Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Celem niniejszego protokołu wideo jest izolacja i ekspansja neurogennych komórek macierzystych z embrionalnego mózgu myszy z wykorzystaniem testu neurosferycznego. Procedura obejmuje pobieranie embrionów myszy w 14. dniu rozwoju (E 14), a następnie mikrodysekcję mózgu w celu wyizolowania eminencji zwojowych, dysocjację pobranej tkanki w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek i na koniec wysianie komórek do hodowli neurosferycznej. Cześć, jestem Hassan Ali z laboratorium dr. Brenta Frennelsa w Mite Brain Institute na Uniwersytecie Florydy.

Dzisiaj pokażę Państwu, jak ustanowić hodowlę neurosfer z zarodkowego mózgu myszy, wykorzystując test neurosfer. W naszym laboratorium rutynowo stosujemy ten test w celu izolacji i ekspansji komórek macierzystych układu nerwowego. Zatem zacznijmy.

Zanurzyć w środku znieczulającym mysz w ciąży. W 14. dniu ciąży przeprowadzić zwichnięcie szyi i wypłukać jamę brzuszną 70% etanolem. Chwycić skórę nad brzuchem za pomocą dużych pincet, a następnie przeciąć skórę i leżącą pod nią powięź dużymi nożyczkami.

Aby odsłonić jamę brzuszną i rogi macicy, należy usunąć rogi macicy zawierające zarodki i przenieść je do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej zimny hem. Po przeniesieniu tkanek macicy do komory z laminarnym przepływem powietrza typu PC two, należy usunąć hem z probówki 50 ml i wypłukać tkanki wystarczającą ilością świeżego zimnego hem, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak krew i sierść; należy przeprowadzić w ten sposób dwa do trzech płukań. Następnie tkanki macicy należy przenieść do szalki Petriego o średnicy 10 cm zawierającej zimny hem.

Otwórz rogi macicy za pomocą małych zakrzywionych pęset i nożyczek, a następnie przenieś embriony do nowej szalki zawierającej zimne HEM. Powtarzaj tę procedurę do czasu zebrania wszystkich embrionów. Następnie umieść embriony pod mikroskopem stereoskopowym.

Oddziel głowy embrionów na poziomie rdzenia kręgowego szyjnego i przenieś je do drugiej szalki Petriego zawierającej zimny roztwór hem. Przytrzymaj głowę za pomocą cienkich zakrzywionych pęsety, używając mikronozyczek. Najpierw wykonaj cięcie poziome nad nosem, a następnie kontynuuj cięcie w linii środkowej od czoła w stronę tyłu głowy.

Należy upewnić się, że cięcie przechodzi przez skórę i czaszkę, nie uszkadzając leżącego poniżej mózgu. Wyjąć mózg z czaszki, odsuwając krawędzie wyciętego fragmentu ruchem w tył za pomocą pęsety zakrzywionej. Kontynuować tę procedurę, aż wszystkie mózgi zostaną usunięte z czaszek.

Unieruchom mózg za pomocą zakrzywionej pęsety tak, aby strona grzbietowa była skierowana ku górze, a następnie za pomocą mikronozyci wytnij korę każdej półkuli, prowadząc cięcie od opuszek węchowych do tylnej części półkuli. Aby odsłonić wyniesienia zwojowe, trzymając mózg w jednej pozycji, wypreparuj całe wyniesienie zwojowe za pomocą pęsety wygiętej pod kątem 45 stopni i przenieś je do drugiej szalki Petriego. Wyniesienie zwojowe jest tutaj wyraźnie widoczne wraz z jego częścią przyśrodkową i boczną.

Alternatywnie można wypreparować wyniosłości zwojowe, usuwając otaczające tkanki za pomocą precyzyjnej pęsety. Można również przeciąć całą wyniosłość na połowę przyśrodkową i boczną, jeśli planuje się hodowlę komórek z którejkolwiek z tych stron.

Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie mózgi zostaną poddane mikrodysekcji. Użyj 1 ml pożywki dla neuralnych komórek macierzystych do zebrania fragmentów tkanki i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Pozostaw grudki tkanki w probówce 15 ml do osadzenia, aby nie pozostawić żadnej tkanki w naczyniu.

Odessać część medium z supernatantu i wypłukać dno szalki Petriego, aby przenieść pozostałe fragmenty tkanki do probówki 15 ml. Przyłożyć końcówkę pipety do dna probówki. Pipetować zawiesinę w górę i w dół trzy do czterech razy, aby rozbić tkankę i uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.

Następnie pozostawić zawiesinę do odstania przez jedną minutę, aby niepowiązane grudki osiadły, a następnie przenieść prawie całą zawiesinę komórkową do drugiej probówki o pojemności 15 ml. Do pozostałych grudek dodać jeden mililitr pożywki dla neuroblastów i zdysocjować je do pojedynczych komórek. Zebrać zawartość probówek.

Następnie odwirować zawiesinę przy 700 RPM lub 110 G przez pięć minut. Usunąć nadsącz i resuspenderć komórki w jednym mililitrze pełnej pożywki dla neuroblastów. Pobrać 10 µL zawiesiny komórkowej i dokładnie wymieszać z 90 µL błękitu trypanu.

Następnie pobierz 10 µL tej zawiesiny i przenieś ją do cytometru hematologicznego. Wykonaj zliczenie komórek. Przenieś łącznie 20 ml kompletnej pożywki dla neuralnych komórek macierzystych do probówki stożkowej o pojemności 50 ml w celu wysiania jednej kolby T 80.

Następnie wymieszać zawiesinę komórkową i dodać odpowiednią liczbę komórek, aby uzyskać całkowitą gęstość 200 000 komórek na mililitr lub 4 miliony komórek na kolbę T 80. Dodać EGF do końcowego stężenia 20 nanogramów na mililitr. Wymieszać komórki znajdujące się w pełnej pożywce dla neuralnych komórek macierzystych z czynnikiem wzrostu, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do kolb T 80.

Oznakuj kolbę i obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek bez grudek tkankowych. Przenieś kolbę do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na pięć do siedmiu dni. Po upływie pięciu do siedmiu dni oceń stan zawartości kolby pod mikroskopem.

Do tego czasu powinny uformować się neurosfery o średnicy od 150 do 200 mikronów, gotowe do subkultury. Zawartość kolby zebrać do sterylnej probówki do hodowli tkankowej o odpowiedniej pojemności, odwirować i usunąć nadsącz. Resuspendować sfery w 1 ml podgrzanej trypsyny i umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na dwie minuty.

Następnie należy dodać taką samą objętość inhibitora trypsyny i wymieszać dokładnie, lecz delikatnie, aby zahamować aktywność trypsyny. Ponownie odwiruj próbkę i usuń nadsącz. Następnie resuspenduj komórki w 1 ml pełnej pożywki dla neuralnych komórek macierzystych i przeprowadź zliczenie komórek, zgodnie z wcześniejszym opisem. W celu wysiania jednej kolby T 175, przenieś łącznie 40 ml pełnej pożywki dla neuralnych komórek macierzystych do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.

Następnie wymieszać komórki i dodać odpowiednią ich ilość, aby uzyskać całkowitą gęstość 50 000 komórek na M lub 2 miliony komórek na kolbę T 1 75. Następnie dodać EGF do stężenia końcowego 20 nanogramów per mil. Wymieszać komórki znajdujące się w pełnej pożywce dla neuralnych komórek macierzystych z czynnikiem wzrostu i przenieść zawiesinę komórkową do kolby T 1 75.

Oznakuj kolbę i przenieś ją do inkubatora na okres od pięciu do siedmiu dni. Jest to przykład pierwotnej hodowli komórek macierzystych neuronów E 14. Strzałki wskazują proliferujące skupiska komórek macierzystych neuronów trzy dni po wysianiu.

Można również zauważyć komórki przytwierdzone do podłoża i zróżnicowane. Jest to przykład pierwotnej hodowli komórek macierzystych neuronów E 14 siedem dni po wysianiu. Jak widać, występują sfery o różnych rozmiarach.

Występują również komórki zróżnicowane. Ilość zanieczyszczeń jest znacznie mniejsza niż w przypadku pierwotnych sfer neuronowych dorosłych osobników. Ponadto sfery nie są zbite i posiadają mikrokolce wokół obwodu, co wskazuje na to, że sfery są zdrowe i żywotne.

Nie należy dopuszczać do zbyt dużego wzrostu sfer, ponieważ mogą one przybrać ciemny kolor w wyniku obumierania komórek w centrum. Duże sfery mogą również przytwierdzić się do podłoża i ulec różnicowaniu. Jest to przykład neurosfer E 14 z pierwszego pasażu pięć dni po wysianiu.

Tutaj ponownie można dostrzec mikrokolce na obwodzie sfer. Właśnie pokazaliśmy, jak hodować neurosfery z eminencji zwojowych myszy w 14. dniu embrionalnym (E 14), stosując te same procedury, które zostały tutaj opisane. Neurosfery można hodować również z innych obszarów mózgu, takich jak kora i śródmózgowie.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w hodowli neurosfer.