Alternatywna metoda dla tradycyjnego modelu odciążenia kończyn tylnych według NASA u myszy

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie odciążenia kończyn tylnych (hu) u myszy przy użyciu prostszej i bardziej bezpośredniej metody, która minimalizuje stres zwierzęcia. Ta metoda z wykorzystaniem ogona skutecznie indukuje zanik kończyn tylnych bez pogorszenia ogólnego stanu zdrowia i masy ciała. Pierwszym krokiem jest wszczepienie pierścienia ogonowego dorosłej myszy.

Ważne jest, aby w trakcie całego badania rejestrować masę ciała oraz obserwacje dotyczące stanu zdrowia. Następnie montuje się aparat do odciążania kończyn tylnych i umieszcza go w klatce, w której będzie odbywać się procedura. Po wybudzeniu zwierzę zostaje umieszczone w aparacie w celu przeprowadzenia odciążania.

Ostatecznie wyniki można uzyskać poprzez pomiary masy ciała oraz masy mięśni, które wykazały zanik mięśni w kończynach tylnych u myszy poddanych odciążeniu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak technika owijania Maori Holton, jest fakt, że skóra ogona jest zawsze widoczna. Myszy nie są w stanie wydostać się z aparatury do zawieszenia ani bawić się pierścieniem, a także szybciej regenerują się i utrzymują stabilną masę ciała.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii układu mięśniowo-szkieletowego, a także w biologii grawitacyjnej i kosmicznej, takich jak sposoby zapobiegania zanikowi mięśni szkieletowych i utracie gęstości kości po przedłużonych okresach nieaktywności fizycznej, unieruchomieniu w łóżku, mobilizacji kończyn, w warunkach mikrograwitacji, w przebiegu chorób nerwowo-mięśniowych oraz wraz z postępującym wiekiem. Pomysł ten pojawił się, gdy napotkaliśmy komplikacje związane z techniką tapowania ogona według Maury’ego Holdena. Regularnie traciliśmy zwierzęta i dane eksperymentalne z powodu ucieczek myszy z aparatury do unieruchomienia kończyn tylnych podczas demonstrowania tej techniki.

Dzisiaj towarzyszą mi Andre Ferrara, starszy asystent naukowy z mojego laboratorium, a w pomaganiu Andresowi uczestniczą Jacqueline Chrissy, doktorantka w laboratorium, oraz Andrew Dunn, student studiów licencjackich, również pracujący w laboratorium. Należy rozpocząć od wysterylizowania pola operacyjnego, znieczulić dorosłą mysz izofluranem, a następnie zapisać masę ciała myszy i umieścić ją na podkładce grzewczej. Przygotować ogon do zabiegu, przemywając go roztworem chlorheksydyny.

Należy rozpocząć odliczanie od końca owłosienia ciała u nasady ogona, aby zlokalizować piątą, szóstą lub siódmą przestrzeń międzykręgową pomiędzy dwoma kostnymi wypustkami na ogonie. Używając kleszczyków hemostatycznych i igły 20 5G, należy wykonać otwór prowadzący między dwoma kręgami, wchodząc w przestrzeń międzykręgową. Następnie należy wyjąć igłę i wprowadzić stalową szwę.

Odetnij nitkę do długości 10 centymetrów, przecinając ją przez otwór. Z każdej strony ogona powinno wystawać pięć centymetrów szwu. Połóż czubek kciuka na ogonie i za pomocą wolnej ręki owiń stalową nitkę wokół kciuka.

Skręć końce, aby utworzyć dużą pętlę. Część zwojona lub okrągła powinna mieć długość plus lub minus 3 mm. Zaciśnij jedną nić szwu za pomocą hemostatu i zegnij ją w mniejszą pętlę, której koniec należy przymocować jak najbliżej skrętu na oryginalnej dużej pętli.

Odetnij nadmiar drutu i odegnij skręcony drut. Zatamuj ewentualne nadmierne krwawienie za pomocą patyczków z azotanem srebra. Pozostaw zwierzę do rekonwalescencji na okres od pięciu do siedmiu dni przed odciążeniem kończyn tylnych lub hu po operacji.

Przymocuj domykanie pojedynczo, aby zapobiec zaplątaniu się pierścieni ogonowych. Połóż jeden cal drutu o grubości trzech ósmych cala, płytkiego naciętego pręta stalowego, na górnej części klatki i przymocuj go taśmą. Dodaj kolejną podkładkę i nakrętkę motylkową, ale nie dokręcaj ich całkowicie, aby umożliwić późniejsze dokonanie regulacji.

Włóż śrubę maszynową przez otwór centralny szpuli, aby zapobiec jej zsunięciu się. Na końcu śruby maszynowej zakręć nylonową nakrętką samokontrującą. Szpula powinna obracać się swobodnie.

Włóż karabińczyk z obrotki wędkarskiej przez dolną część szpulki. Za pomocą szczypiec uformuj z spinacza do papieru haczyk w kształcie litery S. Przełóż jeden koniec haczyka w kształcie litery S przez otwór obrotki wędkarskiej i zaciśnij go szczypcami.

Umieść drut w kształcie litery U równolegle do śruby maszynowej wewnątrz klatki i zagnij jego końce nad krawędzią. Aby zamocować pełną butelkę z wodą, włóż butelkę do drutu w kształcie litery U tak, aby kurek był skierowany w dół, ale nie dotykał dna. Przymocuj butelkę z wodą do klatki za pomocą taśmy naprawczej.

Rozgiń dwucalowy zacisk biurowy, zachowując wystarczające napięcie, aby utrzymać kilka kawałków pokarmu bez zgniatania pelletów przed przeprowadzeniem procedury odciążania kończyn tylnych. Zapisz masę ciała myszy do późniejszych porównań. Następnie wprowadź otwarty koniec haka w kształcie litery S przez mniejszy pierścień wystający z ogona.

Dostosuj wysokość myszy, dokręcając lub luzując dolną nakrętkę skrzydłową śruby urządzenia. Kończyny dolne nie powinny być obciążone. Po osiągnięciu optymalnej wysokości dokręć górną nakrętkę skrzydłową, a następnie ponownie ustaw butelkę z wodą i drut o nowym kształcie tak, aby mysz nie mogła wspiąć się na kranik kończynami tylnymi.

Aby zmierzyć spożycie pokarmu podczas badania, należy zważyć granulaty przed umieszceniem ich w zacisku do zszywek. Należy dostarczyć około 8 do 10 g, aby umożliwić spożycie około 5 do 6 g karmy na dzień. Dla każdego stanowiska myszy należy przymocować zacisk do zszywek z pokarmem do dna klatki w taki sposób, aby mysz nie mogła się na niego wspiąć, a następnie przykleić go taśmą naprawczą.

Użyj luźno ułożonych kawałków materiału (gores) o wymiarach dwa na dwa cale. Owiń ogon wokół wirbelka wędkarskiego. Owiń mały fragment ogona wokół kawałków materiału, aby przymocować je do ogona.

Ten krok jest istotny, aby zapobiec opadaniu ogona w dół, co mogłoby doprowadzić do gromadzenia się krwi w jego końcówce i w konsekwencji do martwicy ogona. Powtórz tę samą procedurę dla kolejnego zwierzęcia po drugiej stronie klatki. Przy kwaterowaniu dwóch zwierząt w jednej klatce, ustaw je w taki sposób, aby niemal mogły się ze sobą stykać.

W środku klatki. Do klatki dodaj niewielką ilość ściółki z kolb, upewniając się, że nie jest jej wystarczająco dużo, aby mysz mogła uformować kopiec. Po zakończeniu procedury odciążenia kończyn tylnych wyjmij zwierzę z aparatury i zdejmij pierścień z ogona.

Za pomocą przecinaka do drutów zmierz masę ciała i umieść zwierzę z powrotem w klatce macierzystej w celu rekonwalescencji. Po okresie regeneracji zwierzęta są ponownie ważone, a następnie mierzy się masę mięśnia płaszczowatego oraz nadnerczy. Masa ciała przed zabiegiem usunięcia ogona nie różniła się istotnie od masy zmierzonej pięć dni po operacji i przed hu.

Mimo że odciążenie kończyn tylnych przez 14 i 28 dni spowodowało niewielką, lecz nieistotną statystycznie utratę masy ciała, myszy w pełni odzyskały masę ciała sprzed HU po trzech dniach rekonwalescencji. Przedstawiono tutaj spożycie pokarmu u myszy z grupy kontrolnej (ruchomej) oraz myszy HU.

Średnie dzienne spożycie pokarmu u myszy w grupie HU nie różniło się w ciągu 28 dni w porównaniu z grupą kontrolną. Po 14 i 28 dniach HU zaobserwowano znaczną atrofię mięśnia trójgłowego łydki, co wskazuje na skuteczność procedury po trzech dniach rekonwalescencji. Masa mięśnia była istotnie większa niż w obu grupach HU, lecz nadal znacząco mniejsza niż u zwierząt z grupy kontrolnej poruszających się swobodnie.

Zarówno lewy, jak i prawy nadnercze zostały wycięte i zważone, aby uzyskać wskaźnik stresu zwierząt. Jak widać tutaj, średnie masy były porównywalne pomiędzy myszami kontrolnymi a myszami w grupie HU. Po opanowaniu techniki, operacja szycia może zostać wykonana w czasie od 5 do 10 minut na mysz, a przygotowanie klatki po tym zabiegu zajmuje 15 minut. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób regeneracji i reakcji układu mięśniowego oraz kostnego na przedłużone okresy nieużywania, można zastosować inne metody, takie jak obciążanie kończyn i rekonwalescencja po zaniku z nieużywania u myszy (Hein).

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić odciążenie kończyn tylnych u myszy. Technika ta umożliwia badanie wielu tkanek i układów, takich jak układ sercowo-naczyniowy, mięśniowo-szkieletowy i przedsionkowy, w warunkach obciążenia i ponownego obciążenia, z wykorzystaniem różnych modeli mysich, takich jak nokauty lub nokiny.