Name: Alternatywna metoda do tradycyjnego modelu rozładunku kończyn tylnych NASA u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę rozładunku kończyn tylnych u myszy, która minimalizuje stres zwierząt i skutecznie wywołuje atrofię mięśniową przy zachowaniu stabilnej masy ciała.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Andrew J. Dunnowi, wybitnemu studentowi studiów licencjackich prowadzącemu badania w naszym laboratorium, za pomoc techniczną i opiekę nad zwierzętami. Praca ta była finansowana z grantu National Institute of Health HD058834 oraz stypendium University of Missouri Life Sciences Fellowship.

Instrumenty i materiały przedoperacyjne
<ul>
<li>Obcinaczki do drutu/szczypce</li>
<li>Gaziki 2 x 2"</li>
<li>Podkładka grzewcza</li>
<li>Klejnotki z azotanu srebra</li>
<li>Sterylne rękawiczki chirurgiczne</li>
<li>Izofluran (anestetyk do inhalacji)</li>
<li>Gluconian chlorheksydyny 4% (antyseptyczny środek do mycia chirurgicznego)</li>
<li>Sterylna stalowa nić chirurgiczna 2-0</li>
<li>Igła o rozmiarze 25 X 5/8 A (autoklawowana)</li>
<li>Kleszczyki hemostatyczne (autoklawowane)</li>
<li>Stalowa nić chirurgiczna</li>
</ul>
Procedura chirurgiczna
<ol>
<li>Przygotuj pole sterylne. Postępuj zgodnie z procedurą sterylną.</li>
<li>Zanestezjować mysz przy użyciu 2–3% izofluranu.</li>
<li>Umieść mysz na podkładce grzewczej.</li>
<li>Umyj ogon roztworem chlorheksydyny.</li>
<li>Zlokalizuj 5, 6 lub 7th przestrzeń międzykręgowa (między dwoma kostnymi wypustkami na ogonie, licząc od końca owłosienia ciała, u nasady ogona).</li>
<li>Użyj hemostatu i igły 25G, aby wykonać otwór prowadzący między dwoma kręgami, w przestrzeni międzykręgowej.</li>
<li>Za pomocą obcinaczek do drutu odetnij stalową nici szwy o długości 10 cm.</li>
<li>Usuń igłę i przełóż stalową nicią przez otwór, pozostawiając 5 cm nici na obu końcach.</li>
<li>Każda strona ogona powinna mieć dodatkowe 5 cm szwu.</li>
<li>Przyłóż opuszkę kciuka do ogona.</li>
<li>Używając wolnej ręki, nawiń stalową nić chirurgiczną na opuszkę kciuka i skręć końce, aby utworzyć dużą pętlę. Część okrągła lub pętla powinna mieć długość + 3 mm.</li>
<li>Usuń kciuk.</li>
<li>Zaciśnij jeden koniec nici chirurgicznej za pomocą hemostatu i wygnij go w mniejszą pętlę, której końcówkę należy przymocować jak najbliżej splotu pierwotnej dużej pętli.</li>
<li>Odetnij nadmiar drutu i zegnij skręcony drut z powrotem.</li>
<li>W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia można je zatamować za pomocą patyczków z azotanem srebra.</li>
<li>Wyłącz isofluran i umieść mysz w pojedynczej klatce domowej w celu rekonwalescencji przez 5–7 dni przed odciążeniem kończyn tylnych. Pierścienie ogonowe mogą się zaplątać, jeśli w jednej klatce umieści się więcej niż jedną mysz.</li>
</ol>
1. Procedura odciążenia kończyn tylnych

Materiały
<ul>
<li>Śruby maszynowe rozmiar 10-24 X 4, jedna na zwierzę.</li>
<li>Nylonowa nakrętka samoblokująca rozmiar 10-24, jedna na zwierzę.</li>
<li>Nakrętka motylkowa rozmiar 10 X 24, dwie na zwierzę.</li>
<li>Podkładka rozmiar ¼ X 1, dwie na zwierzę.</li>
<li>Krętlik wędkarski z karabińczykiem rozmiar #6, 1-11/16", jeden na zwierzę.</li>
<li>Metalowa szpulka do maszyny do szycia. Jedna na zwierzę.</li>
<li>Mały spinacz biurowy do wykonania haka w kształcie litery S, jeden na zwierzę.</li>
<li>Szczypce.</li>
<li>Gaza 2 x 2".</li>
<li>Czarne metalowe żabki do papieru 2".</li>
<li>Taśma armatnia/taśma laboratoryjna.</li>
<li>Pozinkowany szczelinowy pręt stalowy 1-3/8", który wystaje nieco poza całkowitą długość klatki.</li>
<li>Klatka 50cm X 40cm X 20cm (klatka dla szczurów).</li>
<li>Butelka z wodą z wygiętą rurką.</li>
<li>Drut ze stali nierdzewnej w kształcie litery U do podparcia butelki z wodą.</li>
</ul>
Przygotowanie klatek
<ol>
<li>Połóż stalowy pręt szczelinowy o długości 1-38" na górnej części klatki i przymocuj go tymczasowo taśmą naprawczą.</li>
<li>Nakręć jedną nakrętkę motylkową na śrubę maszynową, załóż podkładkę, a następnie przełóż śrubę maszynową przez szczelinową płytę stalową w odległości ok. 15 cm od krawędzi klatki.</li>
<li>Dodaj kolejną podkładkę i nakrętkę motylkową. Dokręć obie nakrętki, ale nie rób tego całkowicie, ponieważ później konieczne będą regulacje.</li>
<li>Przełóż śrubę maszynową przez otwór centralny szpulki.</li>
<li>Aby zapobiec spadnięciu szpulki, nakręć nylonową nakrętkę samokontrującą na koniec śruby maszynowej. Szpulka powinna obracać się swobodnie.</li>
<li>Przełóż karabińczyk z obrotu wędkarskiego przez dolną część szpulki.</li>
<li>Używając szczypiec, uformuj z klipsa do papieru haczyk w kształcie litery S (odetnij 2 cm z klipsa, aby uformować haczyk).</li>
<li>Wsuń jeden koniec haczyka w kształcie litery S przez otwór obrotu wędkarskiego i zaciśnij go szczypcami.</li>
<li>Umieść drut w kształcie litery U równolegle do śruby maszynowej od wewnętrznej strony klatki i odegnij końce, aby mogły podtrzymać pełną butelkę z wodą.</li>
<li>Wsuń butelkę z wodą w drut w kształcie litery U, tak aby kranek był skierowany w dół, ale nie dotykał dna.</li>
<li>Odegnij 2" żabkę biurową tak, aby nie mogła się całkowicie zamknąć. Zastosuj na tyle napięcia, aby utrzymać w niej od 3 do 4 kawałków pokarmu bez ich wypadania. Zapobiegnie to zmiażdżeniu pokarmu przez siłę docisku żabki lub przytrzaśnięciu nosa myszy.</li>
<li>Umieść od 3 do 4 kawałków karmy dla gryzoni w żabce biurowej.</li>
</ol>
Odciążenie kończyn tylnych myszy
<ol>
<li>Wsuń otwarty koniec haka w kształcie litery S przez mniejszy pierścień obrączki ogonowej.</li>
<li>Wyreguluj wysokość myszy, dokręcając lub luzując dolną nakrętkę skrzydłową na śrubie maszynowej. Kończyny dolne nie powinny przenosić ciężaru ciała. Po uzyskaniu optymalnej wysokości dokręć górną nakrętkę skrzydłową.</li>
<li>Przestaw butelkę z wodą i drut w kształcie litery U w taki sposób, aby mysz nie mogła wspiąć się kończynami tylnymi na kranik. Przymocuj butelkę z wodą do boku klatki za pomocą taśmy Duct tape.</li>
<li>Umieść zacisk sprężynowy z pokarmem na dnie klatki w taki sposób, aby mysz nie mogła się na niego wspiąć; przymocuj go taśmą Duct tape.</li>
<li>Powtórz tę samą procedurę, jeśli po drugiej stronie klatki odciążone są kończyny tylne więcej niż jednego zwierzęcia. Umieść dwa zwierzęta w jednej klatce; rozmieść je tak, aby niemal mogły się ze sobą dotykać.</li>
<li>Użyj gazy 2 X 2, aby luźno owinąć ogon myszy wokół obrotowej spławikowej kotwicy. Użyj małego kawałka taśmy, aby owinąć gazę, mocując ją do ogona. Krok ten jest istotny, aby zapobiec opadaniu ogona w dół, co mogłoby prowadzić do gromadzenia się krwi w jego końcówce i w konsekwencji do martwicy ogona.</li>
<li>Wsyp do klatki niewielką ilość ściółki z kukurydzy (cob bedding). Nie dodawaj zbyt dużo ściółki, w przeciwnym razie mysz uformuje z niej kopiec i spróbuje obciążyć kończyny tylne na ściółce.</li>
</ol>
2. Reprezentatywne wyniki:

Aby potwierdzić skuteczność techniki HU z wykorzystaniem pierścienia na ogonie, zmierzono masę ciała zwierząt przed operacją założenia pierścienia, przed i po zastosowaniu HU oraz po regeneracji; masę mięśnia płaszczowatego oraz masę nadnerczy we wszystkich grupach.
Masa ciała myszy w trakcie całego eksperymentu przedstawiona jest na Rysunku 1. Masa ciała myszy przed operacją założenia pierścienia na ogonie (24,7 ± 3,5g) nie różniła się znacząco po 5 dniach rekonwalescencji po zabiegu (24,3 ± 2,9g) przed podaniem HU. Masa ciała nie spadła również istotnie bezpośrednio po 14 dniach HU (22,7 ± 1,9g), 28 dniach HU (21,3 + 2,1g) ani po 3 dniach rekonwalescencji po HU (24,0 ± 1,8g). Chociaż HU przez 14 i 28 dni spowodowało niewielki (-6,8% i 12%), ale nieistotny statystycznie spadek masy ciała, myszy całkowicie odzyskały masę ciała sprzed podania HU po 3 dniach rekonwalescencji. Zużycie pokarmu przez myszy kontrolne i myszy HU przedstawiono na Rysunku 3. Średnie dzienne spożycie pokarmu u myszy HU w ciągu 28 dni nie różniło się w porównaniu z grupą kontrolną.
Zaobserwowaliśmy znaczną atrofię mięśnia płaszczowatego po HU trwającej 14 i 28 dni (-39,1% oraz -46,6%), co wskazuje na skuteczność procedury HU (Rysunek 2). Co więcej, stopień tej atrofii jest zgodny z wartościami oczekiwanymi w literaturze dla 2–4 tygodni HU 2, 7, 8. Po 3 dniach regeneracji po HU masa mięśnia płaszczowatego znacząco wzrosła do 74% wartości grupy kontrolnej. Masa mięśnia płaszczowatego w grupie regeneracji była znacząco większa niż w obu grupach HU, lecz nadal znacząco mniejsza niż u zwierząt kontrolnych w stanie ambulatoryjnym.
Masy nadnerczy zmierzono jako wskaźnik stresu zwierząt; wycignięto i zważono oba nadnercza, lewy i prawy. Średnie masy były porównywalne dla myszy kontrolnych oraz myszy HU we wszystkich grupach (Rysunek 4).
Wcześniej wykazaliśmy u szczurów, że współczynnik sukcesu, określony jako liczba zwierząt na początku HU w stosunku do liczby zwierząt, które ukończyły HU bez wypadnięcia z aparatury zawieszeniowej (na skutek przegryzienia przez zwierzęta taśmy trakcyjnej ogona), wyniósł 10 z 12 przy zastosowaniu techniki Morey-Holton 1. Żadne z myszy (n=54) w niniejszym badaniu nie spadło z zawieszenia przed zakończeniem okresu HU. Odnotowaliśmy jednak przypadek jednej myszy, u której rozwinął się silny stan zapalny ogona. Gdy stan zapalny stał się widoczny, usunęliśmy pierścień ogonowy, aby umożliwić zagojenie się zapalonego obszaru, a następnie założyliśmy kolejny pierścień ogonowy, aby dokończyć czas trwania HU.
W przeszłości, stosując metodę Morey-Holtona w odniesieniu do HU, zazwyczaj eliminowaliśmy 1-2 myszy na grupę z powodu ich wydostania się z aparatury zawieszeniowej. Przy zastosowaniu metody z pierścieniem szlakowym nie odnotowano przypadków przypadkowego wydostania się myszy z aparatury HU podczas okresu HU trwającego 14 lub 28 dni (n=54 myszy).
 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig1.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący grupy masy ciała; wyniki analizy statystycznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Zmiany masy ciała (średnia ± SD). Skróty: CON: kontrolne myszy obciążone (n=76); Pre-HU: wszystkie myszy przed HU (n=54); HU14: myszy poddane odciążeniu kończyn tylnych przez 14 dni (n=34); HU28: myszy poddane odciążeniu kończyn tylnych przez 28 dni (n=20); REC: myszy po odciążeniu kończyn tylnych poddane 3-dniowej rekonwalescencji w klatce (n=22). Nie zaobserwowano istotnych różnic w masie ciała pomiędzy grupami.
 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący masę mięśnia płaszczkowatego w różnych warunkach: CON, HU14, HU28, REC; dane badawcze." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Zanik mięśnia płaszczkowatego (średnia ± SD). Skróty: CON: myszy kontrolne obciążone (n=76); HU14: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 14 dni (n=34); HU28: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 28 dni (n=20); oraz REC: myszy z odciążeniem kończyn tylnych poddane 3-dniowej rekonwalescencji w klatce (n=22). *Istotna różnica (p&lt;0.001) w stosunku do grupy kontrolnej obciążonej (CON). δIstotna różnica (p&lt;0.01) w stosunku do obu grup HU.
 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący dzienne spożycie pokarmu (g/dobę) pomiędzy grupami CON i HU; wyniki badania żywieniowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Spożycie pokarmu (średnia ± SD). Średnie dzienne spożycie pokarmu (g/dobę) podczas obciążania kończyn oraz odciążenia kończyn tylnych. Skróty: CON: myszy kontrolne obciążające kończyny (n=76); HU: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 14–28 dni. Nie zaobserwowano istotnych różnic pomiędzy grupami CON i HU.
 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig4.jpg" alt="Porównanie masy nadnerczy na wykresie słupkowym; grupy: CON, HU14, HU28, REC; wyniki analizy wariancji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Masa nadnerczy (średnia ± SD). Skróty: CON: myszy kontrolne z obciążeniem kończyn (n=76); HU14: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 14 dni (n=34); HU28: myszy z odciążeniem kończyn tylnych przez 28 dni (n=20); oraz REC: myszy z odciążeniem kończyn tylnych poddane 3-dniowej rekonwalescencji w klatce (n=22). Nie zaobserwowano istotnych różnic między grupami.

<ol><li>Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+hindlimb+unweighting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gravitational+Physiol%22%5BJournal%5D)">An alternative method for hindlimb unweighting.</a> J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).</li>
<li>Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+disuse%3A+a+comparison+of+hindlimb+suspension+and+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization.</a> J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).</li>
<li>Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+transients+in+mouse+soleus+muscle+after+hindlimb+unloading+and+reloading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading.</a> Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).</li>
<li>Morey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spaceflight+and+bone+turnover%3A+correlation+with+a+new+rat+model+of+weightlessness%5BTitle%5D)+AND+%22BioScience%22%5BJournal%5D)">Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness.</a> BioScience. 29, 168-172 (1979).</li>
<li>Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindlimb+unloading+of+growing+rats%3A+a+model+for+predicting+skeletal+changes+during+space+flight%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight.</a> Bone. 22, 83-88 (1998).</li>
<li>Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindlimb+unloading+rodent+model%3A+technical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hindlimb unloading rodent model: technical aspects.</a> J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).</li>
<li>Thomason, D. B., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrophy+of+the+soleus+muscle+by+hindlimb+unweighting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting.</a> J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).</li>
<li>Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+soleus+muscle+myosin+expression+during+hindlimb+suspension+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery.</a> J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Oceniliśmy alternatywną metodę odciążania kończyn tylnych u myszy, która w naszej ocenie okazała się bardzo skuteczna. Opisana tutaj metoda pierścienia ogonowego została zastosowana do długotrwałego zawieszenia kończyn tylnych oraz do badania regeneracji po HU. W każdym z tych przypadków nie stwierdzono braku adaptacji, co potwierdziły stabilne spożycie pokarmu, masa ciała oraz masa nadnerczy myszy. Ta technika HU z użyciem pierścienia ogonowego jest łatwa do wykonania i może zostać szybko wdrożona przy minimalnym doświadczeniu chirurgicznym.
Metoda pierścienia ogonowego posiada kilka zalet w porównaniu do tradycyjnej metody Morey-Holton 5, 6. Po pierwsze, skóra oraz miejsce implantacji pierścienia na ogonie są zawsze widoczne, dzięki czemu w przypadku wystąpienia problemów jest to zauważalne natychmiast, a nie dopiero pod koniec okresu zawieszenia. Po drugie, zwierzęta nie są w stanie wydostać się z aparatury do zawieszenia w żadnym momencie podczas HU, co eliminuje konieczność decydowania, czy dana mysz powinna pozostać w zbiorze danych. Ponadto myszy nie wykazują zainteresowania aparaturą pierścieniową i po zwolnieniu z HU w celu rekonwalescencji nie uszkadzają swoich ogonów, co pozwala na płynną fazę regeneracji po HU. Wreszcie, myszy z odciążonymi kończynami tylnymi przy zastosowaniu metody pierścienia ogonowego lepiej utrzymują masę ciała niż myszy poddane odciążeniu kończyn tylnych techniką trakcji ogona Morey-Holton. W naszych badaniach po 14 dniach HU zaobserwowaliśmy niewielki (-6,8%), ale nieistotny statystycznie spadek masy ciała. Tymczasem Ingalls et al. zaobserwowali istotny spadek masy ciała o -12% u myszy po 14 dniach HU metodą Morey-Holton 3. Choć Ingalls nie podał masy nadnerczy, wydaje się, że nasza metoda pierścienia ogonowego wywołuje mniejszy stres u myszy (masa nadnerczy u naszych myszy HU nie różni się od grupy kontrolnej) i zapewnia lepsze utrzymanie masy ciała przez cały okres odciążenia kończyn tylnych.
Podsumowując, opracowano i przetestowano metodę odciążenia kończyn tylnych z wykorzystaniem pierścienia ogonowego na myszach poddanych HU przez 14 i 28 dni, a także na myszach poddanych 3-dniowej rekonwalescencji w klatkach po HU. Na podstawie masy nadnerczy, masy ciała oraz spożycia pokarmu można stwierdzić, że myszy dobrze zaadaptowały się do aparatury z pierścieniem ogonowym. Metoda odciążenia kończyn tylnych z użyciem pierścienia ogonowego stanowi użyteczną i prostą alternatywę dla tradycyjnej techniki odciążania kończyn tylnych Moreya-Holtona.

<table><tbody><tr><td>Obcinaczki do drutu/kombinerki</td><td>Ace Hardware</td><td>84-056</td><td></td></tr><tr><td>Gaza</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-901</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka grzewcza</td><td>Sunbeam</td><td>Z-1228-001</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z azotanu srebra</td><td>ARZOL</td><td>0001-2</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Novaplus</td><td>NDC 0409-3292-49</td><td></td></tr><tr><td>Gluconian chlorheksydyny 4%</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-200-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna stalowa nić chirurgiczna 2-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>SS-28</td><td></td></tr><tr><td>Igła rozmiar 25 G, 5/8 cala</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>NN 2516R</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat/uchwyt do igieł</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Wkręty maszynowe rozmiar 10-24 X 4</td><td>Hillman The Fastener Center</td><td>90272</td><td></td></tr><tr><td>Nylatowa nakrętka samokontrująca rozmiar 10 X 24</td><td>Hillman The Fastener Center</td><td>180141</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętka motylkowa rozmiar 10 X 24</td><td>Hillman The Fastener Center</td><td>180243</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka szeroka rozmiar &amp;#188; X 1</td><td>Hillman The Fastener Center</td><td>290012</td><td></td></tr><tr><td>Krętlik wędkarski z karabińczykiem rozmiar #6, 1-11/16&amp;#8221;</td><td>Bass Pro Shop</td><td>38-481-554-01</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa szpulka do maszyny do szycia</td><td>Singer Instruments</td><td>45785</td><td></td></tr><tr><td>Spinacz do papieru</td><td>Office Depot</td><td>221720</td><td></td></tr><tr><td>Czarne żabki do papieru 2&amp;#8221;</td><td>Office Depot</td><td>308957</td><td></td></tr><tr><td>Wielofunkcyjna taśma naprawcza Scotch Duct Tape</td><td>Office Depot</td><td>790710</td><td></td></tr><tr><td>Pozłacana szczelinowa stalowa szyna 1-3/8&amp;#8221;</td><td>Home Depot</td><td>548932</td><td>Wystaje nieco poza pełną długość klatki</td></tr><tr><td>Klatka 50cm X 40cm X 20cm (klatka dla szczurów)</td><td>Alternative Design Manufacturing</td><td>RC88D-PC</td><td></td></tr><tr><td>Butelka z wodą</td><td>Alternative Design Manufacturing</td><td>WB16FS</td><td></td></tr><tr><td>Drut ze stali nierdzewnej</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>SWX-4029</td><td>Drut w kształcie litery U do podparcia butelki z wodą</td></tr></tbody></table>

alternatywna metoda dla tradycyjnego modelu odciążenia kończyn tylnych według nasa u myszy

An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

Metoda Morey-Holton odciążania kończyn tylnych (HU) jest powszechnie akceptowanym modelem naziemnym Narodowej Agencji Aeronautyki i Przestrzeni Kosmicznej (NASA) służącym do badania zaniku z nieużywania u gryzoni 4-6. W naszym badaniu oceniono alternatywną metodę względem uznawanej za złoty standard techniki Morey-Holton HU polegającej na trakcji ogona u myszy. Pięćdziesiąt cztery samice myszy (w wieku 4-8 mies.) poddano procedurze HU przez 14 dni (n=34) lub 28 dni (n=20). Regenerację po HU oceniono po 3 dniach normalnego poruszania się w klatce po zakończeniu HU (n=22). Myszy w tym samym wieku (n=76) służyły jako kontrole obciążeniowe.
Przed HU utworzono pierścień ogonowy za pomocą sterylnego drutu chirurgicznego ze stali o rozmiarze 2-0, który przeprowadzono przez 5., 6. lub 7. przestrzeń międzykręgową i uformowano w pierścień, na którym zawieszono myszy. Lokalizację kręgu dla pierścienia ogonowego wybrano tak, aby odpowiednio zrównoważyć masę ciała zwierzęcia, nie zakłócając procesu defekacji.
Skuteczność tej nowej techniki HU ocenialiśmy poprzez pomiar masy ciała przed i po HU, stopień zaniku mięśnia soleus oraz masę nadnerczy po HU. Masa ciała myszy przed HU (24,3 ± 2,9g) nie spadła znacząco bezpośrednio po 14 dniach HU (22,7 ± 1,9g), 28 dniach HU (21,3 + 2,1g) ani po 3 dniach rekonwalescencji (24,0 ± 1,8g). Masa mięśnia soleus uległa znacznemu spadkowi (-39,1% i -46,6%) odpowiednio po 14 i 28 dniach HU (p&lt;0,001). Po 3 dniach rekonwalescencji masa mięśnia soleus znacząco wzrosła do 74% wartości kontrolnych. Masa nadnerczy myszy poddanych HU nie różniła się od masy nadnerczy myszy z grupy kontrolnej.
O skuteczności naszej nowej metody HU świadczy utrzymanie masy ciała zwierząt, porównywalna masa nadnerczy oraz zanik mięśnia soleus po zastosowaniu HU, co odpowiada oczekiwanym wartościom literaturowym 2, 7, 8. Głównymi zaletami tej metody HU są: 1) łatwość badania ogona podczas zawieszenia; 2) zmniejszone prawdopodobieństwo wystąpienia sinicy, stanu zapalnego i/lub martwicy ogonów, często obserwowane przy mocowaniu ogona taśmą podczas HU; 3) brak możliwości przegryzienia przez myszy taśmy trakcyjnej i wypadnięcia z aparatury do zawieszenia; oraz 4) szybka rekonwalescencja i normalna aktywność w klatce bezpośrednio po HU.

Opracowaliśmy model naprzemiennego odciążenia kończyn tylnych u myszy. Główną zaletą naszej metody odciążania kończyn tylnych z wykorzystaniem pierścienia ogonowego w stosunku do konwencjonalnej techniki trakcji ogona Morey-Holton jest prosta i bezpośrednia procedura, która minimalizuje stres u zwierzęcia.

Alternatywna metoda dla tradycyjnego modelu odciążenia kończyn tylnych według NASA u myszy

Metoda odciążania kończyn tylnych (HU) Moreya-Holtona jest powszechnie akceptowanym, opracowanym przez Narodową Agencję Aeronautyki i Przestrzeni Kosmicznej (NASA) naziemnym modelem służącym do badania...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie odciążenia kończyn tylnych (hu) u myszy przy użyciu prostszej i bardziej bezpośredniej metody, która minimalizuje stres zwierzęcia. Ta metoda z wykorzystaniem ogona skutecznie indukuje zanik kończyn tylnych bez pogorszenia ogólnego stanu zdrowia i masy ciała. Pierwszym krokiem jest wszczepienie pierścienia ogonowego dorosłej myszy.Ważne jest, aby w trakcie całego badania rejestrować masę ciała oraz obserwacje dotyczące stanu zdrowia. Następnie montuje się aparat do odciążania kończyn tylnych i umieszcza go w klatce, w której będzie odbywać się procedura. Po wybudzeniu zwierzę zostaje umieszczone w aparacie w celu przeprowadzenia odciążania.Ostatecznie wyniki można uzyskać poprzez pomiary masy ciała oraz masy mięśni, które wykazały zanik mięśni w kończynach tylnych u myszy poddanych odciążeniu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak technika owijania Maori Holton, jest fakt, że skóra ogona jest zawsze widoczna. Myszy nie są w stanie wydostać się z aparatury do zawieszenia ani bawić się pierścieniem, a także szybciej regenerują się i utrzymują stabilną masę ciała.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii układu mięśniowo-szkieletowego, a także w biologii grawitacyjnej i kosmicznej, takich jak sposoby zapobiegania zanikowi mięśni szkieletowych i utracie gęstości kości po przedłużonych okresach nieaktywności fizycznej, unieruchomieniu w łóżku, mobilizacji kończyn, w warunkach mikrograwitacji, w przebiegu chorób nerwowo-mięśniowych oraz wraz z postępującym wiekiem. Pomysł ten pojawił się, gdy napotkaliśmy komplikacje związane z techniką tapowania ogona według Maury’ego Holdena. Regularnie traciliśmy zwierzęta i dane eksperymentalne z powodu ucieczek myszy z aparatury do unieruchomienia kończyn tylnych podczas demonstrowania tej techniki.Dzisiaj towarzyszą mi Andre Ferrara, starszy asystent naukowy z mojego laboratorium, a w pomaganiu Andresowi uczestniczą Jacqueline Chrissy, doktorantka w laboratorium, oraz Andrew Dunn, student studiów licencjackich, również pracujący w laboratorium. Należy rozpocząć od wysterylizowania pola operacyjnego, znieczulić dorosłą mysz izofluranem, a następnie zapisać masę ciała myszy i umieścić ją na podkładce grzewczej. Przygotować ogon do zabiegu, przemywając go roztworem chlorheksydyny.Należy rozpocząć odliczanie od końca owłosienia ciała u nasady ogona, aby zlokalizować piątą, szóstą lub siódmą przestrzeń międzykręgową pomiędzy dwoma kostnymi wypustkami na ogonie. Używając kleszczyków hemostatycznych i igły 20 5G, należy wykonać otwór prowadzący między dwoma kręgami, wchodząc w przestrzeń międzykręgową. Następnie należy wyjąć igłę i wprowadzić stalową szwę.Odetnij nitkę do długości 10 centymetrów, przecinając ją przez otwór. Z każdej strony ogona powinno wystawać pięć centymetrów szwu. Połóż czubek kciuka na ogonie i za pomocą wolnej ręki owiń stalową nitkę wokół kciuka.Skręć końce, aby utworzyć dużą pętlę. Część zwojona lub okrągła powinna mieć długość plus lub minus 3 mm. Zaciśnij jedną nić szwu za pomocą hemostatu i zegnij ją w mniejszą pętlę, której koniec należy przymocować jak najbliżej skrętu na oryginalnej dużej pętli.Odetnij nadmiar drutu i odegnij skręcony drut. Zatamuj ewentualne nadmierne krwawienie za pomocą patyczków z azotanem srebra. Pozostaw zwierzę do rekonwalescencji na okres od pięciu do siedmiu dni przed odciążeniem kończyn tylnych lub hu po operacji.Przymocuj domykanie pojedynczo, aby zapobiec zaplątaniu się pierścieni ogonowych. Połóż jeden cal drutu o grubości trzech ósmych cala, płytkiego naciętego pręta stalowego, na górnej części klatki i przymocuj go taśmą. Dodaj kolejną podkładkę i nakrętkę motylkową, ale nie dokręcaj ich całkowicie, aby umożliwić późniejsze dokonanie regulacji.Włóż śrubę maszynową przez otwór centralny szpuli, aby zapobiec jej zsunięciu się. Na końcu śruby maszynowej zakręć nylonową nakrętką samokontrującą. Szpula powinna obracać się swobodnie.Włóż karabińczyk z obrotki wędkarskiej przez dolną część szpulki. Za pomocą szczypiec uformuj z spinacza do papieru haczyk w kształcie litery S. Przełóż jeden koniec haczyka w kształcie litery S przez otwór obrotki wędkarskiej i zaciśnij go szczypcami.Umieść drut w kształcie litery U równolegle do śruby maszynowej wewnątrz klatki i zagnij jego końce nad krawędzią. Aby zamocować pełną butelkę z wodą, włóż butelkę do drutu w kształcie litery U tak, aby kurek był skierowany w dół, ale nie dotykał dna. Przymocuj butelkę z wodą do klatki za pomocą taśmy naprawczej.Rozgiń dwucalowy zacisk biurowy, zachowując wystarczające napięcie, aby utrzymać kilka kawałków pokarmu bez zgniatania pelletów przed przeprowadzeniem procedury odciążania kończyn tylnych. Zapisz masę ciała myszy do późniejszych porównań. Następnie wprowadź otwarty koniec haka w kształcie litery S przez mniejszy pierścień wystający z ogona.Dostosuj wysokość myszy, dokręcając lub luzując dolną nakrętkę skrzydłową śruby urządzenia. Kończyny dolne nie powinny być obciążone. Po osiągnięciu optymalnej wysokości dokręć górną nakrętkę skrzydłową, a następnie ponownie ustaw butelkę z wodą i drut o nowym kształcie tak, aby mysz nie mogła wspiąć się na kranik kończynami tylnymi.Aby zmierzyć spożycie pokarmu podczas badania, należy zważyć granulaty przed umieszceniem ich w zacisku do zszywek. Należy dostarczyć około 8 do 10 g, aby umożliwić spożycie około 5 do 6 g karmy na dzień. Dla każdego stanowiska myszy należy przymocować zacisk do zszywek z pokarmem do dna klatki w taki sposób, aby mysz nie mogła się na niego wspiąć, a następnie przykleić go taśmą naprawczą.Użyj luźno ułożonych kawałków materiału (gores) o wymiarach dwa na dwa cale. Owiń ogon wokół wirbelka wędkarskiego. Owiń mały fragment ogona wokół kawałków materiału, aby przymocować je do ogona.Ten krok jest istotny, aby zapobiec opadaniu ogona w dół, co mogłoby doprowadzić do gromadzenia się krwi w jego końcówce i w konsekwencji do martwicy ogona. Powtórz tę samą procedurę dla kolejnego zwierzęcia po drugiej stronie klatki. Przy kwaterowaniu dwóch zwierząt w jednej klatce, ustaw je w taki sposób, aby niemal mogły się ze sobą stykać.W środku klatki. Do klatki dodaj niewielką ilość ściółki z kolb, upewniając się, że nie jest jej wystarczająco dużo, aby mysz mogła uformować kopiec. Po zakończeniu procedury odciążenia kończyn tylnych wyjmij zwierzę z aparatury i zdejmij pierścień z ogona.Za pomocą przecinaka do drutów zmierz masę ciała i umieść zwierzę z powrotem w klatce macierzystej w celu rekonwalescencji. Po okresie regeneracji zwierzęta są ponownie ważone, a następnie mierzy się masę mięśnia płaszczowatego oraz nadnerczy. Masa ciała przed zabiegiem usunięcia ogona nie różniła się istotnie od masy zmierzonej pięć dni po operacji i przed hu.Mimo że odciążenie kończyn tylnych przez 14 i 28 dni spowodowało niewielką, lecz nieistotną statystycznie utratę masy ciała, myszy w pełni odzyskały masę ciała sprzed HU po trzech dniach rekonwalescencji. Przedstawiono tutaj spożycie pokarmu u myszy z grupy kontrolnej (ruchomej) oraz myszy HU.Średnie dzienne spożycie pokarmu u myszy w grupie HU nie różniło się w ciągu 28 dni w porównaniu z grupą kontrolną. Po 14 i 28 dniach HU zaobserwowano znaczną atrofię mięśnia trójgłowego łydki, co wskazuje na skuteczność procedury po trzech dniach rekonwalescencji. Masa mięśnia była istotnie większa niż w obu grupach HU, lecz nadal znacząco mniejsza niż u zwierząt z grupy kontrolnej poruszających się swobodnie.Zarówno lewy, jak i prawy nadnercze zostały wycięte i zważone, aby uzyskać wskaźnik stresu zwierząt. Jak widać tutaj, średnie masy były porównywalne pomiędzy myszami kontrolnymi a myszami w grupie HU. Po opanowaniu techniki, operacja szycia może zostać wykonana w czasie od 5 do 10 minut na mysz, a przygotowanie klatki po tym zabiegu zajmuje 15 minut. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób regeneracji i reakcji układu mięśniowego oraz kostnego na przedłużone okresy nieużywania, można zastosować inne metody, takie jak obciążanie kończyn i rekonwalescencja po zaniku z nieużywania u myszy (Hein).Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić odciążenie kończyn tylnych u myszy. Technika ta umożliwia badanie wielu tkanek i układów, takich jak układ sercowo-naczyniowy, mięśniowo-szkieletowy i przedsionkowy, w warunkach obciążenia i ponownego obciążenia, z wykorzystaniem różnych modeli mysich, takich jak nokauty lub nokiny.

an-alternant-method-to-traditional-nasa-hindlimb-unloading-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Alternatywna metoda tradycyjnego modelu NASA obciążenia tylnych kończyn u myszy

Przedstawiono procedurę chirurgiczną indukcji jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej, z potwierdzeniem niedokrwienia za pomocą obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera.

Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

Model przecięcia nerwu piszczelowego jest dobrze tolerowanym, sprawdzonym i powtarzalnym modelem zaniku mięśni szkieletowych. Modelowy protokół chirurgiczny został opisany i zademonstrowany na myszach C57Black6.

Przecięcie nerwu piszczelowego - standaryzowany model atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją u myszy

MikroRNA odgrywają kluczową rolę w mózgu i są potencjalnymi celami do modelowania neurodegeneracji. Jednak zaburzanie poziomów miRNA jest trudne ze względu na krótką długość miRNA i niedostępność tkanki mózgowej. Ten film przedstawia metodę projektowania antagomiru i dostarczania specyficznego dla mózgu przy użyciu neuropeptydu u myszy.

Prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu miRNA

Ten nowatorski model do ortotopowego przeszczepu kończyn tylnych u myszy, wykorzystujący technikę mankietu bez szwów do zespolenia supermikronaczyniowego, stanowi potężne narzędzie do mechanistycznych badań immunologicznych in vivo związanych z unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA).

Ortotopowy przeszczep kończyn tylnych u myszy

Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest przydatna do badania angiogenezy, jednak jest ona zagrożona u niektórych szczepów myszy wsobnych, które wykazują wyraźną nekrozę tkanek wywołaną niedokrwieniem. Opisano metody wywoływania podostrego niedokrwienia kończyn za pomocą ameroidowych zwężaczy w celu obejścia tego problemu poprzez indukcję stopniowej niedrożności tętnic.

Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Korzystając z innowacyjnego naziemnego modelu analogowego, jesteśmy w stanie symulować misję kosmiczną, w tym podróż na (0 g) i pobyt na Marsie (0,38 g) u szczurów. Model ten pozwala na podłużną ocenę zmian fizjologicznych zachodzących podczas dwóch hipograwitacyjnych etapów misji.

Naśladowanie misji kosmicznej na Marsa przy użyciu rozładunku kończyn tylnych i częściowego obciążania szczurów

Ten model zwierzęcy umożliwia badaczom wywołanie statystycznie istotnego wtórnego obrzęku limfatycznego w tylnej kończynie myszy, trwającego co najmniej 8 tygodni. Model może być wykorzystany do badania patofizjologii obrzęku limfatycznego i badania nowych opcji leczenia.

Zmieniona metoda wywoływania wtórnego obrzęku limfatycznego w tylnej kończynie myszy

Ten protokół przedstawia solidny, powtarzalny model unaczynionego kompozytowego allotransplantu (VCA) nastawiony na jednoczesne badanie immunologii i funkcjonalnego odzyskiwania. Czas zainwestowany w skrupulatną technikę przeszczepu ortotopowego prawej kończyny tylnej w połowie uda z ręcznie szytymi zespoleniami naczyniowymi i koaaptacją neuronalną daje możliwość badania funkcjonalnej regeneracji.

Kolejny krok: ortotopowy model przeszczepu kończyn tylnych z koaaptacją neuronalną w celu maksymalizacji powrotu do sprawności u szczura

Ten artykuł demonstruje skuteczne podejście chirurgiczne do ustalenia ostrego niedokrwienia u myszy z małym nacięciem. Takie podejście może być stosowane przez większość grup badawczych bez konieczności modernizacji laboratoriów.

Zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia

Minimalnie inwazyjne techniki i proste urządzenie laboratoryjne poprawiają odtwarzalność modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego, zmniejszając uszkodzenia operacyjne u zwierząt doświadczalnych i umożliwiając utrzymanie anatomicznej morfologii. Metoda ta jest opłacalna, ponieważ wiarygodne wyniki i powtarzalna procedura ułatwiają badanie mechanizmów naprawy choroby.

Ustalenie modelu urazu rdzenia kręgowego stłuczenia u myszy w oparciu o technikę minimalnie inwazyjną

Ten mysi model łączy w sobie zniewagę septyczną z nieużywaniem mięśni kończyn tylnych, aby podsumować cechę typowego pacjenta z sepsą, która jest przykuta do łóżka. Model ten stanowi znaczące odejście od poprzednich modeli do badania dysfunkcji mięśni w sepsie i jest powtarzalnym podejściem do strategii terapeutycznych w leczeniu tego schorzenia.

Przedkliniczny model miopatii wywołanej sepsą z niestosowaniem u myszy

Poznaj uproszczoną metodę rozładunku kończyn tylnych u myszy, która minimalizuje stres zwierząt i skutecznie wywołuje atrofię mięśniową przy zachowaniu stabilnej masy ciała.

Alternatywna metoda dla tradycyjnego modelu odciążenia kończyn tylnych według NASA u myszy

Przeglądaj więcej filmów