Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest wyciszenie endogennej ekspresji genów poprzez wstrzyknięcie dwuniciowego RNA do embrionów drosofil w celu zidentyfikowania genów niezbędnych do rozwoju narządów. Jest to realizowane poprzez wstępne zebranie i ustawienie embrionów w linii prostej. Następnie przygotowuje się igły, których używa się do wstrzykiwania dwuniciowego RNA do embrionów.

Na koniec zarodki umieszcza się w komorze wilgotnej w celu ich rozwoju. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące wady fuzji gałęzi tchawki u drosophila poprzez barwienie przeciwciałami zarodków w późnym stadium lub poprzez obserwację larw pod mikroskopem w świetle przechodzącym. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak forward genetic screen w celu identyfikacji genów niezbędnych do rozwoju organów, jest to, że jest to stosunkowo proste i szybkie podejście odwrotnej genetyki umożliwiające analizę funkcji genów, zanim dostępny będzie mutant dla danego genu.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak identyfikacja krytycznych genów niezbędnych do rozwoju układu tchawkowego Drosophila. Jest to doskonały model do badania morfogenezy organów ssaków, takich jak drogi oddechowe kręgowców, układ krwionośny, cewki nerkowe oraz nabłonek eksploracyjny. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ opanowanie takich czynności jak ustawianie embrionów w linii, łamanie igieł oraz wstrzykiwanie nici RNA do embrionów wymaga czasu i wprawy.

Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ ilość wstrzykiwanego dwuniciowego RNA różni się w zależności od zarodka, a opisowy opis wyglądu zarodków na etapie blastodermy syncytialnej może być niejednoznaczny. Kroki te są trudne do opanowania, gdyż wstrzyknięcie odpowiedniej ilości dwuniciowego RNA do zarodków na etapie blastodermy syncytialnej jest etapem krytycznym dla skutecznego wyciszenia ekspresji genów endogennych.

Aby rozpocząć, przygotować klatki w temperaturze 25 °C, używając much W 1 1 1 8 w wieku od dwóch do czterech dni; wymieniać pożywkę z sokiem winogronowym co godzinę w ciągu dnia, aby zsynchronizować zbiór jaj w okresie od jednego do dwóch dni. Przed zbiorem zebrać embriony syn city lub blaster derm przez jedną godzinę w temperaturze 25 °C na prostokątnym kawałku agaru z sokiem winogronowym, a następnie lekko naciąć linię na środku agaru za pomocą żyletki.

Za pomocą metalowej sondy przenieś embriony z płytki z sokiem z winogron na fragment agaru z sokiem z winogron. Ułóż około 50 embrionów w prostej linii, tak aby ich dłuższe osie były ustawione pod kątem 45 stopni względem linii w środku agaru. Upewnij się, że wszystkie embriony są skierowane w tym samym kierunku, a ich końce tylne są odwrócone od linii.

Wytnij prostokątny kawałek dwustronnej taśmy i przyklej go do szkiełka podstawowego o wymiarach 18 na 18 milimetrów. Za pomocą taśmy na szkiełku pobierz embriony. Umieść szkiełko na szkiełku przedmiotowym.

Lekko dociśnij embriony do dwustronnej taśmy i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez około 10 minut. Przykryj embriony cienką warstwą oleju halo węglowego 700. Odczekaj około 10 minut, aż embriony staną się przejrzyste pod mikroskopem.

Igły do mikrowstrzykiwania przygotowuje się poprzez wyciąganie szklanych kapilar. Używamy wyciągacza igieł firmy World Precision Instruments z następującymi ustawieniami programu: Heat one delay four back.

Napełnij igłę dwiema mikrolitrami dwuniciowego RNA, używając pipety Einor P 20 z końcówkami einor micro loader. Przygotuj szkiełko podstawowe z czystym szkiełkiem nakrywką na wierzchu i przymocuj je do siebie taśmą. Przystaw napełnioną igłę do krawędzi szkiełka nakrywki, tworząc ostry punkt.

Dwuniciowy RNA wycieka z końcówki igły. Po naciśnięciu pedału pompy pico, przygotuj preparat na szkiełku z kroplą oleju w środku. Wprowadź igłę w kroplę oleju.

Ustaw pompę pikolitrową tak, aby po naciśnięciu pedału wypuściła od 100 do 200 picoliters dwuniciowego RNA. Dwuniciowe RNA będzie widoczne jako mała kropla w określonej pozycji.

Gdy końcówka igły znajduje się w tylnej części pierwszego embrionu, należy nacisnąć pedał pompy pikolitrowej. Dwuniciowy RNA pojawi się jako mała kropka w miejscu iniekcji.

Zakończ wstrzykiwanie dwuniciowego RNA do embrionów na szkiełku. Usuń wszystkie embriony, które nie osiągnęły stadium blastodermy. Umieść szkiełko podstawowe z nakrywką w osłoniętej wilgotnej komorze, np. w plastikowej szalce Petriego, w temperaturze 18 °C do czasu, aż embriony rozwiną się do pożądanego stadium embrionalnego lub larwalnego.

W przypadku zarodków, które rozwinęły się do pożądanego stadium embrionalnego, należy użyć sondy, aby zdjąć je z dwustronnej taśmy i przesunąć w stronę krawędzi szkiełka nakrywki. Zarodki należy spłukać heptanem do probówki zbierającej z nylonową siatką na dnie. Zarodki należy przemyć trzykrotnie w roztworze PBT, a następnie inkubować w 50% Bleach przez pięć minut i ponownie przemyć trzykrotnie w PBT.

Przenieś zarodki z probówki zbiorczej na kawałek nylonowej siatki za pomocą pipety, a następnie zanurz kawałek siatki w roztworze utrwalającym. Utrwalaj zarodki przez 30 minut. Usuń dolną warstwę roztworu utrwalającego.

Następnie utrwalone w metanolu embriony przenosi się do probówki typu Eppendorf i poddaje immunobarwieniu przeciwciałami anty-A12 oraz anty-dyfuzyjnymi, stosując standardowe protokoły barwienia przeciwciałami dla embrionów, które rozwinęły się do pożądanego stadium larwalnego. Przygotowuje się szkiełko z kroplą oleju halokarbonowego 700 w środku oraz dwoma małymi szkiełkami podstawkowymi po obu stronach kropli oleju. Przenosi się jedną larwę na szkiełko, a następnie nakłada szkiełko cover slip na wierzch kropli oleju.

Obserwuj larwy pod mikroskopem w świetle przechodzącym. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki zarówno dla dyfuzji dwuniciowego RNA, jak i dla iniekcji dwuniciowego RNA GFP.

Zarodki z wstrzykniętym dwuniciowym RNA GFP wykazują prawidłowe łączenie tchawic, a białko dyfuzyjne jest obecne w komórkach fuzyjnych. Strzałki wskazują bocznie położone komórki fuzyjne wykazujące pozytywny wynik dyfuzji w tułowiu, a gwiazdka oznacza miejsce prawidłowego połączenia.

Jednak w embrionach po wstrzyknięciu dwuniciowego RNA przeciwko dyfuzynom obserwuje się brak fuzji odgałęzień, a białka dyfuzyny nie występują w komórkach fuzji. Trójkąt wskazuje miejsce braku fuzji odgałęzień tchawki w embrionach po wstrzyknięciu dwuniciowego RNA, które rozwinęły się do stadium larwalnego. Larwy G-F-P-R-N AI wykazują prawidłową fuzję odgałęzień tchawki, oznaczoną gwiazdką.

Z drugiej strony, larwy RN AI dla genu diffusion wykazały niepowodzenie fuzji gałęzi, co zaznaczono trójkątami. Wyniki te pokazują efekt wyciszenia ekspresji endogennego genu diffusion poprzez wstrzyknięcie dwuniciowego RNA do embrionów drozłożydi. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o utylizacji wszystkich embrionów enseal blaster po zakończeniu ich rozwoju.

Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii rozwoju do zgłębiania funkcji nowych genów odpowiedzialnych za rozwój organów u drosophila. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wyciszać geny endogenne poprzez wstrzykiwanie dwuniciowego RNA do embrionów drosophila.