Name: Zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny u świadomego szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny do oceny wrażliwości na insulinę u świadomych szczurów. Ta metoda pozwala bezpośrednio mierzyć tempo wykorzystania glukozy przy wysokich fizjologicznych poziomach insuliny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było wspierane przez Canadian Institutes of Health Research oraz Genome Canada. JS otrzymuje wsparcie finansowe w ramach stypendiów z Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada oraz Canadian Diabetes Association. Szczególne podziękowania kierujemy do dr. Davida Wassermana i Bingle Bracy za przeszkolenie laboratorium Shearera w tej procedurze.

<ol><li>Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+to+basal+and+insulin-stimulated+skeletal+muscle+glucose+uptake+in+the+high-fat-fed+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Limitations to basal and insulin-stimulated skeletal muscle glucose uptake in the high-fat-fed rat.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 279, E1064-E1071 (2000).</li>
<li>Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+to+muscle+glucose+uptake+due+to+high+fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations to muscle glucose uptake due to high fat feeding.</a> Am. J. Physiol. 279, E1064-E1071 (2000).</li>
<li>Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+for+assessing+insulin+sensitivity+and+resistance+in+vivo%3A+advantages%2C+limitations%2C+and+appropriate+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, 15-26 (2008).</li>
<li>Cho, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+a+diabetes+mellitus-like+syndrome+in+mice+lacking+the+protein+kinase+Akt2+%28PKB+beta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta).</a> Science. 292, 1728-1731 (2001).</li>
<li>Dubois, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SHP-1+protein+tyrosine+phosphatase+negatively+modulates+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The SHP-1 protein tyrosine phosphatase negatively modulates glucose homeostasis.</a> Nat Med. 12, 549-556 (2006).</li>
<li>Pacini, G., Thomaseth, K., Ahren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+to+glucose+tolerance+of+insulin-independent+vs.+insulin-dependent+mechanisms+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Contribution to glucose tolerance of insulin-independent vs. insulin-dependent mechanisms in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 281, 693-703 (2001).</li>
<li>Herbach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant-negative+effects+of+a+novel+mutated+Ins2+allele+causes+early-onset+diabetes+and+severe+beta-cell+loss+in+Munich+Ins2C95S+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Dominant-negative effects of a novel mutated Ins2 allele causes early-onset diabetes and severe beta-cell loss in Munich Ins2C95S mutant mice.</a> Diabetes. 56, 1268-1276 (2007).</li>
<li>Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+insulin+resistance+in+mice+lacking+adiponectin%2FACRP30%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30.</a> Nat Med. 8, 731-737 (2002).</li>
<li>Potenza, M. A., Marasciulo, F. L., Tarquinio, M., Quon, M. J., Montagnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+spontaneously+hypertensive+rats+with+rosiglitazone+and%2For+enalapril+restores+balance+between+vasodilator+and+vasoconstrictor+actions+of+insulin+with+simultaneous+improvement+in+hypertension+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Treatment of spontaneously hypertensive rats with rosiglitazone and/or enalapril restores balance between vasodilator and vasoconstrictor actions of insulin with simultaneous improvement in hypertension and insulin resistance.</a> Diabetes. 55, 3594-3603 (2006).</li>
<li>Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+design+of+hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse.</a> Diabetes. 55, 390-397 (2006).</li>
<li>Wasserman, D. H., Ayala, J. E., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Lost in translation.</a> Diabetes. 58, 1947-1950 (2009).</li>
</ol>

Procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Calgary i są zgodne z wytycznymi Kanadyjskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych dotyczącymi przeprowadzania eksperymentów. Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów ani ujawnień.

Procedura clamp, opracowana początkowo do badania wrażliwości na insulinę u ludzi, została obecnie zaadaptowana do innych gatunków, w tym do szczurów i myszy laboratoryjnych. Badanie modeli zwierzęcych insulinooporności stanowi istotną pomoc w zrozumieniu patofizjologii wrażliwości na insulinę i związanych z nią patologii, a także w identyfikacji interwencji terapeutycznych o wartości klinicznej1,2. Do oceny wrażliwości na insulinę u zwierząt zastosowano kilka metod3. Techniki te obejmują warianty t...

<table><tbody><tr><td>Przezroczysta rurka polietylenowa Intramedic (PE-50)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-12B</td><td>Średnica wewnętrzna 0,58 mm (0,023&quot;) x średnica zewnętrzna 0,965 mm (0,038&quot;)</td></tr><tr><td>Laboratoryjna rurka Silastic Dow Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15C</td><td>Średnica wewnętrzna 0,76 mm (0,030&quot;) x średnica zewnętrzna 1,65 mm (0,065&quot;) </td></tr><tr><td>Medyczna rurka Tygon S-50-HL</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 72-1251</td><td>Średnica wewnętrzna 3,2 mm (0,125&quot;) x średnica zewnętrzna 4,7 mm (0,1875&quot;)</td></tr><tr><td>Super Glue Loctite</td><td>Grand Toy</td><td>32237</td><td>W formie żelu (Gel Control)</td></tr><tr><td>Sterylny skalpel</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiona mikropinceta preparacyjna</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-20</td><td>x 2</td></tr><tr><td>Prosta mikropinceta preparacyjna</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-15</td><td>x 2</td></tr><tr><td>Zakrzywiony zacisk hemostatyczny</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-1135</td><td>x 2</td></tr><tr><td>Prosty zacisk hemostatyczny</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-1130</td><td>x 2</td></tr><tr><td>Osłonki końcówek zacisków hemostatycznych</td><td>Robbins Instruments, Inc.</td><td>15.09-2-004</td><td></td></tr><tr><td>Proste nożyczki chirurgiczne</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Adapter Luer do wielokrotnego pobierania próbek VENOJECT</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>810127A</td><td>21 G, 1 cal</td></tr><tr><td>Sterylny wprowadzacz do cewnika</td><td>BD Biosciences</td><td>406999</td><td></td></tr><tr><td>Tępa igła 14 G</td><td>BD Biosciences</td><td>511310</td><td>14 G, 2 cale</td></tr><tr><td>Sterylna nić chirurgiczna</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>1679H</td><td>Jedwab, rozmiar 3-0</td></tr><tr><td>Niesterylna nić chirurgiczna </td><td>Angiotech Pharmaceuticals, Inc.</td><td>SP116</td><td>Jedwab, rozmiar 4-0</td></tr><tr><td>Patyczki bawełniane</td><td>VWR international</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>4-warstwowe gaziki</td><td>VWR international</td><td>CA43845-062</td><td></td></tr><tr><td>Bezprzewodowa maszynka do strzyżenia małych zwierząt</td><td>Harvard Apparatus</td><td>729063</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>IPN-45</td><td></td></tr><tr><td>Wózek anestezjologiczny</td><td>Benson Medical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Antyseptyczny roztwór Betadine</td><td>Western Drug Distribution Center, Ltd.</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa model 11 Plus</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702208</td><td></td></tr><tr><td>Stalowe łączniki do rurek</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4434</td><td>23 G, 0,3 cala</td></tr><tr><td>Stalowe zaślepki do rurek</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4436</td><td>23 G, 0,5 cala</td></tr><tr><td>Stalowe tępe igły</td><td>Instech Laboratories, Inc</td><td>LS22</td><td>22 G</td></tr><tr><td>Złącza Y 60 stopni</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>STCY-22-05</td><td>22 G</td></tr><tr><td>Wirówka do mikrohematokrytu CritSpin</td><td>Iris Sample Processing</td><td>CS12</td><td></td></tr><tr><td>Miniwirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówki</td><td>VWR international</td><td>53550-778</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe probówki wirówkowe 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe strzykawki 1 ml z końcówką typu slip tip</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe strzykawki 3 ml z końcówką Luerlok</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Wstrzykiwalna heparyna przeciwzakrzepowa</td><td>Western Drug Distribution Center, Ltd.</td><td>102824</td><td>Producent: LEO Pharma Inc. Stężenie 1000 IU</td></tr><tr><td>Roztwór EDTA</td><td>Promega Corp.</td><td>V4231</td><td>0,5 M, pH 8,0</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>Western Drug Distribution Center, Ltd.</td><td>ABB7983154</td><td>Producent: Hospira, 0,9% chlorku sodu</td></tr><tr><td>50% dekstroza</td><td>V&amp;eacute;toquinol</td><td>8DEX012D</td><td></td></tr><tr><td>Humulin-R </td><td>Eli Lilly</td><td>HI-210</td><td>100 U/ml</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe 1 ml </td><td>BD Biosciences</td><td>309311</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz Fisherbrand* Hemato-Seal</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-678</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary do mikrohematokrytu Fisherbrand*</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td></td></tr><tr><td>Paski testowe One Touch Ultra</td><td>LifeScan, Inc.</td><td>AW 085-314H</td><td></td></tr><tr><td>Glukometr One Touch Ultra</td><td>LifeScan, Inc.</td><td>AW 085-314B</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>Stężenie 54,7 mg/ml</td></tr><tr><td>Czerwona taśma laboratoryjna do etykietowania</td><td>VWR international</td><td>89097-932</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska taśma laboratoryjna do etykietowania</td><td>VWR international</td><td>89097-936</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-913-88</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło Vortex</td><td>VWR international</td><td>58815-234</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>VWR international</td><td>62344-641</td><td></td></tr></tbody></table>

zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny u świadłego szczura

Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp in the Conscious Rat

Częstość występowania cukrzycy typu 2 (T2D) gwałtownie rośnie. Charakteryzująca się albo niewystarczającą produkcją insuliny, albo niezdolnością do wykorzystania produkowanej insuliny, T2D prowadzi do podwyższonego poziomu glukozy we krwi. „Złotym standardem” w ocenie wrażliwości na insulinę jest zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny (hyperinsulinemic-euglycemic clamp) lub zacisk insulinowy. W tej procedurze insulinę infunduje się ze stałą prędkością, co skutkuje spadkiem poziomu glukozy we krwi. Aby utrzymać poziom glukozy we krwi na stałym poziomie, do krążenia żylnego infunduje się egzogenną glukozę (D50). Ilość glukozy infundowanej w celu utrzymania homeostazy jest wskaźnikiem wrażliwości na insulinę. W niniejszym materiale przedstawiamy podstawową procedurę zacisku u szczura z chronicznie wszczepionymi cewnikami, nieunieruchomionego i świadomego. Model ten pozwala na pobieranie krwi przy minimalnym stresie dla zwierzęcia. Po wprowadzeniu znieczulenia wykonuje się cięcie w linii środkowej, a następnie cewnikuje się lewą wspólną tętnicę szyjną i prawą żyłę szyjną. Wprowadzone cewniki płucze się solą fizjologiczną z heparyną, a następnie wyprowadza na zewnątrz i mocuje. Zwierzętom pozwala się na rekonwalescencję przez 4-5 dni przed rozpoczęciem eksperymentów, przy codziennym monitorowaniu przyrostu masy ciała. Do eksperymentów wykorzystuje się wyłącznie te zwierzęta, których masa ciała powróciła do poziomu sprzed operacji. W dniu eksperymentu szczury są głodzone i podłączone do pomp zawierających insulinę oraz D50. Poziom glukozy wyjściowy jest oceniany z linii tętniczej i służy jako punkt odniesienia w trakcie całego eksperymentu (euglikemia). Następnie insulinę infunduje się ze stałą prędkością do krążenia żylnego. Aby zrównoważyć spadek poziomu glukozy we krwi, infunduje się D50. Jeśli szybkość infuzji D50 jest większa niż szybkość poboru, nastąpi wzrost poziomu glukozy. Podobnie, jeśli szybkość jest niewystarczająca, aby zrównoważyć pobór glukozy przez cały organizm, nastąpi spadek. Miareczkowanie glukozy trwa do momentu uzyskania stabilnych odczytów poziomu glukozy. Poziomy glukozy oraz szybkości infuzji glukozy w tym stabilnym okresie są rejestrowane i raportowane. Wyniki stanowią indeks ogólnoustrojowej wrażliwości na insulinę. Technikę tę można doprecyzować, aby sprostać konkretnym wymaganiom eksperymentalnym. Można ją dodatkowo usprawnić poprzez zastosowanie znaczników radioaktywnych, które pozwalają określić stymulowany insuliną pobór glukozy w konkretnych tkankach, a także ogólnoustrojowy obrót glukozy.

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny jest „złotym standardem” w ocenie działania insuliny. Insulinę podaje się w stałym tempie, co stymuluje wychwyt glukozy. Ilość egzogennej glukozy podawanej w celu przeciwdziałania temu spadkowi jest wskaźnikiem wrażliwości na insulinę. W niniejszym materiale procedura jest przeprowadzana na przytomnym, nieskrępowanym szczurze.

Zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny u świadłego szczura

Częstość występowania cukrzycy typu 2 (T2D) gwałtownie rośnie. Charakteryzuje się ona albo niedostateczną produkcją insuliny, albo niezdolnością do wykorzystania produkowanej insuliny, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena wrażliwości na insulinę u świadłego, nieskrępowanego szczura. Jest to realizowane poprzez uprzednie wprowadzenie cewnika do lewej tętnicy szyjnej. Następnie kaniulowana jest prawa żyła szyjna, aby zapewnić optymalne wyniki.Cewniki są codziennie przemywane w celu utrzymania ich drożności podczas pięciodniowego okresu rekonwalescencji pooperacyjnej. Ostatecznie, z hiperinsulinemiczno-euglikemicznego zacisku można uzyskać wyniki wykazujące wskaźniki infuzji glukozy do całego organizmu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania bezpośrednich pomiarów wskaźników utylizacji glukozy w całym organizmie przy wysokich fizjologicznych poziomach insuliny.Kaniule tętnicze i żylne muszą zostać przygotowane przed rozpoczęciem procedury chirurgicznej. Kaniule powinny mieć zaokrąglone końce, być wypełnione solą fizjologiczną z heparyną i wysterylizowane etanolem, z mocno przymocowaną gumką zabezpieczającą w odległości odpowiednio 2,7 lub 3,2 centymetra od jednego końca dla kaniul tętniczych i żylnych. W tej procedurze wykorzystuje się dorosłe samce szczurów linii Sprague Dawley o masie około 300 gramów.Zanotuj początkową masę ciała zwierzęcia i wykorzystaj tę wartość do monitorowania przyrostu masy po operacji. Pracuj w aseptycznym obszarze chirurgicznym. Zanieść szczura 3% isofluranem, umieszczając go w komorze anestezjologicznej.Przenieś zwierzę poza obszar chirurgiczny i przygotuj miejsce nacięcia, usuwając sierść z okolic szyi i barków. Po usunięciu sierści umieść zwierzę w stożku nosowym, aby podtrzymać anestezję przy użyciu około 2% izofluranu. Przymocuj zwierzę do stołu operacyjnego.Upewnij się, że szczur jest w pełni znieczulony, sprawdzając obecność odruchów stopy i/lub oka. Oczyść miejsce nacięcia 70% ethanol, następnie wykonaj scrub Betadine, a na koniec ponownie przemyj 70% ethanol. Pierwszym krokiem procedury jest wykonanie niewielkiego pionowego nacięcia w linii środkowej 10 millimeter powyżej mostka.Używając zakrzywionej pęsety mikrosekcyjnej, wykonaj tępe rozdzielenie tkanek, aby odsłonić lewy mięsień mostkowo-乳様owy (sternomastoideus). Odchyl ten mięsień, aby odsłonić około jednego centymetra lewej tętnicy szyjnej. Umieść pęsetę mikrosekcyjną pod tętnicą szyjną, aby ją ustabilizować, delikatnie oddzielając tkankę łączną.Ważne jest, aby wyizolować nerw błędny od tętnicy, nie uszkadzając ani tętnicy, ani nerwu. Należy użyć sterylnej nici jedwabnej 4-0 do podwiązania końca cephaladnego. Naczynie należy zacisnąć ząbkowaną mikropincetą anatomiczną.Nakłuć miejsce podwiązywania. Zakończyć adapterem do wielokrotnego pobierania próbek o rozmiarze 21 G. Wyjąć stalowy korek z cewnika i za pomocą sterylnego wprowadzacza do cewników wprowadzić go do tętnicy.Użyć pęsety, aby upewnić się, że kaniula jest stabilna. Częściowo zwolnić mikro-pęsetę dyssekcyjną, zaciskając tętnicę, i kontynuować wprowadzanie kaniuli aż do koralika. W tym momencie końcówka kaniuli powinna znajdować się w łuku aorty.Zabezpiecz dwa szwy poniżej koralika i jeden powyżej, a następnie przemyj linię heparynowaną solą fizjologiczną w stężeniu 10 jednostek na mililitr. Aby potwierdzić drożność cewnika, ponownie zamknij jego zewnętrzny koniec za pomocą stalowego korka. Następnie wykonaj tępe rozczepianie tkanek, aby odsłonić prawą żyłę szyjną zewnętrzną, ostrożnie wyizoluj żyłę i podwiąż żyłę głowną.Zakończyć szwem jedwabnym. Nakłuć żyłę igłą 21 G. Wypchnąć adapter do pobierania próbek multis.Wyjąć stalowy korek z cewnika i za pomocą sterylnego wprowadzacza wprowadzić go aż do koralika. Zabezpieczyć dwa szwy poniżej koralika i jeden powyżej. Następnie przemyć linię fizjologicznym roztworem z heparyną o stężeniu 10 jednostek na mililitr.Aby potwierdzić, że cewnik pobiera próbki, należy ponownie zamknąć zewnętrzny koniec cewnika za pomocą stalowego korka, wykorzystując do tego tępą igłę o rozmiarze 14 G, przeprowadzić go podskórnie i wykonać nacięcie na grzbiecie szczura pomiędzy łopatkami. Następnie należy przeciągnąć cewniki przez igłę tak, aby wystawały z grzbietu szczura. Widoczna powinna być około cztery centymetry każdego cewnika.Odetnij 0,5 centymetra rurki medycznej Tigon S 50 HL i umieść ją wokół obu zewnętrznych cewników. Zabeziecz niebieską taśmą w przypadku żył i czerwoną w przypadku tętnic. Ponownie sprawdź drożność cewników, a następnie przepłucz i wypełnij je solą fizjologiczną z heparyną o stężeniu 150 jednostek na mililitr, aby zapobiec krzepliwości.Zamknąć wszystkie nacięcia za pomocą nici jedwabnej 3-0. Umieścić szczura w pozycji brzusznej w wcześniej ogrzanej, czystej klatce z łatwo dostępnym pokarmem. Gdy szczur w pełni odzyska zdolność poruszania się i czujność, przenieść go z powrotem do klatki macierzystej.Pozostawić szczura w celu rekonwalescencji przez trzy do pięciu dni, monitorując codziennie pod kątem infekcji, bólu oraz zmian masy ciała. Ważne jest, aby przez cały okres badania zachować drożność cewnika. Każdego dnia po operacji należy napełnić strzykawki z końcówką typu slip tip o objętości jednego mililitra solą fizjologiczną z heparyną w stężeniu 150 jednostek na mililitr i zamknąć je tępą igłą o rozmiarze 22G.Tępa igła zostaje włożona do 20 centymetrów rurki PE 50 z łącznikiem z rurki ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23 G na drugim końcu. Należy upewnić się, że z przewodu usunięto wszystkie pęcherzyki powietrza. Zaciśnij kleszczykami tętnicę zewnętrzną szczura, tuż poniżej zatyczki.Usuń stalową zatyczkę cewnika, używając drugiej pary kleszczyków hemostatycznych. Wprowadź złączkę rurki połączoną ze strzykawką do linii tętniczej i zwolnij kleszczyki hemostatyczne blokujące zewnętrzny fragment cewnika tętniczego. Następnie odessać krew tętniczą z cewnika do strzykawki.Jeśli cewnik nie zasysa płynu z łatwością, może być konieczne bardzo delikatne wciśnięcie niewielkiej ilości roztworu przez cewnik w celu odblokowania końcówki. Po tym zabiegu cewnik uznaje się za drożny. Gdy krew dotrze do zacisku strzykawki, należy zapiąć zacisk P 50 na prowadnicy w pobliżu strzykawki o objętości 1 ml, a następnie zutylizować strzykawkę.Wymień strzykawkę na nową, wypełnioną świeżym lodowatym roztworem soli fizjologicznej z heparyną. Otwórz zacisk rurki i, trzymając nową strzykawkę pionowo, stuknij w nią, aby przesunąć pęcherzyki powietrza w górę i z dala od linii. Wstrzyknij heparynową sól fizjologiczną, aż linia cewnika będzie przejrzysta i wolna od krwi.Zaklemuj linię tętniczą tuż poniżej łącznika rurki. Zdejmij złącze strzykawki z linii cewnika tętniczego i zastąp je stalowym korkiem do rurek. Zwolnij kleszczyki hemostatyczne zamykające zewnętrzną część cewnika tętniczego.Powtórz tę procedurę dla linii żylnej. Ze względu na niskie ciśnienie żylne pobranie próbek może być niemożliwe. Generalnie, jeśli sól fizjologiczna z heparyną może być infundowana przy minimalnym oporze, prawdopodobnie cewnik jest prawidłowo umieszczony w żyle.Przed rozpoczęciem procedury należy zważyć zwierzęta, przygotować roztwory oraz złożyć aparat zaciskowy. Po zważeniu zwierzęcia i potwierdzeniu drożności cewnika, należy umieścić je w niewielkim pojemniku z podścieliskiem, który ogranicza, ale nie blokuje ruchów. Szczury wykorzystane w tym badaniu są głodzone przez co najmniej pięć godzin i spełniły wymogi dotyczące przyrostu masy ciała po operacji. Masa ciała szczura określa tutaj wymaganą ilość insuliny.Dawkę 4 mU/kg/min podaje się z szybkością 2 µL/min. Należy przygotować 50% roztwór dekstrozy i upewnić się, że ilość obu roztworów wystarczy na około dwie godziny; używa się do tego strzykawek o pojemności 3 mL. Teraz można przystąpić do montażu aparatu zaciskowego.Przygotuj linie i pompy infuzyjne zgodnie z przedstawionym schematem. Umieść strzykawki z glukozą i insuliną w pompie strzykawkowej. Zaklemuj linie i pozostaw szczura do odpoczynku na 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.Aby rozpocząć procedurę, pobierz wyjściową próbkę insuliny oraz hematokrytu; pomiar hematokrytu zapewnia utrzymanie objętości krwi w trakcie całego eksperymentu. Zazwyczaj poziom hematokrytu nie powinien spaść o więcej niż 10% wartości początkowej. Pobierz wyjściową próbkę glukozy i określ poziom glukozy do zaklemowania.W tym przypadku utrzymujemy poziom glikemii na poziomie 5 mM. Po pobraniu każdej próbki krwi należy przepłukać linię tętniczą niewielką objętością soli fizjologicznej z dodatkiem 10 j./ml heparyny, aby zapobiec krzepnięciu. Po ustaleniu poziomu glukozy do utrzymania należy rozpocząć wlew roztworu insuliny.Pomierz poziom glukozy we krwi w odstępach od 5 do 10 minut i dostosuj szybkość infuzji glukozy w razie potrzeby, aż do osiągnięcia stanu stacjonarnego. Jest to zazwyczaj proces prób i błędów, który może zająć od 30 minut do ponad dwóch godzin. Poziom glukozy wymagany do utrzymania glikemii zależy od protokołu eksperymentalnego.Gatunki i warunki: aby uznać poziom glukozy za ustabilizowany (clamped), trzy kolejne pomiary muszą zmieścić się w określonym zakresie. Trzy odczyty różniące się od siebie o około 1 mmol/L oznaczają, że poziomy glukozy osiągnęły stan stacjonarny. Prędkość infuzji glukozy wymagana do utrzymania glikemii przez okres 30 minut; w tym czasie można pobrać co najmniej dodatkowe próbki krwi.Po zakończeniu procedury clampowania należy pobrać drugą próbkę hematokrytyczną insuliny w osoczu. Zwierzęta mogą zostać wykorzystane do dalszych badań lub poddane eutanazji w celu pobrania tkanek do dalszej analizy. W zależności od zwierzęcia, przy prawidłowym wykonaniu, wkłucia cewników mogą pozostać drożne od pięciu do siedmiu dni.Procedura clamp pozwala na pomiar wrażliwości na insulinę w stanie stacjonarnym. Niezbędne jest monitorowanie poziomów insuliny i glukozy, a także szybkości wlewów glukozy oraz wartości hematokrytu. Stan stacjonarny zostaje osiągnięty, gdy poziomy glukozy utrzymują się w granicach jednego milimola względem siebie w okresie 30 minut.Szybkość wlewu glukozy wskazuje poziom egzogennej glukozy niezbędny do utrzymania glikemii; w miarę możliwości szybkość ta powinna być naniesiona na wykres w funkcji czasu, a nie przedstawiona jako pojedynczy punkt średni. Należy podać poziomy insuliny zarówno na czczo, jak i w fazie zaciskania (clamping). Pomiary te potwierdzają prawidłowe podanie insuliny i pozwalają wykryć wszelkie różnice w odpowiedzi insulinowej pomiędzy grupami badawczymi. Pomiar poziomu hematokryty wyjściowo oraz ponownie po zakończeniu procedury daje pewność, że poziomy te nie spadły o więcej niż 5% wartości wyjściowej w trakcie trwania eksperymentu po zastosowaniu tej procedury.Do oceny wykorzystania glukozy w całym organizmie oraz w konkretnych tkankach można zastosować inne metody, takie jak podawanie znaczników izotopowych.

hyperinsulinemic-euglycemic-clamp-in-the-conscious-rat

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Klem hiperinsulinemii-euglukemii u świadomej szczury

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo. Opisano metodę przeprowadzania clampów insulinowych u myszy. Obejmuje ona metodę cewnikowania tętniczego, która pozwala na wykonywanie eksperymentów na świadomych, nieskrępowanych myszach przy minimalnym stresie.

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Opisano protokół przewlekłych infuzji glukozy i intralipidów u szczurów. Model ten można wykorzystać do badania wpływu nadmiaru składników odżywczych na funkcjonowanie narządów i parametry fizjologiczne.

Model przewlekłego wlewu składników odżywczych u szczura

Ten protokół bada rolę ligandu 5 (CCL5) chemokiny (motyw C-C) w podwzgórzu, dostarczając antagonistę, MetCCL5, do mózgu myszy za pomocą systemu infuzji mózgu za pomocą mikro-pompy osmotycznej. To przejściowe zahamowanie aktywności CCL5 przerwało sygnalizację insuliny w podwzgórzu, prowadząc do nietolerancji glukozy i obwodowej ogólnoustrojowej wrażliwości na insulinę.

Badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy

Zacisk hiperglikemiczny służy do pomiaru uwalniania insuliny przy utrzymującym się wyższym stężeniu glukozy we krwi. Zacisk hipoglikemiczny służy do pomiaru produkcji glukozy indukowanej reakcjami przeciwregulacyjnymi. Obie metody wykorzystują tę samą procedurę chirurgiczną. W tym miejscu przedstawiamy technikę zaciskową do oceny ogólnoustrojowego metabolizmu glukozy.

Zacisk hiperglikemiczny i zacisk hipoglikemiczny u świadomych myszy

Płuco jest perfundowane zarówno przez tętnicę oskrzelową systemową, jak i tętnice płucne.  W większości patologii płuc to mniejsze uczynki układowe wykazują solidną neowaskularyzację.  Zatrzymanie przepływu krwi w płucach sprzyja energicznej angiogenezie oskrzeli.  Zapewniamy chirurgiczne szczegóły indukowania niedokrwienia lewej tętnicy płucnej, które sprzyja neowaskularyzacji oskrzeli.

Angiogeneza w niedokrwiennym płucu szczura

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak Elvax 40W może być używany jako metoda o powolnym uwalnianiu do dostarczania leku do siatkówki dorosłego szczura. Opisano protokół przygotowania, ładowania i dostarczania kompleksu lek-żywica do oka.

Dostarczanie leku o powolnym uwalnianiu przez Elvax 40W do siatkówki szczura: implikacje dla leczenia chorób przewlekłych

Dostęp naczyniowy do pomiaru hemodynamiki, dostarczania płynów i pobierania próbek krwi jest ważny dla każdego badania na małym modelu zwierzęcym. Przedstawiamy technikę wszczepiania cewników do tętnicy szyjnej i żyły szyjnej wspólnej u znieczulonego szczura w celu podłączenia do systemu w celu przeprowadzenia monitorowania, infuzji i pobierania próbek.

Cewnikowanie tętnicy szyjnej i żyły szyjnej w celu wykonania pomiarów hemodynamicznych, infuzji i pobierania próbek krwi w świadomym modelu szczurzym

Określenie współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem do oceny ogólnej funkcji nerek. Jednak tradycyjne procedury pomiaru tego parametru są kłopotliwe i wymagają dużej inwestycji czasu. W tym miejscu opisujemy szybszą i minimalnie inwazyjną metodę przezskórnego oznaczania GFR.

Przezskórna ocena czynności nerek u świadomych gryzoni

Opisujemy metodę tworzenia zwierzęcego modelu zwłóknienia wątroby u szczura i oceniamy stopień zwłóknienia poprzez badanie histologiczne wątroby. Model może być wykorzystany do badania rozwoju chorób wątroby, a także do testowania skuteczności potencjalnych środków przeciwzwłóknieniowych.

Model zwłóknienia wątroby wywołanego dimetylonitrozoaminą u szczura

Unikalny model zacisku wnękowego wątroby szczura został opracowany do badania wpływu cząsteczek farmakologicznych na łagodzenie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Model ten obejmuje bezpośrednią kaniulację dopływu wrotnego do niedokrwionego segmentu wątroby przez odgałęzienie żyły wrotnej, co pozwala na bezpośrednie dostarczenie wątrobowe.

Metoda bezpośredniego segmentalnego dostarczania dowątrobowego przy użyciu modelu klamry Hilar wątroby szczura

Poznaj zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny do oceny wrażliwości na insulinę u świadomych szczurów. Ta metoda pozwala bezpośrednio mierzyć tempo wykorzystania glukozy przy wysokich fizjologicznych poziomach insuliny.

Zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny u świadłego szczura

Przeglądaj więcej filmów