Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie rozkładu oraz ocena skuteczności terapeutycznej nanocząstek znakowanych magnetycznie lub sformułowanych z lekiem. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wytworzenie cząstek, przetestowanie ich właściwości biologicznych pod kątem poboru przez komórki w laboratoryjnych systemach modelowych, a następnie wstrzyknięcie sformułowań obciążonych komórkami i ocenę ich rozkładu w tkankach za pomocą obrazowania biologicznego. Dotknięte obszary mózgu zostały zwizualizowane przed i po wstrzyknięciu makrofagów pochodzenia monocytarnego zainfekowanych wirusem.

Drugim krokiem procedury jest obrazowanie podregionów mózgu zawierających nanocząstki z obciążeniem komórkowym, znakowane magnetycznie lub terapeutyczne. Jest to wykonywane w różnych odstępach czasu po wstrzyknięciu komórek zawierających nanocząstki znakowane magnetycznie lub leki w formie nanofarmaceutycznej. Trzecim krokiem procedury jest przeprowadzenie końcowej analizy histologicznej w celu oceny biodystrybucji nanocząstek oraz zmian komórkowych.

Współrejestracja wyników obrazowania jest przeprowadzana z histologią. Końcowym krokiem procedury jest ilościowe określenie i przedstawienie biodystrybucji nanocząsteczek, ustalenie nieprawidłowości spektroskopowych oraz ocena nieprawidłowości tensora dyfuzji w funkcji czasu po wykonaniu iniekcji komórek. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące biodystrybucję oraz wpływ na chemię mózgu i morfologię komórek występujący w konsekwencji terapeutycznego i diagnostycznego zastosowania nanomateriałów, przy wykorzystaniu obrazowania rezonansu magnetycznego i spektroskopii współrejestrowanych z analizami histologicznymi.

Witam, jestem dr. Michael Bosca, dyrektor Programu Bioobrazowania na University of Nebraska Medical Center. Niniejsza praca jest częścią trwającej współpracy pomiędzy moim laboratorium a laboratorium dr. Howarda Gendelmana. Główną zaletą obrazowania nieinwazyjnego w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna czy nanocząsteczki fluorescencyjne, jest możliwość objęcia całego mózgu podczas jednego badania oraz możliwość prowadzenia badań podłużnych na tym samym zwierzęciu.

Ogranicza to zmienność biologiczną, wymaga mniejszej liczby zwierząt i w wielu przypadkach może zostać przełożone na zastosowania u ludzi. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii dotyczących nowo opracowanych nanocząsteczek, w tym profili biodystrybucji, farmakokinetyki oraz skuteczności terapeutycznej. Połączenie solidnych procedur obrazowania z korejestracją histologiczną jest unikalne i niezbędne do przeprowadzenia badań biodystrybucji rozdzielonych w czasie oraz badań skuteczności leków w złożonych zwierzęcych modelach chorób. Procedury te będą demonstrować technicy w moim laboratorium, Lindsey i Melissa, oraz stażysta podoktorski dr P. Są oni odpowiedzialni za pozyskiwanie danych obrazowych od zwierząt w laboratorium.

Aaron i Mariano odpowiadają za przetwarzanie obrazów, w tym obrazowanie tensora dyfuzji oraz korejestrację histologiczną. Dzień dobry, nazywam się dr Howard Delman i jestem kierownikiem Carol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratory na University of Nebraska Medical Center. Ta interdyscyplinarna współpraca z dr. Bascą i jego laboratorium ma szerokie znaczenie dla terapii i diagnostyki szeregu chorób neurodegeneracyjnych.

Nieprawidłowości w spektroskopii rezonansu magnetycznego oraz obrazowaniu tensora dyfuzji są wykorzystywane do monitorowania uszkodzeń neuronów i wypustek neuronalnych w przebiegu choroby. W obecnym projekcie metody te pozwalają na wgląd w skuteczność biodystrybucji nanoleków, takich jak rozkład leku w całym organizmie oraz skuteczność terapeutyczna w obrębie układu nerwowego. Opracowywany jest szereg technik wytwarzania cząstek, które mogłyby poprawić detekcję dystrybucji komórkowej podczas choroby, obejmujący modyfikacje rozmiaru, powłoki i ładunku cząstek.

Wszystkie te zagadnienia pozostaną aktywnymi obszarami badań w naszych laboratoriach. Po pierwsze, należy przygotować nanomateriały do dostarczania leków i biodystrybucji, co jest tematem równoległego artykułu w tym numerze. Najpierw odtwórz kandydujące nanoformulacje do zastosowań in vivo, zastępując rdzeń leku lub kroplę cząstką o identycznym rozmiarze bądź zmielonym fragmentem superparamagnetycznego tlenku żelaza przed pokryciem odpowiednim surfaktantem.

Następnie należy zmierzyć rozmiar, ładunek, kształt oraz cytotoksyczność, aby ustalić, czy modelowy układ SPIO posiada takie same właściwości jak kandydacki lek w formie nanoformułacji. Na koniec należy przeprowadzić testy ładowania komórkowego poprzez inkubację z kandydacką nanoformułacją modelową SPIO, aby określić aktywność wewnątrz komórek; w tym celu należy przygotować w trzech powtórzeniach fantomy składające się z znakowanych komórek zawieszonych w żelu agarowym, stosując szereg stężeń, aby ilościowo ocenić aktywność wynikającą z poboru SPIO przez komórki. Pozwala to uzyskać wskaźnik czułości i określić, czy nanoformulacje mogą wpływać na stan utlenienia, a tym samym na widoczność SPIO w badaniach obrazowych metodą rezonansu magnetycznego.

Przed rozpoczęciem skanowania umieść zwierzę w komorze anestezjologicznej wypełnionej wcześniej gazami anestetycznymi. Przyspieszy to indukcję znieczulenia i zminimalizuje czas potrzebny na zapewnienie, że zwierzę nie obudzi się po wyjęciu z komory. Po pełnym znieczuleniu wyjmij zwierzę z komory i umieść je w uchwycie stereotaktycznym wyposażonym w system monitorowania częstości oddechów i temperatury.

Umieść głowę zwierzęcia w uchwycie do głowy, zamocuj pręty uszne i przymocuj ciało za pomocą gazy. Uchwyt do zwierzęcia powinien być wyposażony w regulowany pręt zębowy, umożliwiający wyrównanie głowy w pionie i poziomie; upewnij się, że głowa jest prawidłowo ustawiona w kierunku rostralnym i nie jest obrócona. Sprawdź, czy cewka powierzchniowa jest prawidłowo rozmieszczona na głowie, umożliwiając obrót uchwytu do zwierzęcia.

Gdy zwierzę znajduje się w magnesie, zapewniona zostanie kompensacja niewielkich obrotów, które mogą występować w zależności od osobnika. Po zabezpieczeniu zwierzęcia w uchwycie, umieść uchwyt w skanerze MRI. Następnie przesuń uchwyt wraz z cewką powierzchniową do centrum skanera.

Do przesyłania energii RF w celu wytworzenia sygnału zastosowano aktywno rozsprzęglony rezonator o średnicy 72 mm, natomiast do odbioru sygnału wykorzystano cewkę głowową. Następnie wyznaczono pozycję początkową, stosując jednowymiarowy odczyt w czasie rzeczywistym w kierunku rostralnym. Zastosowanie odbioru za pomocą cewki powierzchniowej ogranicza sygnał do obszaru wokół cewki, co zmniejsza konieczność interpretacji obserwowanych przebiegów falowych.

Następnie wykonuje się lokalizator w trzech płaszczyznach, aby określić dokładną pozycję zwierzęcia w skanerze. W dalszej kolejności konieczne jest przeprowadzenie shimowania lub korekty homogeniczności pola magnetycznego. W tym celu stosujemy sekwencję wielokrotnego echa gradientowego oraz oprogramowanie do mapowania opracowane przez dr Hobie Heatheringtona, które dopasowuje obszary homogeniczności do regionu badanego przez każdą z poszczególnych metod obrazowania.

Po zakończeniu shimowania można przystąpić do akwizycji interesujących skanów. Biodystrybucję nanocząsteczek zawierających SPIO można wykryć jako obszary utraty sygnału w wysokorozdzielczych obrazach MRI ważonych T2*. Po pierwsze, przed wstrzyknięciem preparatu zwierzęciu, należy określić na podstawie skanów lokalizacyjnych (LOCALIZER) obszar mózgu do obrazowania. Następnie należy zaprogramować wysokorozdzielczą 3D sekwencję gradientową z echem powracającym o izotropowej rozdzielczości 150 mikronów.

Wykonaj skan bazowy, następnie podaj preparat zwierzęciu i ponownie wykonaj tę samą sekwencję. Równoległe badania w celu określenia skuteczności terapeutycznej nanoleków można przeprowadzić z wykorzystaniem obrazowania tensora dyfuzji oraz spektroskopii magnetyczno-rezonansowej wodoru. Najpierw wykonaj obrazy zwiadowcze S, a następnie przeprowadź shimowanie obszaru przeznaczonego do skanowania.

Następnie wykonano obrazowanie DTI z wykorzystaniem sekwencji obrazowania echo-planarnego z dyfuzją ważoną, z zastosowaniem spinowego echa bramkowanego oddechem w naszych skanach. Do kodowania dyfuzji wykorzystano zrównoważony, rotacyjnie zmienny schemat ISO cathedral z naprzemienną polaryzacją w 12 kierunkach; schemat kodowania został zaprojektowany w celu zredukowania sprzężeń gradientów dyfuzji tła. Całkowity czas akwizycji wynosił od 20 do 40 minut, w zależności od częstotliwości oddychania.

Następnie przeprowadź badanie MR-spektroskopowe. Zlokalizuj obszar zainteresowania na wcześniej uzyskanych obrazach, wykonaj shimming w wybranym obszarze, a następnie zoptymalizuj moc impulsów tłumienia sygnału wody. Zmierz częstotliwość wody, aby zapewnić rezonans sygnału wody, i uzyskaj krótkie widmo testowe w celu kontroli jakości, jeśli widma będą niewystarczającej jakości.

Sprawdzić ustawienia systemu, w tym częstotliwość radiową, moc oraz ustawienia shima. Na koniec zarejestrować widma w krótkich blokach, resetując częstotliwość systemu pomiędzy akwizycjami w celu wyeliminowania efektów dryftu pola magnetycznego. Po zakończeniu akwizycji.

Użyj widma pojedynczego impulsu wody jako zdefiniowanego wzmocnienia przedwzmacniacza w celu uzyskania ilościowego odniesienia amplitudy sygnału. Po ostatnim skanie MRI w serii przeprowadź perfuzję myszy, wyjmij mózg i zatop go w bloku związku OCT, który został przyciemniony za pomocą kropli tuszu indyjskiego. Następnie umieść ten blok w kriosztacie w celu wykonania cięć i analizy histologicznej.

Należy wykonać zdjęcia powierzchni bloku za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej z przodu kriostatu. Zdjęcia powinny być wykonywane co 50 µm przez całą objętość mózgu, aby umożliwić rejestrację przekrojów w obrębie tej objętości. Po obróbce histologicznej i barwieniu należy dopasować poszczególne przekroje powierzchni bloku w celu rekonstrukcji objętości 3D.

Wykorzystując kontury bloków w celu uwzględnienia drgań w pozycji głowicy kriostatu, należy automatycznie przeprowadzić segmentację objętości mózgu przy użyciu algorytmu region growing opartego na ziarnie w pakiecie oprogramowania analyze. Superparamagnetyczny tlenek żelaza powoduje utratę sygnału w obrazowaniu MRI ważonym T2*, w związku z czym ubytek sygnału MRI jest czułym, ale nieswoistym markerem jego obecności. Aby zapewnić zarówno czułość, jak i swoistość w wykrywaniu obecności SPIO w mózgu.

Dla potrzeb naszego badania z trójwymiarowych skanów MRI wykonanych przed i po iniekcji należy utworzyć obrazy różnicowe. Skanowanie podregionów (sub-imaging) przeprowadzono przy użyciu metody ograniczonego zbioru poziomów (constrained level set method) opracowanej w naszym laboratorium. Objętości podregionów mózgu zostały następnie zarejestrowane wspólnie, a intensywność sygnału znormalizowana; następnie wykonano odejmowanie objętości w celu wykrycia obszarów w mózgu z utratą sygnału, z wyłączeniem obszarów przy krawędziach, aby wyeliminować fałszywie dodatnie sygnały wynikające z błędów rejestracji na poziomie subpikselowym.

Następnie przeprowadza się korejestrację obrazów histologicznych i MRI, wykorzystując obraz powierzchni bloku jako wspólny punkt odniesienia. Dokładna kolokalizacja tych dwóch sygnałów stanowi miarę precyzji korejestracji oraz deformacji obrazów histologicznych do oryginalnych kształtów przekrojów. Skanowania DTI można analizować, rozpoczynając od wyboru anatomicznego obszaru zainteresowania (ROI), aby określić średnie właściwości dyfuzyjne tkanki w konkretnej podstrukturze anatomicznej.

W naszych badaniach analizy danych obrazowania dyfuzyjnego są następnie przeprowadzane przy użyciu specjalistycznych programów napisanych w języku IDL (interactive data language), udostępnionych przez dr Cada Hassana. Analizy te pozwalają na wygenerowanie map dyfuzyjności tensorowej, średniej dyfuzyjności oraz frakcyjnej anizotropii. Po utworzeniu map można również uzyskać komponenty poprzeczne i podłużne tensora dyfuzji.

Wyznacz obszary zainteresowania (ROI) na obrazach MRI ważonych czasowo T2 z nałożonymi kolorowymi mapami kierunkowości. Przedstawiono tutaj przykłady obszarów wybranych w naszych eksperymentach do analizy w mysim modelu HIV. Dane z każdego obszaru zainteresowania są pobierane w formie pliku tekstowego, aby w późniejszym czasie wprowadzić je do bazy danych.

Tutaj przedstawiono przykład wyniku dopasowania krzywej MRS z pojedynczego widma, uzyskanego w naszym laboratorium. Stosujemy metodę dopasowania w dziedzinie czasu zwaną Quest, zawartą w pakiecie do przetwarzania sygnałów J-M-R-U-I.

Program Quest dopasowuje widma, wykorzystując liniową kombinację widm poszczególnych metabolitów, aby przeprowadzić minimalizację metodą najmniejszych kwadratów pomiędzy widmem stymulowanym a rzeczywistym. Jako potencjalne czynniki wkładające wykorzystujemy zestaw bazy składającej się z 22 poszczególnych metabolitów. Widma bazowe są symulowane i walidowane z wykorzystaniem widm roztworów poszczególnych metabolitów.

Przykłady biodystrybucji makrofagów znakowanych SPIO z wykorzystaniem tych metod przedstawiono tutaj, gdzie nałożono na siebie lokalizację komórek znakowanych wykrytą za pomocą MRI (kolor czerwony), lokalizację komórek znakowanych przy użyciu zarejestrowanej histologii (kolor niebieski) oraz obszary pokrywania się obu metod (kolor żółty). Myszy wstrzyknięto do żyły ogonowej znakowane makrofagi pochodzące z monocytów. Pięć dni później wykonano obrazowanie MRI T2* i przetworzono dane zgodnie z opisem.

Myszy przygotowano poprzez wstrzyknięcie zainfekowanych HIV ludzkich makrofagów do mózgu, co widoczne jest jako linia wykrytych makrofagów pochodzenia monocytowego myszy. Dalsze przykłady zarówno detekcji znakowanych komórek, jak i korejestracji z badaniami histologicznymi można znaleźć w naszych poprzednich publikacjach. Producent cząsteczek oraz testowanie ich właściwości biologicznych w zakresie wychwytu przez komórki w laboratoryjnych systemach modelowych jest wymagane i musi być przeprowadzone zgodnie z procedurami sterylnymi w celu zastosowania w tych badaniach na zwierzętach.

Iniekcje formulacji zawierających komórki muszą być wykonane bez naruszenia dostępu do żyły, ponieważ wpłynie to na obszary mózgu i innych tkanek wizualizowanych w celu oceny integracji produktu biologicznego z wykorzystaniem technik obrazowania biomedycznego, a szeroka współpraca międzyzespołowa okazała się kluczowa dla sukcesu całego projektu. Po opanowaniu techniki procedury można ukończyć w ciągu dwóch godzin, zależnie od dostępności przeszkolonego personelu do przygotowania stanowiska i kalibracji systemów podczas wykonywania zabiegu. Ważne jest zachowanie sterylności, aby kruche myszy z niedoborami odporności pozostały żywe przez cały czas trwania badań seryjnych, z których niektóre mogą trwać wiele miesięcy.

Metody te stworzyły podstawy do badania związku między zmianami komórkowymi uwidocznionymi w badaniu histologicznym a wykrytymi nieprawidłowościami morfologicznymi, fizjologicznymi i biochemicznymi. Wykorzystanie metod neuroobrazowania w korejestracji histologii mózgu jest zadaniem trudnym i zostało zrealizowane jedynie przez kilka grup badawczych. Po obejrzeniu tego filmu.

Należy zrozumieć, w jaki sposób przeprowadza się eksperymenty obrazowania mózgu oraz jak dokonuje się ich korejestracji z badaniami histologicznymi na gryzoniu w modelu choroby. Metoda ta może być wykorzystana do pomiaru biodystrybucji superparamagnetycznych cząsteczek tlenku żelaza. Alternatywnie, MRI oraz lokalna spektroskopia MR mogą być stosowane do śledzenia neurodegeneracji występującej w przebiegu procesów chorobowych.

Następnie można seryjnie oceniać efekty terapeutyczne w celu złagodzenia uszkodzeń mózgu. Obrazowanie można stosować wraz z histologią w celu walidacji wyników eksperymentalnych. Ogólnie rzecz biorąc, metody te zapewnią dynamiczny i precyzyjny zestaw pomiarów dotyczących biodystrybucji nanocząstek oraz ich skuteczności terapeutycznej.