Name: Ustanowienie embrionalnej hodowli nerwowych komórek macierzystych myszy za pomocą testu neurosfery (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T20:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Poznaj metodę neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych układu nerwowego z mózgu myszy embrionalnej. Technika ta umożliwia badanie właściwości komórek nerwowych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana ze środków Overstreet Foundation.

1. Podstawowe przygotowanie przed przystąpieniem do sekcji:
<ol>
<li>Odpowiednią objętość pełnej pożywki NSC przygotowuje się poprzez zmieszanie NeuroCult NSC Basal Medium oraz NeuroCult NSC Proliferation Supplements w stosunku odpowiednio 9:1.</li>
<li>Pożywkę ogrzewa się w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.</li>
<li>Zimną, buforowaną HEPES minimalną pożywkę niezbędną (HEM) z wysokim stężeniem antybiotyków (10%) przygotowuje się do celów sekcji i przemywania. Alternatywnie, do tego celu można użyć bazowej pożywki NSC z dodatkiem antybiotyków.</li>
<li>25-30 mL zimnej pożywki HEM zawierającej antybiotyki przelewa się do sterylnych probówek o pojemności 50 mL w celu zbierania embrionów.</li>
<li>Kilka plastikowych szalek Petri o średnicy 10 cm jest niezbędnych do trzymania embrionów i mózgów podczas sekcji, a także do umieszczania wypreparowanej tkanki.</li>
<li>Narzędzia chirurgiczne potrzebne do usuwania embrionów (duże nożyczki, małe nożyczki z ostrzem, duża pęseta, mała pęseta zakrzywiona) lub do sekcji embrionalnego mózgu (mała pęseta, zakrzywiona pęseta precyzyjna, pęseta precyzyjna pod kątem 45° oraz małe nożyczki) sterylizuje się w sterylizatorze szklanym w temperaturze 250°C lub za pomocą innych dostępnych metod autoklawowania.</li>
<li>Mikroskop sekcyjny przeciera się 70% alkoholem i ustawia wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza lub dygestorium klasy PC2.</li>
</ol>
2. Pobieranie mózgu myszy w stadium E14 i mikrodysekcja:
<ol>
<li>Myszkę w ciąży po kontrolowanym kryciu znieczula się w 14th dniu gestacji zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję protokołem dotyczącym zwierząt.</li>
<li>Wykonuje się zwichnięcie szyi, aby upewnić się, że zwierzę nie odczuwa bólu i stresu.</li>
<li>Znieczuloną myszkę kładzie się na plecach na chłonnym papierze tkankowym, a brzuch płucze 70% etanolem w celu sterylizacji obszaru.</li>
<li>Skórę nad brzuchem chwyta się dużym pincetem, a następnie skórę i leżącą pod nią powięź przecina się dużymi nożyczkami, aby odsłonić jamę brzuszną i rogi macicy.</li>
<li>Macice usuwa się małym pincetem i nożyczkami, a następnie przenosi do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej zimny roztwór HEM.</li>
<li>Tkanki macicy przenosi się pod dygestorium, a następnie płucze raz lub dwa razy odpowiednią objętością świeżego, sterylnego, zimnego roztworu HEM, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia, takie jak krew i sierść.</li>
<li>Tkanki macicy przenosi się następnie do szalki Petriego o średnicy 10 cm zawierającej zimny roztwór HEM.</li>
<li>Rogi macicy otwiera się za pomocą małego zakrzywionego pinceta i nożyczek, a zarodki przenosi do nowej szalki o średnicy 10 cm zawierającej zimny roztwór HEM.</li>
<li>Głowy zarodków oddziela się na poziomie rdzenia kręgowego szyjnego i przenosi do kolejnej szalki Petriego zawierającej zimny roztwór HEM.</li>
<li>Szalkę Petriego przenosi się pod mikroskop sekcyjny, aby usunąć mózg z czaszki.</li>
<li>Głowy utrzymuje się za pomocą cienkiego zakrzywionego pinceta od strony ogonowej w taki sposób, aby strona grzbietowa głowy była skierowana do góry. Za pomocą mikronożyczek wykonuje się najpierw cięcie poziome nad oczami, a następnie kontynuuje je w linii środkowej od czoła w stronę tyłu głowy. Należy upewnić się, że cięcie przechodzi przez skórę i czaszkę, nie uszkadzając leżącego poniżej mózgu.</li>
<li>Mózg usuwa się z czaszki, przesuwając krawędzie nacięcia ruchem wstecznym za pomocą zakrzywionego pinceta. Procedurę tę kontynuuje się do momentu usunięcia wszystkich mózgów z czaszek.</li>
<li>Mózg unieruchamia się za pomocą zakrzywionego pinceta tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, a następnie za pomocą mikronożyczek wykonuje się cięcie przez korę każdej półkuli, rozciągające się od opuszki węchowej do tyłu półkuli, aby odsłonić wyniesienia zwojowe.</li>
<li>Używając zakrzywionego pinceta w jednej ręce i pinceta pod kątem 45° w drugiej, rozsuwa się nacięte płaty kory i wycina wyniesienia zwojowe.</li>
<li>Wyciętą tkankę umieszcza się w sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm i powtarza tę procedurę, aż wszystkie mózgi zostaną poddane mikrodysekcji.</li>
<li>Fragmenty tkanki zbiera się za pomocą 1 mL pożywki NSC w końcówce pipety 1 mL i przenosi do probówki wirówkowej 15 mL.</li>
<li>Tkankę dysocjuje się następnie dokładnie, ale delikatnie, dociskając końcówkę pipety do dna probówki i pipetując zawiesinę w górę i w dół. W ten sposób grudki zostają rozbite na pojedyncze komórki. Pipetowanie wykonuje się 3-4 razy, aż do uzyskania zawiesiny o mlecznym wyglądzie. Następnie pozostawia się zawiesinę na 1-2 minuty, aby niedysocjowane grudki osiadły.</li>
<li>Prawie całą zawiesinę komórkową przenosi się do drugiej probówki, a następnie do pozostałych grudek dodaje kolejne 1 mL pożywki NSC i dysocjuje je do pojedynczych komórek w opisany sposób.</li>
<li>Zawartość probówek łączy się i wiruje przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy 700rpm (110g).</li>
<li>Nadsącz odsysa się próżniowo do poziomu osadu, a komórki resuspenduje w 1 mL kompletnej pożywki NSC.</li>
<li>Pożywkę delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
<li>10 μL zawiesiny komórkowej miesza się z 90 μL błękitu trypanu w celu wykonania obliczeń liczby komórek.</li>
<li>Na koniec komórki wysiewa się w zagęszczeniu 2x105 cells/ mL w kompletnej pożywce NSC uzupełnionej o 20ng/ mL epidermal growth factor (EGF). Do kolb T25 stosuje się 5 mL pożywki, do T75 20 mL, a do T175 40 mL.</li>
<li>Neurosfery formują się w ciągu 5-7 dni podczas inkubacji w 37° C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2. Po 6-7 dniach sfery powinny mieć rozmiar od 150-200 mikronów i będą gotowe do subkultury (pasażowania).</li>
</ol>
3. Pasażowanie i ekspansja embrionalnych NSCs:
<ol>
<li>Gdy neurosfery są gotowe do subkultury (średnica 150-200 μm), medium z zawieszonymi sferami usuwa się z kolb, przenosi do sterylnej probówki do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości i wiruje przy 700 rpm (110 g) przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Nadsadewkę odrzuca się, a sfery resuspenduje w 1 mL 0,05% trypsyny-EDTA.</li>
<li>Zawiesinę komórkową inkubuje się następnie w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 2-3 min, po czym stosuje się równą objętość inhibitora trypsyny z soi w celu zatrzymania aktywności trypsyny.</li>
<li>Zawiesinę komórkową delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby upewnić się, że trypsyna została całkowicie zniesiona.</li>
<li>Zawiesinę komórkową wiruje się przy 700 rpm (110g) przez 5 min. Następnie usuwa się nadsadewkę, a komórki resuspenduje w 1 mL kompletnego medium NSC.</li>
<li>10 μL zawiesiny komórkowej miesza się z 90 μL błękitu trypanu w celu wykonania posiewu komórek.</li>
<li>Komórki wysiewa się w stężeniu 5x104 komórek/mL w kompletnym medium NSC uzupełnionym o 20ng/mL EGF do kolby do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości. Do kolb T25 stosuje się 5 mL medium, do kolb T75 20 mL, a do kolb T175 40 mL.</li>
<li>Wtórne neurosfery tworzą się w ciągu 5-7 dni podczas inkubacji w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
W pierwotnej hodowli embrionalnych NSC większość komórek stanie się hipertroficzna i przywrze do naczyń hodowlanych po wysianiu. Choć większość komórek obumrze lub ulegnie różnicowaniu, po 2-3 dniach komórki proliferujące tworzą małe skupiska, które oddzielają się od podłoża (Rycina 1). Powstawania dużych agregatów sferoidalnych w ciągu pierwszych 48 godzin hodowli nie należy mylić z sferami pierwotnymi. Tworzenie się agregatów zależy głównie od ilości zanieczyszczeń i nierozwiązanych grudek tkanki w hodowli. Prawdziwe neurosfery są jasne w kontraście fazowym i stają się bardziej sferyczne wraz ze wzrostem rozmiaru (Rycina 2). Na zewnętrznej powierzchni żywotnych i zdrowych sfer pojawiają się małe wypustki (Rycina 3). Po 5-7 dniach sfery powinny być okrągłe, ale nie zbite, a ich średnica powinna wynosić od 150 do 200 μm. Jeśli dopuści się do zbyt dużego wzrostu neurosfer (po 9-10 dniach hodowli), mogą one tworzyć agregaty lub ciemnieć z powodu obumierania komórek w centrum sfer (patrz wideo). Duże neurosfery mogą z czasem zacząć różnicować się in situ (przywierając do podłoża i migrując ku peryferiom). Trudne jest również dysocjowanie dużych neurosfer w celu ich pasażowania.
<img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig1.jpg" alt="Kultura komórkowa pokazująca pączkowanie komórek drożdży, mikroskopia w świetle przechodzącym, tworzenie kolonii, rozmnażanie bezpłciowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Podstawowa kultura NSC E14 3 dni po wysianiu. Strzałki wskazują proliferujące skupiska NSC. Powiększenie oryginalne; 20x
<img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig2.jpg" alt="Sferoidy hodowli komórkowej pod mikroskopem, pokazujące trójwymiarowy wzrost komórek, obraz mikroskopowy, badania laboratoryjne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Pierwotna hodowla NSC E14 7 dni po wysianiu. Powiększenie oryginalne; 10x
<img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig3.jpg" alt="Grupowanie komórek, obraz mikroskopowy, sferoidy nowotworowe, badania, badanie raka, analiza biologiczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Neurosfery E14 z pierwszego pasażu 5 dni po wysianiu. Zwróć uwagę na mikrokolce (strzałki) na obwodzie sfer. Powiększenie oryginalne: 20x

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Craig, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+factor+expansion+of+endogenous+subependymal+neural+precursor+cell+populations+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain.</a> J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Test neurosfer jest preferowaną metodą izolacji i ekspansji neuralnych komórek macierzystych 1-5 ze względu na swoją prostotę i powtarzalność. Badanie to stanowi nieocenione narzędzie do wielkoskalowej generacji niezróżnicowanych komórek prekursorowych OUN, które mogą być wykorzystane zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo. Należy podkreślić, że neurosfery mogą powstawać zarówno z rzeczywistych neuralnych komórek macierzystych, jak i z bardziej ograniczonych progenitorów. W związku z tym...

<table><tbody><tr><td>Podłoże podstawowe NeuroCult NSC Basal Medium</td><td>Podłoże</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05700</td><td></td></tr><tr><td>Suplementy do proliferacji NeuroCult NSC Proliferation Supplements</td><td>Suplement do podłoża</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05701</td><td></td></tr><tr><td>%0.05 trypsyny-EDTA</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>*MEM</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41500-018</td><td>składnik HEM</td></tr><tr><td>*HEPES</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>składnik HEM</td></tr><tr><td>*Woda destylowana</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek</td><td>Sito</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T25</td><td>Naczynie hodowlane</td><td>Nalge Nunc international</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T80</td><td>Naczynie hodowlane</td><td>Nalge Nunc international</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Naczynie hodowlane</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Naczynie hodowlane</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta zakrzywiona</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251&amp;#8208;35</td><td></td></tr><tr><td>Mała precyzyjna pęseta</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272&amp;#8208;30</td><td></td></tr><tr><td>Mała pęseta</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050&amp;#8208;10</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjne nożyczki</td><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Czynnik wzrostu</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2028-EG</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Czynnik wzrostu</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3139-FB</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Czynnik wzrostu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td>zrekonstytuowana w PBS</td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p class=&quot;jove_content">*Aby przygotować HEM, wymieszać opakowanie MEM 1&amp;#215;10L oraz 160ml 1M HEPES i uzupełnić objętość do 8.75 L za pomocą wody destylowanej. Ustawić końcowe pH na 7.4 i przechowywać w temperaturze 4&amp;#x00B0;C.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

U ssaków komórki macierzyste służą jako źródło niezróżnicowanych komórek, które zapewniają genezę i odnowę komórek w różnych tkankach i organach w ciągu całego życia zwierzęcia. Mogą one potencjalnie zastępować komórki utracone w procesie starzenia się organizmu, w wyniku urazów lub chorób. Istnienie neuralnych komórek macierzystych (NSCs) zostało po raz pierwszy opisane przez Reynoldsa i Weissa (1992) w dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) ssaka z wykorzystaniem nowatorskiego systemu hodowli bezsurowiczej, czyli testu neurosferycznego (NSA). Zastosowanie tego testu umożliwia również izolację i namnażanie NSCs z różnych obszarów embrionalnego CNS. Namnażane in vitro NSCs są wielopotencjalne i mogą dawać początek trzem głównym typom komórek CNS. Choć NSA wydaje się stosunkowo proste w wykonaniu, wymagana jest dbałość o procedury zaprezentowane w niniejszym materiale, aby uzyskać wiarygodne i spójne wyniki. W tym filmie praktycznie zaprezentowano metodę NSA w celu generowania i namnażania NSCs z tkanki mózgowej myszy w 14. dniu embrionalnym oraz podano szczegóły techniczne pozwalające na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer. Procedura obejmuje pobieranie embrionów myszy E14, mikrodysekcję mózgu w celu wyizolowania wyniesień zwojowych, dysocjację pobranej tkanki w medium do NSCs w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, a na koniec wysiew komórek do hodowli NSA. Po 5-7 dniach inkubacji otrzymane pierwotne neurosfery są pasażowane, aby dalej zwiększyć liczbę NSCs na potrzeby przyszłych eksperymentów.

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.

Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

U ssaków komórki macierzyste stanowią źródło niezróżnicowanych komórek, które zapewniają genezę oraz odnowę komórkową w różnych tkankach i narządach w ciągu całego życia...

Celem niniejszego protokołu wideo jest izolacja i ekspansja komórek macierzystych układu nerwowego z embrionalnego mózgu myszy z wykorzystaniem testu neurosfer. Procedura obejmuje pobranie embrionów myszy w 14 dniu rozwoju (E 14), a następnie mikrodysekcję mózgu w celu wyizolowania wybrzuszeń zwojowych, dysocjację pobranej tkanki w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek i na koniec wysianie komórek do hodowli neurosfer. Cześć, jestem Hassan Ali z laboratorium dr. Brenta Frennelsa w Instytucie Mózgu Uniwersytetu Florydy.Dzisiaj pokażę Państwu, jak prowadzić hodowlę neurosfer z zarodkowego mózgu myszy przy użyciu testu neurosfer. W naszym laboratorium rutynowo stosujemy tę metodę do izolacji i namnażania komórek macierzystych układu nerwowego. Zatem zacznijmy.Zanurz w znieczuleniu czasowo zapłodnioną mysz w ciąży. W 14. dniu gestacji wykonaj zwichnięcie szyi i opłucz brzuch 70% etanolem. Chwyć skórę nad brzuchem za pomocą dużych pęsety, a następnie przetnij skórę i leżącą pod nią powięź dużymi nożyczkami.Aby odsłonić jamę brzuszną i rogi macicy, należy usunąć rogi macicy zawierające zarodki i przenieść je do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej zimny hem. Po przeniesieniu tkanek macicy do komory z laminarnym przepływem powietrza klasy II, należy usunąć hem z probówki 50 ml i wypłukać tkanki wystarczającą ilością świeżego zimnego hemu, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak krew i sierść; należy powtórzyć ten proces dwa do trzech razy. Następnie tkanki macicy należy przenieść do szalki Petriego o średnicy 10 cm zawierającej zimny hem.Otwórz rogi macicy za pomocą małych zakrzywionych pincet i nożyczek, a następnie przenieś zarodki do nowej szalki zawierającej zimne hem. Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie zarodki zostaną pobrane. Następnie umieść zarodki pod mikroskopem stereoskopowym.Oddziel głowy embrionów na poziomie rdzenia kręgowego szyjnego i przenieś je do innej szalki Petriego zawierającej zimny hem. Przytrzymaj głowę za pomocą precyzyjnych zakrzywionych pęsety i użyj mikronoareczek. Najpierw wykonaj cięcie poziome powyżej nosa, a następnie kontynuuj cięcie w linii środkowej od czoła w stronę tyłu głowy.Należy upewnić się, że nacięcie przechodzi przez skórę i czaszkę, nie uszkadzając leżącego pod nimi mózgu. Wyjąć mózg z czaszki, przesuwając krawędzie naciętego fragmentu ruchem wstecznym za pomocą pęsety zakrzywionej. Powtarzać tę procedurę aż do momentu usunięcia wszystkich mózgów z czaszek.Przytrzymaj mózg nieruchomo za pomocą zakrzywionej pincety tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, a następnie za pomocą mikronozyciórek przetnij korę każdej półkuli od cebulek węchowych do tylnej części półkuli. Aby odsłonić eminencje zwojowe, trzymając mózg w jednej pozycji, wypreparuj całą eminencję zwojową za pomocą pincety kątowej 45 stopni i przenieś ją do innej szalki Petriego. Eminencja zwojowa jest tutaj wyraźnie pokazana wraz z jej częścią przyśrodkową i boczną.Alternatywnie można wypreparować grudki zwojowe, usuwając otaczające tkanki za pomocą precyzyjnej pęsety. Można również przeciąć całą grudkę na połowę przyśrodkową i boczną, jeśli planuje się hodowlę komórek z któregokolwiek z tych obszarów.Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie mózgi zostaną poddane mikrodysekcji. Użyj 1 ml pożywki dla neuralnych komórek macierzystych, aby zebrać fragmenty tkanki i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Pozostaw grudki tkanki w probówce 15 ml do osadzenia, aby nie pominąć żadnego fragmentu tkanki.Odssać część medium znad osadu i wypłukać dno szalki Petriego, aby przenieść resztę tkanki do probówki o pojemności 15 ml. Umieścić końcówkę pipety przy dnie probówki. Kilkakrotnie (od trzech do czterech razy) pobierać i wydmuchiwać zawiesinę, aby rozbić tkankę i uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.Następnie pozostawić zawiesinę na jedną minutę, aby niepowiązane grudki osiadły, a następnie przenieść prawie całą zawiesinę komórkową do kolejnej probówki o pojemności 15 ml. Do pozostałych grudek dodać jeden mililitr pożywki dla neuronowych komórek macierzystych i rozbić je do pojedynczych komórek. Zebrać zawartość probówek.Następnie odwiruj zawiesinę z prędkością 700 RPM lub przy 110 G przez pięć minut. Usuń nadsącz i ponownie zawieś komórki w 1 ml pełnej pożywki dla neuronowych komórek macierzystych. Pobierz 10 µL zawiesiny komórkowej i dokładnie wymieszaj z 90 µL błękitu trypanowego.Następnie pobierz 10 µL tej zawiesiny i przenieś ją do komory licznikowej (hemocytometru). Wykonaj zliczenie komórek. Przenieś łącznie 20 ml pełnej pożywki dla neuralnych komórek macierzystych do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, aby zasiać jedną kolbę T 80.Następnie wymieszaj zawiesinę komórkową i dodaj odpowiednią liczbę komórek, aby uzyskać całkowitą gęstość 200 000 komórek na mililitr lub 4 miliony komórek na kolbę T 80. Dodaj EGF do końcowego stężenia 20 nanogramów na mililitr. Wymieszaj komórki znajdujące się w pełnej pożywce dla neuralnych komórek macierzystych z czynnikiem wzrostu, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do kolb T 80.Oznakuj kolbę i obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że otrzymano zawiesinę pojedynczych komórek bez grudek tkanki. Przenieś kolbę do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na okres od pięciu do siedmiu dni. Po pięciu do siedmiu dniach oceń stan komórek w kolbie pod mikroskopem.Do tego czasu neurosfery powinny już powstać, osiągnąć średnicę od 150 do 200 mikronów i być gotowe do pasażowania. Przenieść zawartość kolby do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiednim rozmiarze, odwirować probówkę i usunąć supernatant. Resuspendować sfery w 1 ml podgrzanej trypsyny i umieścić probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na dwie minuty.Następnie dodać taką samą objętość inhibitora trypsyny i dokładnie, lecz delikatnie wymieszać, aby zatrzymać działanie trypsyny. Ponownie odwirować i usunąć supernatant. Następnie resuspenderć komórki w 1 ml kompletnego medium dla neuralnych komórek macierzystych i przeprowadzić liczenie komórek zgodnie z wcześniejszymi opisami. W celu wysiania komórek do jednej kolby T175, przenieść łącznie 40 ml kompletnego medium dla neuralnych komórek macierzystych do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Następnie wymieszaj komórki i dodaj odpowiednią ich liczbę, aby uzyskać całkowitą gęstość 50 000 komórek na M lub 2 milionów komórek na kolbę T 1 75. Następnie dodaj EGF do stężenia końcowego 20 nanogramów per mil. Wymieszaj komórki znajdujące się w pełnej pożywce dla neuralnych komórek macierzystych z czynnikiem wzrostu, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do kolby T 1 75.Oznakuj kolbę i przenieś ją do inkubatora na okres od pięciu do siedmiu dni. Jest to przykład pierwotnej hodowli komórek macierzystych układu nerwowego E 14. Strzałki wskazują proliferujące skupiska komórek macierzystych układu nerwowego trzy dni po wysiewie.Można również zauważyć komórki przytwierdzone do podłoża, które uległy różnicowaniu. Jest to przykład pierwotnej hodowli neuroblastów z zarodka E 14 siedem dni po wysianiu. Jak widać, obecne są sfery o różnych rozmiarach.Występują również komórki zróżnicowane. Ilość zanieczyszczeń jest znacznie mniejsza niż w przypadku pierwotnych sfer neuronowych dorosłych osobników. Ponadto sfery nie są zbite i posiadają mikrokolce na obwodzie, co świadczy o tym, że sfery są zdrowe i żywotne.Nie należy dopuścić do nadmiernego wzrostu sfer, ponieważ mogą one przybrać ciemny kolor na skutek obumarcia komórek w ich centrum. Duże sfery mogą również przytwierdzać się do podłoża i ulegać różnicowaniu. Jest to przykład neurosfer E 14 z pierwszego pasażu pięć dni po wysianiu.Tutaj ponownie można zauważyć mikrokolce na obwodzie sfer. Przedstawiliśmy sposób hodowli neurosfer z wyrostków zwojowych myszy w stadium E 14, stosując te same procedury, które zostały tutaj opisane. Neurosfery można hodować również z innych obszarów mózgu, takich jak kora mózgowa i śródmózgowie.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w hodowli neurosfer.

establishing-embryonic-mouse-neural-stem-cell-culture-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ustanowienie hodowli ludzkich komórek macierzystych rogówki za pomocą metody kulek nerwowych

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Niniejszy protokół wideo demonstruje sposób rozróżniania i zliczania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego w mieszanej populacji komórek prekursorowych układu nerwowego z wykorzystaniem testu tworzenia kolonii neuronalnych.

Test tworzenia kolonii neuronalnych: metoda różnicowania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego od komórek progenitorowych układu nerwowego

Niniejszy protokół wideo demonstruje nową metodę generowania i następnego oczyszczania neuronalnych komórek progenitorowych z odnawialnego źródła neuralnych komórek macierzystych (NSCs) w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i ziarnistość wewnętrzną) oraz fluorescencyjne, z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej.

Analiza neuroblastów: metoda generowania i wzbogacania populacji neuronalnych komórek progenitorowych z różnicujących się potomków neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Film pokazuje proces izolacji i hodowli nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej mózgu myszy. Polega na rozwarstwieniu tkanek, dysocjacji enzymatycznej i wyhodowaniu ich za pomocą czynników różnicujących, aby rozwinęły się w dojrzałe komórki nerwowe.

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Ten film demonstruje szczegółowy protokół izolowania ścian bocznych komór od mózgu dorosłej myszy i przeprowadzania enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu uzyskania pojedynczych komórek. Komórki te są następnie poddawane specyficznym warunkom hodowli, które selektywnie zwiększają proliferację nerwowych komórek macierzystych i promują ich różnicowanie w kokultury oligodendrocytów i astrocytów.

Uzyskiwanie mieszanej kultury oligodendrocytów i astrocytów z dorosłych komórek macierzystych nerwowych myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) odnoszą się do komórek, które mogą samoodnawiać się i różnicować w trzy linie nerwowe. W tym miejscu opisujemy protokół określania częstości NSC w danej populacji komórek za pomocą tworzenia i różnicowania neurosfery w warunkach klonalnych.

Liczenie nerwowych komórek macierzystych za pomocą testów klonalnych

Tutaj demonstrujemy działanie modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u dorosłej myszy, która oszczędza centralną niszę kanałową, w której znajdują się endogenne nerwowe komórki macierzyste (NSC). Pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do ilościowego określenia aktywacji i migracji ostatecznych i pierwotnych NSC po urazie.

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół generowania kultur neurosfery z pourodzeniowych mysich nerwowych komórek macierzystych pochodzących z głównych nisz neurogennych myszy. Neurosfery służą do identyfikacji nerwowych komórek macierzystych z tkanki mózgowej, co pozwala na oszacowanie liczby komórek prekursorowych. Co więcej, te struktury 3D mogą być powlekane w warunkach różnicowania, dając początek neuronom, oligodendrocytom i astrocytom, umożliwiając badanie losu komórek.

Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Poznaj metodę neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych układu nerwowego z mózgu myszy embrionalnej. Technika ta umożliwia badanie właściwości komórek nerwowych in vitro.

Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Przeglądaj więcej filmów