Lokalizacja białek w trójwymiarowej kulturze komórek macierzystych neuronów: hybrydowa metodologia wizualizacji

W warunkach hodowli w zawiesinie komórki progenitorowe neuronów wyizolowane z nisz neurogennych mózgu proliferują, tworząc neurosfery. W niniejszym materiale przedstawiamy metodę izolacji i seryjnego cięcia wolno pływających postnatalnych neurosfer pochodzących z hipokampa w celu zlokalizowania ekspresji białek w obrębie trójwymiarowej neurosfery. Wykonamy barwienie immunocytochemiczne na interesujące nas białko – w tym przypadku Conexion 29, a następnie przeprowadzimy montaż i translację dwuwymiarowych obrazów mikroskopowych w trójwymiarową rekonstrukcję neurosfery.

Wizualizacja białek w kontekście ich natywnych struktur trójwymiarowych, takich jak swobodnie pływająca sferoida neuronalna lub tkanka, pozwala na lepsze zrozumienie funkcji białek na podstawie ich lokalizacji w tych strukturach, a także umożliwia wnioskowanie o możliwych regułach dla białek o znanej lokalizacji, lecz nieznanych funkcjach. Cześć, jestem Sophia Ambo z Laboratorium Regeneracji Neuronalnej na Uniwersytecie w Ottawie. A ja jestem Nicholas Valenzuela z Carlton Immersive Media Studio na Uniwersytecie Carleton w Ottawie.

Dzisiaj zaprezentujemy sposób izolacji, ekspansji i seryjnego cięcia postnatalnych komórek progenitorowych neuronów pochodzących z hipokampa w formie neurosfer. W celu zlokalizowania ekspresji białek za pomocą barwienia immunocytochemicznego, wykorzystamy dwuwymiarowe obrazy seryjnych przekrojów neurosfer pobranych po barwieniu, aby zilustrować metodę rekonstrukcji rozmieszczenia komórek i białek w strukturze trójwymiarowej, a tym samym ocenić organizację przestrzenną ekspresji białek w obrębie neurosfer. Zatem zacznijmy.

Po pobraniu mózgów, przygotuj je do umieszczenia na uchwycie, tworząc płaską powierzchnię, na której mózgi będą stabilnie spoczywać. Proces ten nazywa się blokowaniem. Zablokuj móżdżek, używając żyletki i pęsety.

Następnie nanieś kroplę kleju cyjanoakrylowego na uchwyt i przymocuj do niego pierwszy mózg, stroną przednią do góry, a stroną grzbietową skierowaną w Twoją stronę. Postępuj w ten sam sposób z pozostałymi mózgami; w przypadku ostatniego mózgu zaleca się ustawienie strony grzbietowej przodem od siebie, ponieważ cięcie w tym kierunku bywa niepełne. Jeśli dojdzie do niepełnego cięcia, użyj skalpela, aby przeciąć tkankę i pobrać przekrój.

Szybkość jest kluczowa podczas etapu przyklejania, ponieważ mózgi nie mogą być zbyt długo wystawione na działanie powietrza. Po przyklejeniu wszystkich mózgów uchwyt zostaje umieszczony w wibratorze, a holder wypełniony lodowatym CSF.

Ustaw wibrator na częstotliwość 8.5 oraz prędkość od 3.5 do 4.5. Przystaw ostrze do A CSF i ustaw automatyczne cięcie. Teraz wykonamy plastry o grubości 500 micron.

Zachowaj plastry zawierające hipokamp. Umieść je w naczyniu wypełnionym lodowatym A CSF, a pozostałe plastry odrzuć. Po zebraniu wszystkich plastrów przystąp do wycięcia hipokampu.

Używając stereomikroskopu, pobieramy tylko grzbietową część hipokampa w zakresie od około bgma minus 1,65 milimetra do minus 2,10 milimetra. Umieść hipokampy w pustym, schłodzonym naczyniu z lodem. Gdy wszystkie hipokampy zostaną zebrane z przekrojów, należy przenieść je do komory z laminarnym przepływem powietrza w celu przeprowadzenia dysocjacji mechanicznej.

Za pomocą skalpela, spryskując ostrze 70% etanolem i opalając je w płomieniu w celu sterylizacji, nacinaj tkankę, aż stanie się ona płynna. Następnie, używając medium do dysocjacji zawierającego papainę i proteazę neuronalną, zbierz tkankę za pomocą pipety i umieść ją w probówce o pojemności 15 ml.

W celu przeprowadzenia dyssekcji enzymatycznej należy umieścić probówkę w inkubatorze obrotowym ustawionym na 37 °C i pozostawić do trawienia na okres od 45 minut do godziny. Po zakończeniu trawienia należy dodać 10 mL sterylnego roztworu PBS do hodowli tkankowej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, a następnie odwirować komórki z prędkością 300 ×g przez pięć minut. Należy usunąć nadsącz i resuspendować osad.

W pięciu mililitrach PBS, używając pipety Pasteura, trituj próbkę, aby dalej rozdzielić tkankę. Trituj tak długo, aż fragmenty tkanki przestaną się zmniejszać. W tym momencie ponownie odwiruj komórki w formie pelletu.

Usunąć PBS i resuspendować osad w trzech mililitrach pożywki konserwującej. Następnie dokładnie utrzeć próbkę. Pobrać alikwot 15 µL i zmieszać go z równą objętością błękitu trypanowego.

Pobierz dwie próbki o objętości 10 µL i nanieś je na komorę countingową (hemocytometr) w celu policzenia komórek. Policz komórki w trzech polach w każdej sekcji, co daje łącznie sześć pól. Oblicz średnią liczbę komórek, aby wyznaczyć gęstość komórkową.

Pamiętając o tym, że próbka jest rozcieńczona, wysiej komórki w naczyniach o niskiej adhezji w gęstości 2,5 × 10⁵ komórek na naczynie w końcowej objętości 5 mL medium konserwującego. Jeśli naczynia o niskiej adhezji nie są dostępne, można użyć szalek Petriego.

W tym przypadku należy delikatnie stukać w naczynia z neurosferami rano i po południu każdego dnia przez pierwsze sześć dni, aby neurosfery nie przywarły do dna naczynia. Przed umieszczeniem naczyń w inkubatorze dodaj EG, F oraz FGF. Czynniki wzrostu te należy uzupełniać co dwa dni przez cały okres hodowli. W 14. dniu in vitro utrwal neurosfery za pomocą formaldehydu do stężenia końcowego około 4%, dodając go bezpośrednio do hodowli i inkubując w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Odwirować komórki, wirując z prędkością 300 ×g przez pięć minut, aż do utworzenia osadu. Przesmyć komórki dwukrotnie za pomocą PBS i resuspender w 15–20% roztworze sacharozy przygotowanym w 10 mM buforze fosforanowym. Pozostawić do krioprotekcji w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny przed przecinaniem na kriostacie.

Wyjmij krioschronione neurosfery z lodówki i umieść je w szalce o średnicy 60 mm. W przypadku sekwencjonowania seryjnego, gdzie kluczowe jest zebranie każdego pojedynczego przekroju, najskuteczniejszą metodą okazało się wybranie neurosfer o odpowiedniej wielkości i kształcie przy użyciu stereomikroskopu; następnie za pomocą pipetora należy umieścić neurosferę w formie do krioembeddingu wypełnionej związkiem OCT. Zaznacz na formie miejsce, w którym znajduje się neurosfera.

Ten krok ułatwi odnalezienie neurosfer podczas sekcjonowania. Po szybkim umieszczeniu od pięciu do 10 sfer w formie, należy je zamrozić za pomocą CO2. Wykorzystując oznaczenia na formie kriogenicznej, należy zaznaczyć położenie neurosfer bezpośrednio w zamrożonym bloku OTC.

Wyjmij blok OCT z formy i umieść go na uchwycie kriosztatu. Przymocuj formę do uchwytu za pomocą CO2 i umieść ją w kriosztacie. Pozostaw próbki do wyrównania temperatury przez co najmniej 30 minut.

Po wykonaniu tej czynności szybko przetnij tkankę do znaczników naniesionych na formę, a następnie zacznij zbierać każdy kolejny przekrój. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, gdzie zaczynają się przekroje neurosfer. Po zakończeniu sekcjonowania przechowuj preparaty w zamrażarce do momentu przeprowadzenia immunochemii. Na tym etapie wyjmij preparaty zawierające jeden z seryjnie ciętych neurosfer oraz preparaty z pięcioma poprzednimi i pięcioma następnymi przekrojami.

Zapewni to obrazowanie całej neurosfery. Zastosowanie barwienia jądrowego będzie niezbędne w celu odnalezienia wszystkich przekrojów neurosfery. Należy o tym pamiętać podczas planowania immunobarwienia. Slajdy należy potraktować PBS i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej przez co najmniej pięć minut; używamy buforu z przeciwciałami zawierającego 0,3% Triton X 100 w celu permeabilizacji oraz 3% albuminy surowicy bydlęcej do blokowania.

Odpowiednio rozcień przeciwciało pierwszorzędowe w tym buforze i inkubuj w komorze dla tkanek ludzkich przez noc w temperaturze 4°C. Użyj PBS, aby oddzielić parafom od neurosfer, a następnie ostrożnie usuń go za pomocą pęsety. Jest to pierwsze z czterech pięciominutowych płukań w PBS.

Nanieś przeciwciało wtórne na preparaty i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Podobnie jak wcześniej, oddziel paraformę od szkiełka za pomocą PBS i usuń ją pęsetą. Jest to pierwsze z czterech pięciominutowych przemyć w PBS.

Podczas trzeciego przemywania stosujemy HOS 3 3 2, 5 8 jako barwnik kontrastowy jądra komórkowego, rozcieńczony do stężenia 0,5 micrograms per milliliter. Po przemywaniu z użyciem HOS następuje jeszcze jedno pięciominutowe przemywanie w PBS. Po zakończeniu wszystkich etapów przemywania, na spód preparatu nanosi się odpowiednią ilość medium montażowego i przykrywa go szkiełkiem nakrywkowym.

Zabezpieczyć narożniki za pomocą lakieru do paznokci. Po nałożeniu szkiełek nakrywkowych na wszystkie preparaty, zabezpieczyć pozostałe krawędzie szkiełek. Wykonać obrazowanie preparatów niezwłocznie lub przechowywać je w temperaturze -20 °C do momentu rozpoczęcia tej procedury.

Podczas obrazowania najtrudniejszym etapem jest zlokalizowanie komórek na szkiełku; wykrycie komórek należących do sfery będzie łatwiejsze, jeśli będą poszukiwane przy użyciu barwienia przeciwjądrowego. Po znalezieniu początku sfery neuronowej, która może składać się z zaledwie kilku komórek, należy obrazować każdy kolejny przekrój. Należy wykonać zdjęcia barwienia jąder, interesującego białka lub białek oraz obraz w kontraście fazowym.

Ten obraz w kontraście fazowym będzie bardzo istotny na etapach modelowania. Obrazy z wbudowanymi paskami skali 10 micrometers oraz 50 micrometers, ustalonymi w oprogramowaniu open lab 3.56, są importowane do programu Photoshop CS 4 przy użyciu standardowego rozmiaru obszaru roboczego 3300 na 2550 pixels.

Wszystkie obrazy serii przekrojów są zapisywane jako pliki TIFF z zachowaniem standardowego rozmiaru obszaru roboczego. Otwórz obrazy kontrastowe pierwszej i drugiej fazy serii przekrojów neurosfer. Zwiększ przezroczystość drugiego przekroju w zakładce obrazu, otwórz funkcję obrotu obrazu i wybierz opcję dowolną.

Obracaj drugi przekrój, aż uda się zidentyfikować punkty ciągłości geometrycznej i strukturalnej między obrazami. Powtórz tę czynność dla wszystkich przekrojów seryjnych, zapisując każdy z nich jako osobną warstwę. Upewnij się, że warstwy obrazów odpowiadające obrazowi w fazie i ekspresji białka są powiązane, tak aby wszystkie obroty dla każdego kanału były wykonywane jednocześnie.

Utwórz w programie Maya płaszczyznę o tych samych proporcjach co plik Photoshop, korzystając z paska stanu w interfejsie użytkownika Mayi. Zmień ustawienie paska menu z domyślnej opcji animacji na powierzchnie. Używając prymitywnej sfery z podziałem (subdivision sphere), utwórz ciało komórki, mając wybraną sferę.

Rozpocznij manipulację wierzchołkami, klikając prawym przyciskiem myszy na obiekcie i wybierając opcję vertex z menu znakowania. Następnie dopracuj powierzchnię sfery, zmieniając poziom wyświetlania w menu znakowania w zakładce subdivision surfaces menu głównego. Otwórz okno opcji collapse hierarchy i ustaw liczbę poziomów na dwa.

Zredukuj sferę. Zmień pasek menu z powierzchni (surfaces) na wielokąty (polygons). Mając zaznaczoną sferę, otwórz narzędzie rzeźbienia geometrii (sculpt geometry) z karty siatki (mesh) w menu głównym.

Dopracuj powierzchnię komórki do jej ostatecznej formy. W tym celu wykorzystaj zestaw narzędzi sculpt geometry dostępny w karcie ustawień narzędzi. Powtórz ten proces dla każdej komórki w swojej typologii, aby zasymulować różnorodność komórek progenitorowych obecnych w neurosferach.

W tej demonstracji podstawą neurosfery będzie 10 różnych komórek progenitorowych. Wybierz typologię komórek i zamroź transformacje dla komórek swojej typologii. Zostaną zaprojektowane dwa shadery powierzchni, reprezentujące zarówno komórki wykazujące ekspresję białka connects in 29, jak i komórki, w których białko to nie występuje.

Otwórz okno HyperShade z karty edytora renderowania okien w menu głównym. Wybierz shader typu ramp z karty materiałów powierzchniowych. Otwórz edytor atrybutów i ustaw atrybuty koloru shadera, inkandescentności, koloru otoczenia, mapy wypukłości (bump map) oraz koloru zwierciadlanego.

Przypisz teksturę Browna 3D do węzła koloru otoczenia (ambient color) oraz teksturę fraktalną 2D do węzła mapowania wypukłości (bump mapping). Zaznacz wynikowe połączenia wejściowe i wyjściowe shadera, a następnie wyeksportuj zaznaczoną sieć. Wybierz typologię komórkową i otwórz okno opcji eksportu zaznaczenia.

Wybierz typ pliku Maya A-S-C-I-I i odznacz pole „include these inputs” (uwzględnij te dane wejściowe) w opcji eksportu zaznaczenia. Otwórz plik z wyrównanymi przekrojami seryjnymi w programie Adobe Photoshop. Stwórz legendę z pociągnięć ołówkiem, aby zaznaczyć położenie każdej komórki progenitorowej w przekrojach seryjnych.

W tej demonstracji zastosowano legendę składającą się z trzech symboli. Pełny kwadrat, kwadrat z przerywaną linią oraz kwadrat z krzyżykiem posłużą do wskazania, czy komórka znajduje się w jednej, dwóch czy trzech sekcjach.

Niniejsza legenda pociągnięć jest dodatkowo zdefiniowana przez kolor czerwony, reprezentujący komórki wykazujące ekspresję conexion 29, oraz kolor biały, reprezentujący komórki niewykazujące ekspresji Conexion 29. Włącz warstwę fazową i zacznij zaznaczać środek każdej komórki progenitorowej białym pociągnięciem ołówka. Do tworzenia map wykorzystaj oddzielną warstwę w folderze sekcji.

Przełączaj widok między sekcjami, aby zlokalizować położenie komórek, upewniając się, że komórki znajdujące się na więcej niż jednej sekcji są prawidłowo oznaczone. Przy włączonej warstwie CX 29 zaznacz komórki znajdujące się w obszarach, w których stwierdzono pozytywną ekspresję CX 29.

Wybierz polecenie wypełnienia (fill) z karty edycji (edit) głównego paska menu programu Photoshop i zmień białe linie na czerwone po ukończeniu map. Zapisz każdą sekcję jako osobny obraz JPEG w folderze obrazów źródłowych projektu Maya. Aby to zrobić, najpierw należy utworzyć nowy projekt Maya z linii stanu interfejsu użytkownika programu Maya.

Zmień ustawienia paska menu z domyślnej animacji na import wielokątów (polygons) dla płaszczyzn. Wybierz ma i pasek skali. Pliki ma z folderu projects seen z zaznaczoną płaszczyzną.

Przypisz cieniownik Lamberta, klikając prawym przyciskiem myszy na obiekcie i otwierając zakładkę przypisania nowego materiału w edytorze atrybutów. Z menu wysuwanego kliknij pole w kratkę znajdujące się po prawej stronie atrybutu koloru materiałów. W edytorze atrybutów, w sekcji atrybutu pliku, wybierz opcję plik z sekcji tekstury 2D.

Kliknij ikonę pliku po prawej stronie atrybutu nazwy obrazu. Wybierz pierwszą sekcję z folderu obrazów źródłowych. Przełącz kamerę okna obszaru roboczego z widoku perspektywicznego na domyślny ortograficzny widok z góry, otwierając zakładkę tego panelu.

Wybierz narzędzie tworzenia wielokąta (create polygon) z karty siatki (mesh) w menu głównym i obrysuj kontur przekroju. Wybierz pierwszą mapę z folderu obrazów źródłowych i przypisz ją do nowo utworzonej płaszczyzny wielokąta. Postępując zgodnie z procedurą tworzenia płaszczyzny wielokąta przy zaznaczonym obiekcie, wybierz opcję UV z menu znakowania, klikając prawym przyciskiem myszy na płaszczyźnie.

Zaznacz wszystkie punkty UV płaszczyzn i otwórz edytor tekstur UV z karty Window w menu głównym, a następnie proporcjonalnie przeskaluj mapy UV, aby dopasować je do płaszczyzny przekroju. Powtórz ten proces dla każdej sekcji sfery neuros, upewniając się, że odstępy między poszczególnymi sekcjami odpowiadają wysokości paska skali z paska stanu interfejsu użytkownika programu Maya. Zmień ustawienie paska menu z domyślnej opcji Animation na Dynamics, pozostawiając widoczną jedynie pierwszą sekcję sfery neuros.

Ukryj wszystkie pozostałe sekcje, zmieniając ustawienia wyświetlania w zakładce wyświetlania z otwartym oknem opcji narzędzi krzywej CV; w ustawieniach krzywej CV wybierz opcję „one linear”. Patrząc na scenę z kamery widoku z góry, rozpocznij przypisywanie punktów do map komórek, tworząc jedną krzywą dla komórek CX 29 negatywnych i jedną dla komórek CX 29 pozytywnych. Powstałe krzywe są płaskie w widoku z kamery bocznej.

Przybliż grubość przekrojów, przesuwając punkty krzywej wzdłuż osi Y, posługując się paskiem skali jako odniesieniem. Powtórz ten proces dla każdego przekroju neurosfery.

Zaimportuj plik cell typology.ma z folderu scenes projektu i powiel typologię komórek zarówno dla progenitorów CX 29 negatywnych, jak i CX 29 pozytywnych. Otwórz okno hyper shade z karty windows rendering editors w menu głównym.

Zaimportuj wcześniej utworzone shadery, przypisując je do komórek typologii z okna outlinera. Usuń nazwę pliku z początku zaimportowanych obiektów. Będzie to istotne na późniejszych etapach procesu modelowania.

Wybierz kartę particles z głównego menu i utwórz emitera cząsteczek dla pierwszej krzywej CV. Otwórz kartę particle shape one i w sekcji emission attributes zmień max count z wartości minus jeden na liczbę punktów na pierwszej krzywej. W karcie render attributes zmień particle render type na blobby surface.

Kliknij poniższe pole bieżącego typu renderowania i zmień promień cząsteczek na 0.01. Przypnij cząsteczki do wierzchołków krzywej, wybierając najpierw cząsteczki, a następnie wybierając krzywą z naciśniętym klawiszem Shift.

Otwórz opcje celu w zakładce cząsteczek (particles) głównego menu i ustaw wagę celu (goal weight) na jeden. Kliknij create. Wybierz kolejno komórki od numeru 1 do 10 w oknie konspektu (outliner), a następnie otwórz okno opcji natychmiastowego zastępowania (in instant replacement) w zakładce cząsteczek (particles) głównego menu.

W polu obiektów instancji powinny być wymienione kolejno wszystkie 10 komórek. Wybierz odpowiednią nazwę kształtu cząsteczki z listy rozwijanej w zakładce obiektu cząsteczki do instancji. Kliknij Create. Domyślnie tylko pierwsza wybrana komórka zastąpi cząsteczki wzdłuż krzywej; aby wszystkie 10 pojawiły się i zmieniały się losowo między cząsteczkami, wymagane jest zastosowanie wyrażenia.

Drugi wyraz zapewni, że komórki będą emitowane losowo w ten sam sposób przy każdym uruchomieniu. Suwak zakresu zostaje ponownie ustawiony po wybraniu emitera. Otwórz edytor atrybutów w zakładce z kształtem cząsteczki w sekcji dodawania dynamicznych atrybutów.

Kliknij pole ogólne pod długą nazwą. Wpisz losowy indeks z podkreśleniem w typie atrybutu, zmień go ze skalara na tablicę na cząsteczkę i kliknij dodaj w zakładce atrybutów tablicy na cząsteczkę. Pole losowego indeksu z podkreśleniem zostało dodane.

Kliknij prawym przyciskiem myszy w pustym obszarze i z menu rozwijanego wybierz opcję utwórz wyrażenie. W polu wyrażenia wpisz następujący tekst, aby je uzupełnić. W edytorze atrybutów otwórz zakładkę natychmiastowego wyszukiwania zastępowania geometrii, a następnie w opcjach ogólnych wybierz indeks obiektu.

Wybierz losowy indeks podkreślnika z listy rozwijanej. Przesuń suwak czasu do pierwszej klatki i naciśnij przycisk odtwarzania. Typy komórek są teraz rozłożone losowo pomiędzy cząsteczkami.

Powtórz ten proces dla każdej sekcji sfery neuronowej. Upewnij się, że każda nowa instancja emitera oraz indeks losowy są rozróżnialne pod względem nazwy i odpowiednio uporządkowane w oknie outliner w renderze. W sekcji okna ustawień renderowania zmień silnik renderujący z Maya software na mental ray.

Otwórz zakładkę jakości (quality) i w sekcji śledzenia promieni (ray tracing) zmień ustawienie odbić (reflection) na zero. Otwórz zakładkę bufora ramki (frame buffer), zmień przycinanie kolorów (color clip) z opcji raw na alpha i odznacz pole Pre multiply.

Otwórz edytor warstw w polu kanałów (channel box) i zmień ustawienia edytora warstw z trybu wyświetlania (display) na renderowanie (render). Zaznacz zaimportowane komórki typologii, a następnie kliknij ikonę tworzenia nowej warstwy i przypisywania zaznaczonych obiektów. Zmień nazwę warstwy na ambient occlusion.

Klikając prawym przyciskiem myszy na nowo utworzoną warstwę, wybierz atrybuty (attributes) z menu po prawej stronie pola warstwy renderowania. Kliknij przycisk ustawień wstępnych (presets) i wybierz occlusion z listy rozwijanej. Wybierz kartę MIB underscore AMB underscore occlusion one i zmień liczbę próbek (samples) z 16 na 256.

Ponownie otwórz edytor warstw pola kanałów (channel box layer editor) i w karcie opcji otwórz okno opcji renderowania wszystkich warstw, wybierz „composite” i pozostaw zaznaczoną warstwę „ambient occlusion”. W rozwijanym menu znajdującym się bezpośrednio nad listą warstw zmień tryb z „normal” na „multiply”. Wyrenderuj dwie przebiegi sfery neuros: raz z włączoną warstwą „ambient occlusion”, a raz z włączoną warstwą główną („master layer”). Zapisz obrazy jako pliki IFF w folderze obrazów projektu.

Otwórz oba obrazy w programie Adobe Photoshop. Umieść warstwę ambient occlusion nad warstwą główną i ustaw tryb mieszania na mnożenie. Utwórz tło i spłaszcz obraz.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób hodowli neurogennych komórek pochodzących z hipokampa w formie neurosfer, metodę seryjnego cięcia hodowli neurosfer z użyciem kriotomu oraz sposób przeprowadzania immunobarwienia w celu wykrycia białka zainteresowania. Pokazaliśmy również, jak modelować przestrzenną lokalizację ekspresji tego białka w trzech wymiarach, wykorzystując kombinację rejestracji hodowli komórkowych i oprogramowania do modelowania 3D.

Mamy nadzieję, że ta instrukcja okaże się pomocna. Powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.