Name: Respirometryczna ocena fosforylacji oksydacyjnej we włóknach sercowych przepuszczalnych saponiną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj metodę respirometrycznej oceny fosforylacji oksydacyjnej we włóknach sercowych przepuszczalnych saponiną. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary funkcji mitochondrialnej in situ przy zachowaniu architektury komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez Canadian Institutes of Health Research oraz Genome Canada. JS otrzymuje wsparcie finansowe na wynagrodzenie z Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada oraz Canadian Diabetes Association. Laboratorium pragnie podziękować firmie Oroboros Instruments za pomoc techniczną podczas wdrażania techniki z wykorzystaniem włókien przepuszczalnych dla saponin.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+solubilities+of+media+used+in+electrochemical+respiration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements.</a> Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).</li>
<li>Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+fails+to+reduce+cerebral+oxygen+consumption+early+after+non-hemorrhagic+closed+head+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats.</a> J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+conformance+of+cellular+respiration.+A+perspective+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology.</a> Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.</li>
<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
<li>Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+oxidative+capacity+and+increased+mitochondrial+uncoupling+impair+myocardial+energetics+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity.</a> Circulation. 112, 2686-2695 (2005).</li>
<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>O, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retarded+diffusion+of+ADP+in+cardiomyocytes%3A+possible+role+of+mitochondrial+outer+membrane+and+creatine+kinase+in+cellular+regulation+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).</li>
<li>Endo, M., Kitazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-C+coupling+studies+in+skinned+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Aspects+of+Cardiac+Muscle%22%5BJournal%5D)">E-C coupling studies in skinned cardiac fibers.</a> Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).</li>
<li>Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+saponin+on+biological+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Action of saponin on biological cell membranes.</a> Nature. , 196-952 (1962).</li>
<li>Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipids of mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).</li>
<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
<li>Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkladal%2C+D+%22What+is+Controlling+Life%3F%22">What is Controlling Life?</a>. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Drug-Induced+Mitochondrial+Dysfunction%22">Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction</a>. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Technika włókien sercowych permeabilizowanych saponiną oferuje unikalny kompromis między oceną konsumpcji tlenu w procesie OXPHOS mitochondriów in vitro a in vivo. Zalety tej techniki obejmują zwiększoną istotność fizjologiczną w porównaniu do izolowanych mitochondriów, ponieważ zachowana zostaje architektura komórkowa. Podczas gdy błona plazmatyczna ulega degradacji, wewnątrzkomórkowe struktury błonowe, w tym mitochondria12, 14, siateczka sarkoplazmatyczna14, miofilamenty i cytosz...

<table><tbody><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna 5&amp;#8242;-dwuwodnian srebrowytlenek potasu ADP (fosforan dwuodstrojowy, sól monopotasowa, dwuwodzian)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy z surowicy bydlęcej, kwasy tłuszczowe niezbędne&amp;#8211;bezpłatny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna 5&amp;#8242;uwodniona sól disodowa trifosforanu adenozyny (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractylosyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Karbonylocyjanek p-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>glikol etylenowy-bis-(2-amino&amp;#8211;thylether)-N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;-kwas etylenoglikolotetraoctowy (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Kwas glutaminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>Kwas laktobionowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu sześciowodny (MgCl₂·6H₂O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Kwas jabłkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-dihydrochlorowodorek tetrametylop-fenylenediamine (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cyjank potasu</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Wodny wodorofosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>Stęż. 54,7 mg/ml</td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 15 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Proste pęsety jubilerskie</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiona pęseta jubilerska</td><td>George Tiemann &amp;i Spółka</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>Proste nożyce chirurgiczne</td><td>George Tiemann &amp;i Spółka</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny skalpel chirurgiczny</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;Filtry strzykawkowe</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szalki Petriego</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>polistyrenowe płytki hodowlane z 12 dołkami</td><td>VWR International</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne z podgrzewaniem</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Microbars Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>Waga laboratoryjna</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;mikrosyringa Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;mikrosstrzykawka Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;mikrostrzykawka Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Butelki do wyciskania Nalgene</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe naczynia wagowe</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Badanie funkcji mitochondriów stanowi istotny parametr fizjologii serca, ponieważ mitochondria biorą udział w metabolizmie energetycznym, stresie oksydacyjnym, apoptozie, starzeniu się organizmu, encefalomiopatiach mitochondrialnych oraz toksyczności leków. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na technologie pozwalające mierzyć funkcje mitochondriów w sercu. Jedną z technik wykorzystujących podejście integracyjne do pomiaru funkcji mitochondrialnych jest respirometryczna analiza fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS).
Zasada oceny OXPHOS metodą respirometryczną opiera się na pomiarze stężenia tlenu przy użyciu elektrody Clarka. W miarę jak permeabilizowany pęczek włókien zużywa tlen, jego stężenie w zamkniętej komorze spada. Dzięki zastosowaniu wybranych protokołów miareczkowania substratami, inhibitorami i odsprzęgaczami, elektrony są dostarczane do konkretnych miejsc łańcucha transportu elektronów, co umożliwia ocenę funkcji mitochondriów. Przed analizą respirometryczną funkcji mitochondrialnych stosuje się mechaniczne i chemiczne techniki przygotowawcze w celu permeabilizacji sarkolemmy włókien mięśniowych. Permeabilizacja chemiczna wykorzystuje saponinę do selektywnego perforowania błony komórkowej przy zachowaniu architektury komórkowej.
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje etapy przygotowania włókien sercowych pozbawionych błon komórkowych za pomocą saponiny do pomiarów zużycia tlenu w celu oceny mitochondrialnego OXPHOS. Ponadto przedstawiono wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, a także określone substraty, inhibitory i odsprzęgacze, które mogą być wykorzystane do określenia funkcji mitochondriów w konkretnych miejscach łańcucha transportu elektronów. Co istotne, opisany protokół można łatwo zastosować do tkanek serca i mięśni szkieletowych różnych modeli zwierzęcych oraz próbek ludzkich.

Przygotowanie włókien permeabilizowanych saponiną w połączeniu z respirometryczną analizą fosforylacji oksydacyjnej umożliwia zintegrowaną ocenę funkcji mitochondriów. Oddychanie mitochondrialne w stanach fizjologicznych i patologicznych może odzwierciedlać różne wpływy regulacyjne, w tym oddziaływania mitochondrialne, morfologię oraz biochemikę.

Ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną

Badanie funkcji mitochondriów stanowi istotny parametr fizjologii serca, ponieważ mitochondria biorą udział w metabolizmie energetycznym, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie włókien serca przepuszczonych saponiną do pomiarów polarygraficznych. Jest to realizowane poprzez najpierw wycięcie serca z myszy. Drugim krokiem procedury jest mechaniczne przygotowanie pęczków włókien serca zawierających maksymalnie od sześciu do ośmiu luźno połączonych włókien.Następnie wiązki kardiologiczne poddawane są chemicznej permeabilizacji saponiną. Następnie wiązki kardiologiczne są płukane w celu usunięcia saponiny oraz wszelkich pozostałych metabolitów. Ostatecznie można uzyskać wyniki dostarczające informacji na temat mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej za pomocą pomiarów polarygraficznych.Witajcie, jestem Curtis Huey z laboratorium dr Jane Sheer z Katedry Biochemii i Biologii Molekularnej na Uniwersytecie w Calgary. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przygotowania włókien sercowych przepuszczalnych dla saponin. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do oceny in situ fosforylacji oksydacyjnej mitochondriów.Przejdźmy zatem do pracy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyciąć serce zwierzęcia morskiego i umieścić je w szalce Petri z roztworem RP w warunkach chłodniczych (na lodzie). Przy użyciu mikroskopu

respirometric-oxidative-phosphorylation-assessment-saponin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena oksydacyjnej fosforylacji respiracyjnej w przepuszczalnych dla saponiny włóknach mięśnia sercowego

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Poniższy protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie do ilościowego pomiaru szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego. Omówiono również metody stosowane do analizy próbek i interpretacji danych.

Metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Ten protokół opisuje kalorespirometrię, bezpośredni i jednoczesny pomiar zarówno rozpraszania ciepła, jak i oddychania, co zapewnia nieinwazyjne podejście do oceny metabolizmu energetycznego. Technika ta służy do oceny udziału ścieżek tlenowych i beztlenowych w wykorzystaniu energii poprzez monitorowanie całkowitego przepływu energii komórkowej.

Kalorespirometria: potężne, nieinwazyjne podejście do badania metabolizmu energii komórkowej

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Poznaj metodę respirometrycznej oceny fosforylacji oksydacyjnej we włóknach sercowych przepuszczalnych saponiną. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary funkcji mitochondrialnej in situ przy zachowaniu architektury komórkowej.

Ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną

Przeglądaj więcej filmów