Name: Lokalizacja białka w hodowli 3D nerwowych komórek macierzystych: hybrydowa metodologia wizualizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Poznaj metodę lokalizacji białek w trójwymiarowych neurosferach pochodzących z komórek macierzystych hipokampu. Technika ta pozwala na wizualizację przestrzennej organizacji białek w kontekście ich naturalnej struktury.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Evanowi Dysartowi i Marcowi Léonardowi za ekspercką pomoc techniczną w produkcji i montażu wideo, Mattowi Cooke'owi za pomoc w gromadzeniu danych oraz Sarah Gelbard za ekspercką pomoc redakcyjną. Praca była finansowana z grantów operacyjnych Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR, MOP 62626) przyznanych SALB, grantu z programu Strategicznej Inicjatywy Szkoleniowej w Badaniach nad Zdrowiem przyznanego SALB i SF (CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics, TGF 9121) oraz wsparcia infrastrukturalnego z Canadian Foundation Innovation i Ontario Innovation Trust przyznanego SF. SI otrzymała stypendium Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology ze wsparciem Parkinson Research Consortium. NV otrzymuje stypendium post-profesjonalne z Institute of Aging oraz CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics. Z wdzięcznością uznajemy oprogramowanie edukacyjne i wsparcie techniczne dostarczone przez AutoDesk Research.

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres%3A+insights+into+neural+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li>
<li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li>
</ol>

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie oraz Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami.

Niniejszy protokół opisuje procedurę hodowli i seryjnego mrożenia oraz cięcia kriostatowego postnatalnych NPC hipokampa, lokalizacji ekspresji białek za pomocą detekcji immunologicznej, a następnie rekonstrukcji i analizy topograficznego położenia komórek immunopozytywnych w obrębie całej 3D neurosfery. Łącząc techniki hodowli i przetwarzania z zakresu biologii komórki, obrazowanie mikroskopowe (oprogramowanie OpenLab, Improvision i inne oprogramowanie do analizy obrazu), możliwości programów do edycji grafiki (Adobe Photoshop) oraz możliwości oprogramowania do animacji i kompozycji 3D (Autodesk Maya), przedstawiamy metodologię rekonstrukcji pełnego składu komórkowego hodowli 3D z seryjnych obrazów 2D, co pozwala na wierną rekonstrukcję pozycji komórek i ekspresji białek w całej hodowli neurosfery. Protokół ten może być z równą skutecznością łączony z rejestracją i rekonstrukcją cienkich seryjnych przekrojów epifluorescencyjnych lub stosów Z z mikroskopii konfokalnej przez grubsze przekroje seryjne. Ponieważ klonalna ekspansja pojedynczych NPC w hodowli neurosfer odtwarza wiele etapów obserwowanych w przebiegu neurogenezy i gliogenezy w mózgu postnatalnym, wpływ struktury 3D stanowi istotny czynnik determinujący los NPC w potomstwie wystawionym na to samo środowisko eksperymentalne1. Różnice w linii komórkowej i ekspresji białek w rdzeniu i na peryferiach seryjnych przekrojów neurosfer sugerują, że wiele czynników fizycznych, w tym pozycja komórki, stres mechaniczny i siły ścinania, odgrywa istotną rolę w regulacji biologii NPC2. Co więcej, wykazano, że ekspresja białek konneksyn, analizowana w niniejszej pracy, zmienia się w zależności od tego, czy NPC są hodowane jako 3D neurosfery w zawiesinie, czy wysiewane na podłożu z lamininy, przy czym funkcjonalna komunikacja zapśredniczona przez konneksyny ulega zmianie w zależności od tego, czy komórki są hodowane na plastiku i podłożu, czy w 3D wolno pływających hodowlach3. Wpływ pozycji komórkowej na los NPC pozostaje niejasny. Analiza wpływu lokalizacji przestrzennej w hodowli 3D na biologię NPC jest trudna pod względem technicznym, ponieważ ocena antygenowa białek linii komórkowej i sygnałowych wymaga naruszenia architektury 3D w celu umożliwienia permeabilizacji komórek i dostępu przeciwciał do wszystkich komórek. Tutaj wykazujemy, że hybrydowa metodologia wizualizacji umożliwia ustalenie, czy określone białka wykazują unikalne lokalizacje pozycyjne w hodowli 3D, może być wykorzystana do wnioskowania i testowania funkcji oraz regulacji białek w odniesieniu do lokalizacji regionalnej w obrębie neurosfery i, co być może najważniejsze, dostarcza danych pozycyjnych niezbędnych do badania wpływu topografii 3D i rozmieszczenia komórek na los NPC w hodowli 3D.

<table><tbody><tr><td>Euthansol</td><td>Odczynnik</td><td>Merck &amp;amp; Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td>Odczynnik</td><td>Home Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wibratom VT1000S</td><td>Sprzęt</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteaza neuronalna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6141</td><td>Roztwory zapasowe przechowywane w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762</td><td>Roztwory zapasowe przechowywane w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DNAza I</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11 284 932 001</td><td>Roztwory zapasowe przechowywane w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny MZ6</td><td>Sprzęt</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji ProBlot 6</td><td>Sprzęt</td><td>Labnet International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5702</td><td>Sprzęt</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kPBS</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>PBS404</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowej o bardzo niskim wiązaniu (Ultra Low Binding)</td><td>Materiał jednorazowy</td><td>Corning</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki czynnik wzrostu naskórka (EGFr)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td>Roztwory zapasowe przechowywane w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów-2</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>Znany również jako podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)&lt;br/&gt;Roztwory zapasowe przechowywane w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>37% formaldehyd (stopień czystości molekularnej)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka Belly Dancer</td><td>Sprzęt</td><td>Stovall Life Sciences, IBI Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma kriogeniczna Tissue-Tek</td><td>Materiał jednorazowy</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Związek Tissue-Tek OCT</td><td>Odczynnik</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papier do blottingu Whatman stopień 703</td><td>Materiał jednorazowy</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat CM1900</td><td>Sprzęt</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało pierwotne anty-Cx29</td><td>Odczynnik</td><td>Udostępnione przez dr Davida Paula, Harvard Medical School</td><td></td><td>Przechowywane 1:1 w glicerolu w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Koniugowane z Cy3 przeciwciało osiołkowe anty-królicze IgG</td><td>Odczynnik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>Przechowywane 1:1 w glicerolu w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33258</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny DMRA2, kamera Orca ER, OpenLab v3.56</td><td>Sprzęt/Oprogramowanie</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Protokół ten można przeprowadzić przy użyciu dowolnego mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego.</td></tr><tr><td>Photoshop CS4</td><td>Oprogramowanie</td><td>Adobe</td><td></td><td>Oprogramowanie graficzne</td></tr><tr><td>Maya v10</td><td>Oprogramowanie</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Oprogramowanie do modelowania</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Sprzęt</td><td>Intel</td><td></td><td>Procesor: Intel Corei7 920, Pamięć: 12GB DDR3&lt;br/&gt;Karta graficzna: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)</td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p class=&quot;jove_content">* Wszystkie pozostałe standardowe odczynniki chemiczne wymienione w protokole pochodzą z firmy Sigma-Aldrich. Wszystkie pozostałe standardowe odczynniki do hodowli tkankowej pochodzą z firmy Invitrogen.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

lokalizacja białek w trójwymiarowej kulturze komórek macierzystych neuronów: hybrydowa metodologia wizualizacji

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Znaczenie topografii trójwymiarowej (3D) w wywieraniu wpływu na fenotyp neuronalnych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) jest powszechnie uznane, choć trudne do zbadania. Po odseparowaniu od embrionalnego lub postnatalnego mózgu, pojedyncze NPC proliferują w zawiesinie, tworząc neurosfery. Komórki potomne w tych kulturach spontanicznie przyjmują odrębne linie rozwojowe (neurony, oligodendrocyty i astrocyty) w trakcie ekspansji, mimo wystawienia na to samo środowisko zewnątrzkomórkowe. Proces ten odtwarza wiele etapów obserwowanych podczas neurogenezy i gliogenezy w mózgu postnatalnym i jest często wykorzystywany do badania podstawowej biologii NPC w kontrolowanym środowisku. Ocena pełnego wpływu topografii 3D oraz rozmieszczenia komórkowego w tych kulturach na los NPC jest jednak trudna. Aby zlokalizować białka docelowe i zidentyfikować linie NPC za pomocą immunocytochemii, swobodnie pływające neurosfery muszą zostać wysiane na podłożu lub poddane seryjnemu cięciu. Obróbka ta jest niezbędna, aby zapewnić równomierną permeabilizację komórek i dostęp przeciwciał w całej sferze. W rezultacie obrazy epifluorescencyjne 2D kriosnittów lub rekonstrukcje konfokalne stosów Z w 3D mogą dostarczyć informacji przestrzennych o pozycji komórek jedynie w obrębie dyskretnych fizycznych lub cyfrowych przekrojów 3D i nie pozwalają na wizualizację pozycji komórkowej w nienaruszonej sferze. W niniejszej pracy, aby odtworzyć topografię kultury neurosfer i umożliwić analizę przestrzenną ekspresji białek w całej kulturze, przedstawiamy protokół izolacji, ekspansji i seryjnego cięcia postnatalnych neurosfer hipokampalnych, odpowiedni do epifluorescencyjnej lub konfokalnej immunodetekcji białek docelowych. Jako przykład przeanalizowano koneksynę 29 (Cx29). Następnie, wykorzystując hybrydę oprogramowania do edycji graficznej i modelowania 3D, rygorystycznie zastosowaną w celu zachowania szczegółów biologicznych, opisujemy sposób ponownego złożenia trójwymiarowego rozmieszczenia strukturalnego tych obrazów i cyfrowego mapowania znakowanych komórek w obrębie kompletnej neurosfery. Metodologia ta umożliwia wizualizację i analizę pozycji komórkowej białek docelowych oraz komórek w całej topografii kultury 3D i ułatwi bardziej szczegółową analizę relacji przestrzennych między komórkami w przebiegu neurogenezy i gliogenezy in vitro.
Zarówno Imbeault, jak i Valenzuela przyczynili się do pracy w równym stopniu i powinni być uznani za współautorów pierwszych.

W niniejszej pracy opisujemy sposób wytwarzania, namnażania i immunoznakowania postnatalnych neuralnych komórek progenitorowych (NPCs) hipokampa w kulturze trójwymiarowej (3D). Następnie, wykorzystując hybrydowe technologie wizualizacji, demonstrujemy, w jaki sposób cyfrowe obrazy immunoznakowanych kriosrezy mogą służyć do rekonstrukcji i mapowania położenia przestrzennego komórek immunopozytywnych w całej trójwymiarowej neurosferze.

Lokalizacja białek w trójwymiarowej kulturze komórek macierzystych neuronów: hybrydowa metodologia wizualizacji

Znaczenie topografii trójwymiarowej (3D) w kształtowaniu fenotypu neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) jest powszechnie uznawane, jednak stanowi wyzwanie w zakresie...

localizing-protein-3d-neural-stem-cell-culture-hybrid-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Lokalizowanie białka w kulturze komórek macierzystych nerwowych 3D: hybrydowa metoda wizualizacji

W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie samoorganizującego się rusztowania trójwymiarowego do hodowli ludzkich komórek progenitorowych neuronów. Przedstawiamy protokół uwalniania komórek z rusztowań w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek w celu przeprowadzenia szczegółowych badań mechanistycznych.

Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Ten film pokazuje rozwój i różnicowanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych w trójwymiarowym rusztowaniu. Powłoka lamininowa na rusztowaniu sprzyja przyczepianiu się komórek, podczas gdy pożywka nerwowa wolna od czynnika wzrostu indukuje różnicowanie komórek w neuronalne komórki progenitorowe, które rozszerzają swoje procesy w porowatej architekturze w wielu kierunkach, tworząc trójwymiarową...

Różnicowanie ludzkich neuronalnych komórek macierzystych w kulturę 3D za pomocą porowatego rusztowania

Źródło: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronów. J. vis. exp. (2017){{}} . Film przedstawia proces przygotowania, obrazowania i śledzenia dorosłych nerwowych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym w celu zbadania zachowań komórek, w tym podziału i różnicowania.

 Obrazowanie na żywo i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania linii neuronalnej w dorosłych nerwowych komórkach macierzystych

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie do badania zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym. W tym miejscu opisujemy protokół wideomikroskopii poklatkowej pierwotnych komórek kory mózgowej, który umożliwia szczegółowe badanie faz odgrywanych podczas progresji linii od pierwotnych nerwowych komórek macierzystych do zróżnicowanych neuronów i gleju.

Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2D

Opisany potok jest przeznaczony do segmentacji zestawów danych mikroskopii elektronowej większych niż gigabajty, w celu wyodrębnienia morfologii całych komórek. Po zrekonstruowaniu komórek w 3D, dostosowane do indywidualnych potrzeb oprogramowanie może być wykorzystane do przeprowadzenia analizy jakościowej i ilościowej bezpośrednio w 3D, wykorzystując również rzeczywistość wirtualną do pokonania okluzji widoku.

Metoda rekonstrukcji 3D i analizy w wirtualnej rzeczywistości komórek glejowych i neuronalnych

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Poznaj metodę lokalizacji białek w trójwymiarowych neurosferach pochodzących z komórek macierzystych hipokampu. Technika ta pozwala na wizualizację przestrzennej organizacji białek w kontekście ich naturalnej struktury.

Lokalizacja białek w trójwymiarowej kulturze komórek macierzystych neuronów: hybrydowa metodologia wizualizacji

Przeglądaj więcej filmów