Organotypowy test warstwowy do obrazowania poklatkowego migracji neuronów w mózgu po urodzeniu w wysokiej rozdzielczości

Nazywam się Troy Gasai. Porozmawiamy o organtypowym teście warstwowym, który został udoskonalony w moim laboratorium w ciągu ostatnich kilku lat. Kurtka Bena w moim laboratorium pokaże ci, jak przeprowadza się ten test.

Test organotypowy wycinka mózgu po urodzeniu jest potężną metodą testowania różnych czynników i roli w migracji neuronów w mózgu postnatalnym i strumieniu migracyjnym TRO. Cześć, nazywam się Ben Jakay. Jestem adiunktem w laboratorium Dr. Troy gge w College of Veterinary Medicine na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej i jestem tu dzisiaj, aby pokazać wam, jak przeprowadzamy przeszczep tkanek między organotypowymi wycinkami mózgu myszy w celu wizualizacji migrujących neuroblastów w mózgu po urodzeniu.

Wszystkie techniki opisane w tym filmie powinny być wykonywane w sterylnym środowisku, najlepiej w okapie z przepływem laminarnym przy użyciu wysterylizowanych narzędzi. Kroplę pożywki w plasterkach o pojemności 150 mikrolitrów umieszcza się na środku szklanki, w dolnej części naczynia za pomocą jednorazowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 23. Kilka miejsc kleju umieszcza się na zewnątrz okrągłej szklanej dolnej warstwy pokrywy, pozostawiając jedną stronę nieprzyklejoną w celu wymiany płynu Membrana porów jądrowych AA jest następnie delikatnie umieszczana na wierzchu podłoża za pomocą mikrokleszczyków, upewniając się, że pęcherzyki powietrza nie są uwięzione pod membraną.

Zakrzywione kleszcze są następnie używane do spłaszczania miejsc kleju i zabezpieczania membrany na miejscu. Jeden mililitr pożywki w plastrach dodaje się na wierzch membrany, a na koniec naczynia umieszcza się w inkubatorze, aż będą gotowe do użycia. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy plastry przygotowuje się z młodych myszy po urodzeniu, najpierw od P jeden do P dziesięć, głowę stabilizuje się poprzez przytrzymanie pyska mikrokleszkami.

Skóra jest wycinana wzdłużnie od szyi do pyska. Skóra głowy jest złuszczana, aby odsłonić kość, a czaszka jest cięta wzdłużnie i do przodu, zaczynając od mostka wielkiego, wykonując jedno przyśrodkowe i dwa boczne cięcia, po jednym z każdej strony. Należy zachować ostrożność, aby zminimalizować kontakt z leżącą poniżej tkanką korową.

Ponieważ płaty czaszki są usuwane z dala od mózgu, aby poprawić stabilność tkanki. Podczas cięcia vibram boczne i kodalne aspekty mózgu są usuwane za pomocą żyletki. Dwie półkule są ostrożnie wyjmowane z czaszki i umieszczane przyśrodkową powierzchnią w dół w formie do zatapiania.

Natychmiast pokrywa się je stopionym żelem AGA AGA klasy 3% DNA, rozpuszczonym w buforze do przygotowania tkanek, który jest utrzymywany w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch minutach stabilizacji na płaskiej poziomej powierzchni. Aby zapewnić równomierne utwardzenie róż aga, formy są umieszczane na lodzie, aby zakończyć wiązanie.

Po związaniu żelu zawierającego półkule wyjmuje się go z formy i przycina wokół tkanki mózgowej. Tkanka zatopiona w żelu jest następnie montowana na krążku próbki o tonie wibracyjnym powierzchnią przyśrodkową do góry i zabezpieczana klejem cyjanoakrylowym. Dysk jest następnie instalowany w tacce na próbki wibracyjne wypełnionej lodowatym podłożem do przygotowania tkanek, a mózg jest dzielony na sekcje o grubości 150 mikrometrów.

Po uwolnieniu plastrów zawierających RMS z ostrza, są one ostrożnie wyjmowane za pomocą małej szpatułki z płaską główką i umieszczane płasko na środku naczyń hodowlanych. Bardzo ważne jest, aby obchodzenie się z plastrami było ograniczone do minimum, ponieważ tkanka jest bardzo delikatna. Ilość pożywki w szalkach hodowlanych jest dostosowana do poziomu wystarczającego do pokrycia części mózgu, jednocześnie zapobiegając ich przemieszczaniu się.

Naczynia są etykietowane i przenoszone do inkubatora. Mózgi dawców są przygotowywane w sposób podobny do mózgów biorców, z tą różnicą, że skrawki są cięte na poziomie 250 stopni. Grubość mikrometru i plastry są zbierane w lodzie.

Przygotowanie zimnych tkanek. Plastry buforowe są natychmiast umieszczane pod mikroskopem preparacyjnym z funkcją fluorescencji epi. RMS jest widoczny jako szara struktura w kształcie litery U, rozciągająca się od strefy podwyściółkowej do opuszki węchowej.

RMS jest delikatnie mikrodyekcjonowany za pomocą mikrokleszczyków. Jeden kleszcz służy do stabilizacji plasterka, podczas gdy drugi służy do wykonywania małych nacięć wokół RMS, aż zostanie zwolniony z plasterka. Wycięty RMS jest następnie cięty na małe x explan o średnicy około 200 do 500 mikrometrów.

W tym przykładzie bakłażany są przygotowywane z myszy wykazujących ekspresję białka czerwonej fluorescencji, szkła pomidorowego TD. Dolne szalki zawierające plastry gospodarza wyjmuje się z inkubatora i umieszcza pod mikroskopem preparacyjnym przy użyciu światła widzialnego. W początkowym segmencie RMS wykonuje się małe nacięcie i za pomocą pipery wyposażonej w końcówkę o pojemności 20 mikrolitrów, Pojedynczy dawca RMS Explan jest przenoszony do naciętego miejsca w RMS gospodarza.

Explan jest delikatnie wciskany w nacięcie, aby nawiązać kontakt między dwiema tkankami. Aby zapewnić stabilny kontakt, eksplan jest lekko wciskany między plaster a membranę ubogą jądrowo. Szalki są następnie umieszczane z powrotem w inkubatorze na co najmniej godzinę, aby skrawki mogły osiąść na membranie.

Neuroblast powinien rozpocząć migrację z explanu do RMS hosta po około jednej do dwóch godzin. Migrację komórek najlepiej zobrazować za pomocą obiektywów o bardzo dużej mocy roboczej 20. Zagadnienia związane z hodowlą tkankową są przenoszone z inkubatora do komory inkubacyjnej pod mikroskopem.

Neuroblast fluorescencyjny może być obrazowany w odstępach od zera do 10 minut, w zależności od pożądanego rodzaju analizy. Nasz protokół organicznej typowej hodowli warstwowej został dokładnie przetestowany i zoptymalizowany w ciągu ostatnich kilku lat pod kątem spójności wzorca migracji i orientacji w RMS. W tym przykładzie analiza komórek migrujących z explan, uzyskanych od myszy, u których pomidor TD ulega ekspresji pod gniazdem w promotorze, ujawnia wysoce zorientowaną i szybką migrację do RMS gospodarza.

Duże powiększenie. Analiza poklatkowa wykazuje doskonałą rozdzielczość na całej długości migrującego neuroblastu podczas 20-minutowej sesji obrazowania. Po zakończeniu obrazowania plastry skóry należy utrwalić lodem, zimnym i świeżo przygotowanym, 4% paraformem, aldehydem i barwnikiem immunologicznym dla różnych składników strumienia migracji.

W tym przypadku astrocyty GFAP dodatnie na niebiesko i naczynia krwionośne CD 31 dodatnie na zielono ujawnia się za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej, analizy w dużym powiększeniu wycinków barwionych na białka cytoszkieletu aktyny na niebiesko i tubuliny na zielono, ujawniając niejednorodną ekspresję tych składników przez komórkę. W samym środku migracji. Nasz protokół stawia przed nami pewne wyzwania, które wymagają cierpliwości, praktyki i poświęcenia czasu zarówno na przygotowanie, jak i analizę wyników.

Oto kilka przydatnych sugestii, które pomogą Ci uzyskać najlepsze wyniki eksperymentów. Z naszego doświadczenia wynika, że myszy w przedziale wiekowym od P 1 do P 10 zapewniają najlepsze wyniki. Dopasowanie wieku między mózgami dawcy i biorcy również poprawia odtwarzalność eksperymentów.

Ponieważ większość odczynników i naczyń hodowlanych musi być świeżo przygotowana, nasz test plastrów wymaga kilku godzin nieprzerwanego przygotowania i obrazowania w ciągu jednego dnia. Po pobraniu mózgów, kroki w konsekwencji muszą zostać wykonane tak szybko, jak to możliwe. Pomiędzy dekapitacją a przygotowaniem plastrów wszystkie kroki powinny być wykonywane przy użyciu lodu, zimnych odczynników, a manipulacje tkankami powinny być ograniczone do minimum, aby uniknąć zaburzeń anatomicznych.

Narzędzia używane do tych sekcji powinny być sterylne i zarezerwowane wyłącznie do manipulacji żywymi tkankami. Nigdy nie używaj narzędzi, które kiedykolwiek miały kontakt z utrwalaczami, takimi jak formaldehyd. Plasterki są na ogół żywotne do 36 godzin z widocznym spadkiem migracji, szybkości i orientacji między 24 a 36 godzinami.

Uważaj na to ograniczenie podczas planowania eksperymentów i analiz.