Name: Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę izolacji genomowego DNA z ogonów myszy, obejmującą pobieranie biopsji, zapobieganie zanieczyszczeniom oraz identyfikację osobników. Technika ta jest kluczowa dla badań genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style="margin-top: 0in">
<li>Odciąć fragmenty ogona (3mm) i oznaczyć uszy.</li>
<li>Dodać 720 ml STE oraz 30 ml Proteinazy K (roztwór stokowy 10 mg/ml).</li>
<li>Inkubować w 55°C na bloku grzejnym, mieszając w vortexie co godzinę przez 3 godziny z maksymalną prędkością przez 10 sekund.</li>
<li>Inaktywować proteinazę K w 70°C przez 5 minut.</li>
<li>Schłodzić na lodzie przez 5 minut.</li>
<li>Odwirować DNA z ogona przez&nbsp;10 minut z maksymalną prędkością.</li>
<li>Przelać do nowej probówki zawierającej 720 ml izopropanolu.&nbsp; </li>
<li>Wytrącić DNA poprzez odwracanie probówki lub mieszanie w vortexie.</li>
<li>Odwirować DNA przez 5 minut z maksymalną prędkością. Usunąć nadsącz.</li>
<li>Przemyć osad 70% etanolem.</li>
<li>Odwirować DNA genomowe przez 5 minut z maksymalną prędkością. Usunąć nadsącz.</li>
<li>Pozostawić DNA do wyschnięcia na 1-2 minuty.</li>
<li>Resuspendować DNA w 100-200 ml, zależnie od wielkości osadu.</li>
<li>Umieścić probówkę w 55°C na 1 godzinę, aby ułatwić rozpuszczanie DNA.&nbsp; </li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / w H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

izolacja genomowego dna z ogonów myszy

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy

Jest to 10-dniowy szczenię mysie, u którego wykonam biopsję ogona, a następnie wyizoluję genomowe DNA z pobranej tkanki. Odcinam niewielki fragment ogona, około 3 mm, po czym umieszczam go w probówce typu Eppendorf i wkładam probówkę do suchego lodu. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej między myszami, zazwyczaj zaznaczam na ostrzu skalpela miejsce, w którym wykonano ostatnie cięcie.W ten sposób przy kolejnej myszy będę mieć pewność, że do pobrania biopsji ogona użyję czystego fragmentu żyletek. Aby rozróżnić poszczególne myszy w miocie, niezbędny będzie sposób ich identyfikacji. Jedną z metod jest wykonanie otworu w uchu za pomocą dziurkacza do uszu, który jest tutaj pokazany.Delikatnie chwyć mysz za kark w ten sposób, odwróć ją i uciśnij ogon między palcami. Weź dziurkacz do uszu w drugiej ręce i wykonaj szybkie nacięcie w uchu myszy. Widzisz, jak bezbolesne to było?Dobrze, teraz widzą Państwo, że w probówkach typu Eppendorf znajdują się fragmenty ogona, do których teraz dodam roztwory wspomagające trawienie. Najpierw dodam 720 µL roztworu STE, a następnie 30 µL proteinazy K. Oto fragment ogona, który wycięliśmy przed przystąpieniem do trawienia.Teraz umieszczę fragmenty ogona w bloku grzewczym ustawionym na 55 °C. Wiele protokołów wymaga ciągłego ruchu kołyszącego w temperaturze 55 °C, jednak w moim przypadku nie będzie to konieczne, ponieważ fragmenty ogona będę mieszać w wstrząsarzu wirującym. Teraz będę mieszać fragment ogona w wstrząsarzu wirującym przez dwie sekundy.Raz, dwa. Po wirowaniu w vortexie tak wygląda zawartość probówki Eppendorf; widać, że fragment ogona został całkowicie rozpuszczony. Następnie należy aktywować proteinazę K w temperaturze 70 °C przez pięć minut. Przerwać reakcję, schładzając na lodzie przez pięć minut.Odwirować fragmenty ogonków w mikrowirówce przez 10 minut przy pełnej prędkości. W tej mikrowirówce pełna prędkość wynosi 13 000 RPM. Podczas wirowania trawionych ogonków, opisać probówki typu Eppendorf i napełnić je 750 µL izopropanolu.Po odwirowaniu strawionych fragmentów ogonów, włosy i niestrawione materiały utworzą osad na dnie probówki. Odlej roztwór zawierający strawiony materiał, STE i proteinazę K do probówki Eppendorf zawierającej izopropanol. DNA zacznie wytrącać się z roztworu, przybierając postać mgiełki lub pierzy; w tej bąbelku znajduje się wyizolowane z ogona myszy DNA genomowe. Po wymieszaniu izopropanolu i roztworu STE, DNA genomowe wytrąci się z roztworu i pojawi się jako mała kulka; odwiruj wytrącone DNA genomowe przez pięć minut z maksymalną prędkością w mikrocentryfudze.Na dnie probówki widoczny jest osad naszego genomowego DNA. Teraz odessam roztwór z wnętrza probówki, pozostawiając jedynie pellet genomowego DNA. Przy każdym odsysaniu zawartości kolejnej probówki będę wymieniać końcówkę.Przytwierdź końcówkę do tego aspiratora. Po odessaniu STE i izopropanolu dodam 1 mL 70% etanolu, aby wypłukać osad genomowego DNA. Ponieważ osad genomowego DNA zazwyczaj przylega do ścianki probówki do mikrowirówki i trudno go usunąć w celu dokładnego wypłukania w 70% etanolu, należy go zeskrobać, przesuwając probówkę o statyw do probówek do mikrowirówki, który tutaj mam.Można to zrobić w następujący sposób. Oto widok genomicznego DNA po jego sfragmentowaniu w osad i przemyciu 70% etanolem. Ponownie odwiruję go z maksymalną prędkością przez pięć minut, a następnie odessam 70% etanolu i odwiruję osady genomicznego DNA po ich przemyciu.Wiruj w 70% etanolu przez pięć minut z maksymalną prędkością, następnie odessij 70% etanol i pozostaw DNA do wyschnięcia na pięć minut. Oto widok granulatu genomowego DNA na dnie probówki; powinien być on niemal całkowicie suchy. Po wysuszeniu granulatu genomowego DNA z ogonów myszy, dodaj 100 µL 40 mM TRIS o pH 8.Zatem utrzymuję genomowe DNA w temperaturze 50 °C, w której rozpuści się ono szybciej niż w temperaturze pokojowej. Po około godzinie w 50 °C zamrożę je lub będę przechowywać w temperaturze 4 °C aż do momentu przeprowadzenia reakcji PCR, aby ustalić, które myszy są pozytywne pod kątem mojego transgenu.

isolation-of-genomic-dna-from-mouse-tails

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja DNA genomowego z ogonów myszy

Pełne genotypowanie próbki ogona myszy, obejmujące trawienie tkanki i odczyt PCR, wykonuje się w półtorej godziny przy użyciu zestawu Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR.

Szybkie genotypowanie tkanek mysich z wykorzystaniem zestawu Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do pobierania próbek, umożliwiające efektywne gromadzenie próbek sierści od płochliwych małych ssaków, co zaprezentowano na przykładzie piki amerykańskiej. Wykazujemy użyteczność tej metody poprzez ekstrakcję DNA z pobranej sierści oraz amplifikację kilku typów markerów molekularnych powszechnie stosowanych w badaniach nad ekologią i ochroną dzikiej przyrody.

Nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości DNA od trudnych do uchwycenia małych ssaków

W tym filmie demonstrujemy procedurę obcinania ogona na modelu myszy w celu pobrania krwi obwodowej. Pobrana krew jest następnie poddawana odwirowaniu w celu oddzielenia osocza, które można wykorzystać do dalszych eksperymentów.

Procedura wycinania ogona myszy w celu pobrania krwi obwodowej i izolacji osocza

Opisujemy prostą i szybką eksperymentalną procedurę generowania pierwotnych fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Procedura nie wymaga specjalnego szkolenia zwierząt i może być stosowana do generowania kultur fibroblastów z uszu przechowywanych w RT przez okres do 10 dni.

Generowanie pierwotnych kultur fibroblastów z tkanek uszu i ogona myszy

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Opisujemy szczegółowy protokół testu mutacji Lambda Select cII w hodowanych komórkach transgenicznych gryzoni lub odpowiadających im zwierząt potraktowanych chemicznie/fizycznym środkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Podejście to jest szeroko stosowane do badania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków.

System detekcji mutacji Lambda Select cII

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Ten protokół zapewnia prostą, opłacalną metodę izolacji DNA do analizy zmian mikroflory jelitowej myszy podczas rozwoju choroby autoimmunologicznej.

Analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji DNA

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Poznaj metodę izolacji genomowego DNA z ogonów myszy, obejmującą pobieranie biopsji, zapobieganie zanieczyszczeniom oraz identyfikację osobników. Technika ta jest kluczowa dla badań genetycznych.

Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy

Przeglądaj więcej filmów