Name: Organotypowy test warstwowy do obrazowania poklatkowego migracji neuronów w mózgu po urodzeniu w wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metodę preparatu organotypowego do obrazowania migracji neuroblastów w strumieniu migrującym rostralnym mózgu po urodzeniu myszy. Technika ta umożliwia wizualizację komórek nerwowych w wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Danowi McWhorterowi za narrację protokołu w filmie. Praca ta jest finansowana z grantu NIH 5R01NS062182, grantu z American Federation for Aging Research oraz środków instytucjonalnych przyznanych HTG.

<ol><li>Ghashghaei, H. T., Lai, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+adult+brain%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the adult brain: are we there yet.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 141-151 (2007).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neocortex%3A+a+perspective+from+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 724-735 (2009).</li>
<li>Jaglin, X. H., Chelly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-related+cortical+dysgeneses%3A+microtubule+dysfunction+underlying+neuronal+migration+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Tubulin-related cortical dysgeneses: microtubule dysfunction underlying neuronal migration defects.</a> Trends Genet. 25, 555-566 (2009).</li>
<li>Carro, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+network+for+mesenchymal+transformation+of+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The transcriptional network for mesenchymal transformation of brain tumours.</a> Nature. 463, 318-325 (2010).</li>
<li>Wu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+guidance+of+neuronal+migration+in+the+olfactory+system+by+the+protein+Slit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional guidance of neuronal migration in the olfactory system by the protein Slit.</a> Nature. 400, 331-336 (1999).</li>
<li>Hu, H., Tomasiewicz, H., Magnuson, T., Rutishauser, U., U, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polysialic+acid+in+migration+of+olfactory+bulb+interneuron+precursors+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of polysialic acid in migration of olfactory bulb interneuron precursors in the subventricular zone.</a> Neuron. 16, 735-743 (1996).</li>
<li>Shapiro, E. M., Gonzalez-Perez, O., Garcia-Verdugo, M. anuel, Alvarez-Buylla, J., &amp, A., Koretsky, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+the+migration+of+neuronal+precursors+generated+in+the+adult+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of the migration of neuronal precursors generated in the adult rodent brain.</a> Neuroimage. , (2006).</li>
<li>Vreys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+visualization+of+endogenous+neural+progenitor+cell+migration+along+the+RMS+in+the+adult+mouse+brain%3A+validation+of+various+MPIO+labeling+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">MRI visualization of endogenous neural progenitor cell migration along the RMS in the adult mouse brain: validation of various MPIO labeling strategies.</a> Neuroimage. 49, 2094-2103 (2010).</li>
<li>Davenne, M., Custody, C., Charneau, P., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+migrating+neurons+in+the+mammalian+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of migrating neurons in the mammalian forebrain.</a> Chem. Senses. 30, Suppl 1. 115-116 (2005).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cells+Confer+Unique+Pinwheel+Architecture+to+the+Ventricular+Surface+in+Neurogenic+Regions+of+the+Adult+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cells Confer Unique Pinwheel Architecture to the Ventricular Surface in Neurogenic Regions of the Adult Brain.</a> Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).</li>
<li>Polleux, F. &amp, Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. , L9-L9 (2002).</li>
<li>Murase, S. &amp, Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Suzuki, S. O. &amp, Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cell+populations+in+the+early+postnatal+subventricular+zone+take+distinct+migratory+pathways%3A+a+dynamic+study+of+glial+and+neuronal+progenitor+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration.</a> J. Neurosci. 23, 4240-4250 (2003).</li>
<li>Ghashghaei, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuregulin-ErbB4+interactions+on+the+proliferation+and+organization+of+cells+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The role of neuregulin-ErbB4 interactions on the proliferation and organization of cells in the subventricular zone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 1930-1935 (2006).</li>
<li>Khodosevich, K., Seeburg, P. H., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+signaling+pathways+in+migrating+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Major signaling pathways in migrating neuroblasts.</a> Front Mol. Neurosci. 2, 7-7 (2009).</li>
<li>Jacquet, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuronal+proliferation%2C+migration+and+differentiation+in+the+postnatal+brain+using+equine+infectious+anemia+virus-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuronal proliferation, migration and differentiation in the postnatal brain using equine infectious anemia virus-based lentiviral vectors.</a> Gene Ther. 16, 1021-1033 (2009).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez North Carolina State University oraz powiązany z nią College of Veterinary Medicine.
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Migracja neuronów w RMS jest istotnym elementem postnatalnej neurogenezy w opolpowych cebulkach węchowych 1. Migracja przez RMS odbywa się w płaszczyźnie stycznej do powierzchni mózgu. Neuroblasty migrujące stycznie różnią się od komórek migrujących radialnie lokalizacją źródłowych komórek progenitorowych, a także odmiennym losem końcowych produktów neuronalnych 1, 2, 3. Stosunkowo czysta populacja komórek migrujących stycznie w postnatalnym RMS sprawia, że ten anatomicznie zdefiniowany obszar stano...

organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogeneza w mózgu postnatalnym zależy od utrzymania trzech zdarzeń biologicznych: proliferacji komórek progenitorowych, migracji neuroblastów oraz różnicowania i integracji nowych neuronów z istniejącymi obwodami neuronalnymi. W przypadku neurogenezy postnatalnej w opłatyczkach węchowych zdarzenia te są rozdzielone pomiędzy trzy anatomicznie odrębne domeny: proliferacja zachodzi głównie w strefie podependymalnej (SEZ) komór bocznych, migrujące neuroblasty przemieszczają się przez rostralny strumień migracyjny (RMS), a nowe neurony różnicują się i integrują w obrębie opłatyczków węchowych (OB). Te trzy domeny stanowią idealne platformy do badania mechanizmów komórkowych, molekularnych i fizjologicznych, które w odrębny sposób regulują każde z tych zdarzeń biologicznych. Niniejsza praca opisuje zoptymalizowany dla postnatalnej tkanki mózgowej test na organotypowych skrawkach, w którym warunki zewnątrzkomórkowe ściśle naśladują środowisko in vivo dla migrujących neuroblastów. Wykazujemy, że nasz test zapewnia jednolity, zorientowany i szybki ruch neuroblastów w obrębie RMS. Test ten będzie bardzo przydatny do badania autonomicznej i nieautonomicznej regulacji migracji neuronalnej z wykorzystaniem metod transplantacji krzyżowej u myszy o różnych podłożach genetycznych.

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Neurogeneza w mózgu postnatalnym zależy od utrzymania trzech procesów biologicznych: proliferacji komórek progenitorowych, migracji neuroblastów oraz...

Nazywam się Troy Gasai. Omówimy analizę organotypowych przekrojów tkankowych, która została dopracowana w moim laboratorium w ciągu ostatnich kilku lat. Ben Jacket z mojego laboratorium zademonstruje Państwu, jak przeprowadza się tę analizę.Analiza organotypowych skrawków postnatalnego mózgu to potężna metoda badania różnych czynników oraz ich roli w migracji neuronów w mózgu postnatalnym i w obrębie prądu migracyjnego TRO. Cześć, nazywam się Ben Jakay. Jestem pracownikiem postdoc w laboratorium dr. Troya Gge na College of Veterinary Medicine Uniwersytetu Stanowego Karoliny Północnej i jestem tutaj dzisiaj, aby pokazać Państwu, jak przeprowadzamy transplantację krzyżową tkanek pomiędzy organotypowymi skrawkami mózgu myszy w celu wizualizacji migrujących neuroblastów w mózgu postnatalnym.Wszystkie techniki opisane w tym filmie powinny być wykonywane w środowisku sterylnym, najlepiej w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy użyciu sterylizowanych narzędzi. Kropla 150 µL medium do skrawków jest umieszczana w centrum szklanego dna naczynia za pomocą jednorazowej strzykawki wyposażonej w igłę 23G. Kilka kropel kleju nanosi się poza okrągłym szklanym zakryciem dna, pozostawiając jeden bok niezaklejony w celu wymiany płynów A. Następnie błonę porów jądrowych delikatnie układa się na medium za pomocą mikro pęsety, dbając o to, aby pod błoną nie uwięziono pęcherzyków powietrza.Następnie za pomocą zakrzywionej pęsety spłaszcza się kropki kleju i stabilizuje błonę w docelowym położeniu. Na wierzch błony dodaje się 1 mL medium do skrawków, a następnie naczynia umieszcza się w inkubatorze do momentu rozpoczęcia procedury. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy skrawki przygotowuje się z młodych myszy ponatalnych, od P1 do P10; najpierw stabilizuje się głowę, trzymając pyszczek za pomocą mikropęsety.Skórę wycina się wzdłuż, od szyi do pyska. SkALP zostaje oddzielony, aby odsłonić kość, a czaszkę przecina się wzdłuż i w kierunku przednim, zaczynając od sternum magna, wykonując jedno cięcie przyśrodkowe i dwa boczne, po jednym z każdej strony. Należy zachować ostrożność, aby zminimalizować kontakt z leżącą poniżej tkanką korową.Następnie płaty czaszkowe są oddalane od mózgu, aby zwiększyć stabilność tkanki. Podczas sekcjonowania w wibrotomie najbardziej boczna i kodalna część mózgu są usuwane za pomocą żyletki. Obie półkule są ostrożnie wyjmowane z czaszki i umieszczane powierzchnią przyśrodkową do dołu w formie do zatapiania.Zostają one natychmiast pokryte stopionym żelem agarozy klasy DNA o stężeniu 3%, rozpuszczonym w buforze do przygotowania tkanek i utrzymywanym w temperaturze 37°C. Po dwóch minutach stabilizacji na płaskiej, poziomej powierzchni, aby zapewnić równomierne stwardnienie agarozy, formy umieszcza się na lodzie do czasu całkowitego zastygnięcia.Po zastygnięciu żelu zawierającego półkule, zostaje on wyjęty z formy i przycięty wokół tkanki mózgowej. Tkanka zatopiona w żelu jest następnie montowana na dysku do preparatów w wibratomie powierzchnią przyśrodkową do góry i mocowana za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Dysk jest następnie instalowany w tacy do preparatów wibratomu wypełnionej lodowatym medium do przygotowania tkanek, a mózg jest cięty na sekcje o grubości 150 µm.Po zwolnieniu z ostrza plastrów zawierających RMS, są one ostrożnie wyjmowane za pomocą małej szpatułki płaskiej i kładzione płasko w centrum naczyń hodowlanych. Kluczowe jest, aby manipulacje z plastrami były ograniczone do minimum, ponieważ tkanka jest bardzo delikatna. Ilość pożywki w naczyniach hodowlanych jest dostosowana do poziomu wystarczającego do przykrycia sekcji mózgu, przy jednoczesnym zapobieganiu ich przemieszczaniu się.Naczynia zostają oznakowane i przeniesione do inkubatora. Mózgi dawców przygotowuje się w sposób podobny do mózgów biorców, z wyjątkiem tego, że przekroje są wycinane o grubości 250 µm, a plastry są zbierane w lodzie.Przygotowanie tkanki w warunkach chłodniczych. Przezcięcia w buforze są niezwłocznie umieszczane pod stereomikroskopem z funkcją epifluorescencji. RMS jest widoczny jako szara struktura w kształcie litery U, rozciągająca się od strefy podependymańskiej do opuszki węchowej.RMS jest delikatnie mikroprecyzyjnie wycinany za pomocą mikropincet. Jedna pęseta służy do stabilizacji skrawka, podczas gdy druga jest używana do wykonywania niewielkich nacięć wokół RMS, aż do momentu jego uwolnienia ze skrawka. Wycięty RMS jest następnie dzielony na małe eksplanty o średnicy około 200 do 500 micrometers.W tym przykładzie przygotowano szczepy z myszy wykazujących ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego TD tomato glass. Płytki dolne zawierające skrawki gospodarza zostają wyjęte z inkubatora i umieszczone pod mikroskopem stereoskopowym z wykorzystaniem światła widzialnego. W początkowym segmencie RMS wykonuje się niewielkie nacięcie, a następnie za pomocą pipetora z końcówką 20 µl pojedynczy eksplant donorowy RMS przenosi się w miejsce nacięcia w RMS gospodarza.Eksplant jest delikatnie wpychany w nacięcie, aby nawiązać kontakt między obiema tkankami. W celu zapewnienia stabilności tego kontaktu, eksplanty są lekko dociskane pomiędzy skrawkiem a membraną z porami jądrowymi. Następnie naczynia są przenoszone z powrotem do inkubatora na co najmniej jedną godzinę, aby umożliwić osadzenie się sekcji na membranie.Neuroblasty powinny zacząć migrować z eksplantu do RMS gospodarza po około jednej lub dwóch godzinach. Migrację komórek najlepiej obrazować za pomocą obiektywów 20x o bardzo dużej odległości roboczej. Hodowlane tkanki przenosi się z inkubatora do komory inkubacyjnej mikroskopu.Fluorescencyjne neuroblasty można obrazować w odstępach od 0 do 10 minut, w zależności od pożądanego rodzaju analizy. Nasz protokół hodowli organicznych przekrojów typowych został szczegółowo przetestowany i zoptymalizowany w ciągu ostatnich kilku lat pod kątem spójności wzorca migracji i orientacji w RMS. W niniejszym przykładzie analiza komórek imigrcyjnych z eksplantu, otrzymanego od myszy, w których TD tomato jest eksprymowane pod promotorem nestin, ujawnia silnie zorientowaną i szybką migrację do RMS gospodarza.Duże powiększenie. Analiza poklatkowa wykazuje doskonałą rozdzielczość na całej długości migrującego neuroblasta podczas 20 minutowej sesji obrazowania. Po zakończeniu obrazowania przekroje można utrwalić w lodowatej, świeżo przygotowanej 4% paraformaldehydzie, a następnie przeprowadzić immunobarwienie różnych komponentów strumienia migracji.W tym przypadku, za pomocą fluorescencyjnej immunohistochemii uwidoczniono astrocyty wykazujące obecność GFAP w kolorze niebieskim oraz naczynia krwionośne wykazujące obecność CD 31 w kolorze zielonym; analiza przy dużym powiększeniu przekrojów barwionych pod kątem białek cytoszkieletowych – aktyny w kolorze niebieskim i tubuliny w kolorze zielonym – ujawnia niejednorodną ekspresję tych składników w komórce w trakcie migracji. Nasz protokół wiąże się z pewnymi wyzwaniami, które wymagają cierpliwości, wprawy oraz poświęcenia czasu zarówno na przygotowanie, jak i analizę wyników.Poniżej przedstawiamy kilka przydatnych sugestii, które pomogą uzyskać najlepsze wyniki w eksperymentach. Według naszego doświadczenia, myszy w przedziale wiekowym od P1 do P10 zapewniają najlepsze rezultaty. Dopasowanie wieku mózgów dawcy i biorcy poprawia również powtarzalność eksperymentów.Ponieważ większość odczynników i naczyń hodowlanych musi być przygotowana na świeżo, nasz test na skrawkach wymaga kilku godzin nieprzerwanych przygotowań i obrazowania w ciągu jednego dnia. Po pobraniu mózgów kolejne etapy muszą zostać przeprowadzone tak szybko, jak to możliwe. Od momentu odcięcia głowy do przygotowania skrawków wszystkie czynności powinny być wykonywane z użyciem lodu i zimnych odczynników, a manipulacje tkanką należy ograniczyć do minimum, aby uniknąć zaburzeń anatomicznych.Narzędzia wykorzystywane do tych sekcji powinny być sterylne i przeznaczone wyłącznie do manipulacji na żywej tkance. Nigdy nie należy używać narzędzi, które miały kontakt z utrwalaczami, takimi jak formaldehyd. Przekroje są zazwyczaj żywe do 36 godzin, przy czym widoczny spadek migracji, prędkości i orientacji następuje między 24 a 36 godziną.Należy wziąć pod uwagę to ograniczenie podczas planowania eksperymentów i analiz.

an-organotypic-slice-assay-for-high-resolution-time-lapse-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Test warstwowca narządowego do wysokorozdzielczego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji neuronów w mózgu pourazdowym

Przedstawiamy metodę przygotowania organotypowych skrawków embrionów myszy w połowie okresu gestacji do hodowli i obrazowania time-lapse wzrostu nerwów obwodowych.

Organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Źródło: Wiegreffe, C., et. al.,  Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017) Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę preparatu organotypowego do obrazowania migracji neuroblastów w strumieniu migrującym rostralnym mózgu po urodzeniu myszy. Technika ta umożliwia wizualizację komórek nerwowych w wysokiej rozdzielczości.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Przeglądaj więcej filmów