Kwantyfikacja dsDNA za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 i barwnika PicoGreen
5 listopada 2010
Demonstracja kwantyfikacji dsDNA za pomocą sond molekularnych barwnika PicoGreen i spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 wyposażonego w czytnik mikropłytek.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie zdolności spektrofotometru fluorescencyjnego F 7 000 z czytnikiem mikropłytek do wykonywania dwuniciowej kwantyfikacji DNA przy użyciu zielonego barwnika Pico. W tym celu należy najpierw przygotować próbki i odczynniki. Drugim krokiem procedury jest konfiguracja instrumentu.
Trzecim krokiem procedury jest załadowanie próbek do czytnika mikropłytek. Ostatnim etapem procedury jest wykonanie pomiaru wzorców i próbek. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują liniową krzywą kalibracyjną, którą można wykorzystać do kwantyfikacji dwuniciowego DNA nieznanych próbek.
Włącz fluorymetr Hitachi F 7 000 Spectra, aby umożliwić rozgrzanie lampy ksenonowej przez godzinę w programie Excel. Utwórz plik ze standardami i przykładowymi danymi i zapisz go w formacie CSV z wartościami oddzielonymi przecinkami lub w formacie CSV. Aby najpierw skonfigurować fluorymetr, kliknij przycisk metody, który otwiera okno metody analizy.
W polu pomiaru wybierz fotometrię z menu rozwijanego. Teraz kliknij zakładkę kwantyfikacji. W polu typu kwantyfikacji wybierz długość fali, aby wskazać, że odczyt fluorescencji zostanie wykonany przy użyciu określonej długości fali.
Jako typ kalibracji wybierz pierwszą kolejność, a dla liczby długości fal wybierz jedną. Wprowadź nanogramy na mililitr jako jednostkę stężenia. Upewnij się, że ręczna kalibracja i krzywa siły przez pola zerowe nie są sprawdzane pod kątem cyfry Po przecinku dziesiętnym wybierz dwa, wprowadź zero dla dolnego limitu stężenia i 10 000 dla górnego pola limitu stężenia.
Następnie kliknij na zakładkę przyrządu i w polu trybu danych wybierz fluorescencję. Sprawdź, czy pole prędkości cięcia jest nieaktywne, ponieważ jest używane tylko do pomiarów fosforescencji. W polu trybu długości fali wybierz oba WL stałe w polu ex WL one, wprowadź 480 nanometrów w polu EM WL one.
Wprowadź 520 nanometrów. Pozostaw wszystkie inne pola w sekcjach EX i EM jako nieaktywne. Ustaw zarówno szczelinę ex, jak i szczelinę EM na 5.0 nanometrów.
Korzystając z menu rozwijanych, pozostaw pole przed napięciem PMT od jednego do 1000 woltów niezaznaczone. Dla napięcia PMT wybierz 700 woltów z menu rozwijanego. Wybierz również dwa dla obliczeń automatycznej statystyki numer jeden dla replik: 0,1 sekundy dla czasu integracji i zero dla opóźnienia.
Teraz otwórz kartę monitor i ustaw pole max osi dlaczego na 10 000 i dlaczego oś min na zero. Następnie zaznacz pole po lewej stronie otwartego przetwarzania danych po pobraniu danych oraz, jeśli jest to wymagane, pole po lewej stronie drukuj raport po pobraniu danych dla raportu, który ma być drukowany automatycznie po zakończeniu odczytów. Na koniec, aby zapisać wszystkie wybrane parametry w różnych zakładkach okna metody analizy, należy kliknąć na zakładkę ogólne i zapisać pod nową nazwą pliku w określonym miejscu.
Kliknij przycisk OK, aby zamknąć to okno. Na tym kończy się ustawianie parametrów testu przyrządu. W celu skonfigurowania czytnika mikropłytek należy kliknąć przycisk MPR, aby przenieść okno konfiguracji MPR na wierzch
.Najpierw wybierz studnie do standardów. Na przykład kliknij pozycję A jeden i przeciągnij mysz do pozycji E jeden. Następnie kliknij przycisk zestawu standardowego.
Spowoduje to wybranie pozycji, które mają być używane dla standardów, jak zaznaczono na zielono. Następnie wybierz pozycje dla próbek. W podobny sposób kliknij i przeciągnij myszką nad odpowiadającymi im pozycjami na płycie, a następnie kliknij w przycisk zestawu próbek, który automatycznie podświetli wybrane pozycje na żółto.
Kontynuuj powtarzanie tej samej operacji dla pozycji żądanych pomiarów próbki. Aby załadować standardy i przykładowe informacje do przygotowanego wcześniej pliku zmiennych oddzielonych przecinkami. Kliknij zakładkę informacji o studni w oknie konfiguracji MPR.
Wybierz przycisk załaduj informacje o studni, a otworzy się okno Eksploratora Windows, aby zidentyfikować plik csv z informacjami o studni. Po załadowaniu informacji okno powinno wyświetlić się jako tabela. W celu przygotowania roztworu roboczego zielonego odczynnika Pico, dodaj 50 mikrolitrów odczynnika 200 X pico green do 9,95 mililitra buforu TE.
Dla krzywej wzorcowej należy przygotować seryjne rozcieńczenia dwuniciowego DNA Lambda w buforze TE dla końcowych stężeń, w zakresie od jednego do 100 nanogramów na mililitr, pipetę 150 mikrolitrów każdego wzorca do wyznaczonych dołków na 96-dołkowej płytce. Następnie odpipetować 150 mikrolitrów każdej badanej próbki do odpowiednich wyznaczonych dołków płytki. Teraz za pomocą pipety wielokrotnej dodaj 150 mikrolitrów zielonego roztworu Pico do każdej studzienki i wymieszaj roztwór z próbkami DNA.
Delikatnie inkubuj płytkę w ciemnym miejscu przez dwie do pięciu minut, aby rozwinęła się reakcja. Kliknij przycisk ekranu wyświetlacza MPR, aby wyświetlić okno konfiguracji MPR na górze wyświetlacza i kliknij przycisk pozycji wymiany. Platforma do trzymania mikropłytek przesunie się w kierunku przodu urządzenia, otworzy drzwi czytnika mikropłytek i umieści 96-dołkową płytkę na platformie przytrzymującej z jednym dołkiem A skierowanym do przodu i zamknie drzwi czytnika mikropłytek.
Kliknij przycisk pozycji początkowej, aby umieścić pozycję A jednej z mikropłytek w pozycji pomiarowej. Kliknij przycisk wyświetlacza monitora, aby przenieść okno pomiarowe na wyświetlacz. Kliknij przycisk pomiaru, aby rozpocząć pomiar wzorców i nieznanych próbek.
Dobra krzywa kalibracyjna jest oceniana przy użyciu różnych parametrów dostarczanych przez oprogramowanie F 7 000. Na przykład ta idealna krzywa kalibracyjna uzyskana do kwantyfikacji dwuniciowego DNA przy użyciu zielonego barwnika Pico obliczyła współczynnik determinacji wynoszący 0,99993. Opisywany system o wysokiej przepustowości to seryjny zespół technologii, w tym Pico Green Dye, spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F 7 000, wyposażonego w czytnik mikropłytek i oprogramowanie do automatyzacji gromadzenia, przechowywania, analiz i prezentacji danych.
Połączenie zaawansowanych technologii może zaspokoić rosnącą potrzebę dokładnej analizy małych ilości dwuniciowych. DNA.
Przegląd
Niniejszy artykuł demonstruje ilościową analizę podwójnie strunowego DNA (dsDNA) przy użyciu barwnika PicoGreen i spektrofotometru fluorescencyjnego Hitachi F-7000 z czytnikiem mikroplatek. Procedura opisuje przygotowanie próbek, konfigurację urządzenia oraz procesy pomiarowe w celu uzyskania liniowej krzywej kalibracji dla ilościowej analizy dsDNA.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Spektroskopia fluorescencyjna
- Ilościowa analiza DNA
- Technologia czytników mikroplatek
Tło
- Barwnik PicoGreen to wrażliwy fluorescencyjny barwnik stosowany do ilościowej analizy dsDNA.
- Hitachi F-7000 to wszechstronny spektrofotometr fluorescencyjny.
- Dokładna ilościowa analiza DNA jest niezbędna dla różnych eksperymentów biologicznych.
- Systemy wysoko przepustowe umożliwiają analizę wielu próbek jednocześnie.
Cel badania
- Demonstracja zdolności spektrofotometru F-7000 do ilościowej analizy dsDNA.
- Ustanowienie niezawodnej metody pomiaru nieznanych próbek DNA.
- Stworzenie liniowej krzywej kalibracji dla dokładnej ilościowej analizy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie odczynnika PicoGreen i standardów DNA.
- Konfiguracja parametrów spektrofotometru Hitachi F-7000.
- Ładowanie próbek do czytnika mikroplatek.
- Pomiar fluorescencji w celu wygenerowania krzywej kalibracji.
Główne wyniki
- Ustanowiona została liniowa krzywa kalibracji dla ilościowej analizy dsDNA.
- Metoda wykazała wysoką wrażliwość i dokładność.
- Wyniki wykazały współczynnik determinacji 0,99993.
- System skutecznie analizował małe ilości dsDNA.
Wnioski
- Kombinacja barwnika PicoGreen i spektrofotometru F-7000 zapewnia niezawodną metodę ilościowej analizy DNA.
- To podejście o wysokiej przepustowości spełnia wymagania dotyczące dokładnej analizy w badaniach biologicznych.
- Metoda może być zastosowana w różnych badaniach wymagających precyzyjnych pomiarów DNA.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of double-stranded DNA is a foundational requirement for target validation, assay development, and preclinical model generation in biopharma R&D. The Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with PicoGreen dye enables high-sensitivity, high-throughput measurement of dsDNA, supporting reliable standard curve generation for downstream applications. This method provides predictive confidence in nucleic acid quantification, reducing variability in early discovery workflows and enabling scalable, reproducible data generation across compound screening and biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise measurement of dsDNA concentrations for cloning, transfection, and PCR-based target validation assays.
- Operational Value: Supports reproducible sample preparation and quantification, reducing technical variability in hypothesis-driven experiments.
- Predictive Value: Generates linear calibration curves with high determination coefficients (R² > 0.999), ensuring accurate quantification of unknown samples in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative fluorescence readouts compatible with 96-well formats for assay standardization and reagent titration.
- Operational Value: Enables rapid measurement of 96 wells in under 60 seconds using kinetics mode, supporting high-throughput screening readiness.
- Scalability: Software allows saving and recalling microplate configurations, facilitating consistent assay setup across teams and projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Delivers reliable dsDNA quantification for biomarker analysis, PCR validation, and vector production in preclinical models.
- Risk Mitigation: High sensitivity (50 picomoles fluorescein equivalent) and wide dynamic range (5 orders of magnitude) allow accurate quantification across dilution series, reducing false negatives in low-abundance targets.
- Workflow Integration: Outputs data to Excel or report formats, enabling seamless transfer to bioinformatics and analytical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical development, where accurate nucleic acid quantification is essential for experimental reproducibility and data integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise dsDNA measurement for cloning efficiency, gene expression analysis, and mutagenesis studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support assay robustness and compound library normalization.
- Analytics: Generates linear calibration curves and determination coefficients (R²) that allow inter-experiment comparison and quality control.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through reliable quantification of DNA in drug formulations, viral vectors, and biomarker assays.
- Enterprise Reuse: Configurable software and standardized protocols allow reuse across departments, reducing method redevelopment and increasing operational efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High sensitivity and specificity for dsDNA reduce false signals and improve data confidence in molecular assays.
- Operational Value: Automated data collection, storage, and presentation via software minimize manual handling and transcription errors.
- Strategic Value: Reliable quantification supports go/no-go decisions in lead optimization by ensuring accurate dosing and normalization in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing trustworthy nucleic acid data for candidate selection and formulation studies.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence spectroscopy and microplate reader operation.
- Necessitates access to Hitachi F-7000 spectrophotometer with microplate reader accessory and compatible software.
- Demands standardized reagent preparation (PicoGreen dilution in TE buffer) and sample handling to avoid fluorescence quenching.
- Involves optimization of incubation time (2–5 minutes in dark) and wavelength settings (Ex 480 nm, Em 520 nm) for signal consistency.
- Includes practical limitations such as the need for dark incubation and potential interference from contaminants or organic solvents.
