Name: Respirometryczna ocena fosforylacji oksydacyjnej we włóknach sercowych przepuszczalnych saponiną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj metodę respirometrycznej oceny fosforylacji oksydacyjnej we włóknach sercowych przepuszczalnych saponiną. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary funkcji mitochondrialnej in situ przy zachowaniu architektury komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez Canadian Institutes of Health Research oraz Genome Canada. JS otrzymuje wsparcie finansowe na wynagrodzenie z Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada oraz Canadian Diabetes Association. Laboratorium pragnie podziękować firmie Oroboros Instruments za pomoc techniczną podczas wdrażania techniki z wykorzystaniem włókien przepuszczalnych dla saponin.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+solubilities+of+media+used+in+electrochemical+respiration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements.</a> Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).</li>
<li>Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+fails+to+reduce+cerebral+oxygen+consumption+early+after+non-hemorrhagic+closed+head+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats.</a> J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+conformance+of+cellular+respiration.+A+perspective+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology.</a> Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.</li>
<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
<li>Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+oxidative+capacity+and+increased+mitochondrial+uncoupling+impair+myocardial+energetics+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity.</a> Circulation. 112, 2686-2695 (2005).</li>
<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>O, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retarded+diffusion+of+ADP+in+cardiomyocytes%3A+possible+role+of+mitochondrial+outer+membrane+and+creatine+kinase+in+cellular+regulation+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).</li>
<li>Endo, M., Kitazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-C+coupling+studies+in+skinned+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Aspects+of+Cardiac+Muscle%22%5BJournal%5D)">E-C coupling studies in skinned cardiac fibers.</a> Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).</li>
<li>Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+saponin+on+biological+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Action of saponin on biological cell membranes.</a> Nature. , 196-952 (1962).</li>
<li>Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipids of mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).</li>
<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
<li>Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkladal%2C+D+%22What+is+Controlling+Life%3F%22">What is Controlling Life?</a>. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Drug-Induced+Mitochondrial+Dysfunction%22">Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction</a>. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Technika włókien sercowych permeabilizowanych saponiną oferuje unikalny kompromis między oceną konsumpcji tlenu w procesie OXPHOS mitochondriów in vitro a in vivo. Zalety tej techniki obejmują zwiększoną istotność fizjologiczną w porównaniu do izolowanych mitochondriów, ponieważ zachowana zostaje architektura komórkowa. Podczas gdy błona plazmatyczna ulega degradacji, wewnątrzkomórkowe struktury błonowe, w tym mitochondria12, 14, siateczka sarkoplazmatyczna14, miofilamenty i cytosz...

<table><tbody><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna 5&amp;#8242;-dwuwodnian srebrowytlenek potasu ADP (fosforan dwuodstrojowy, sól monopotasowa, dwuwodzian)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy z surowicy bydlęcej, kwasy tłuszczowe niezbędne&amp;#8211;bezpłatny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna 5&amp;#8242;uwodniona sól disodowa trifosforanu adenozyny (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractylosyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Karbonylocyjanek p-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>glikol etylenowy-bis-(2-amino&amp;#8211;thylether)-N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;-kwas etylenoglikolotetraoctowy (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Kwas glutaminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>Kwas laktobionowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu sześciowodny (MgCl₂·6H₂O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Kwas jabłkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-dihydrochlorowodorek tetrametylop-fenylenediamine (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokreatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cyjank potasu</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Wodny wodorofosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>Stęż. 54,7 mg/ml</td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Kwas bursztynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 15 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Proste pęsety jubilerskie</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiona pęseta jubilerska</td><td>George Tiemann &amp;i Spółka</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>Proste nożyce chirurgiczne</td><td>George Tiemann &amp;i Spółka</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny skalpel chirurgiczny</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;Filtry strzykawkowe</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szalki Petriego</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>polistyrenowe płytki hodowlane z 12 dołkami</td><td>VWR International</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne z podgrzewaniem</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Microbars Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>Waga laboratoryjna</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;mikrosyringa Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;mikrosstrzykawka Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;mikrostrzykawka Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Butelki do wyciskania Nalgene</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe naczynia wagowe</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Badanie funkcji mitochondriów stanowi istotny parametr fizjologii serca, ponieważ mitochondria biorą udział w metabolizmie energetycznym, stresie oksydacyjnym, apoptozie, starzeniu się organizmu, encefalomiopatiach mitochondrialnych oraz toksyczności leków. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na technologie pozwalające mierzyć funkcje mitochondriów w sercu. Jedną z technik wykorzystujących podejście integracyjne do pomiaru funkcji mitochondrialnych jest respirometryczna analiza fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS).
Zasada oceny OXPHOS metodą respirometryczną opiera się na pomiarze stężenia tlenu przy użyciu elektrody Clarka. W miarę jak permeabilizowany pęczek włókien zużywa tlen, jego stężenie w zamkniętej komorze spada. Dzięki zastosowaniu wybranych protokołów miareczkowania substratami, inhibitorami i odsprzęgaczami, elektrony są dostarczane do konkretnych miejsc łańcucha transportu elektronów, co umożliwia ocenę funkcji mitochondriów. Przed analizą respirometryczną funkcji mitochondrialnych stosuje się mechaniczne i chemiczne techniki przygotowawcze w celu permeabilizacji sarkolemmy włókien mięśniowych. Permeabilizacja chemiczna wykorzystuje saponinę do selektywnego perforowania błony komórkowej przy zachowaniu architektury komórkowej.
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje etapy przygotowania włókien sercowych pozbawionych błon komórkowych za pomocą saponiny do pomiarów zużycia tlenu w celu oceny mitochondrialnego OXPHOS. Ponadto przedstawiono wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, a także określone substraty, inhibitory i odsprzęgacze, które mogą być wykorzystane do określenia funkcji mitochondriów w konkretnych miejscach łańcucha transportu elektronów. Co istotne, opisany protokół można łatwo zastosować do tkanek serca i mięśni szkieletowych różnych modeli zwierzęcych oraz próbek ludzkich.

Przygotowanie włókien permeabilizowanych saponiną w połączeniu z respirometryczną analizą fosforylacji oksydacyjnej umożliwia zintegrowaną ocenę funkcji mitochondriów. Oddychanie mitochondrialne w stanach fizjologicznych i patologicznych może odzwierciedlać różne wpływy regulacyjne, w tym oddziaływania mitochondrialne, morfologię oraz biochemikę.

Ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną

Badanie funkcji mitochondriów stanowi istotny parametr fizjologii serca, ponieważ mitochondria biorą udział w metabolizmie energetycznym, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie włókien serca przepuszczonych saponiną do pomiarów polarygraficznych. Jest to realizowane poprzez najpierw wycięcie serca z myszy. Drugim krokiem procedury jest mechaniczne przygotowanie pęczków włókien serca zawierających maksymalnie od sześciu do ośmiu luźno połączonych włókien.Następnie wiązki kardiologiczne poddawane są chemicznej permeabilizacji saponiną. Następnie wiązki kardiologiczne są płukane w celu usunięcia saponiny oraz wszelkich pozostałych metabolitów. Ostatecznie można uzyskać wyniki dostarczające informacji na temat mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej za pomocą pomiarów polarygraficznych.Witajcie, jestem Curtis Huey z laboratorium dr Jane Sheer z Katedry Biochemii i Biologii Molekularnej na Uniwersytecie w Calgary. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przygotowania włókien sercowych przepuszczalnych dla saponin. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do oceny in situ fosforylacji oksydacyjnej mitochondriów.Przejdźmy zatem do pracy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyciąć serce zwierzęcia morskiego i umieścić je w szalce Petri z roztworem RP w warunkach chłodniczych (na lodzie). Przy użyciu mikroskopu stereoskopowego należy ostrożnie usunąć wszelką tkankę łączną oraz tłuszcz.Przeciąć serce na pół wzdłuż przegrody i wyciąć od 10 do 25 mg tkanki (masa mokra), pobierając fragment z powierzchni wsierdzia lewej komory. Należy upewnić się, że nacięcie przebiega wzdłuż orientacji włókien, aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne mięśnia sercowego. Wyciętą próbkę tkanki umieścić w oddzielnej płytce Petriego zawierającej roztwór RP, schłodzonej na lodzie.Pokrój serce wzdłuż przebiegu włókien na podłużne paski o średnicy od 1 do 1,5 mm. Skróć paski skalpelem do długości od 2 do 4 mm, zachowując szczególną ostrożność i używając ostrych pęsety. Rozdziel wiązki włókien mechanicznie.Końcowe pęczki włókien powinny zawierać maksymalnie od sześciu do ośmiu włókien połączonych niewielkimi obszarami kontaktu i ważyć od jednego do trzech miligramów masy mokrej. Wizualnie tkanka serca powinna zmienić barwę z pierwotnej czerwonej na bladoróżową. Przygotowanie pęczków włókien serca należy rozpocząć od umieszczenia płytki 12-dołkowej na lodzie.Przepłucz dołki roztworem RP, aby zminimalizować zanieczyszczenie wapniem. Do jednego z dołków dodaj 3 mL lodowatego roztworu RP zawierającego 50 µg/mL saponiny. Następnie przenieś mechanicznie przygotowane pęczki włókien do dołka.Inkubować pęczki włókien przez 20 minut na lodzie, delikatnie mieszając. Przepłukać nową studzienkę roztworem Mirror 5, a następnie pipetować 10 ml schłodzonego do temperatury lodowej roztworu Mirror 5 do nowej studzienki. Przenieść pęczki serca do studzienki i inkubować przez 10 minut na lodzie, delikatnie mieszając.Po inkubacji powtórz procedurę z użyciem buforu mirror five. Przemyj próbki dwa do trzech razy świeżym buforem mirror five, za każdym razem przenosząc pęczki tkanek serca do 10 ml lodowatego buforu mirror five.Powtarzające się etapy płukania mają na celu zapewnienie usunięcia saponiny A-T-P-A-D-P oraz wszelkich pozostałych substratów z pęczków włókien bezpośrednio przed analizą oddechową. Wyznaczono masę mokrą poszczególnych pęczków włókien, osuszając je na powierzchni chłonnej za pomocą pęsety i dociskając włókno do powierzchni przez pięć sekund lub do momentu całkowitego odprowadzenia wilgoci. Za pomocą drugiej powierzchni chłonnej usunięto nadmiar cieczy z pęsety.Włącz wagę i umieść pęczek włókien na plastikowej podstawce w celu pomiaru masy. Przenieś pęczek włókien sercowych do nowej studzienki z lodowatym roztworem NEAR-5. Pęczek włókien jest teraz gotowy do oceny zużycia tlenu.Poniższe miareczkowania walidacyjne są przeprowadzane przy użyciu grafu wtryskowego do miareczkowania dwukomorowego XI. Eksperymenty te mogą być wykonywane jako osobny protokół lub włączone do protokołu miareczkowania, w zależności od celu eksperymentalnego i diagnostycznego badań barometrii oddechowej. Wykorzystany tutaj system ERO GRA 2K umożliwia pomiar stężenia tlenu.Urządzenie jest podłączone do komputera z oprogramowaniem DAT lab, co pozwala na rejestrowanie zmian stężenia tlenu jako pomiarów zużycia tlenu w czasie rzeczywistym przez cały czas trwania eksperymentu. Przed umieszczeniem lustrzanych włókien serca w komorach XI graft, należy dodać 2,1 milliliters roztworu mirror five do obudowy komór zawierającej polarygraficzne czujniki tlenu (POS). Po zamknięciu komór w każdej komorze XI graft znajdzie się dwa milliliters roztworu mirror five.Należy pozostawić odpowiednią ilość czasu na nasycenie powietrzem i wyrównanie temperatury w urządzeniu mirror five do 37 °C. Po osiągnięciu równowagi termicznej, próbki włókien sercowych należy umieścić w urządzeniu mirror five znajdującym się w komorach graftu XI, mieszając je za pomocą pasków magnetycznych pokrytych politetrafluoroetylenem.Zwiększ stężenie tlenu w komorach GRAT do poziomu od 250 do 550 micromolar, używając strzykawki wypełnionej tlenem. Pozostaw od pięciu do 10 minut na stabilizację stężenia tlenu, wykorzystując strzykawkę Hamiltona o objętości 10 microliter. Dodaj do komory 10 microliters glutaminianu o stężeniu two molar, aby uzyskać stężenie końcowe 10 millimolar.Następnie, używając oddzielnej strzykawki Hamiltona, należy dodać 5 µL 800 mM malonianu, aby uzyskać stężenie końcowe 2 mM w komorze. Tytułowanie to służy do oznaczenia podstawowego oddychania wspieranego przez kompleks I. Strumień tlenu powinien ustabilizować się w ciągu około pięciu minut od miareczkowania, co pozwala na oznaczenie zużycia tlenu w stanie 2, którym jest zużycie tlenu.W przypadku braku DP po dwóch do pięciu minutach stabilnego zużycia tlenu, należy użyć mikrosyringi Hamiltona o pojemności 25 µL, aby dodać 20 µL 500 mM DP, osiągając końcowe stężenie nasycające wynoszące 5 mM. Stężenie to jest stosowane w celu uzyskania nasycenia powyżej 90%, co pozwala na określenie stanu maksymalnego. Trzy. Oddychanie mitochondrialne poprzez kompleks I pozwala na dodatkowe dwie do pięciu minut stabilnego zużycia tlenu.Następnie, używając mikrostrzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL, należy dodać 5 µL cytochromu C o stężeniu 4 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 10 µM. Stężenie tlenu w tym punkcie jest wykorzystywane do przeprowadzenia analizy kontroli jakości integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej. Po kolejnych dwóch do pięciu minutach stabilnego zużycia tlenu należy dodać 1 µL ACIN o stężeniu 4 mg/mL w celu zahamowania syntazy TP.Ten etap miareczkowania służy do walidacji szczelności wewnętrznej błony mitochondrialnej. Po przeprowadzeniu oceny oxphos w systemie repi metric, należy pobrać próbkę do oznaczenia suchej masy lub markerów mitochondrialnych. Następnie należy wyjąć lustro pięć z komór szklanych urządzenia XI Grat.Przemyj komory co najmniej trzy razy wodą destylowaną. Następnie przemyj komory co najmniej trzy kolejne razy 100% etanolem, aby usunąć inhibitory rozpuszczalne w etanolu, takie jak oligomycyna.Następnie wykonaj dwa dodatkowe przemycia 70% etanolem. Potem dodaj 70% etanol i pozostaw komory przeszczepowe XI w celu namaczania przez 30 minut, aby je wysterylizować. Na koniec przemyj komory zawierające POS co najmniej pięć razy wodą dwukrotnie destylowaną; zużycie tlenu w prawidłowo przygotowanych lustrzanych włóknach sercowych jest oceniane zgodnie z przedstawionym protokołem kontroli jakości; wskaźnik kontroli oddychania lub RCR reprezentuje sprzężenie między zużyciem tlenu a fosforylacją oksydacyjną w preparatach przepuszczalnych włókien.Współczynnik kontroli oddechowej (RCR) to stosunek szybkości oddychania w stanie trzy do stanu dwa lub alternatywnie stanu trzy do stanu cztery; dobrze sprzężone preparaty mitochondrialne odzwierciedlające preparaty serca wykazują RCR w zakresie od trzech do sześciu. Miareczkowanie cytochromem C służy jako walidacja prawidłowego przygotowania tkanki. Cytochrom C jest białkiem zlokalizowanym w przestrzeni międzybłonowej wewnętrznej błony mitochondrialnej.Gdy błona zewnętrzna mitochondriów jest nienaruszona, endogenny cytochrom C pozostaje w przestrzeni międzybłonowej, a miareczkowanie egzogennym cytochromem C ma pomijalny wpływ na oddychanie. I odwrotnie, jeśli błona zewnętrzna mitochondriów jest uszkodzona, endogenny cytochrom C może zostać uwolniony z przestrzeni międzybłonowej i będzie hamował oddychanie aż do dodania egzogennego cytochromu C, co pozwala na ocenę wpływu patologicznych lub eksperymentalnych stresorów na integralność błony zewnętrznej mitochondriów. Dodanie CIN jest wykorzystywane do oceny zmian w oddychaniu przeciekowym (leak respiration), czyli zużycia tlenu, które nie przyczynia się do powstania DP. Włókna kontrolne lub typu dzikiego powinny być wrażliwe na dodanie CIN, co objawi się znacznym spadkiem strumienia tlenu.Niski wskaźnik RCR oraz zmniejszona wrażliwość na oligomycynę, skutkująca stosunkowo wysokim przepływem tlenu, wskazują na uszkodzenie wewnętrznej błony mitochondrialnej podczas przygotowania próbek. Brak reakcji na miareczkowanie odsprzęgaczem i inhibitorem substratu, widoczny w tym przypadku, może świadczyć o zbyt długim czasie inkubacji sasin oraz pęczków włókien pozbawionych osłonki (skinned fibers) w roztworach RP i mirror five. Dalsze działania powinny być ukierunkowane na zminimalizowanie czasu pomiędzy uśmierceniem zwierzęcia a pomiarami zużycia tlenu.Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować pęczki włókien sercowych do pomiarów grafiki polarnej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie szczególnej ostrożności podczas mechanicznej separacji włókien sercowych. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

respirometric-oxidative-phosphorylation-assessment-saponin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena oksydacyjnej fosforylacji respiracyjnej w przepuszczalnych dla saponiny włóknach mięśnia sercowego

Poniższy protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie do ilościowego pomiaru szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego. Omówiono również metody stosowane do analizy próbek i interpretacji danych.

Metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego

Ta praca demonstruje wykonalność techniki spektroskopii rezonansu magnetycznego in vivo fosforu-31 (31PMRS) do ilościowego określenia zdolności mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w ludzkich mięśniach szkieletowych.

Spektroskopia rezonansu magnetycznego Phosphorus-31: narzędzie do pomiaru zdolności ultrautleniającej fosforylacji mitochondrialnej in vivo w ludzkich mięśniach szkieletowych

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Ten protokół opisuje kalorespirometrię, bezpośredni i jednoczesny pomiar zarówno rozpraszania ciepła, jak i oddychania, co zapewnia nieinwazyjne podejście do oceny metabolizmu energetycznego. Technika ta służy do oceny udziału ścieżek tlenowych i beztlenowych w wykorzystaniu energii poprzez monitorowanie całkowitego przepływu energii komórkowej.

Kalorespirometria: potężne, nieinwazyjne podejście do badania metabolizmu energii komórkowej

Tutaj przedstawiamy metodę użycia wewnątrzkomorowego cewnika optycznego w perfundowanych sercach do wykonywania spektroskopii absorbancji przez ścianę serca. Uzyskane dane dostarczają solidnych informacji na temat napięcia tlenu w tkankach, a także wykorzystania substratu i potencjału błonowego jednocześnie z pomiarami wydolności serca w tym wszechobecnym preparacie.

Wewnątrzsercowy cewnik świetlny do bocznego zapłonu do monitorowania metabolizmu komórkowego za pomocą przezściennej spektroskopii absorpcji perfundowanych serc ssaków

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół ilościowego określania tempa zużycia tlenu i szybkości zakwaszania zewnątrzkomórkowego komor dorosłych danio danio (ex vivo ), aby scharakteryzować ich zdolności metaboliczne oksydacyjne i glikolologiczne.

Ocena aktywności metabolycznej całych regenerujących się komor danio pręgowanego ex vivo za pomocą testu strumienia zewnętrznego

Poznaj metodę respirometrycznej oceny fosforylacji oksydacyjnej we włóknach sercowych przepuszczalnych saponiną. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary funkcji mitochondrialnej in situ przy zachowaniu architektury komórkowej.

Ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną

Przeglądaj więcej filmów