Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy

To jest 10-dniowe mysie szczeniak, któremu zamierzam poddać się biopsji ogona, a następnie pobrać genomowe DNA z jego ogona. Więc to co zamierzam zrobić, to odciąć trochę jego ogona, około trzech milimetrów, a następnie umieszczę kawałek ogona w rurce einor i umieszczę rurkę einor na suchym lodzie. Teraz, aby uniknąć zanieczyszczenia z jednej myszy na drugą, zwykle zaznaczam żyletkę w miejscu, w którym wykonałem ostatnie cięcie.

W ten sposób przy następnej myszy na pewno użyję czystego kawałka żyletki do wykonania następnej biopsji ogona. Aby rozróżnić różne myszy w swoim miocie, będziesz potrzebować sposobu na zidentyfikowanie myszy. Jednym ze sposobów, aby to zrobić, jest wybicie w uszach za pomocą dziurkacza do uszu, który jest pokazany tutaj.

Delikatnie chwyć mysz za kark, tak jak mysz, odwróć ją i ściśnij jej ogon między palcami. Weź nakłucie otworu w uchu drugą ręką i szybko odetnij ucho myszy. Widzisz, jakie to było bezbolesne?

Okej, więc teraz widzisz, że mam kilka kawałków ogona w tych rurkach einor i teraz dodam roztwory, które pomogą im się strawić. Najpierw dodam 720 mikrolitrów roztworu STE, a następnie dodam 30 mikrolitrów białka. Ace K.So oto spojrzenie na kawałek ogona, który odcięliśmy przed trawieniem.

Teraz zamierzam umieścić końcówki na bloku grzewczym pod kątem 55 stopni. Wiele protokołów wymaga ciągłego kołysania ruchem pod kątem 55 stopni, ale dla moich celów nie będzie to konieczne, ponieważ będę wirował częściami ogonowymi. Teraz zamierzam wirować kawałkiem ogona przez dwie sekundy.

Raz, dwa. Więc po wirowaniu, spójrz na to, co pozostało w probówce einor, i możesz zobaczyć, że kawałek ogona został całkowicie rozpuszczony i aktywować proteinazę K w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut. Ugasić na lodzie przez pięć minut.

Obracaj końcówki w mikrowirówce przez 10 minut z pełną prędkością. W tej mikrowirówce pełna prędkość wynosi 13 000 obr./min. Podczas gdy ogony trawienne obracają się w dół, oznacz niektóre rurki einor napełnij rurki einor 750 mikrolitrami izopropanolu.

Po odwirowaniu strawionych ogonów, włosy i niestrawiony materiał utworzą granulkę na dnie dekantacji tuby. Roztwór zawierający strawiony materiał, STE i proteinazę K do probówki einor zawierającej DNA izopropanolu, zacznie wychodzić z roztworu, będzie wyglądał jak duch i pióro, a wokół tej bańki pływa genomowe DNA, które zostało wyizolowane z ogona myszy. Po zmieszaniu izopropanolu i roztworu STE, genomowe DNA wyjdzie z roztworu i pojawi się jako ta mała kulka tutaj, wiruj wytrącone genomowe DNA przez pięć minut z pełną prędkością w mikrowirówce.

Tam, na dnie probówki, znajduje się rzut oka na nasze granulowane genomowe DNA. Teraz zamierzam odessać roztwór z wnętrza probówki, pozostawiając tylko osad genomowego DNA. Za każdym razem, gdy zasysam kolejną rurkę, wymieniam rurkę.

Pogłaszcz końcówkę na końcówce tego aspiratora. Po odessaniu STE i izopropanolu dodam jeden mililitr 70% etanolu, aby umyć granulki genomowego DNA. Ponieważ granulka genomowego DNA zwykle przylega do boku rurki z mikro fuge i trudno ją zdjąć, aby dokładnie umyć ją w 70% etanolu, będziesz musiał ją zgrabić w poprzek stojaka na rurki z mikro fuge, który mam tutaj.

Możesz to zrobić w ten sposób. Oto spojrzenie na genomowe DNA po jego granulowaniu i umyciu w 70% etanolu. Zamierzam ponownie odkręcić to z pełną prędkością przez pięć minut, a następnie odessać 70% etanolu, odkręcić granulki genomowego DNA po ich umyciu.

Ich 70% etanol przez pięć minut na pełnej prędkości, a następnie zasysać 70% etanol i pozostawić DNA do wyschnięcia na pięć minut. Na dnie probówki znajduje się granulka genomowego DNA, która jest mniej więcej tak sucha, jak tylko chcesz. Wysuszyłem więc granulki genomowego DNA z mysich ogonów, a teraz zamierzam dodać sto mikrolitrów 40-milimolowego trissu o pH 8.

więc genomowe DNA w temperaturze 50 stopni Celsjusza, gdzie przechodzi w roztwór szybciej niż w temperaturze pokojowej. Po około godzinie w temperaturze 50 stopni albo go zamrożę, albo umieszczę w czterech stopniach, aż będę chciał uruchomić moje reakcje PCR, aby dowiedzieć się, które myszy są pozytywne dla mojego transgenu.