Name: Organotypowe kultury warstwowe hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj metodę hodowli organotypowych plasterków hipokampa zachowujących architekturę tkanki przez dwa tygodnie. Technika umożliwia badanie funkcji mózgu w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez NINDS - NIH R01NS060756

1. Przed rozpoczęciem przygotowania skrawków hipokampa.
<ol>
<li>Przygotuj slicer do tkanek, kładąc arkusz teflonowy i montując nowe ostrze.</li>
<li>Przetrzyj komorę do hodowli komórkowych (TC) 70% etanolem i ustaw wewnątrz mikroskopysekcyjny. Sterylizuj komorę, mikroskop, slicer do tkanek oraz wszystkie narzędzia sekcyjne przez 15 minut światłem UV.</li>
<li>Przygotuj 6-dołkowe płytki TC. Do każdej dołki dodaj 750 μL pożywki do hodowli plastrów tkankowych (SCM) i umieść w nich inserty do hodowli komórkowych. Upewnij się, że membrany są całkowicie zwilżone i nie ma pod nimi pęcherzyków powietrza. Umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 35°C z dopływem 5% CO2 do momentu użycia.</li>
<li>Wlej 50 mL ACSF o niskiej zawartości Na+ (roztwór do sekcji) do zlewki o pojemności 100 mL i umieść ją w mieszaninie lodu z solą. Napowietrzaj ACSF o niskiej zawartości Na+ mieszaniną 5% CO2 / 95% O2, aż zmieni kolor, a ACSF utworzy zawiesinę z zamrożonego i ciekłego roztworu (10-20 min).</li>
<li>Pobierz szczura w wieku P5-P7. Można użyć do trzech młodych szczurów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie skrawków hipokampa.
<ol>
<li>Odetnij głowę zwierzęcia ostrymi nożyczkami użytkowymi. Przetnij skórę i odsłoń czaszkę. Otwórz czaszkę, przecinając ją od strony do strony wzdłuż linii międzyprzysuchem oraz wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą małych nożyczek. W celu ułatwienia usunięcia kości i odsłonięcia mózgu można wykonać opcjonalne cięcie poprzeczne w przedniej części. Szybko wybierz mózg za pomocą zaokrąglonej mikroszpatułki i umieść go w zawiesinie roztworu do sekcji, aby schłodzić go przez ~ 1 minutę. Wlej ~10 mL lodowatego roztworu do sekcji do szalki 60 mm i przenieś mózg z zlewka do szalki. Mózg powinien być całkowicie przykryty roztworem do sekcji.</li>
<li>Pod mikroskopem sekcyjnym: Umieść mózg i utrzymaj go w linii środkowej, dociskając pęsetą sekcyjną do dna szalki 60 mm. Użyj narzędzia do sekcji hipokampa, aby rozdzielić półkule, pozostawiając śródmózowie. Następnie odsłoń hipokampy w każdej półkuli. Delikatnie wybierz hipokamp za pomocą narzędzia do sekcji hipokampa. Użyj igły sekcyjnej, aby całkowicie wyizolować hipokamp i jak najlepiej go oczyścić.</li>
<li>Używając przyciętej końcówki filtra pipety P1000, delikatnie odessij hipokamp i przenieś go na arkusz teflonowy w kroiczeniu tkanek. Ułóż hipokamp stroną wklęsłą do dołu.</li>
<li>Ustaw hipokampy prostopadle do ostrza, aby uzyskać przekroje wieńcowe, i odlej nadmiar płynu.</li>
<li>Krój hipokampy w odstępach co 400 μm.</li>
<li>Wlej ~10 mL zimnego SCM do szalki 60 mm i przenieś pokrojone hipokampy z kroicznika, używając drugiej przyciętej końcówki filtra P1000 i zimnego SCM. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Za pomocą szpatułki irydowej i szpatułki prostej delikatnie rozdziel od siebie plasterki.</li>
<li>Oddziel wyraźne i nieuszkodzone plasterki od tych uszkodzonych.</li>
</ol>
3. Hodowla przekrojów hipokampa
<ol>
<li>Wyjmij z inkubatora płytki sześcio-dołkowe z SCM i wkładkami do hodowli komórkowej. Za pomocą innej przyciętej końcówki z filtrem do pipety P1000 przenieś poszczególne skrawki na membranę. Umieść 4-5 skrawków na jednej membranie. Należy uważać, aby skrawki nie znajdowały się zbyt blisko ścianki wkładki ani zbyt blisko siebie. W razie potrzeby użyj szpatułki irysowej do rozdzielenia skrawków. Usuń nadmiar pożywki. Po umieszczeniu skrawków na membranie unikaj ich dotykania w miarę możliwości.</li>
<li>Włóż płytkę z powrotem do inkubatora i inkubuj w temperaturze 35°C i przy 5% CO2.</li>
<li>Wymieniaj SCM co 48 godzin w komorze z laminarnym przepływem powietrza, odsysając SCM pipetą Pasteura. Dodaj 750 μL świeżego, uprzednio ogrzanego SCM do każdego dołka. Upewnij się, że pod membraną nie powstały pęcherzyki powietrza.</li>
</ol>
4. Roztwory
<ol>
<li>ACSF o niskiej zawartości Na+ – roztwór do sekcji dla kultur skrawków 
Do dejonizowanej i sterylnej H2O dodać: 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Dla 500 mL</td>
 <td>Dla 1000 mL</td>
 <td>Stężenie końcowe</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 (1 M)</td>
 <td>0,5&nbsp; mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>1 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-glukoza</td>
 <td>0,901 g</td>
 <td>1,802 g</td>
 <td>10 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>0,149 g</td>
 <td>0,298 g</td>
 <td>4 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2 (1 M)</td>
 <td>2,5 mL</td>
 <td>5 mL</td>
 <td>5 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>1,092 g</td>
 <td>2,184 g</td>
 <td>26 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sacharoza</td>
 <td>40 g</td>
 <td>80 g</td>
 <td>234 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór czerwieni fenolowej 0,5% w DPBS</td>
 <td>0,5 mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>0,1% v/v</td>
 </tr>
</tbody>
</table> 
Mieszać przez ok. 30 min 
Sterylizować poprzez przefiltrowanie przez filtr 0,22 μm 
Przygotować aliquoty po 50 mL i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez 2 miesiące.</li>
<li>Pożywka do kultur skrawków (SCM) 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Dla 500 mL</td>
 <td>Dla 1000 mL</td>
 <td>Stężenie końcowe</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pożywka MEM Eagle</td>
 <td>4,2 g</td>
 <td>8,4 g</td>
 <td>8,4 g/l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surowica konia inaktywowana ciepłem</td>
 <td>100 mL</td>
 <td>200 mL</td>
 <td>20%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamina (200 mM)</td>
 <td>2,5 mL</td>
 <td>5 mL</td>
 <td>1 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 (1 M)</td>
 <td>0,5 mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>1 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4 (1 M)</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>2 mL</td>
 <td>2 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Insulina (1 mg/mL), rozpuszczona w HCl 0,01 N</td>
 <td>0,5 mL</td>
 <td>1 mL</td>
 <td>1 mg/l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kwas askorbinowy, roztwór (25% w/v)</td>
 <td>0,024 mL</td>
 <td>0,048 mL</td>
 <td>0,00125%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-glukoza</td>
 <td>1,16 g</td>
 <td>2,32 g</td>
 <td>13 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>0,22 g</td>
 <td>0,44 g</td>
 <td>5,2 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hepes</td>
 <td>3,58 g</td>
 <td>7,16 g</td>
 <td>30 mM</td>
 </tr>
</tbody>
</table> 
Mieszać do całkowitego rozpuszczenia i doprowadzić do temperatury pokojowej. 
Dostosować pH do poziomu 7,27–7,28 za pomocą 1 N NaOH 
Zmierzyć osmolarność. Dostosować do 320 mmol/kg za pomocą dejonizowanej i sterylnej H2O. Należy spodziewać się dodania około 25–40 mL. Ponownie sprawdzić osmolarność. 
***pH może nieznacznie ulec zmianie podczas dostosowywania osmolarności, jest to dopuszczalne; ważniejsze jest, aby osmolarność mieściła się w odpowiednim zakresie (317–323). 
Sterylizować poprzez przefiltrowanie przez filtr 0,22 μm. 
Przygotować aliquoty po 20 mL i przechowywać do dwóch-trzech tygodni w temperaturze 4 °C. 
Roztwór zapasowy glutaminy: przygotować w stężeniu 200 mM i przechowywać w temperaturze -20 °C w aliquotach po 2,5 mL. 
Roztwór zapasowy kwasu askorbinowego: przygotować w stężeniu 25% (w/v) i przechowywać w temperaturze -20 °C w aliquotach po 100 μL.</li>
</ol>

5. Reprezentatywne wyniki:
Przekroje pod stereomikroskopem powinny mieć biały kolor, bez czarnych plamek, a obszary CA1, CA3 oraz zakrętu zębaty (Dentate gyrus) powinny być wyraźne i nieuszkodzone. Kontaminacja bakteryjna jest łatwo rozpoznawalna jako ruchome czarne drobinki w medium lub zmętnienie SCM. Po umieszczeniu pod mikroskopem, powierzchnia przekroju po 4 dniach hodowli powinna być czysta, z wyraźnymi i rozróżnialnymi ciałami komórkowymi. Jeśli po 4 dniach nie widać wyraźnych ciał komórkowych, a powierzchnię pokrywa znaczna ilość debris, przekrój nie jest zdrowy.

<ol><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+structure+of+the+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and structure of the issue.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).</li>
<li>Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShepherd%2C+GM+%22The+synaptic+organization+of+the+brain%22">The synaptic organization of the brain</a>. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li>
<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+green+fluorescent+protein+%28GFP%29+into+hippocampal+neurons+through+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+rules+governing+AMPA+receptor+trafficking+to+synapses+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons.</a> Cell. 105, 331-343 (2001).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Esteban, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA+phosphorylation+of+AMPA+receptor+subunits+controls+synaptic+trafficking+underlying+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity.</a> Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).</li>
<li>Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+in+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18, 231-239 (1999).</li>
<li>Barria, A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+NMDA+receptor+trafficking+to+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses.</a> Neuron. 35, 345-353 (2002).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metoda ta opiera się na procedurze opisanej po raz pierwszy przez Stoppini et al. 11 i umożliwia szybką hodowlę skrawków hipokampa. Najważniejszym aspektem tego protokołu jest utrzymanie sterylności skrawków; dlatego kluczowe jest stosowanie odpowiednich technik aseptycznych oraz właściwa dezynfekcja i sterylizacja wszystkich materiałów mających kontakt z tkanką.
Różne źródła surowicy mogą wpływać na jakość otrzymanych skrawków. Zalecamy wcześniejsze przetestowanie kilku p...

<table><tbody><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>płytki 6-dołkowe</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Krojonka do tkanek</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425/51415</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX7-ILLD2-100</td><td></td></tr><tr><td> Narzędzie do wycinania hipokampa</td><td>F.S.T.</td><td>10099-15</td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyce użytkowe. Perfekcja</td><td>F.S.T.</td><td>37500-00/37000-00 praworęczny/leworęczny</td><td></td></tr><tr><td>Spatuła Iris</td><td>F.S.T.</td><td>10093-13</td><td></td></tr><tr><td>Spatuła prosta</td><td>F.S.T.</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka z zaokrągloną łyżeczką</td><td>VWR international</td><td>57949-039</td><td></td></tr><tr><td>Disekcja przy użyciu pojedynczej igły z jednym ostrzem</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>72946</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta anatomiczna</td><td>Dumont</td><td>#2</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki do dyssekcji</td><td>F.S.T.</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>pożywka MEM Eagle</td><td>Cellgro</td><td>50-019 PB</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia inaktywowana ciepłem</td><td>Invitrogen</td><td>26050-88</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>Insulina (1 mg/ml), rozpuszczona w 0,01 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy, roztwór (25%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czerwieni fenolowej 0,5% w DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Hipokamp, będący elementem układu limbicznego, odgrywa istotną rolę w pamięci długotrwałej i nawigacji przestrzennej 1. Neurony hipokampa mogą modyfikować siłę swoich połączeń po krótkich okresach silnej aktywacji. Zjawisko to, znane jako długotrwałe wzmocnienie synaptyczne (LTP), może trwać wiele godzin lub dni i stało się najlepszym kandydatem na mechanizm uczenia się i pamięci 2. Ponadto dobrze określona anatomia i łączność hipokampa 3 sprawiły, że stał się on klasycznym systemem modelowym do badania przekaźnictwa synaptycznego oraz plastyczności synaptycznej4.
Wraz z poszerzaniem wiedzy na temat fizjologii synaps hipokampa i identyfikacją kluczowych cząsteczek, konieczna stała się możliwość manipulacji białkami synaptycznymi. Organotypowe hodowle hipokampa umożliwiają łatwą manipulację genetyczną i precyzyjną interwencję farmakologiczną, zachowując jednocześnie organizację synaptyczną, która jest kluczowa dla zrozumienia funkcji synaps w kontekście bardziej zbliżonym do naturalnego niż w rutynowych metodach hodowli rozproszonych neuronów.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę przygotowania i hodowli skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Metoda ta umożliwia łatwy dostęp do skrawków w celu manipulacji genetycznych z wykorzystaniem różnych podejść, takich jak infekcja wirusowa 5,6 czy biolistyka 7. Ponadto skrawki można łatwo odzyskać do analiz biochemicznych 8 lub przenieść pod mikroskopy w celu obrazowania 9 bądź przeprowadzenia eksperymentów elektrofizjologicznych 10.

Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.

Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Hipokamp, będący elementem układu limbicznego, odgrywa istotną rolę w pamięci długotrwałej oraz nawigacji przestrzennej 1. Neurony hipokampa mogą modyfikować ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla organotypowych skrawków hipokampa. Jest to realizowane poprzez najpierw wypreparowanie hipokampa. Drugim krokiem procedury jest wykonanie skrawków hipokampa.Trzecim krokiem procedury jest oddzielenie i sortowanie skrawków hipokampa. Ostatnim krokiem procedury jest hodowla skrawków hipokampa. W rezultacie można uzyskać zdrowe organiczne skrawki hipokampa, co można potwierdzić za pomocą wizualizacji przy użyciu stereomikroskopu lub mikroskopu.Witajcie, nazywam się Jimena Opitz i jestem naukowcem w laboratorium dr. Andrego Bara na Uniwersytecie Waszyngtońskim w Seattle. Zaprezentuję procedurę hodowli organotypowych plastrów hipokampa. Osoby początkujące w tej metodzie mogą napotykać trudności ze względu na konieczność szybkiej dyssekcji i krojenia hipokampów oraz potrzebę zapobiegania kontaminacji poprzez zastosowanie sterylnego roztworu do dyssekcji i hodowli plastrów.Pożywki można przygotować z wyprzedzeniem do trzech tygodni i przechowywać w temperaturze 4 °C zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Przed przygotowaniem skrawków hipokampa można przygotować hodowle. Niezbędne jest odpowiednie wysterylizowanie zarówno komory z laminarnym przepływem powietrza, jak i sprzętu, który będzie wykorzystywany podczas sekcji.Najpierw przemyj wewnętrzną powierzchnię komory laminarno-ulgawej 70% ethanol. Następnie umieść mikroskop sekcyjny i wszystkie narzędzia do sekcji wewnątrz komory. Przygotuj nacinarkę do tkanek, kładąc czysty arkusz teflonowy na stolem i montując nowe ostrze.Umieść krojankę do tkanek wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą lampy UV wysterylizuj wszystkie powierzchnie oraz sprzęt przez 15 minut. Wyłącz lampę po zakończeniu procesu sterylizacji UV. Praca w komorze do hodowli tkanek.W pierwszej kolejności należy przygotować sześciodołkowe płytki do hodowli tkanek, które zostaną wykorzystane do hodowli plastrów hipokampa. Do każdego dołka płytki sześciodołkowej należy nalać pipetą 750 µL SEM. Następnie, używając sterylnej pęsety, należy umieścić wkład do hodowli komórkowej w każdym dołku płytki do hodowli tkanek.Należy uważać, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza pod wkładką. Ważne jest, aby membrana każdego wkładka do hodowli komórkowych była zwilżona pożywką do hodowli skrawków. Jeśli membrana jest sucha, należy sprawdzić, czy nie występują pęcherzyki powietrza.Jeśli membrana znajduje się powyżej menisku SCM, do studni można dodać więcej pożywki. Umieść przygotowane płytki hodowlane w inkubatorze do hodowli tkankowych. Ustaw temperaturę na 35°C oraz stężenie 5% carbon dioxide do momentu rozpoczęcia dalszych prac.Na koniec napełnij wiaderko z mieszanką lodu i soli i ustaw je obok miejsca dekapitacji, pracując wewnątrz dygestorium. Nalej do zlewki o pojemności 100 mililitrów roztwór do sekcji. Wsuń zlewkę do mieszanki lodu i soli i napowietrzaj roztwór mieszaniną 5%carbon dioxide i 95%oxygen przez 10 do 20 minut, aż kolor zmieni się z różowego na pomarańczowy.Roztwór do sekcji tworzy zawiesinę z zamrożonego i płynnego roztworu. Teraz środowisko do sekcji oraz płytki do hodowli tkanek są gotowe do przeprowadzenia sekcji. Owinięcie P3-P7.Do tej procedury wykorzystuje się szczenięta. Przygotowanie kultur jest możliwe dla maksymalnie trzech szczeniąt jednocześnie. Procedura zostanie przedstawiona na przykładzie jednego szczenięcia.Szybko wy pobierz mózg z odciętej głowy poczwarki wrap i umieść go na jedną minutę w zlewce o pojemności 100 mililitrów zawierającej roztwór do sekcji Slurry Chill. W tym czasie przygotuj naczynie do sekcji, wlewając około 10 mililitrów lodowatego roztworu do sekcji na dno naczynia do hodowli tkanek o średnicy 60 mililitrów. Używając zaokrąglonej łyżeczki lub mikrospatułki, przenieś mózg ze zlewki 100 mililitrów do naczynia 60 mililitrów wypełnionego zimnym medium do sekcji. Upewnij się, że mózg jest całkowicie pokryty roztworem do sekcji.Umieść naczynie z mózgiem pod mikroskopem stereoskopowym. Patrząc przez mikroskop stereoskopowy, zlokalizuj mózg. Za pomocą sterylnej pincety anatomicznej przesuń mózg na środek pola widzenia.Przytrzymaj mózg w linii środkowej, dociskając pęsetę sekcyjną do dna naczynia. Za pomocą narzędzia do sekcji hipokampa delikatnie oddziel półkule korowe od śródmózgowia, pozostawiając śródmózgowie na miejscu; najlepiej zrobić to bez całkowitego odłączania półkul korowych od pozostałej części mózgu, aby odsłonić hipokamp. Następnie za pomocą narzędzia do sekcji hipokampa wyjmij hipokamp z jednej półkuli.Następnie za pomocą igły preparacyjnej oczyścić tkankę, usuwając jak największą ilość materiału spoza obszaru hipokampa. Po wyizolowaniu i oczyszczeniu pierwszego hipokampa powtórzyć tę procedurę dla drugiego hipokampa z drugiej półkuli. Następnie za pomocą sterylnych nożyczek odciąć końcówkę tipsa z filtrem do pipety P 1000.Załóż końcówkę na sterylną pipetę P 1000. Delikatnie odessij jeden hipokamp i nanieś go na arkusz teflonowy w krojonce do tkanek. Następnie w ten sam sposób nanieś drugi hipokamp na krojonkę.Ułóż połówki hipokampa stroną wklęsłą do dołu i ustaw je prostopadle do ostrza, a następnie odessaj nadmiar cieczy z arkusza Teflonu. Ustaw mikrometr w pozycji zero. Przetnij hipokampy na sekcje o grubości 400 micrometer.Przygotuj kolejny przycięty końcówkę z filtrem do pipety P 1000 i zamocuj ją w sterylnej pipecie P 1000. Wlej około 10 mililitrów schłodzonego SCM do 60-milimetrowego sterylnego naczynia do hodowli tkanek. Za pomocą pipety dodaj nieco medium i przenieś skrawki hipokampa z urządzenia do cięcia do naczynia.Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza; po powtórzeniu procesu przenoszenia dla wszystkich plastrów, należy umieścić szalkę pod mikroskopem stereoskopowym. Na koniec, używając szpatułki tępomostkowej i szpatułki prostej, należy delikatnie odseparować plastry od siebie.Oddziel wyraźnie zarysowane i nieuszkodzone plastry od tych uszkodzonych. Wyraźnie zarysowane plastry hipokampa są teraz gotowe do hodowli. Wyjmij z inkubatora wcześniej przygotowane płytki hodowlane z sześcioma dołkami zawierające SCM oraz wkładki do hodowli komórkowej; za pomocą pipety P 1000 z szerokim, przyciętym końcem przenieś od czterech do pięciu pojedynczych plastrów na każdą membranę.W razie potrzeby należy użyć szpatułki do irydy, aby rozdzielić plastry. Należy uważać, by nie umieszczać plastrów zbyt blisko ścianki wkładki ani w bezpośrednim sąsiedztwie siebie. Odessaj nadmiar medium z górnej powierzchni hodowli komórkowej, uważając, aby nie dotknąć plastrów.Włóż membranę. Na koniec umieść płytkę, zawierającą teraz hodowle przekrojów hipokampa, z powrotem w inkubatorze do hodowli tkanek. Ustaw temperaturę na 35 °C oraz stężenie 5% carbon dioxide.Po 48 godzinach wyjmij płytkę z inkubatora, pracując wewnątrz dygestorium do hodowli tkanek. Odessać pożywkę za pomocą pipety Pasteura. Dodać 750 µL świeżego, uprzednio ogrzanego SCM na otwór.Ponownie upewnij się, że pod membraną wkładki do hodowli komórkowych nie utworzyły się pęcherzyki powietrza. Jest to przykład zdrowego skrawka hipokampa gotowego do hodowli. Wyraźnie widoczne i nieuszkodzone są obszary hipokampa: CA1, CA3 oraz zakręt zębaty.Przedstawiony tutaj uszkodzony skrawek hipokampa nie został użyty do hodowli. Na koniec, oto przykład zdrowego skrawka hipokampa po czterech dniach hodowli. Należy zauważyć, że skrawek w świetle mikroskopu stereotypowego ma biały kolor, a jego powierzchnia jest czysta.Obszary hipokampa, takie jak pole CA1, CA3 oraz zakręt zębaty, są wyraźnie widoczne i nieuszkodzone. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje około jednej godziny, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest pamiętanie o stosowaniu odpowiednich technik sterylnych oraz delikatnym obchodzeniu się z tkanką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak hodować organotypowe plastry hipokampa.Dziękujemy i życzymy powodzenia w eksperymentach.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Tkankowe kultury przekrojów hipokampu

Organoptypowy model hodowli plastrów hipokampa jest modelem in vitro stosowanym do badania uszkodzeń neuronalnych w różnych paradygmatach. W niniejszym artykule opisujemy metody przygotowania hodowli plastrów oraz ilościowego oznaczania uszkodzeń neuronalnych.

Model organotypowej hodowli skrawków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów

Ten film demonstruje metodę przygotowania organotypowych kultur wycinków hipokampa z mózgu szczeniaka szczura. Przedstawia etapy związane z sekcją hipokampa, krojeniem i warunkami hodowli wymaganymi do promowania żywotności i wzrostu komórek w wycinkach hipokampa, ostatecznie generując organotypowe kultury warstwowe.

Przygotowanie organtypowych kultur plasterkowych z hipokampa szczeniaka szczura

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Nagrania par to równoczesne nagrania klamrów całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów, umożliwiające precyzyjną elektrofizjologiczną i farmakologiczną charakterystykę synaps między poszczególnymi neuronami. Poniżej opisujemy szczegółową metodologię i wymagania dotyczące ustalenia tej techniki w organotypowych kulturach plastrów hipokampa w dowolnym laboratorium wyposażonym do elektrofizjologii.

Sparowane nagrania całych komórek w organotypowych wycinkach hipokampa

Przedstawiono protokół dla organotypowych kultur entorhino-hipokampowych, który pozwala na odtworzenie wielu aspektów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu. Badając zmiany układu nerwowo-naczyniowego oprócz zmian w neuronach, protokół ten jest wszechstronnym narzędziem do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie.

Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego czujnika opartego na FRET ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych przodomózgowia myszy. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać ten czujnik do dynamicznego obrazowania komórkowych poziomów ATP w neuronach i astrocytach.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Poznaj metodę hodowli organotypowych plasterków hipokampa zachowujących architekturę tkanki przez dwa tygodnie. Technika umożliwia badanie funkcji mózgu w kontrolowanych warunkach in vitro.

Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Przeglądaj więcej filmów