Organotypowe kultury warstwowe hipokampa
February 3rd, 2011
Opisujemy metodę przygotowania organotypowych plastrów hipokampa, które można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Wycinki mózgu układa się na porowatych błonach, a pożywki hodowlane mogą tworzyć granicę fazy. Ta metoda zachowuje ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni w kulturze.
Ogólnym celem tej procedury jest hodowla organtypowych wycinków hipokampa. Osiąga się to poprzez najpierw rozwarstwienie hipokampa. Drugim krokiem zabiegu jest przecięcie hipokampa.
Trzecim krokiem procedury jest oddzielenie i posortowanie plasterków hipokampa. Ostatnim etapem zabiegu jest posiew wycinków hipokampa. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zdrowe organiczne plastry hipokampa hipopotama poprzez wizualizację za pomocą lunety sekcyjnej lub mikroskopu.
Cześć, nazywam się Jimena Opitz i jestem naukowcem w laboratorium dr Andresa Bara na Uniwersytecie Waszyngtońskim. W Seattle będę demonstrować procedurę organotypowego hipokampa, hodowlę LICs. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z koniecznością szybkiego wypreparowania i pokrojenia hipo campi oraz zapobiegania zanieczyszczeniu, sterylnego roztworu preparacyjnego i hodowli plastrów.
Podłoża można przygotowywać z trzytygodniowym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Przed plastrem hipokampa można przygotować kultury. Konieczne jest odpowiednie wysterylizowanie zarówno kaptura do hodowli tkankowej, jak i sprzętu, który będzie używany do sekcji.
Najpierw przetrzyj wewnętrzną powierzchnię kaptura do hodowli tkankowych 70% etanolem. Następnie umieść mikroskop preparacyjny i wszystkie narzędzia preparacyjne w kapturze. Przygotuj krajalnicę do tkanek, umieszczając czysty kawałek arkusza teflonu na stoliku i montując nowe ostrze.
Umieść krajalnicę do tkanek w kapturze do hodowli tkankowych za pomocą światła UV, sterylizuj wszystkie powierzchnie i sprzęt przez 15 minut. Wyłącz światło po zakończeniu procesu sterylizacji UV. Praca w kapturze do hodowli tkankowych.
Najpierw przygotuj sześć dołków na płytki do hodowli tkankowych, które zostaną użyte do hodowli wycinków hipokampa. Odpipetować 750 mikrolitrów SEM do każdego dołka na płytce sześciodołkowej. Następnie za pomocą sterylnych kleszczy umieść wkładkę do hodowli komórkowej w każdym dołku płytki do hodowli tkankowej.
Uważając, aby nie zatrzymać pęcherzyków powietrza pod wkładem. Ważne jest, aby błona każdej wkładki do hodowli komórkowej była zwilżona pożywką do hodowli warstwowej. Jeśli membrana jest sucha, sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza.
Jeśli membrana znajduje się powyżej menisku SCM, do studni można dodać więcej pożywki. Przygotowane płytki hodowlane umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych. Ustaw na 35 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż będzie potrzebny.
Na koniec napełnij wiaderko z lodem mieszanką soli lodowej i umieść je obok obszaru dekapitacji działającego wewnątrz kaptura. Napełnij 100-mililitrową zlewkę roztworem preparacyjnym. Wepchnij zlewkę do mieszanki soli lodowej i bąbelkuj roztwór z 5% dwutlenkiem węgla i 95% tlenem przez 10 do 20 minut, aż kolor zmieni się z różowego na pomarańczowy.
A roztwór preparacyjny tworzy zawiesinę mieszaniny roztworu zamrożonego i płynnego. Teraz środowisko preparacyjne i płytki do hodowli tkankowej są gotowe do sekcji. Zawiń od trzech do siedmiu owinięć.
Do tej procedury wykorzystywane są szczenięta. Kawałek. Kultury można przygotować z maksymalnie trzech zawijanych szczeniąt jednocześnie. Ta procedura zostanie zilustrowana na przykładzie pojedynczego szczeniaka.
Szybko zbierz mózg z odciętego szczeniaka i umieść go w 100-mililitrowej zlewce zawierającej roztwór preparacyjny Slurry Chill na jedną minutę. W tym czasie przygotuj naczynie do sekcji, dodając około 10 mililitrów lodowatego roztworu preparacyjnego na dno 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowych Za pomocą zaokrąglonej łyżki, mikroszpatułki, przenieś mózg ze 100-mililitrowej zlewki do 60-milimetrowej naczynia wypełnionego zimnym medium preparacyjnym. Upewnij się, że mózg jest całkowicie pokryty roztworem preparacyjnym.
Umieść naczynie zawierające mózg pod mikroskopem preparacyjnym. Spójrz przez mikroskop sekcyjny i zlokalizuj mózg. Użyj sterylnych kleszczy preparacyjnych, aby przesunąć mózg do środka pola widzenia.
Przytrzymaj mózg w linii środkowej za pomocą kleszczy preparacyjnych przyciśniętych do dna naczynia. Używając narzędzia do preparowania hipokampa, delikatnie oderwij półkule korowe od śródmózgowia, pozostawiając śródmózgowie na miejscu, a najlepiej bez odłączania półkul korowych od reszty mózgu, hipokamp jest teraz odsłonięty. Weź narzędzie do preparowania hipokampa i zgarnij hipokamp z jednej półkuli.
Następnie użyj igły preparującej, aby usunąć jak najwięcej tkanki niezwiązanej z hipokampem. Gdy pierwszy hipokamp zostanie odizolowany i oczyszczony, powtórz ten proces dla drugiego hipokampa z drugiej półkuli. Następnie za pomocą sterylnych nożyczek odetnij końcówkę końcówki pipety filtrującej P 1000.
Umieść końcówkę pipety na sterylnej pipecie P 1000. Delikatnie odessać jeden hipokamp i pipetować go na arkusz teflonowy na krajalnicy do tkanek. Następnie podobnie umieść drugi hipokamp na krajalnicy.
Ustaw połówki hipokampa na ich wklęsłych bokach i ustaw je prostopadle do ostrza, aby zassać nadmiar płynu z arkusza teflonu. Ustaw pion lub mikrometr w pozycji zerowej. Pokrój hipokampy na 400-mikrometrowe odcinki
.Przygotuj kolejną odciętą końcówkę filtra P 1000 i zamontuj ją na sterylnej pipecie P 1000. Wlej około 10 mililitrów zimnego SCM do 60-milimetrowego sterylnego naczynia do hodowli tkankowych. Za pomocą pipety dodaj trochę pożywki i przenieś plastry hipokampa z krajalnicy na naczynie.
Unikaj robienia bąbelków po powtórzeniu procesu przenoszenia dla wszystkich plastrów, umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym. Na koniec za pomocą szpatułki do tęczówki i prostej szpatułki. Delikatnie oddziel plastry od siebie.
Oddziel dobrze zdefiniowane i nieuszkodzone plastry od uszkodzonych plastrów. Dobrze zdefiniowane wycinki hipokampa są teraz gotowe do hodowli. Usunąć z inkubatora uprzednio przygotowane sześć dołków płytek do hodowli tkankowych zawierających SCM i wkładki do hodowli komórkowych za pomocą P 1000 z odciętą szeroką końcówką knura, przenieść cztery do pięciu pojedynczych wycinków na błonę.
W razie potrzeby użyj szpatułki do tęczówki, aby oddzielić plasterki. Uważaj, aby nie umieszczać plastrów zbyt blisko ścianki wkładki lub w bliskiej odległości od siebie. Uważając, aby nie dotknąć plastrów, odessać nadmiar pożywki z górnej powierzchni kultury komórkowej.
Włóż membranę. Na koniec zwróć płytkę, która teraz zawiera kultury plastrów hipokampa, do inkubatora kultur tkankowych. Ustawiony na 35 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Po 48 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora pracującego wewnątrz kaptura do hodowli tkankowych. Odessać pożywkę za pomocą tylnej pipety. Dodaj 750 mikrolitrów świeżego wstępnie rozgrzanego SCM na.
Cóż, ponownie, upewnij się, że pod membraną wkładki do hodowli komórkowej nie tworzą się pęcherzyki. Jest to przykład zdrowego wycinka hipokampa gotowego do hodowli. CA jeden, CA 3 i zakręt zębaty, obszary hipokampa są wyraźnie widoczne i nieuszkodzone.
Pokazany tutaj jest uszkodzony wycinek hipokampa, który nie jest używany do hodowli. Wreszcie, jest to przykład zdrowego wycinka hipokampa po czterech dniach w kulturze. Zwróć uwagę, że plasterek wygląda na biały pod mikroskopem preparacyjnym, a powierzchnia plasterka jest czysta.
CA jeden, CA 3 i zakręt zębaty, obszary hipokampa są wyraźnie widoczne i nieuszkodzone. Raz to opanuj. Tę technikę można wykonać w około godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podejmując się tej procedury, bardzo ważne jest, aby pamiętać o stosowaniu odpowiednich technik sterydowych i być delikatnym dla tkanki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować organotypowe. Liza hipokampa.
Dzięki i powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę hodowania kropek hipokampalnych, która może być dostosowana dla innych regionów mózgu. Technika zachowuje architekturę hipokampa przez do dwóch tygodni w hodowli.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Hodowla komórek
- Badania hipokampa
Tło
- Hodowle organotypowe są niezbędne do badania fizjologii mózgu.
- Kropki hipokampalne zachowują połączenia synaptyczne i architekturę komórkową.
- Istniejące metody mogą nie zachować integralności tkanki przez dłuższy okres hodowli.
- Ta metoda ma na celu poprawę żywotności i przydatności kropek mózgu w badaniach.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody hodowania kropek hipokampalnych.
- Umożliwienie badania funkcji hipokampa w kontrolowanym środowisku.
- Podanie protokołu, który może być dostosowany dla innych regionów mózgu.
Stosowane metody
- Rozcinanie hipokampa z tkanki mózgowej.
- Krojenie hipokampa na cienkie sekcje.
- Sortowanie i separacja kropek hipokampalnych.
- Hodowla kropek na porowatych membranach z interfejsem pożywkowym.
Główne wyniki
- Skuteczna ochrona architektury hipokampa przez dwa tygodnie.
- Zdrowe organotypowe kropki zwizualizowane za pomocą szkół sekccyjnych lub mikroskopów.
- Wykazana adaptacyjność metody dla innych regionów mózgu.
- Możliwość dalszych badań nad funkcją i patologią hipokampa.
Wnioski
- Metoda zapewnia solidne podejście do hodowania kropek hipokampalnych.
- Zezwala na przedłużone okresy badań przy zachowaniu integralności tkanki.
- Przyszłe zastosowania mogą zwiększyć zrozumienie funkcji mózgu i chorób.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Organotypic hippocampal slice cultures provide a physiologically relevant ex vivo system for interrogating synaptic mechanisms, enabling precise genetic and pharmacological manipulation while preserving native tissue architecture. This platform supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery, bridging the gap between in vitro assays and in vivo models. Its adaptability and reproducibility make it a valuable asset for portfolio triage and translational research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of synaptic proteins in a preserved neural circuit context.
- Supports mechanistic de-risking by maintaining native hippocampal connectivity and architecture.
- Facilitates genetic manipulation and pathway clarification through viral or biolistic approaches.
- Provides a robust system for evaluating target engagement and biological relevance.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible neural tissue systems for downstream compound screening.
- Supports quantitative imaging and electrophysiological readouts for assay standardization.
- Enables scalable preparation of slices for parallelized pharmacological testing.
- Allows for reliable assessment of compound effects on synaptic function and plasticity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neural circuitry for translational biomarker exploration.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving tissue complexity.
- Reduces translational risk by providing predictive data on synaptic modulation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on functional tissue responses.
Pipeline & Workflow Integration
Organotypic hippocampal slice cultures integrate into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, supporting iterative hypothesis testing and mechanistic evaluation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of synaptic function and pathway modulation in a native-like environment.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Supports imaging, electrophysiology, and biochemical assays for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo studies by preserving disease-relevant neural architecture.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for repeated use across neuroscience R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable tissue preparations for cross-functional teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of neuroscience assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile dissection, tissue handling, and slice culture techniques.
- Needs access to tissue culture hoods, microscopes, and specialized slicing equipment.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to other brain regions with protocol modifications as supported by the method.
- Dependent on careful handling to maintain slice viability and minimize contamination.
