Name: Kwantyfikacja dsDNA za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 i barwnika PicoGreen (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj kwantyfikację dsDNA metodą fluorescencyjną z barwnikiem PicoGreen i spektrofotometrem Hitachi F-7000. Technika ta umożliwia precyzyjne oznaczanie DNA z wysoką czułością i dokładnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Konfiguracja urządzenia
<ol>
 <li>Włącz spektrofluorometr i odczekaj 1 godzinę na jego rozgrzanie.</li>
 <li>Za pomocą programu Excel utwórz plik z danymi dla wzorców i próbek, jak pokazano na Rysunku 1, i zapisz go w formacie wartości rozdzielanych przecinkami „csv”. 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="Tabela danych o stężeniu w formacie arkusza kalkulacyjnego dla pomiarów wzorców i próbek w mg/ml." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 1"> 
 Rysunek 1. Dane wzorców i próbek. 
 
 </li>
 <li>Skonfiguruj fluorometr w następujący sposób:
 <ol>
 <li>Kliknij przycisk <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="Ikona schematu metody chemicznej z probówką i chromatogramem, symbolizująca techniki analizy laboratoryjnej." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Icon 1">, co otworzy okno Metody Analizy (Analysis Method), przedstawione na Rys. 2. 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="Konfiguracja metody fotometrii w spektrofluorometrze F-7000 FL; interfejs wprowadzania danych do analizy spektroskopowej." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 2"> 
 Rysunek 2. Okno Metody Analizy, karta Ogólne (General). 
 
 Dokonaj następujących wyborów:
 <ul>
 <li>W polu „Pomiar” (Measurement) wybierz z menu rozwijanego opcję Fotometria (Photometry).</li>
 <li>W polu „Operator” wprowadź imię i nazwisko odpowiedniego operatora.</li>
 <li>Nie ma potrzeby wprowadzania informacji w polu „Instrument”. Jest on wybierany automatycznie przez oprogramowanie.</li>
 <li>Pole „Próbkowanie” (Sampling) jest nieaktywne podczas korzystania z czytnika mikropłytek.</li>
 <li>W polu „Komentarze” (Comments) wpisz wszelkie uwagi, które powinny znaleźć się w raporcie.</li>
 <li>W polu „Akcesorium” (Accessory) wprowadź informacje dotyczące akcesoriów użytych w tym badaniu.</li>
 <li>Zwróć uwagę na przyciski po prawej stronie okna.</li>
 <li>Przycisk „Wczytaj” (Load) umożliwia wczytanie wcześniej zapisanych Metod Analizy.</li>
 <li>Przycisk „Zapisz” (Save) umożliwia aktualizację zestawu parametrów testu lub wcześniej zapisanej i wczytanej Metody Analizy przy użyciu tej samej nazwy.</li>
 <li>Przycisk „Zapisz jako” (Save As) umożliwia zapisanie nowego zestawu parametrów testu lub Metody Analizy pod wybraną nazwą.</li>
 </ul>
 Następnie kliknij kartę „Ilościowe” (Quantitation), patrz Rysunek 3, i dokonaj następujących wyborów. 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="Konfiguracja metody oznaczania ilościowego dla analizy długości fali; wprowadzenie parametrów kalibracji i stężenia." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 3"> 
 Rysunek 3. Okno Metody Analizy, karta Ilościowe (Quantitation). 
 <ul>
 <li>W polu „Typ oznaczania ilościowego” (Quantitation type) wybierz Długość fali (Wavelength). Oznacza to, że odczyt fluorescencji zostanie wykonany przy użyciu wybranej długości fali.</li>
 <li>W polu „Typ kalibracji” (Calibration type) wybierz 1st order (pierwszy rząd).</li>
 <li>W polu „Liczba długości fal” (Number of wavelengths) wybierz 1.</li>
 <li>W polu „Jednostka stężenia” (Concentration unit) wprowadź ng/mL.</li>
 <li>Pozostaw niezaznaczone pola „Kalibracja ręczna” (Manual Calibration) i „Wymuś przejście krzywej przez zero” (Force curve through zero).</li>
 <li>W polu „Cyfry po przecinku” (Digit after decimal point) wybierz 2.</li>
 <li>W polu „Dolna granica stężenia” (Lower concentration limit) wprowadź 0.</li>
 <li>W polu „Górna granica stężenia” (Upper concentration limit) wprowadź 10000.</li>
 </ul>
 
 Teraz kliknij kartę „Instrument” i dokonaj następujących wyborów. 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="Interfejs metody analizy danych fluorescencyjnych, konfiguracja parametrów spektroskopowych, opcje emisji/wzbudzenia." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 4"> 
 Rysunek 4. Okno Metody Analizy, karta Instrument. 
 <ul>
 <li>W polu „Tryb danych:” (Data mode:) wybierz Fluorescencja (Fluorescence).</li>
 <li>Pole „Prędkość cięcia” (Chopping speed) jest obecnie nieaktywne; służy ono wyłącznie do pomiarów fosforescencji.</li>
 <li>W polu „Tryb długości fali” (Wavelength mode) wybierz Obie WL stałe (Both WL fixed).</li>
 <li>W polu „EX / WL1” wprowadź 480nm.</li>
 <li>W polu „EM / WL1” wprowadź 520nm.</li>
 <li>Wszystkie pozostałe pola w sekcjach EX i EM są obecnie nieaktywne.</li>
 <li>W polu „Szczelina EX” (EX slit) wybierz z menu rozwijanego 5.0nm.</li>
 <li>W polu „Szczelina EM” (EM slit) wybierz z menu rozwijanego 5.0nm.</li>
 <li>Pozostaw niezaznaczone pole przy polu „Napięcie PMT 1-1000V” (PMT Voltage 1-1000V).</li>
 <li>W polu „Napięcie PMT” (PMT Voltage) wybierz z menu rozwijanego 700V.</li>
 <li>W polu „Liczba do auto statystyk” (Auto statistic calc. number) wybierz 2.</li>
 <li>W polu „Powtórzenia” (Replicates) wybierz 1.</li>
 <li>W polu „Czas całkowania” (Integration time) wybierz 0.1s.</li>
 <li>W polu „Opóźnienie” (Delay) wprowadź lub wybierz 0s.</li>
 </ul>
 Kliknij kartę „Monitor”. 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="Okno ustawień metody analizy; konfiguracja limitu osi Y w oprogramowaniu do przetwarzania danych." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 5"> 
 Rysunek 5. Okno Metody Analizy, karta Monitor. 
 <ul>
 <li>W polu „Oś Y”, „Maks:” (Y axis, Max:), wybierz 10000.</li>
 <li>W polu „Oś Y”, „Min:” (Y axis, Min:), wybierz 0.</li>
 <li>Zaznacz pole po lewej stronie opcji „Otwórz przetwarzanie danych po akwizycji danych” (Open data processing after data acquisition).</li>
 <li>Pozostaw niezaznaczone pole po lewej stronie opcji „Drukuj raport po akwizycji danych” (Print report after data acquisition), chyba że chcesz, aby raport był drukowany automatycznie po zakończeniu odczytów.</li>
 </ul>
 Kliknij kartę „Raport” (Report), patrz Rysunek 6. 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="Ustawienia metody analizy dla drukowania raportu; zawiera opcje danych, metody i krzywej kalibracyjnej." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 6"> 
 Rysunek 6. Okno Metody Analizy, karta Raport (Report). 
 <ul>
 <li>W polu „Wyjście” (Output) wybierz z menu rozwijanego opcję Drukuj Raport (Print Report). Można również wybrać „Użyj Microsoft Excel” (Use Microsoft Excel), jeśli dane mają zostać wyeksportowane do programu Excel, lub „Użyj arkusza generatora wydruków” (Use Print Generator Sheet), jeśli korzystasz z opcjonalnego programu dodatkowego Report Generator, który umożliwia tworzenie spersonalizowanych raportów.</li>
 <li>Zaznacz pola przy elementach, które chcesz uwzględnić w raporcie.</li>
 <li>Aby zapisać wszystkie wybrane parametry na różnych kartach okna „Metoda Analizy”, kliknij ponownie kartę „Ogólne” (General), zapisz je pod wybraną nazwą pliku w lokalizacji, która umożliwi ich późniejsze odnalezienie, a następnie kliknij przycisk „OK”, aby zamknąć to okno.</li>
 <li>To kończy konfigurację parametrów testowych instrumentu.</li>
 <li>Teraz skonfigurujemy czytnik mikropłytek.</li>
 <li>Kliknij przycisk <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="Ikona oprogramowania MPR do wizualizacji i analizy danych w badaniach naukowych." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Icon 2">, co spowoduje wyświetlenie okna Konfiguracji MPR (MPR Setup) na pierwszym planie.</li>
 </ul>
 Wybierz studzienki dla wzorców i próbek w oknie Konfiguracji MPR/karcie Płyta (Plate), jak pokazano na Rysunku 7. 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="Schemat okna konfiguracji MPR dla analizy mikropłytek, podkreślający dostosowanie pozycji próbek." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 7"> 
 Rysunek 7. Okno konfiguracji MPR, karta Płyta (Plate). 
 <ul>
 <li>Kliknij pozycję A1 i przeciągnij myszą do E1, a następnie kliknij przycisk <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt='Przycisk z napisem „Standard Set” w interfejsie użytkownika oprogramowania.' data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Icon 3">. Wybierze to pozycje, które będą służyć jako wzorce. Pozycje te zostaną podświetlone na zielono.</li>
 <li>Teraz musimy wybrać pozycje od F1 do H3 dla próbek. Kliknij i przeciągnij myszą od pozycji F1 do pozycji H3, a następnie kliknij przycisk <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt='Przycisk z napisem „Sample Set” służący do wyboru lub wprowadzania opcji.' data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Icon 4">; spowoduje to podświetlenie tych pozycji na żółto.</li>
 <li>Następnie powtórz tę samą operację dla pozycji od A2 do E3, aby wybrać te pozycje do pomiarów próbek.</li>
 <li>Teraz wczytaj wcześniej przygotowany plik wartości rozdzielanych przecinkami (csv) z informacjami o wzorcach i próbkach.</li>
 </ul>
 Kliknij kartę „Informacje o studzienkach” (Well information) w oknie „Konfiguracja MPR”, jak pokazano na Rysunku 8. 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="Schemat konfiguracji MPR dla rozmieszczenia próbek na płytce 96-dołkowej, podkreślający początkowe współrzędne studzienek." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 8"> 
 Rysunek 8. Okno konfiguracji MPR, karta Informacje o studzienkach (Well Information). 
 <ul>
 <li>Następnie kliknij przycisk <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt='Przycisk interfejsu użytkownika z napisem „Load Well Information” służący do dostępu do bazy danych w oprogramowaniu inżynierii naftowej.' data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Icon 5">. Otworzy się okno Eksploratora Windows, jak pokazano na Rysunku 9, co pozwoli zlokalizować plik „Well information.csv” i go wczytać. 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="Okno konfiguracji MPR; wprowadzanie DNA do analizy testu fluorescencyjnego, pokazujące import danych z pliku CSV." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 9"> 
 Rysunek 9. Wczytywanie informacji o próbkach w studzienkach. 
 Po wczytaniu pliku „Well information”, informacje o studzienkach będą wyglądać jak na Rysunku 10. 
 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="Interfejs konfiguracji czytnika mikropłytek dla danych o stężeniu w analizie testu fluorescencyjnego." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 10"> 
 Rysunek 10. Wczytane informacje o próbkach w studzienkach. 
 </li>
 </ul>
 </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek do analizy Picogreen
<ol>
 <li>Przygotować bufor TE 1X (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), dodając 1 mL buforu TE 20X do 19 mL dI H2O.</li>
 <li>Przygotować roztwór odczynnika PicoGreen, dodając 50 μL odczynnika PicoGreen 200X do 9,95 mL buforu TE 1X.</li>
 <li>Przygotować wzorce (Lambda dsDNA), wykonując rozcieńczenia seryjne z roztworu stokowego dsDNA (100 μg/mL). Najpierw przygotować roztwór dsDNA o stężeniu 50 μg/mL, dodając 25 μL stokowego dsDNA (100 μg/mL) i 25 μL buforu TE 1X. Następnie przygotować roztwory wzorcowe, dodając wskazane objętości dsDNA i buforu, zgodnie z poniższą tabelą:
 <table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Stężenie dsDNA</td>
 <td>Objętość dsDNA</td>
 <td>Objętość buforu</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 μg/mL</td>
 <td>20 μL dsDNA 50 μg/mL</td>
 <td>980 μL buforu TE 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0,1 μg/mL</td>
 <td>100 μL dsDNA 1 μg/mL</td>
 <td>900 μL buforu TE 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0,01 μg/mL</td>
 <td>100 μL dsDNA 0,1 μg/mL</td>
 <td>900 μL buforu TE 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0,001 μg/mL</td>
 <td>100 μL dsDNA 0,01 μg/mL</td>
 <td>900 μL buforu TE 1X</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
</ol>
3. Pomiar fluorescencji wzorców i próbek
<ol>
 <li>Pipetuj 150 μL każdego standardu do dołków A1-E1 płytki 96-dołkowej, zgodnie z Rysunkiem 7 oraz poniższą tabelą:
 <table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Dołek</td>
 <td>Standard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>A1</td>
 <td>1 μg/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B1</td>
 <td>0,1 μg/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C1</td>
 <td>0,01 μg/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D1</td>
 <td>0,001 μg/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E1</td>
 <td>1 X Bufor TE</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Pipetuj 150 μL nieznanych próbek do dołków od F1 do H3, przedstawionych na Rysunku 7</li>
 <li>Przelej roztwór PicoGreen przygotowany w kroku 1.2 do korytka przeznaczonego do pipet wielokanałowych. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 150 μL roztworu PicoGreen do dołków A1-H3. Delikatnie wymieszaj roztwór ze standardami za pomocą pipety.</li>
 <li>Umieść płytkę w ciemnym miejscu i odczekaj 2-5 minut do czasu zajścia reakcji.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Poprawność krzywej kalibracyjnej ocenia się na podstawie różnych parametrów dostarczanych przez oprogramowanie F-7000 podczas pomiaru wzorców i obliczania krzywej kalibracyjnej przez program.
Współczynnik determinacji wskazuje stopień dopasowania zmierzonych standardów do wyznaczonej krzywej kalibracyjnej. Im wartość ta jest bliższa „1”, tym lepsze dopasowanie wartości zmierzonej do krzywej kalibracyjnej.
Jeśli wartość znacznie odbiega od „1”, należy ponownie zmierzyć standardy, przygotować je od nowa lub zmienić dopasowanie krzywej kalibracyjnej.
Rysunek 11 przedstawia przykład krzywej kalibracyjnej z obliczonym współczynnikiem determinacji = 0,99993, uzyskanej podczas ilościowego oznaczania dsDNA z użyciem barwnika PicoGreen.
<img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="Standardowy wykres kalibracyjny, liniowa regresja pierwszego rzędu, ng/ml, analiza stężenia, R²=0.999." data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 11"> 
 Rysunek 11. Przykład krzywej kalibracyjnej dsDNA.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li>
</ol>

Luis A. Moreno i Kendra L. Cox są zatrudnieni w firmie Hitachi High Technologies America, która produkuje instrument wykorzystany w niniejszym artykule.

Staranne pipetowanie podczas przygotowania próbek, a także zastosowanie stabilnego i czułego spektrofotometru fluorescencyjnego, są niezbędne do uzyskania dobrych i powtarzalnych wyników.
W przypadku spektrofotometru fluorescencyjnego użytego w tym badaniu zaleca się stosowanie końcowej objętości próbki wynoszącej 300 μL w czytniku mikropłytek. Mniejsza objętość zmniejsza czułość, natomiast większa objętość może spowodować kontaminację krzyżową między dołkami.

<table><tbody><tr><td>Woda destylowana H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania dsDNA Quant-iT Picogreen firmy Invitrogen</td><td>Odczynnik</td><td></td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne mikropłytki Nalge Nunc nr kat. 237108</td><td>Materiały</td><td></td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>12-kanałowa mikropipeta Eppendorf</td><td>Materiały</td><td></td><td>3516677</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Eppendorf 1000 &amp;mu;L</td><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Eppendorf 200 &amp;mu;L </td><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 mL</td><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr fluorescencyjny Hitachi F-7000 z oprogramowaniem FL Solutions 2.1</td><td>Sprzęt</td><td></td><td>5J1-0003</td><td></td></tr><tr><td>Akcesorium do odczytu mikropłytek dla modelu F-7000</td><td>Sprzęt</td><td></td><td>5J0-0139</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe oznaczenie dsdna przy użyciu spektrofotometru fluorescencyjnego hitachi f-7000 i barwnika picogreen

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Ilościowe oznaczanie DNA, zwłaszcza w niskich stężeniach, jest istotnym zadaniem o szerokim zakresie zastosowań biologicznych, obejmującym standardowe testy biologii molekularnej, takie jak synteza i oczyszczanie DNA, zastosowania diagnostyczne, m.in. oznaczanie ilości produktów amplifikacji DNA, oraz wykrywanie cząsteczek DNA w preparatach leków. W tym filmie zaprezentujemy możliwości spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 wyposażonego w akcesorium do odczytu mikropłytek w celu przeprowadzenia oznaczania ilościowego dsDNA przy użyciu zestawu odczynników barwiących Molecular Probes Quant-it PicoGreen.
Spektrofotometr fluorescencyjny F-7000 zapewnia wysoką czułość i szybkość pomiarów. Jest to wysoce elastyczny system umożliwiający pomiar fluorescencji, luminescencji i fosforescencji. Dostępnych jest kilka trybów pomiarowych, w tym skanowanie długości fali, skanowanie czasowe, fotometria oraz pomiar skanowania 3D. Spektrofotometr charakteryzuje się czułością na poziomie 50 picomoli fluoresceiny przy objętości próbki 300 μL w mikropłytce i umożliwia pomiary z prędkością skanowania do 60 000 nm/minutę. Posiada również szeroki zakres dynamiczny, wynoszący do 5 rzędów wielkości, co pozwala na stosowanie krzywych kalibracyjnych w szerokim zakresie stężeń. Układ optyczny opiera się w całości na optyce refleksyjnej, aby zapewnić maksymalną energię i czułość. Standardowy zakres długości fal wynosi od 200 do 750 nm i może zostać rozszerzony do 900 nm przy zastosowaniu jednego z opcjonalnych fotopowielaczy bliskiej podczerwieni. System umożliwia opcjonalną kontrolę temperatury czytnika płytek w zakresie od 5 do 60 °C przy użyciu zewnętrznego, opcjonalnego cyrkulatora cieczy z regulacją temperatury. Czytnik mikropłytek umożliwia stosowanie mikropłytek 96-dołkowych, a czas pomiaru dla 96 dołków wynosi mniej niż 60 sekund w trybie kinetycznym.
Oprogramowanie sterujące urządzeniami F-7000 oraz czytnikiem mikropłytek jest również wysoce elastyczne. Próbki można ustawić w formacie kolumnowym lub wierszowym, a do pomiarów można wybrać dowolną kombinację studzienek. Pozwala to na optymalne wykorzystanie mikropłytki. Dodatkowo oprogramowanie umożliwia importowanie konfiguracji próbek na mikropłytce utworzonych w programie Excel i zapisanych w formacie wartości rozdzielanych przecinkami, czyli formacie „csv”. Konfiguracje pomiarowe mikropłytek mogą być zapisywane i przywoływane przez oprogramowanie w celu zwiększenia wygody i wydajności pracy. Wyniki danych mogą być eksportowane do standardowego raportu, do programu Excel lub do opcjonalnego programu Generator Raportów.

Demonstracja ilościowego oznaczenia dsDNA przy użyciu barwnika PicoGreen firmy Molecular Probes oraz spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 wyposażonego w akcesorium do odczytu mikropłytek.

Ilościowe oznaczenie dsDNA przy użyciu spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 i barwnika PicoGreen

Ilościowe oznaczenie DNA, zwłaszcza w niskich stężeniach, jest istotnym zadaniem o szerokim zakresie zastosowań biologicznych, obejmującym standardowe analizy molekularne...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie możliwości spektrofotometru fluorescencyjnego F 7 000 z czytnikiem mikropłytek do ilościowego oznaczenia dwuniciowego DNA przy użyciu barwnika Pico Green. Jest to realizowane poprzez przygotowanie próbek i odczynników, a następnie konfigurację instrumentu.Trzecim krokiem procedury jest umieszczenie próbek w czytniku mikropłytek. Ostatnim etapem procedury jest wykonanie pomiaru standardów i próbek. W rezultacie można uzyskać liniową krzywą kalibracyjną, która może zostać wykorzystana do kwantyfikacji dwuniciowego DNA w próbach o nieznanym stężeniu.Włącz fluorymetr Hitachi F 7, 000 Spectra, aby lampa ksenonowa mogła się rozgrzać przez jedną godzinę. Utwórz w programie Excel plik zawierający dane standardów i próbek, a następnie zapisz go w formacie wartości rozdzielonych przecinkami (CSV). Aby skonfigurować fluorymetr, najpierw kliknij przycisk „method”, który otwiera okno metody analizy.W polu pomiaru wybierz z menu rozwijanego opcję fotometria. Następnie kliknij kartę ilościowa. W polu typu ilościowania wybierz długość fali, aby wskazać, że odczyt fluorescencji zostanie wykonany przy określonej długości fali.W polu typ kalibracji wybierz pierwszy rząd, a w polu liczba długości fal wybierz jedną. Jako jednostkę stężenia wprowadź nanogramy na mililitr. Upewnij się, że pola kalibracja ręczna oraz wymuszenie krzywej przez zero nie są zaznaczone. W polu liczba cyfr po przecinku wybierz dwie, dla dolnego limitu stężenia wprowadź zero, a dla górnego limitu stężenia wprowadź 10 000.Następnie kliknij kartę urządzenia i w polu trybu danych wybierz fluorescencję. Upewnij się, że pole prędkości rąbania jest nieaktywne, ponieważ służy ono wyłącznie do pomiarów fosforescencji. W polu trybu długości fali wybierz opcję WL fixed w polu ex WL, a w polu EM WL wprowadź 480 nanometrów.Wprowadź wartość 520 nanometrów. Pozostaw wszystkie pozostałe pola w sekcjach EX i EM nieaktywne. Ustaw szerokość szczeliny wzbudzenia (ex slit) oraz szczeliny emisyjnej (EM slit) na 5.0 nanometrów.Korzystając z menu rozwijanych, pozostaw nie zaznaczone pole przed polem napięcia PMT 1000 voltów. Dla napięcia PMT wybierz z menu rozwijanego wartość 700 voltów. Wybierz również wartość dwa dla auto statistic calc number, jeden dla replicates, 0.1 seconds dla integration time oraz zero dla delay.Teraz otwórz zakładkę monitor i ustaw pole max dla osi Y na 10 000 oraz pole min dla osi Y na zero. Następnie zaznacz pole po lewej stronie opcji open data processing after data acquisition oraz, jeśli jest to wymagane, pole po lewej stronie opcji print report after data acquisition, aby raport został wydrukowany automatycznie po zakończeniu odczytów. Na koniec, aby zapisać wszystkie wybrane parametry w różnych zakładkach okna metody analizy, kliknij zakładkę general i zapisz plik pod nową nazwą w określonej lokalizacji.Kliknij przycisk OK, aby zamknąć to okno. Tym samym kończy się konfiguracja parametrów testu urządzenia. Aby skonfigurować czytnik mikropłytek, kliknij przycisk MPR, aby przenieść okno konfiguracji MPR na pierwszy plan.W pierwszej kolejności wybierz dołki dla standardów. Na przykład kliknij pozycję A1 i przeciągnij myszą do E1. Następnie kliknij przycisk ustawiania standardów.To działanie spowoduje zaznaczenie pozycji przeznaczonych dla wzorców, które zostaną podświetlone na kolor zielony. Następnie należy wybrać pozycje dla próbek. W podobny sposób należy kliknąć i przeciągnąć myszą nad odpowiednimi pozycjami na płytce, a następnie kliknąć przycisk zestawu próbek, co automatycznie podświetli wybrane pozycje na kolor żółty.Powtarzaj tę samą operację dla pozycji wybranych pomiarów próbek. Aby wczytać informacje o standardach i próbkach do wcześniej przygotowanego pliku zmiennych rozdzielanych przecinkami, kliknij kartę informacji o dołkach (well information) w oknie konfiguracji MPR.Wybierz przycisk ładowania informacji o dołkach, po czym otworzy się okno Eksploratora Windows, aby zidentyfikować plik dot csv z informacjami o dołkach. Po załadowaniu informacji okno powinno wyświetlić się w formie tabeli. Aby przygotować roztwór roboczy odczynnika Pico green, dodaj 50 µL 200 X odczynnika pico green do 9,95 mL buforu TE.Do przygotowania krzywej standardowej należy sporządzić rozcieńczenia szeregowe dwuniciowego DNA Lambda w buforze TE, aby uzyskać stężenia końcowe w zakresie od 1 do 100 ng/ml. Następnie należy nanieść 150 µl każdego standardu do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej. Kolejnym krokiem jest naniesienie 150 µl każdej próbki testowej do odpowiadających im dołków płytki. Następnie, używając pipety wielokanałowej, należy dodać 150 µl roztworu PicoGreen do każdego dołka, a następnie wymieszać roztwór z próbkami DNA.Inkubuj delikatnie płytkę w ciemnym miejscu przez dwie do pięciu minut, aby reakcja mogła zajść. Kliknij przycisk ekranu wyświetlacza MPR, aby okno konfiguracji MPR pojawiło się na wierzchu ekranu, a następnie kliknij przycisk pozycji wymiany. Platforma trzymająca mikropłytkę przesunie się w stronę przedniej części instrumentu; otwórz drzwiczki czytnika mikropłytek i umieść płytkę 96-dołkową na platformie trzymającej tak, aby dołek A1 był skierowany do przodu, a następnie zamknij drzwiczki czytnika mikropłytek.Kliknij przycisk pozycji początkowej, aby umieścić pozycję A mikropłytki w pozycji pomiarowej. Kliknij przycisk wyświetlacza monitora, aby przenieść okno pomiarowe na wierzch ekranu. Kliknij przycisk pomiaru, aby rozpocząć pomiar standardów i próbek nieznanych.Poprawność krzywej kalibracyjnej ocenia się za pomocą różnych parametrów dostarczanych przez oprogramowanie F 7, 000. Na przykład, ta idealna krzywa kalibracyjna otrzymana dla ilościowego oznaczenia dwuniciowego DNA z użyciem barwnika Pico Green posiada obliczony współczynnik determinacji wynoszący 0,99993. Opisany system wysokoprzepustowy stanowi seryjny zespół technologii, obejmujący barwnik Pico Green, spektrofotometr fluorescencyjny Hitachi F 7, 000 wyposażony w czytnik mikropłytek oraz program komputerowy do automatyzacji zbierania, przechowywania, analizy i prezentacji danych.Połączenie potężnych technologii może odpowiedzieć na rosnącą potrzebę dokładnej analizy niewielkich ilości dwuniciowego DNA.

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kwantyfikacja dsDNA za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 i barwnika PicoGreen

Zastosowanie systemów mikroobjętościowych NanoDrop jako praktycznych i wydajnych alternatyw dla tradycyjnej metodologii oznaczania ilości kwasów nukleinowych opisano poprzez prezentację dwóch protokołów mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych.

Mikroobjętościowe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych za pomocą NanoDrop

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR, który może być używany do jednoczesnego ilościowego oznaczania Enterococcus spp. i markerów genetycznych HF183 jako wskaźników ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach rekreacyjnych.

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Ta metoda pozwala na selektywne barwienie i kwantyfikację DNA w żelach poprzez nasączenie żelu w roztworze SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium, a następnie wystawienie go na działanie światła słonecznego lub źródła niebieskiego światła. Powoduje to powstanie widocznego osadu i nie wymaga prawie żadnego sprzętu, dzięki czemu idealnie nadaje się do użytku w terenie.

Metoda barwienia DNA oparta na wytrącaniu się formazanu wywołanym ekspozycją na światło niebieskie

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) przy użyciu specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA λ i białka znakowanego kropkami kwantowymi.

Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Ten protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białka, oferując korzyści w postaci minimalnej utraty próbki białka i wysokiej dokładności danych.

Wykrywanie interakcji białko-baldaszek CD40 za pomocą różnicowej fluorescencji skaningowej

W pracy przedstawiono prosty, przyjazny dla użytkownika ratiometryczny test FRET do wykrywania i ilościowej oceny aktywności DNazy oraz wykazano jego zastosowanie w analizie słabej nukleazy.

Ocena aktywności DNazy za pomocą ratiometrycznego transferu energii rezonansu fluorescencji

Protokół ten przedstawia projekt podzielonych sond hybrydyzacyjnych wykorzystujących fluorescencyjny aptamer, świecący aptamer DAP-10-42 jako reporter sygnału oraz ich zastosowanie do wykrywania kwasów nukleinowych i różnicowania celów z podstawieniami pojedynczych nukleotydów.

Dzielona sonda hybrydyzacyjna wykorzystująca fluorescencyjny aptamer rozświetlający DNA jako reporter sygnału do analizy kwasów nukleinowych specyficznych dla sekwencji

Protokół ten zapewnia szczegółowe operacje dotyczące przygotowania próbek, zbierania danych oraz analizy widm fluorescencji wewnętrznej DNA.

Spektroskopowe obrazowanie cząsteczek DNA z użyciem kontrastu wewnętrznego

Poznaj kwantyfikację dsDNA metodą fluorescencyjną z barwnikiem PicoGreen i spektrofotometrem Hitachi F-7000. Technika ta umożliwia precyzyjne oznaczanie DNA z wysoką czułością i dokładnością.

Ilościowe oznaczenie dsDNA przy użyciu spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 i barwnika PicoGreen

Przeglądaj więcej filmów