Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych
30 stycznia 2011
Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest utworzenie i zbadanie biofilmów w płytce mikrotitracyjnej. Osiąga się to poprzez dodanie kultury bakteryjnej do płytki 96-dołkowej. Następnie kulturę inkubuje się w odpowiedniej temperaturze i przez określony czas, w zależności od rodzaju mikroorganizmu, w celu zabarwienia biofilmu.
Do każdej studni z bakteriami dodaje się fiolet krystaliczny, a następnie bakterie są przemywane. Na koniec wykonuje się zdjęcia studni i przeprowadza ilościowe określenie liczby bakterii. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące akumulację i tworzenie się biofilmów w czasie poprzez pomiar ilości fioletu krystalicznego.
Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona badaczom na szybką ocenę tworzenia biofilmu przez organizmy bakteryjne i grzybowe. Może ona zostać również skonfigurowana do wysokoprzepustowych przesiewów genetycznych lub do identyfikacji nowych związków terapeutycznych hamujących tworzenie biofilmu. Przygotować pięciomililitrową kulturę nocną szczepu Pseudomonas typu dzikiego, aerogen lub szczepu mutantowego.
W podłożu LB rozcieńcz 10 µL kultury w jednym ml świeżego, minimalnego podłoża M 63 uzupełnionego o magnez, siarczan, glukozę i kwasy kasino. Następnie za pomocą pipety przenieś 100 µL rozcieńczonej kultury do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez okres od 4 do 24 godzin, aby umożliwić wzrost biofilmu.
Po uformowaniu się biofilmów należy wyjąć płytkę z inkubatora i usunąć nadsączki hodowlane poprzez odwrócenie płytki i wytrząśnięcie cieczy. Następnie należy delikatnie zanurzyć płytkę w małej kuwecie z wodą, aby wypłukać wszelkie pozostałe niezwiązane komórki lub składniki pożywki, które mogłyby spowodować barwienie tła. Należy wytrząsnąć wodę, osuszyć płytkę i powtórzyć proces płukania.
Po oczyszczeniu płytki należy dodać 125 µL do każdego dołka 0,1% roztworu fioletu krystalicznego. Aby zabarwić komórki, inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut.
Następnie wypłucz płytkę trzy lub cztery razy, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po ostatnim płukaniu energicznie osusz płytkę, przykładając ją do stosu ręczników papierowych w celu usunięcia nadmiaru cieczy, a następnie odwróć płytkę do góry dnem i pozostaw do wyschnięcia na kilka godzin. Gdy płytka wyschnie, dożewki można sfotografować aparatem cyfrowym, aby ocenić jakość biofilmów.
Jak pokazano tutaj, bakterie ruchliwe, takie jak Pseudomonas aerogenes po lewej i Pseudomonas fluorescence po prawej, mają tendencję do tworzenia biofilmu w miejscu styku fazy powietrznej i ciekłej podczas jego wzrostu. Z kolei bakterie Staphylococcus aureus, które są nieruchome, tworzą biofilmy na dnie studzienek. Aby przeprowadzić ilościowe oznaczenie biofilmów, należy najpierw dodać 125 µL 30% kwasu octowego do każdej studzienki, w tym do studzienki kontrolnej zawierającej sam kwas octowy, a następnie inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut, aby umożliwić rozpuszczenie fioletu krystalicznego zatrzymanego w biofilmach.
Następnie przenieś 125 µL rozpuszczonego barwnika z każdej studni do nowej 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem. Za pomocą czytnika płytek zmierz absorbancję w każdej studni przy długości fali 550 nm. Stężenie fioletu krystalicznego w każdej studni jest proporcjonalne do liczby komórek w biofilmie.
Wykres ten przedstawia ilościowe określenie tworzenia i akumulacji biofilmu przez Pseudomonas fluorescence w czasie podczas inkubacji w temperaturze 37 °C. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat przeprowadzania testu biofilmu na płytce 96-dołkowej, stosowanego w połączeniu z innymi metodami, takimi jak mikroskopia. Może on w znacznym stopniu przyczynić się do zrozumienia procesu tworzenia biofilmu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy test opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby z wykorzystaniem płytki mikrotitracyjnej. Biofilm jest wizualizowany za pomocą barwienia fioletem krystalicznym, co umożliwia zarówno analizę jakościową, jak i ilościową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Badania nad biofilmem
- Opracowywanie testów
Wstęp
- Biofilmy są społecznościami mikroorganizmów przylegającymi do powierzchni.
- Badanie tworzenia się biofilmu jest kluczowe dla zrozumienia zachowania drobnoustrojów.
- Fiolet krystaliczny jest powszechnie stosowanym barwnikiem do wizualizacji biofilmu.
- Ta metoda umożliwia szybką ocenę rozwoju biofilmu.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego testu w celu wykrywania wczesnego tworzenia się biofilmu.
- Ilościowe określenie akumulacji biofilmu w czasie.
- Ułatwienie badania interakcji mikrobiologicznych w biofilmach.
Zastosowane metody
- Przenieść kulturę bakteryjną na 96-dołkową płytkę mikrotitrującą.
- Inkubować kulturę w odpowiedniej temperaturze i czasie.
- Dodać fiolet krystaliczny w celu zabarwienia biofilmu.
- Przemyć dołki i wykonać dokumentację fotograficzną w celu ilościowego oznaczenia tworzenia biofilmu.
Główne wyniki
- Wyniki wykazują akumulację biofilmów w czasie.
- Dane ilościowe można uzyskać z pomiarów fioletem krystalicznym.
- Analiza zapewnia wyraźną wizualizację tworzenia się biofilmu.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu wczesnego etapu tworzenia się biofilmu.
- Można ją zastosować w odniesieniu do różnych gatunków bakterii i grzybów.
- Analiza ta pozwala na lepsze zrozumienie dynamiki mikrobiologicznych biofilmów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test tworzenia biofilmu w płytce mikrotitracyjnej umożliwia szybką, wysokoprzepustową ocenę wczesnych etapów rozwoju biofilmu, co wspiera walidację celów w poszukiwaniu nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Poprzez ilościowe określanie akumulacji biofilmu za pomocą barwienia fioletem krystalicznym, metoda ta dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych, które pomagają w ocenie ryzyka związanego z kandydatami na leki ukierunkowane na adhezję i przetrwanie drobnoustrojów. To skalowalne podejście jest stosowalne w układach bakteryjnych i grzybiczych, ułatwiając wczesne przesiewanie związków modulujących biofilm.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez identyfikację genów i czynników niezbędnych do inicjacji biofilmu, takich jak adhezyny, piliny oraz szlaki cyclic-di-GMP.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez badania przesiewowe utraty funkcji w szczepach drobnoustrojów w standaryzowanych warunkach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję związków z portfolio poprzez odróżnienie tych, które hamują wczesne tworzenie biofilmu, od tych, które nie wykazują żadnego działania.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy mikrobiologiczne do późniejszego screeningu związków poprzez ustalenie powtarzalnych parametrów tworzenia biofilmu.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje problem standaryzacji testów poprzez ujednolicenie etapów inkubacji, barwienia i kwantyfikacji z wykorzystaniem formatu płytek 96-dołkowych.
- Skalowalność: Podkreśla gotowość do screeningu oraz możliwość ponownego wykorzystania platformy do badań genetycznych i analiz bibliotek związków w odniesieniu do wielu szczepów mikrobiologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Łączy dane dotyczące wczesnego tworzenia się biofilmu z profilami oporności fenotypowej, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka w poszukiwaniu wiodących kandydatów na środki przeciwdrobnoustrojowe.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie hamowania biofilmu in vitro z tolerancją na antybiotyki i efektory immunologiczne.
- Dopasowanie biomarkerów: Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych dzięki mierzalnym wynikom korelującym z fenotypami tolerancji związanej z biofilmem.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od identyfikacji celu po optymalizację związku wiodącego, w szczególności w ramach programów przeciwinfekcyjnych ukierunkowanych na oporność pośredniczoną przez biofilm.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków adhezji mikrobiologicznej i tworzenia biofilmu poprzez perturbacje genetyczne i chemiczne.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu poprzez standaryzowane tworzenie biofilmu i ilościowe oznaczanie fioletem krystalicznym, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Wskazuje na ilościowe pomiary absorbancji przy 550 nm, które pozwalają na porównanie biomasy biofilmu w różnych warunkach i szczepach.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne dane dotyczące inhibicji biofilmu z istotnością przedkliniczną poprzez modelowanie mechanizmów tolerancji obserwowanych w przewlekłych infekcjach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Pozycjonuje metodę jako wielokrotnego użytku platformę przesiewową dla programów przeciwbakteryjnych, przeciwgrzybiczych i przeciwbiofilmowych w wielu modelach patogenów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna w walidacji celu poprzez mierzalną redukcję tworzenia biofilmu po interwencji genetycznej lub farmakologicznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność w formatach 96-dołkowych dla zastosowań wysokoprzepustowych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go w identyfikacji wiodących związków poprzez redukcję wyników fałszywie dodatnich dzięki ortogonalnej kwantyfikacji biofilmu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zależne od dawki hamowanie wczesnego tworzenia biofilmu.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga wiedzy mikrobiologicznej w zakresie technik sterylnych, przygotowywania kultur i pracy z biofilmem.
- Zależny od dostępu do czytników płytek umożliwiających pomiar absorbancji przy 550 nm oraz standardowych 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych.
- Wymaga standaryzacji czasu inkubacji, etapów płukania i protokołów barwienia pomiędzy zespołami w celu zminimalizowania zmienności międzydołkowej.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy rozszerzeniu metody na organizmy niedokładne lub grzyby o odmiennych właściwościach adhezyjnych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak brak możliwości modelowania architektury dojrzałego biofilmu lub fenotypów zależnych od przepływu, zgodnie z treścią źródłową.
