oczekuje się, że technologia ta sprawdzi się jako model in vitro do badań podstawowych lub przedklinicznego opracowywania leków.

Generowanie heterogenicznych gradientów leków w różnych populacjach nowotworów w akceleratorze ewolucji mikroprzepływowej do obserwacji w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i hodowli mikrośrodowiska przerzutowego guza bariery krew-mózg, a następnie ilościowego określenia jego stanu za pomocą obrazowania konfokalnego i sztucznej inteligencji (uczenia maszynowego).

Kwantyfikacja mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu za pomocą modelu 3D Organ-On-A Chip, uczenia maszynowego i tomografii konfokalnej

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Poznaj metodę wytwarzania mikroprzepływowego urządzenia do odtwarzania mikrośrodowiska guza in vitro. Technika ta umożliwia testowanie leków cytostatycznych w trójwymiarowej tkance nowotworowej.

Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

Przeglądaj więcej filmów