Zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny u świadłego szczura

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena wrażliwości na insulinę u świadłego, nieunieruchomionego szczura. Jest to realizowane poprzez wstępne wprowadzenie cewnika do lewej tętnicy szyjnej. Następnie, w celu zapewnienia optymalnych wyników, wprowadza się cewnik do prawej żyły szyjnej.

Cewniki są płukane codziennie w celu utrzymania ich drożności podczas pięciodniowego okresu rekonwalescencji pooperacyjnej. Ostatecznie można uzyskać wyniki z hiperinsulinemicznego zacisku glikemicznego, które wskazują szybkość wlewu glukozy do całego organizmu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniego pomiaru szybkości utylizacji glukozy przez cały organizm przy wysokich fizjologicznych poziomach insuliny.

Cewniki tętnicze i żylne należy przygotować przed rozpoczęciem procedury chirurgicznej. Cewnik powinien mieć zaoblone końce, być wypełniony solą fizjologiczną z heparyną i wysterylizowany etanolem, z bezpiecznie przymocowaną opaską ograniczającą w odległości odpowiednio 2,7 lub 3,2 centymetra od jednego z końców dla cewników tętniczych i żylnych. W tej procedurze wykorzystuje się dorosłe samce szczurów linii Sprague-Dawley o masie około 300 gramów.

Zapisz masę początkową zwierzęcia i wykorzystaj ją do monitorowania przyrostu masy ciała po operacji. Pracuj w aseptycznym obszarze chirurgicznym. Z narkozuj szczura 3% isofluranem, umieszczając go w komorze anestezjologicznej.

Przenieś zwierzę poza obszar operacyjny i przygotuj miejsce nacięcia, usuwając sierść z okolic szyi i barków. Po usunięciu sierści umieść zwierzę w stożku nosowym, aby utrzymać znieczulenie przy stężeniu isofluorine wynoszącym około 2%. Przymocuj zwierzę do stołu operacyjnego.

Upewnij się, że szczur jest w pełni znieczulony, sprawdzając obecność odruchów łap i/lub oka. Oczyść miejsce nacięcia 70% ethanol, następnie wykonaj scrub Betadine, a po nim ponownie przemyj obszar 70% ethanol. Pierwszym krokiem procedury jest wykonanie niewielkiego pionowego nacięcia w linii środkowej 10 millimeter powyżej mostka.

Za pomocą zakrzywionej pęsety mikrosekcyjnej przeprowadź tępe rozdzielenie tkanek, aby odsłonić lewy mięsień mostkowo-obojczykowy. Odchyl ten mięsień, aby odsłonić około jednego centymetra lewej tętnicy szyjnej. Umieść pęsetę mikrosekcyjną pod tętnicą szyjną, aby ją ustabilizować, jednocześnie delikatnie usuwając tkankę łączną.

Ważne jest, aby wyizolować nerw błędny od tętnicy, nie uszkadzając ani tętnicy, ani nerwu. Do podwiązania końca głownego należy użyć sterylnej nici jedwabnej 4-0. Naczynie należy zacisnąć ząbkowaną mikropincetą preparacyjną.

Nakłuć miejsce podwiązania. Użyć adaptera do wielokrotnego pobierania próbek typu ven eject o rozmiarze 21 G. Wyjąć stalową zaślepkę z cewnika i za pomocą sterylnego wprowadzacza do cewników wprowadzić go do tętnicy.

Użyj pincety, aby upewnić się, że cewnik jest stabilny. Częściowo zwolnij mikro-pincetę sekcyjną, zaciskając tętnicę, i kontynuuj wprowadzanie cewnika aż do koralika. W tym momencie końcówka cewnika powinna znajdować się w łuku aorty.

Zabezpiecz dwa szwy poniżej koralika i jeden powyżej, a następnie przemyj linię solą fizjologiczną z heparyną w stężeniu 10 jednostek na mililitr. Aby potwierdzić, że cewnik pobiera próbki, ponownie zamknij zewnętrzny koniec cewnika korkiem ze stali nierdzewnej. Następnie wykonaj rozwarstwienie tępe tkanek, aby odsłonić prawą żyłę szyjną zewnętrzną, ostrożnie wyizoluj żyłę i podwiąż żyłę głowną.

Zakończ szwem jedwabnym. Nakłuj żyłę igłą 21 G. Wypchnij adapter do pobierania próbek multis.

Usuń stalowy korek z cewnika i za pomocą sterylnego wprowadzacza do cewników wprowadź go aż do koralika. Zabezpiecz dwa szwy poniżej koralika i jeden powyżej. Następnie przepłucz linię roztworem soli fizjologicznej z heparyną o stężeniu 10 jednostek na ml.

Aby potwierdzić drożność cewnika, należy ponownie zamknąć jego zewnętrzny koniec korkiem ze stali nierdzewnej, używając tępej igły 14 G do przeprowadzenia go pod skórą, a następnie wykonać nacięcie na grzbiecie, pomiędzy łopatkami. Następnie należy przeciągnąć cewniki przez igłę tak, aby wystawały one z grzbietu szczura. Widoczna powinna być około cztery centymetry każdego cewnika.

Odetnij 0,5 centymetra drenu medycznego Tigon S 50 HL i załóż go wokół obu zewnętrznych cewników. Zabeziecz niebieską taśmą w przypadku żył i czerwoną w przypadku tętnic. Ponownie sprawdź cewniki, aby upewnić się, że są drożne, a następnie przepłucz je i wypełnij solą fizjologiczną z heparyną o stężeniu 150 jednostek na mililitr, aby zapobiec krzepnięciu.

Wszystkie nacięcia zaszyj nicią jedwabną 3-0. Umieść szczura w pozycji brzusznej w uprzednio ogrzanym, czystym klatce z łatwo dostępną karmą. Gdy szczur odzyska pełną zdolność poruszania się i czujność, przenieś go z powrotem do klatki domowej.

Pozostawić szczura w celu rekonwalescencji na okres od trzech do pięciu dni, monitorując codziennie występowanie infekcji, ból oraz zmiany masy ciała. Ważne jest, aby przez cały okres badania zachować drożność cewnika. Każdego dnia po zabiegu należy napełnić strzykawki z końcówką typu slip tip o pojemności 1 ml solą fizjologiczną z heparyną w stężeniu 150 jednostek na 1 ml, a następnie zamknąć je tępą igłą o rozmiarze 22G.

Tępą igłę wprowadza się do 20 centymetrów rurki PE 50 z łącznikiem z rurki ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23 G na drugim końcu. Należy upewnić się, że z linii usunięto wszystkie pęcherzyki powietrza. Zewnatrzystną linię tętniczą szczura zaciska się kleszczykami hemostatycznymi tuż poniżej korka.

Usuń stalowy korek cewnika za pomocą drugiej pary kleszczyków hemostatycznych. Wprowadź złączkę rurki połączonej ze strzykawką do linii tętniczej i zwolnij kleszczyki hemostatyczne blokujące zewnętrzny fragment cewnika tętniczego. Następnie odessać krew tętniczą z cewnika do strzykawki.

Jeśli cewnik nie zasysa płynu z łatwością, może być konieczne bardzo delikatne wprowadzenie niewielkiej ilości roztworu przez cewnik, aby odblokować jego końcówkę. Wówczas cewnik uznaje się za drożny. Gdy krew dotrze do zacisku strzykawki, należy zamknąć dren P 50 znajdujący się blisko strzykawki o pojemności 1 mL i zutylizować strzykawkę.

Wymień strzykawkę na nową, wypełnioną świeżym chłodnym roztworem soli fizjologicznej z heparyną. Odklej zacisk z drenu i trzymając nową strzykawkę pionowo, stuknij w nią, aby pęcherzyki powietrza przemieściły się do góry, z dala od linii. Wstrzykuj heparynowaną sól fizjologiczną, aż linia cewnika będzie czysta i wolna od krwi.

Zaklemuj linię tętniczą tuż poniżej łącznika rurki. Zdejmij złącze strzykawki z linii cewnika tętniczego i zastąp je stalowym korkiem do rurek. Zwolnij kleszczyki hemostatyczne blokujące zewnętrzny odcinek cewnika tętniczego.

Powtórz tę procedurę dla linii żylnej. Ze względu na niskie ciśnienie żylne pobranie próbek może być niemożliwe. Ogólnie, jeśli sól fizjologiczna z heparyną może być infundowana przy minimalnym oporze, prawdopodobnie cewnik jest prawidłowo umieszczony w żyle.

Przed rozpoczęciem procedury należy zważyć zwierzęta, przygotować roztwory i złożyć aparat zaciskowy. Po zważeniu zwierzęcia i potwierdzeniu drożności cewnika, należy umieścić je w małym pojemniku z podłożem, które ogranicza, ale nie uniemożliwia ruchu. Szczury wykorzystane w tym badaniu są głodzone przez co najmniej pięć godzin i spełniły wymagania dotyczące pooperacyjnego przyrostu masy ciała. Masa ciała szczura determinuje ilość potrzebnej tutaj insuliny.

Dawkę 4 mU/kg/min podaje się z szybkością 2 µL/min. Należy przygotować 50% roztwór dekstrozy i upewnić się, że dostępna ilość obu roztworów wystarczy na około dwie godziny; w tym celu używa się strzykawek o pojemności 3 mL. Teraz można przystąpić do montażu zestawu zaciskowego.

Przygotować linie i pompy infuzyjne zgodnie z przedstawionym schematem. Umieścić strzykawki z glukozą i insuliną w pompie strzykawkowej. Zakleszczyć linie i pozwolić szczurowi odpocząć przez 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.

Aby rozpocząć procedurę, pobierz wyjściową próbkę insuliny i hematokrytu; pomiar hematokrytu zapewnia utrzymanie objętości krwi w trakcie całego eksperymentu. Zazwyczaj poziom hematokrytu nie powinien spaść o więcej niż 10% wartości początkowej. Pobierz wyjściową próbkę glukozy i określ poziom glukozy do zaclampowania.

W tym przypadku utrzymujemy stały poziom glikemii na poziomie pięciu milimoli. Po pobraniu każdej próbki krwi należy przepłukać linię tętniczą niewielką objętością soli fizjologicznej z heparyną w stężeniu 10 jednostek na mililitr, aby zapobiec krzepnięciu. Po ustaleniu poziomu glukozy, który ma zostać utrzymany, należy rozpocząć wlew roztworu insuliny.

Pomiar poziomu glukozy we krwi należy przeprowadzać w odstępach od 5 do 10 minut i dostosowywać tempo infuzji glukozy w razie potrzeby, aż do osiągnięcia stanu stacjonarnego. Jest to zazwyczaj proces prób i błędów, który może trwać od 30 minut do ponad dwóch godzin. Poziom glukozy wymagany do utrzymania glikemii zależy od protokołu eksperymentalnego.

Gatunki i warunki; aby uznać poziom za ustabilizowany (clamped), trzy kolejne pomiary muszą zmieścić się w zdefiniowanym zakresie. Trzy pomiary różniące się od siebie o około jeden milimol sugerują, że poziom glukozy osiągnął stan stacjonarny. Szybkość wlewu glukozy wymagana do utrzymania glikemii przez okres 30 minut; w tym czasie można pobrać co najmniej dodatkowe próbki krwi.

Po zakończeniu procedury zacisku należy pobrać drugą próbkę osocza na oznaczenie insuliny oraz hematokrytu. Zwierzęta mogą zostać wykorzystane do dalszych testów lub uśpione w celu pobrania tkanek do dalszych analiz. W zależności od zwierzęcia, prawidłowo wprowadzone kaniule mogą pozostawać drożne od pięciu do siedmiu dni.

Procedura clamp pozwala na pomiar insulinowrażliwości w stanie stacjonarnym. Niezbędne jest rejestrowanie poziomów insuliny i glukozy, a także szybkości wlewu glukozy oraz wartości hematokrytu. Stan stacjonarny zostaje osiągnięty, gdy poziomy glukozy utrzymują się w przedziale 1 mM względem siebie przez okres 30 minut.

Wskaźnik infuzji glukozy ujawnia poziom egzogennej glukozy wymaganej do utrzymania glikemii; w miarę możliwości wskaźnik ten powinien zostać przedstawiony w formie wykresu w funkcji czasu, a nie jako pojedynczy punkt średniego czasu. Należy podać poziomy insuliny zarówno w stanie czczym, jak i w fazie clampu. Pomiary te potwierdzają, że insulina została skutecznie podana, i pozwolą wykryć wszelkie różnice w odpowiedzi insulinowej pomiędzy grupami badawczymi. Pomiar poziomu hematokrytu w punkcie wyjściowym, a następnie ponownie po zakończeniu procedury, zapewnia, że poziomy te nie spadły o więcej niż 5% wartości wyjściowej w trakcie trwania eksperymentu po przeprowadzeniu tej procedury.

Do oceny wykorzystania glukozy w całym organizmie oraz w konkretnych tkankach można zastosować inne metody, takie jak podanie izotopowych znaczników.