Name: Interferencja RNAi przez wstrzyknięcie dsRNA do zarodków Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj technikę RNAi przez wstrzyknięcie dsRNA do zarodków Drosophila w celu badania genów niezbędnych dla rozwoju narządów. Ta metoda pozwala szybko analizować funkcje genów in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Stephenowi Crewsowi za cDNA dysfusion, przeciwciało Dys oraz muchy w1118.

1. Pobieranie zarodków
<ol>
<li>Przygotować klatki w temperaturze 25°C, używając 2-4 dniowych much w1118. Podłoża z sokiem z winogron wymieniać co godzinę w ciągu dnia, aby zsynchronizować zbiór jaj w okresie 1-2 dni przed właściwym pobraniem</li>
<li>Zbierać embriony przez 1 h w temperaturze 25°C</li>
<li>Wyciąć prostokątny kawałek agaru z sokiem z winogron, naciąć go lekko w środku żyletką, pozostawiając linię w agarze</li>
<li>Za pomocą metalowej sondy przenieść embriony z płytki z sokiem z winogron na przygotowany kawałek agaru, ustawiając je w prostej linii, tak aby dłuższa oś embrionu była pod kątem 45 stopni względem linii w środku agaru. Ułożyć prostą linię z około 50 embrionów. Upewnić się, że wszystkie embriony są skierowane w tym samym kierunku, z końcem tylnym skierowanym na zewnątrz od linii</li>
<li>Wyciąć prostokątny kawałek dwustronnej taśmy klejącej i przykleić go do szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18x18 mm</li>
<li>Pobrać embriony za pomocą dwustronnej taśmy na szkiełku nakrywkowym</li>
<li>Położyć szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym i suszyć embriony na powietrzu przez około 10 min</li>
<li>Przykryć embriony cienką warstwą oleju Halocarbon 700; są one teraz gotowe do iniekcji</li>
</ol>
2. Wyciąganie igły
Przygotować igły do mikroiniekcji poprzez wyciąganie szklanych kapilar. Używamy wyciągarki do igieł firmy World Precision Instrument (Model PUL-1). Specyfikacja programu wyciągarki to: heat: 1, delay 4.
3. Napełnianie igieł
Napełnij igły od tyłu, używając pipety Eppendorf p20 z końcówkami Eppendorf Microloader, zazwyczaj nabierając 1.5-2 μL dsRNA
4. Przełam igły
<ol>
<li>Przed złamaniem igły umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym.</li>
<li>Przygotuj szkiełko przedmiotowe z kroplą oleju w jego środkowej części.</li>
<li>Włącz mikropompę Picospritzer III, aby wyregulować ciśnienie powietrza.</li>
<li>Złam wypełnioną igłę o krawędź szkiełka nakrywkowe, tworząc ostry czubek.</li>
<li>Po złamaniu końcówki nacisnąć pedał sterujący mikropompy Picospritzer III, aby z końcówki igły wypłynęła niewielka ilość dsRNA.</li>
<li>Wyjmij szkiełko z nakrywką.</li>
<li>Wprowadź igłę pod kroplę oleju w środku wcześniej przygotowanego szkiełka przedmiotowego.</li>
<li>Dostosuj ustawienia mikropompy Picospritzer III tak, aby po naciśnięciu pedału wydzielano 100-200pl dsRNA. dsRNA powinno być widoczne jako mała kropelka.</li>
</ol>
5. Iniekcja
<ol>
<li>Zbliż końcówkę igły do tylnej części zarodka w stadium pierwszej blastodermy, dopasowując ją do tej samej płaszczyzny ogniskowej, a następnie wykonaj wtryskiwanie poza centrum, w odległości około 30-50% długości jaja.</li>
<li>Po naciśnięciu pedału pompy piko-mikropompowej Picospritzer III, niewielka ilość dsRNA pojawi się w miejscu wstrzyknięcia w postaci małej kropki.</li>
</ol>
6. Analiza fenotypowa
<ol>
<li>Po wstrzyknięciu umieść szkiełko w przykrytej wilgotnej komorze (plastikowa szalka Petriego) w temperaturze 18°C, aż embriony rozwiną się do pożądanego stadium embrionalnego.</li>
<li>Za pomocą sondy usuń embriony z dwustronnej taśmy i przesuń je do krawędzi szkiełka nakrywkowego. 
Zmyj embriony ze szkiełka do probówki zbiorczej z nylonowym sitkiem na dnie, używając heptanu, a następnie przemyj 3 razy roztworem PBT. 
Przeprowadź dechorionację embrionów w 50% wybielaczu przez 5 min, a następnie przemyj 3 razy roztworem PBT. 
Przenieś embriony z probówki zbiorczej na fragment nylonowego sitka, a następnie zanurz sitko w roztworze utrwalającym (5ml heptanu, 4.5ml PBS, 0.5ml 37% formaldehydu), aby uwolnić embriony. Utrwalaj embriony w roztworze utrwalającym przez 30min. 
Przeprowadź dewitellinizację embrionów za pomocą metanolu, przenieś embriony do probówki typu Eppendorf i przeprowadź immunobarwienie embrionów zgodnie ze standardowymi protokołami.</li>
<li>Embriony mogą być również rozwijane do odpowiedniego stadium larwalnego.</li>
<li>Przygotuj szkiełko z kroplą oleju Halocarbon 700 na środku.</li>
<li>Przenieś jedną larwę na szkiełko i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym.</li>
<li>Obserwuj larwy pod mikroskopem w polu jasnym.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Przykład wyciszenia genu dysfusion (dys) za pomocą dsRNA w embrionie Drosophila przedstawiono na Rys. 1. Embriony wstrzyknięte z GFP-dsRNA stanowią kontrolę negatywną. Dys jest czynnikiem transkrypcyjnym bHLH PAS eksprymowanym w komórkach fuzji tchawki. Embriony wstrzyknięte z GFP-dsRNA wykazują prawidłową fuzję tchawki, a białko Dys jest obecne w komórkach fuzji (Rysunek 1A). Z kolei embriony wstrzyknięte z dys-dsRNA wykazują brak fuzji odgałęzień, a białka Dys nie są obecne w komórkach fuzji (Rysunek 1B). Gdy embriony po wstrzyknięciu dsRNA rozwinęły się do stadium larwalnego, larwy po wstrzyknięciu dys-dsRNA wykazywały brak fuzji odgałęzień (Rys. 1D) w porównaniu do kontroli negatywnej po wstrzyknięciu GFP-dsRNA (Rysunek 1C). Wyniki te wykazały skuteczne wyciszenie endogennej ekspresji genu dys poprzez wstrzyknięcie dsRNA do embrionów Drosophila
 <img src="/files/ftp_upload/2477/2477fig1.jpg" alt="Wyniki RNAi dla GFP i dys, schemat; interferencja RNA w tkance neuronalnej, porównanie wzorców ekspresji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Usunięcie funkcji dys poprzez dys-RNAi ujawnia defekty fuzji tchawic. Zarodki w stadium blastodermy (w1118) wstrzyknięto GFP-dsRNA (kontrola negatywna) lub dys-dsRNA, a następnie poddano analizie pod kątem defektów tchawic. (A) Zarodek w stadium 16 po wstrzyknięciu GFP-dsRNA, barwiony przeciwciałami α-Dys oraz MAb 2A12 barwiącymi światło tchawic. Wyraźnie widoczny jest zrośnięty boczny pień. Strzałki wskazują komórki fuzji pnia bocznego wykazujące obecność Dys. (B) Zarodek w stadium 16 po wstrzyknięciu dys-dsRNA, barwiony przeciwciałami α-Dys oraz MAb 2A12. W zarodku stwierdzono brak fuzji pnia bocznego (gwiazdka wskazuje normalną lokalizację fuzji pnia bocznego w zarodkach kontrolnych). Nie zaobserwowano komórek wykazujących obecność Dys, co wskazuje, że dys-RNA skutecznie zniosło ekspresję białka Dys. (C do D) Larwy drugiego stadium po wstrzyknięciu GFP-dsRNA lub dys-dsRNA zbadano pod kątem defektów tchawic za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym. (C) Miejsca fuzji są zaznaczone gwiazdką w larwach kontrolnych po wstrzyknięciu GFP-dsRNA. (D) W larwach po wstrzyknięciu dys-RNA nie doszło do fuzji pnia bocznego; (*) wskazuje normalną lokalizację fuzji pnia bocznego.

<ol><li>St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+pattern+and+polarity+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.</a> Cell. 68, 201-219 (1992).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+for+gene+manipulation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95, 1017-1026 (1998).</li>
<li>Misquitta, L., Paterson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+gene+function+in+Drosophila+by+RNA+interference+%28RNA-i%29%3A+a+role+for+nautilus+in+embryonic+somatic+muscle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).</li>
<li>Horowitz, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Branching morphogenesis.</a> Circ. Res. 103, 784-795 (2008).</li>
<li>Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis%3A+molecular+mechanisms+of+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).</li>
<li>Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+morphogenesis+of+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).</li>
<li>Jiang, L., Crews, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfusion+transcriptional+control+of+Drosophila+tracheal+migration%2C+adhesion%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).</li>
<li>Jiang, L., Crews, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+dysfusion+basic+helix-loop-helix+%28bHLH%29-PAS+gene+controls+tracheal+fusion+and+levels+of+the+trachealess+bHLH-PAS+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda wstrzykiwania dsRNA umożliwia bardzo czułą i szybką analizę funkcji genów w rozwoju cewy oddechowej Drosophila. Metodę tę można potencjalnie zastosować do analizy funkcji genów w rozwoju innych tkanek i narządów.

<table><tbody><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Pikopompa Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Fisher Scientific</td><td>21170M</td><td></td></tr><tr><td>Mikroładownice</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr></tbody></table>

interferencja rnai poprzez wstrzykiwanie dsrna do embrionów drosophila

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Przesiewanie genetyczne jest jedną z najpotężniejszych dostępnych metod pozwalających na uzyskanie wglądu w złożone procesy biologiczne 1. Na przestrzeni lat opracowano wiele ulepszeń i narzędzi do manipulacji genetycznych u Drosophila 2. Wkrótce po odkryciu dokonanym przez Frie i Mello 3, że dwuniciowy RNA może być wykorzystany do wyciszenia aktywności pojedynczych genów u Caenorhabditis elegans, wykazano, że interferencja RNA (RNAi) stanowi potężne podejście genetyki odwrotnej do analizy funkcji genów w rozwoju organów Drosophila 4, 5.
Wiele organów, w tym płuca, nerki, wątroba i układ naczyniowy, składa się z rozgałęzionych sieci cewkowych, które transportują żywotne płyny lub gazy 6, 7. Analiza formowania się cewii u Drosophila stanowi doskonały system modelowy do badania morfogenezy innych organów cewkowych 8. Projekt genomu Drosophila realizowany w Berkeley ujawnił setki genów eksprymowanych w układzie cewii. Aby zbadać molekularne i komórkowe mechanizmy formowania cewek, kluczowym wyzwaniem jest zrozumienie roli tych genów w rozwoju układu cewii. W niniejszej pracy opisaliśmy szczegółową metodę wstrzykiwania dsRNA do embrionów Drosophila w celu wyciszenia ekspresji poszczególnych genów. Pomyślnie wyciszyliśmy endogenną ekspresję genu dysfusion(dys) poprzez wstrzyknięcie dsRNA. Dys jest białkiem bHLH-PAS eksprymowanym w komórkach fuzji cewii i jest niezbędne do fuzji odgałęzień cewii 9, 10. dys-RNAi całkowicie wyeliminowało ekspresję dys, co doprowadziło do defektu fuzji cewii. Ta stosunkowo prosta metoda dostarcza narzędzia do identyfikacji genów niezbędnych do rozwoju tkanek i organów u Drosophila.

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Przesiewy genetyczne są jedną z najpotężniejszych dostępnych metod pozyskiwania wiedzy na temat złożonych procesów biologicznych 1. Na przestrzeni lat wprowadzono wiele ulepszeń...

Ogólnym celem tej procedury jest wyciszenie endogennej ekspresji genów poprzez wstrzyknięcie dwuniciowego RNA do embrionów drosofil w celu zidentyfikowania genów niezbędnych do rozwoju narządów. Jest to realizowane poprzez wstępne zebranie i ustawienie embrionów w linii prostej. Następnie przygotowuje się igły, których używa się do wstrzykiwania dwuniciowego RNA do embrionów.Na koniec zarodki umieszcza się w komorze wilgotnej w celu ich rozwoju. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące wady fuzji gałęzi tchawki u drosophila poprzez barwienie przeciwciałami zarodków w późnym stadium lub poprzez obserwację larw pod mikroskopem w świetle przechodzącym. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak forward genetic screen w celu identyfikacji genów niezbędnych do rozwoju organów, jest to, że jest to stosunkowo proste i szybkie podejście odwrotnej genetyki umożliwiające analizę funkcji genów, zanim dostępny będzie mutant dla danego genu.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak identyfikacja krytycznych genów niezbędnych do rozwoju układu tchawkowego Drosophila. Jest to doskonały model do badania morfogene

rnai-interference-by-dsrna-injection-into-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Interferencja RNA za pomocą wstrzyknięcia dsRNA do zarodków Drosophila

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

RNA (RNAi) są podstawą badań nad Tribolium. W tym miejscu przedstawiamy przegląd naszej techniki RNAi larwalnych w Tribolium castaneum. Larwalne RNAi to prosta, ale potężna technika, która zapewnia szybki dostęp do fenotypów utraty funkcji, umożliwiając naukowcom badanie funkcji genów w różnych kontekstach.

Interferencja larwalnego RNA u chrząszcza mącznego (Tribolium castaneum)

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Manipulacja interferencją RNA (RNAi) stanowi ogromne wyzwanie dla wielu gatunków parazytoidów o niewielkich rozmiarach, takich jak osy Trichogramma. W badaniu tym opracowano skuteczną metodę RNAi u Trichogramma denrolimi. Obecna metodologia zapewnia solidny model do badania regulacji genów u os Trichogramma.

Interferencja RNA w parazytoidzie jaja, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Poznaj technikę RNAi przez wstrzyknięcie dsRNA do zarodków Drosophila w celu badania genów niezbędnych dla rozwoju narządów. Ta metoda pozwala szybko analizować funkcje genów in vivo.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Przeglądaj więcej filmów