Ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie włókien serca przepuszczonych saponiną do pomiarów polarygraficznych. Jest to realizowane poprzez najpierw wycięcie serca z myszy. Drugim krokiem procedury jest mechaniczne przygotowanie pęczków włókien serca zawierających maksymalnie od sześciu do ośmiu luźno połączonych włókien.

Następnie wiązki kardiologiczne poddawane są chemicznej permeabilizacji saponiną. Następnie wiązki kardiologiczne są płukane w celu usunięcia saponiny oraz wszelkich pozostałych metabolitów. Ostatecznie można uzyskać wyniki dostarczające informacji na temat mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej za pomocą pomiarów polarygraficznych.

Witajcie, jestem Curtis Huey z laboratorium dr Jane Sheer z Katedry Biochemii i Biologii Molekularnej na Uniwersytecie w Calgary. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przygotowania włókien sercowych przepuszczalnych dla saponin. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do oceny in situ fosforylacji oksydacyjnej mitochondriów.

Przejdźmy zatem do pracy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyciąć serce zwierzęcia morskiego i umieścić je w szalce Petri z roztworem RP w warunkach chłodniczych (na lodzie). Przy użyciu mikroskopu stereoskopowego należy ostrożnie usunąć wszelką tkankę łączną oraz tłuszcz.

Przeciąć serce na pół wzdłuż przegrody i wyciąć od 10 do 25 mg tkanki (masa mokra), pobierając fragment z powierzchni wsierdzia lewej komory. Należy upewnić się, że nacięcie przebiega wzdłuż orientacji włókien, aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne mięśnia sercowego. Wyciętą próbkę tkanki umieścić w oddzielnej płytce Petriego zawierającej roztwór RP, schłodzonej na lodzie.

Pokrój serce wzdłuż przebiegu włókien na podłużne paski o średnicy od 1 do 1,5 mm. Skróć paski skalpelem do długości od 2 do 4 mm, zachowując szczególną ostrożność i używając ostrych pęsety. Rozdziel wiązki włókien mechanicznie.

Końcowe pęczki włókien powinny zawierać maksymalnie od sześciu do ośmiu włókien połączonych niewielkimi obszarami kontaktu i ważyć od jednego do trzech miligramów masy mokrej. Wizualnie tkanka serca powinna zmienić barwę z pierwotnej czerwonej na bladoróżową. Przygotowanie pęczków włókien serca należy rozpocząć od umieszczenia płytki 12-dołkowej na lodzie.

Przepłucz dołki roztworem RP, aby zminimalizować zanieczyszczenie wapniem. Do jednego z dołków dodaj 3 mL lodowatego roztworu RP zawierającego 50 µg/mL saponiny. Następnie przenieś mechanicznie przygotowane pęczki włókien do dołka.

Inkubować pęczki włókien przez 20 minut na lodzie, delikatnie mieszając. Przepłukać nową studzienkę roztworem Mirror 5, a następnie pipetować 10 ml schłodzonego do temperatury lodowej roztworu Mirror 5 do nowej studzienki. Przenieść pęczki serca do studzienki i inkubować przez 10 minut na lodzie, delikatnie mieszając.

Po inkubacji powtórz procedurę z użyciem buforu mirror five. Przemyj próbki dwa do trzech razy świeżym buforem mirror five, za każdym razem przenosząc pęczki tkanek serca do 10 ml lodowatego buforu mirror five.

Powtarzające się etapy płukania mają na celu zapewnienie usunięcia saponiny A-T-P-A-D-P oraz wszelkich pozostałych substratów z pęczków włókien bezpośrednio przed analizą oddechową. Wyznaczono masę mokrą poszczególnych pęczków włókien, osuszając je na powierzchni chłonnej za pomocą pęsety i dociskając włókno do powierzchni przez pięć sekund lub do momentu całkowitego odprowadzenia wilgoci. Za pomocą drugiej powierzchni chłonnej usunięto nadmiar cieczy z pęsety.

Włącz wagę i umieść pęczek włókien na plastikowej podstawce w celu pomiaru masy. Przenieś pęczek włókien sercowych do nowej studzienki z lodowatym roztworem NEAR-5. Pęczek włókien jest teraz gotowy do oceny zużycia tlenu.

Poniższe miareczkowania walidacyjne są przeprowadzane przy użyciu grafu wtryskowego do miareczkowania dwukomorowego XI. Eksperymenty te mogą być wykonywane jako osobny protokół lub włączone do protokołu miareczkowania, w zależności od celu eksperymentalnego i diagnostycznego badań barometrii oddechowej. Wykorzystany tutaj system ERO GRA 2K umożliwia pomiar stężenia tlenu.

Urządzenie jest podłączone do komputera z oprogramowaniem DAT lab, co pozwala na rejestrowanie zmian stężenia tlenu jako pomiarów zużycia tlenu w czasie rzeczywistym przez cały czas trwania eksperymentu. Przed umieszczeniem lustrzanych włókien serca w komorach XI graft, należy dodać 2,1 milliliters roztworu mirror five do obudowy komór zawierającej polarygraficzne czujniki tlenu (POS). Po zamknięciu komór w każdej komorze XI graft znajdzie się dwa milliliters roztworu mirror five.

Należy pozostawić odpowiednią ilość czasu na nasycenie powietrzem i wyrównanie temperatury w urządzeniu mirror five do 37 °C. Po osiągnięciu równowagi termicznej, próbki włókien sercowych należy umieścić w urządzeniu mirror five znajdującym się w komorach graftu XI, mieszając je za pomocą pasków magnetycznych pokrytych politetrafluoroetylenem.

Zwiększ stężenie tlenu w komorach GRAT do poziomu od 250 do 550 micromolar, używając strzykawki wypełnionej tlenem. Pozostaw od pięciu do 10 minut na stabilizację stężenia tlenu, wykorzystując strzykawkę Hamiltona o objętości 10 microliter. Dodaj do komory 10 microliters glutaminianu o stężeniu two molar, aby uzyskać stężenie końcowe 10 millimolar.

Następnie, używając oddzielnej strzykawki Hamiltona, należy dodać 5 µL 800 mM malonianu, aby uzyskać stężenie końcowe 2 mM w komorze. Tytułowanie to służy do oznaczenia podstawowego oddychania wspieranego przez kompleks I. Strumień tlenu powinien ustabilizować się w ciągu około pięciu minut od miareczkowania, co pozwala na oznaczenie zużycia tlenu w stanie 2, którym jest zużycie tlenu.

W przypadku braku DP po dwóch do pięciu minutach stabilnego zużycia tlenu, należy użyć mikrosyringi Hamiltona o pojemności 25 µL, aby dodać 20 µL 500 mM DP, osiągając końcowe stężenie nasycające wynoszące 5 mM. Stężenie to jest stosowane w celu uzyskania nasycenia powyżej 90%, co pozwala na określenie stanu maksymalnego. Trzy. Oddychanie mitochondrialne poprzez kompleks I pozwala na dodatkowe dwie do pięciu minut stabilnego zużycia tlenu.

Następnie, używając mikrostrzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL, należy dodać 5 µL cytochromu C o stężeniu 4 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 10 µM. Stężenie tlenu w tym punkcie jest wykorzystywane do przeprowadzenia analizy kontroli jakości integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej. Po kolejnych dwóch do pięciu minutach stabilnego zużycia tlenu należy dodać 1 µL ACIN o stężeniu 4 mg/mL w celu zahamowania syntazy TP.

Ten etap miareczkowania służy do walidacji szczelności wewnętrznej błony mitochondrialnej. Po przeprowadzeniu oceny oxphos w systemie repi metric, należy pobrać próbkę do oznaczenia suchej masy lub markerów mitochondrialnych. Następnie należy wyjąć lustro pięć z komór szklanych urządzenia XI Grat.

Przemyj komory co najmniej trzy razy wodą destylowaną. Następnie przemyj komory co najmniej trzy kolejne razy 100% etanolem, aby usunąć inhibitory rozpuszczalne w etanolu, takie jak oligomycyna.

Następnie wykonaj dwa dodatkowe przemycia 70% etanolem. Potem dodaj 70% etanol i pozostaw komory przeszczepowe XI w celu namaczania przez 30 minut, aby je wysterylizować. Na koniec przemyj komory zawierające POS co najmniej pięć razy wodą dwukrotnie destylowaną; zużycie tlenu w prawidłowo przygotowanych lustrzanych włóknach sercowych jest oceniane zgodnie z przedstawionym protokołem kontroli jakości; wskaźnik kontroli oddychania lub RCR reprezentuje sprzężenie między zużyciem tlenu a fosforylacją oksydacyjną w preparatach przepuszczalnych włókien.

Współczynnik kontroli oddechowej (RCR) to stosunek szybkości oddychania w stanie trzy do stanu dwa lub alternatywnie stanu trzy do stanu cztery; dobrze sprzężone preparaty mitochondrialne odzwierciedlające preparaty serca wykazują RCR w zakresie od trzech do sześciu. Miareczkowanie cytochromem C służy jako walidacja prawidłowego przygotowania tkanki. Cytochrom C jest białkiem zlokalizowanym w przestrzeni międzybłonowej wewnętrznej błony mitochondrialnej.

Gdy błona zewnętrzna mitochondriów jest nienaruszona, endogenny cytochrom C pozostaje w przestrzeni międzybłonowej, a miareczkowanie egzogennym cytochromem C ma pomijalny wpływ na oddychanie. I odwrotnie, jeśli błona zewnętrzna mitochondriów jest uszkodzona, endogenny cytochrom C może zostać uwolniony z przestrzeni międzybłonowej i będzie hamował oddychanie aż do dodania egzogennego cytochromu C, co pozwala na ocenę wpływu patologicznych lub eksperymentalnych stresorów na integralność błony zewnętrznej mitochondriów. Dodanie CIN jest wykorzystywane do oceny zmian w oddychaniu przeciekowym (leak respiration), czyli zużycia tlenu, które nie przyczynia się do powstania DP. Włókna kontrolne lub typu dzikiego powinny być wrażliwe na dodanie CIN, co objawi się znacznym spadkiem strumienia tlenu.

Niski wskaźnik RCR oraz zmniejszona wrażliwość na oligomycynę, skutkująca stosunkowo wysokim przepływem tlenu, wskazują na uszkodzenie wewnętrznej błony mitochondrialnej podczas przygotowania próbek. Brak reakcji na miareczkowanie odsprzęgaczem i inhibitorem substratu, widoczny w tym przypadku, może świadczyć o zbyt długim czasie inkubacji sasin oraz pęczków włókien pozbawionych osłonki (skinned fibers) w roztworach RP i mirror five. Dalsze działania powinny być ukierunkowane na zminimalizowanie czasu pomiędzy uśmierceniem zwierzęcia a pomiarami zużycia tlenu.

Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować pęczki włókien sercowych do pomiarów grafiki polarnej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie szczególnej ostrożności podczas mechanicznej separacji włókien sercowych. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.