Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa
3 lutego 2011
Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla organotypowych skrawków hipokampa. Jest to realizowane poprzez najpierw wypreparowanie hipokampa. Drugim krokiem procedury jest wykonanie skrawków hipokampa.
Trzecim krokiem procedury jest oddzielenie i sortowanie skrawków hipokampa. Ostatnim krokiem procedury jest hodowla skrawków hipokampa. W rezultacie można uzyskać zdrowe organiczne skrawki hipokampa, co można potwierdzić za pomocą wizualizacji przy użyciu stereomikroskopu lub mikroskopu.
Witajcie, nazywam się Jimena Opitz i jestem naukowcem w laboratorium dr. Andrego Bara na Uniwersytecie Waszyngtońskim w Seattle. Zaprezentuję procedurę hodowli organotypowych plastrów hipokampa. Osoby początkujące w tej metodzie mogą napotykać trudności ze względu na konieczność szybkiej dyssekcji i krojenia hipokampów oraz potrzebę zapobiegania kontaminacji poprzez zastosowanie sterylnego roztworu do dyssekcji i hodowli plastrów.
Pożywki można przygotować z wyprzedzeniem do trzech tygodni i przechowywać w temperaturze 4 °C zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Przed przygotowaniem skrawków hipokampa można przygotować hodowle. Niezbędne jest odpowiednie wysterylizowanie zarówno komory z laminarnym przepływem powietrza, jak i sprzętu, który będzie wykorzystywany podczas sekcji.
Najpierw przemyj wewnętrzną powierzchnię komory laminarno-ulgawej 70% ethanol. Następnie umieść mikroskop sekcyjny i wszystkie narzędzia do sekcji wewnątrz komory. Przygotuj nacinarkę do tkanek, kładąc czysty arkusz teflonowy na stolem i montując nowe ostrze.
Umieść krojankę do tkanek wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą lampy UV wysterylizuj wszystkie powierzchnie oraz sprzęt przez 15 minut. Wyłącz lampę po zakończeniu procesu sterylizacji UV. Praca w komorze do hodowli tkanek.
W pierwszej kolejności należy przygotować sześciodołkowe płytki do hodowli tkanek, które zostaną wykorzystane do hodowli plastrów hipokampa. Do każdego dołka płytki sześciodołkowej należy nalać pipetą 750 µL SEM. Następnie, używając sterylnej pęsety, należy umieścić wkład do hodowli komórkowej w każdym dołku płytki do hodowli tkanek.
Należy uważać, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza pod wkładką. Ważne jest, aby membrana każdego wkładka do hodowli komórkowych była zwilżona pożywką do hodowli skrawków. Jeśli membrana jest sucha, należy sprawdzić, czy nie występują pęcherzyki powietrza.
Jeśli membrana znajduje się powyżej menisku SCM, do studni można dodać więcej pożywki. Umieść przygotowane płytki hodowlane w inkubatorze do hodowli tkankowych. Ustaw temperaturę na 35°C oraz stężenie 5% carbon dioxide do momentu rozpoczęcia dalszych prac.
Na koniec napełnij wiaderko z mieszanką lodu i soli i ustaw je obok miejsca dekapitacji, pracując wewnątrz dygestorium. Nalej do zlewki o pojemności 100 mililitrów roztwór do sekcji. Wsuń zlewkę do mieszanki lodu i soli i napowietrzaj roztwór mieszaniną 5%carbon dioxide i 95%oxygen przez 10 do 20 minut, aż kolor zmieni się z różowego na pomarańczowy.
Roztwór do sekcji tworzy zawiesinę z zamrożonego i płynnego roztworu. Teraz środowisko do sekcji oraz płytki do hodowli tkanek są gotowe do przeprowadzenia sekcji. Owinięcie P3-P7.
Do tej procedury wykorzystuje się szczenięta. Przygotowanie kultur jest możliwe dla maksymalnie trzech szczeniąt jednocześnie. Procedura zostanie przedstawiona na przykładzie jednego szczenięcia.
Szybko wy pobierz mózg z odciętej głowy poczwarki wrap i umieść go na jedną minutę w zlewce o pojemności 100 mililitrów zawierającej roztwór do sekcji Slurry Chill. W tym czasie przygotuj naczynie do sekcji, wlewając około 10 mililitrów lodowatego roztworu do sekcji na dno naczynia do hodowli tkanek o średnicy 60 mililitrów. Używając zaokrąglonej łyżeczki lub mikrospatułki, przenieś mózg ze zlewki 100 mililitrów do naczynia 60 mililitrów wypełnionego zimnym medium do sekcji. Upewnij się, że mózg jest całkowicie pokryty roztworem do sekcji.
Umieść naczynie z mózgiem pod mikroskopem stereoskopowym. Patrząc przez mikroskop stereoskopowy, zlokalizuj mózg. Za pomocą sterylnej pincety anatomicznej przesuń mózg na środek pola widzenia.
Przytrzymaj mózg w linii środkowej, dociskając pęsetę sekcyjną do dna naczynia. Za pomocą narzędzia do sekcji hipokampa delikatnie oddziel półkule korowe od śródmózgowia, pozostawiając śródmózgowie na miejscu; najlepiej zrobić to bez całkowitego odłączania półkul korowych od pozostałej części mózgu, aby odsłonić hipokamp. Następnie za pomocą narzędzia do sekcji hipokampa wyjmij hipokamp z jednej półkuli.
Następnie za pomocą igły preparacyjnej oczyścić tkankę, usuwając jak największą ilość materiału spoza obszaru hipokampa. Po wyizolowaniu i oczyszczeniu pierwszego hipokampa powtórzyć tę procedurę dla drugiego hipokampa z drugiej półkuli. Następnie za pomocą sterylnych nożyczek odciąć końcówkę tipsa z filtrem do pipety P 1000.
Załóż końcówkę na sterylną pipetę P 1000. Delikatnie odessij jeden hipokamp i nanieś go na arkusz teflonowy w krojonce do tkanek. Następnie w ten sam sposób nanieś drugi hipokamp na krojonkę.
Ułóż połówki hipokampa stroną wklęsłą do dołu i ustaw je prostopadle do ostrza, a następnie odessaj nadmiar cieczy z arkusza Teflonu. Ustaw mikrometr w pozycji zero. Przetnij hipokampy na sekcje o grubości 400 micrometer.
Przygotuj kolejny przycięty końcówkę z filtrem do pipety P 1000 i zamocuj ją w sterylnej pipecie P 1000. Wlej około 10 mililitrów schłodzonego SCM do 60-milimetrowego sterylnego naczynia do hodowli tkanek. Za pomocą pipety dodaj nieco medium i przenieś skrawki hipokampa z urządzenia do cięcia do naczynia.
Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza; po powtórzeniu procesu przenoszenia dla wszystkich plastrów, należy umieścić szalkę pod mikroskopem stereoskopowym. Na koniec, używając szpatułki tępomostkowej i szpatułki prostej, należy delikatnie odseparować plastry od siebie.
Oddziel wyraźnie zarysowane i nieuszkodzone plastry od tych uszkodzonych. Wyraźnie zarysowane plastry hipokampa są teraz gotowe do hodowli. Wyjmij z inkubatora wcześniej przygotowane płytki hodowlane z sześcioma dołkami zawierające SCM oraz wkładki do hodowli komórkowej; za pomocą pipety P 1000 z szerokim, przyciętym końcem przenieś od czterech do pięciu pojedynczych plastrów na każdą membranę.
W razie potrzeby należy użyć szpatułki do irydy, aby rozdzielić plastry. Należy uważać, by nie umieszczać plastrów zbyt blisko ścianki wkładki ani w bezpośrednim sąsiedztwie siebie. Odessaj nadmiar medium z górnej powierzchni hodowli komórkowej, uważając, aby nie dotknąć plastrów.
Włóż membranę. Na koniec umieść płytkę, zawierającą teraz hodowle przekrojów hipokampa, z powrotem w inkubatorze do hodowli tkanek. Ustaw temperaturę na 35 °C oraz stężenie 5% carbon dioxide.
Po 48 godzinach wyjmij płytkę z inkubatora, pracując wewnątrz dygestorium do hodowli tkanek. Odessać pożywkę za pomocą pipety Pasteura. Dodać 750 µL świeżego, uprzednio ogrzanego SCM na otwór.
Ponownie upewnij się, że pod membraną wkładki do hodowli komórkowych nie utworzyły się pęcherzyki powietrza. Jest to przykład zdrowego skrawka hipokampa gotowego do hodowli. Wyraźnie widoczne i nieuszkodzone są obszary hipokampa: CA1, CA3 oraz zakręt zębaty.
Przedstawiony tutaj uszkodzony skrawek hipokampa nie został użyty do hodowli. Na koniec, oto przykład zdrowego skrawka hipokampa po czterech dniach hodowli. Należy zauważyć, że skrawek w świetle mikroskopu stereotypowego ma biały kolor, a jego powierzchnia jest czysta.
Obszary hipokampa, takie jak pole CA1, CA3 oraz zakręt zębaty, są wyraźnie widoczne i nieuszkodzone. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje około jednej godziny, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest pamiętanie o stosowaniu odpowiednich technik sterylnych oraz delikatnym obchodzeniu się z tkanką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak hodować organotypowe plastry hipokampa.
Dziękujemy i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę hodowli organotypowych skrawków hipokampa, którą można dostosować do innych obszarów mózgu. Technika ta pozwala na zachowanie architektury hipokampa w hodowli przez okres do dwóch tygodni.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Hodowla komórkowa
- Badania nad hipokampem
Wstęp
- Hodowle organotypowe są niezbędne do badania fizjologii mózgu.
- Przekroje hipokampa zachowują połączenia synaptyczne i architekturę komórkową.
- Istniejące metody mogą nie zapewniać zachowania integralności tkanki podczas przedłużonych okresów hodowli.
- Celem niniejszej metody jest poprawa żywotności i użyteczności przekrojów mózgu w badaniach.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody hodowli skrawków hipokampa.
- Umożliwienie badania funkcji hipokampa w kontrolowanym środowisku.
- Zapewnienie protokołu, który można dostosować do innych obszarów mózgu.
Zastosowane metody
- Wypreparowanie hipokampa z tkanki mózgowej.
- Krojenie hipokampa na cienkie przekroje.
- Sortowanie i rozdzielanie przekrojów hipokampa.
- Hodowla przekrojów na membranach porowatych z interfejsem pożywek.
Główne wyniki
- Skuteczna konserwacja architektury hipokampa przez dwa tygodnie.
- Zdrowe skrawki organotypowe wizualizowane za pomocą stereomikroskopów lub mikroskopów.
- Wykazana możliwość adaptacji metody do innych obszarów mózgu.
- Potencjał do dalszych badań nad funkcją i patologią hipokampa.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodne podejście do hodowli skrawków hipokampa.
- Umożliwia ona przedłużone okresy badań przy jednoczesnym zachowaniu integralności tkanki.
- Przyszłe zastosowania mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia funkcji mózgu oraz mechanizmów chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Organotypowe hodowle plastrów hipokampa stanowią fizjologicznie istotny system ex vivo do badania mechanizmów synaptycznych, umożliwiając precyzyjne manipulacje genetyczne i farmakologiczne przy jednoczesnym zachowaniu naturalnej architektury tkanki. Platforma ta wspiera wczesny etap walidacji celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków w neurologii, niwelując lukę między testami in vitro a modelami in vivo. Jej adaptacyjność i powtarzalność sprawiają, że jest ona cennym narzędziem w selekcji projektów badawczych oraz zapewnianiu ciągłości badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę białek synaptycznych w zachowanym kontekście obwodów neuronalnych.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez utrzymanie natywnej łączności i architektury hipokampa.
- Ułatwia manipulacje genetyczne i wyjaśnianie szlaków sygnałowych za pomocą metod wirusowych lub biolistycznych.
- Zapewnia niezawodny system oceny oddziaływania na cel oraz istotności biologicznej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych, powtarzalnych systemów tkanki nerwowej do późniejszego przesiewania związków.
- Wspiera ilościowe obrazowanie i odczyty elektrofizjologiczne w celu standaryzacji testów.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie skrawków do zrównoleglonych badań farmakologicznych.
- Pozwala na wiarygodną ocenę wpływu związków na funkcję i plastyczność synaptyczną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z obwodami neuronalnymi istotnymi dla choroby, co umożliwia poszukiwanie biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie złożoności tkanki.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, dostarczając danych predykcyjnych dotyczących modulacji synaptycznej.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu, uwzględniając ryzyko w oparciu o funkcjonalne odpowiedzi tkankowe.
Integracja potoków i przepływów pracy
Organotypowe hodowle skrawków hipokampa integrują się z kontinuum odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne, wspierając iteracyjne testowanie hipotez i ocenę mechanistyczną.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących funkcji synaptycznej i modulacji szlaków w środowisku zbliżonym do naturalnego.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków oraz opracowywania testów.
- Analityka: Wspiera obrazowanie, elektrofizjologię i analizy biochemiczne w celu przeprowadzenia analiz porównawczych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy badania in vitro i in vivo poprzez zachowanie architektury neuronalnej istotnej dla przebiegu choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowaną, adaptowalną platformę do wielokrotnego zastosowania w programach B&R w dziedzinie neuronauki.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne preparaty tkankowe dla zespołów interdyscyplinarnych.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie rzetelnych danych przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację i rozwój zasobów z zakresu neuronauki z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie sterylnej dysekcji, obchodzenia się z tkankami oraz technik hodowli plastrów tkankowych.
- Wymaga dostępu do komór laminarnych do hodowli tkankowych, mikroskopów oraz specjalistycznego sprzętu do krojenia.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do innych obszarów mózgu poprzez modyfikacje protokołu zgodnie z opisaną metodą.
- Zależność od starannego obchodzenia się z próbkami w celu utrzymania żywotności plastrów i zminimalizowania kontaminacji.
