Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Nazywam się Troy Gasai. Omówimy analizę organotypowych przekrojów tkankowych, która została dopracowana w moim laboratorium w ciągu ostatnich kilku lat. Ben Jacket z mojego laboratorium zademonstruje Państwu, jak przeprowadza się tę analizę.

Analiza organotypowych skrawków postnatalnego mózgu to potężna metoda badania różnych czynników oraz ich roli w migracji neuronów w mózgu postnatalnym i w obrębie prądu migracyjnego TRO. Cześć, nazywam się Ben Jakay. Jestem pracownikiem postdoc w laboratorium dr. Troya Gge na College of Veterinary Medicine Uniwersytetu Stanowego Karoliny Północnej i jestem tutaj dzisiaj, aby pokazać Państwu, jak przeprowadzamy transplantację krzyżową tkanek pomiędzy organotypowymi skrawkami mózgu myszy w celu wizualizacji migrujących neuroblastów w mózgu postnatalnym.

Wszystkie techniki opisane w tym filmie powinny być wykonywane w środowisku sterylnym, najlepiej w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy użyciu sterylizowanych narzędzi. Kropla 150 µL medium do skrawków jest umieszczana w centrum szklanego dna naczynia za pomocą jednorazowej strzykawki wyposażonej w igłę 23G. Kilka kropel kleju nanosi się poza okrągłym szklanym zakryciem dna, pozostawiając jeden bok niezaklejony w celu wymiany płynów A. Następnie błonę porów jądrowych delikatnie układa się na medium za pomocą mikro pęsety, dbając o to, aby pod błoną nie uwięziono pęcherzyków powietrza.

Następnie za pomocą zakrzywionej pęsety spłaszcza się kropki kleju i stabilizuje błonę w docelowym położeniu. Na wierzch błony dodaje się 1 mL medium do skrawków, a następnie naczynia umieszcza się w inkubatorze do momentu rozpoczęcia procedury. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy skrawki przygotowuje się z młodych myszy ponatalnych, od P1 do P10; najpierw stabilizuje się głowę, trzymając pyszczek za pomocą mikropęsety.

Skórę wycina się wzdłuż, od szyi do pyska. SkALP zostaje oddzielony, aby odsłonić kość, a czaszkę przecina się wzdłuż i w kierunku przednim, zaczynając od sternum magna, wykonując jedno cięcie przyśrodkowe i dwa boczne, po jednym z każdej strony. Należy zachować ostrożność, aby zminimalizować kontakt z leżącą poniżej tkanką korową.

Następnie płaty czaszkowe są oddalane od mózgu, aby zwiększyć stabilność tkanki. Podczas sekcjonowania w wibrotomie najbardziej boczna i kodalna część mózgu są usuwane za pomocą żyletki. Obie półkule są ostrożnie wyjmowane z czaszki i umieszczane powierzchnią przyśrodkową do dołu w formie do zatapiania.

Zostają one natychmiast pokryte stopionym żelem agarozy klasy DNA o stężeniu 3%, rozpuszczonym w buforze do przygotowania tkanek i utrzymywanym w temperaturze 37°C. Po dwóch minutach stabilizacji na płaskiej, poziomej powierzchni, aby zapewnić równomierne stwardnienie agarozy, formy umieszcza się na lodzie do czasu całkowitego zastygnięcia.

Po zastygnięciu żelu zawierającego półkule, zostaje on wyjęty z formy i przycięty wokół tkanki mózgowej. Tkanka zatopiona w żelu jest następnie montowana na dysku do preparatów w wibratomie powierzchnią przyśrodkową do góry i mocowana za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Dysk jest następnie instalowany w tacy do preparatów wibratomu wypełnionej lodowatym medium do przygotowania tkanek, a mózg jest cięty na sekcje o grubości 150 µm.

Po zwolnieniu z ostrza plastrów zawierających RMS, są one ostrożnie wyjmowane za pomocą małej szpatułki płaskiej i kładzione płasko w centrum naczyń hodowlanych. Kluczowe jest, aby manipulacje z plastrami były ograniczone do minimum, ponieważ tkanka jest bardzo delikatna. Ilość pożywki w naczyniach hodowlanych jest dostosowana do poziomu wystarczającego do przykrycia sekcji mózgu, przy jednoczesnym zapobieganiu ich przemieszczaniu się.

Naczynia zostają oznakowane i przeniesione do inkubatora. Mózgi dawców przygotowuje się w sposób podobny do mózgów biorców, z wyjątkiem tego, że przekroje są wycinane o grubości 250 µm, a plastry są zbierane w lodzie.

Przygotowanie tkanki w warunkach chłodniczych. Przezcięcia w buforze są niezwłocznie umieszczane pod stereomikroskopem z funkcją epifluorescencji. RMS jest widoczny jako szara struktura w kształcie litery U, rozciągająca się od strefy podependymańskiej do opuszki węchowej.

RMS jest delikatnie mikroprecyzyjnie wycinany za pomocą mikropincet. Jedna pęseta służy do stabilizacji skrawka, podczas gdy druga jest używana do wykonywania niewielkich nacięć wokół RMS, aż do momentu jego uwolnienia ze skrawka. Wycięty RMS jest następnie dzielony na małe eksplanty o średnicy około 200 do 500 micrometers.

W tym przykładzie przygotowano szczepy z myszy wykazujących ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego TD tomato glass. Płytki dolne zawierające skrawki gospodarza zostają wyjęte z inkubatora i umieszczone pod mikroskopem stereoskopowym z wykorzystaniem światła widzialnego. W początkowym segmencie RMS wykonuje się niewielkie nacięcie, a następnie za pomocą pipetora z końcówką 20 µl pojedynczy eksplant donorowy RMS przenosi się w miejsce nacięcia w RMS gospodarza.

Eksplant jest delikatnie wpychany w nacięcie, aby nawiązać kontakt między obiema tkankami. W celu zapewnienia stabilności tego kontaktu, eksplanty są lekko dociskane pomiędzy skrawkiem a membraną z porami jądrowymi. Następnie naczynia są przenoszone z powrotem do inkubatora na co najmniej jedną godzinę, aby umożliwić osadzenie się sekcji na membranie.

Neuroblasty powinny zacząć migrować z eksplantu do RMS gospodarza po około jednej lub dwóch godzinach. Migrację komórek najlepiej obrazować za pomocą obiektywów 20x o bardzo dużej odległości roboczej. Hodowlane tkanki przenosi się z inkubatora do komory inkubacyjnej mikroskopu.

Fluorescencyjne neuroblasty można obrazować w odstępach od 0 do 10 minut, w zależności od pożądanego rodzaju analizy. Nasz protokół hodowli organicznych przekrojów typowych został szczegółowo przetestowany i zoptymalizowany w ciągu ostatnich kilku lat pod kątem spójności wzorca migracji i orientacji w RMS. W niniejszym przykładzie analiza komórek imigrcyjnych z eksplantu, otrzymanego od myszy, w których TD tomato jest eksprymowane pod promotorem nestin, ujawnia silnie zorientowaną i szybką migrację do RMS gospodarza.

Duże powiększenie. Analiza poklatkowa wykazuje doskonałą rozdzielczość na całej długości migrującego neuroblasta podczas 20 minutowej sesji obrazowania. Po zakończeniu obrazowania przekroje można utrwalić w lodowatej, świeżo przygotowanej 4% paraformaldehydzie, a następnie przeprowadzić immunobarwienie różnych komponentów strumienia migracji.

W tym przypadku, za pomocą fluorescencyjnej immunohistochemii uwidoczniono astrocyty wykazujące obecność GFAP w kolorze niebieskim oraz naczynia krwionośne wykazujące obecność CD 31 w kolorze zielonym; analiza przy dużym powiększeniu przekrojów barwionych pod kątem białek cytoszkieletowych – aktyny w kolorze niebieskim i tubuliny w kolorze zielonym – ujawnia niejednorodną ekspresję tych składników w komórce w trakcie migracji. Nasz protokół wiąże się z pewnymi wyzwaniami, które wymagają cierpliwości, wprawy oraz poświęcenia czasu zarówno na przygotowanie, jak i analizę wyników.

Poniżej przedstawiamy kilka przydatnych sugestii, które pomogą uzyskać najlepsze wyniki w eksperymentach. Według naszego doświadczenia, myszy w przedziale wiekowym od P1 do P10 zapewniają najlepsze rezultaty. Dopasowanie wieku mózgów dawcy i biorcy poprawia również powtarzalność eksperymentów.

Ponieważ większość odczynników i naczyń hodowlanych musi być przygotowana na świeżo, nasz test na skrawkach wymaga kilku godzin nieprzerwanych przygotowań i obrazowania w ciągu jednego dnia. Po pobraniu mózgów kolejne etapy muszą zostać przeprowadzone tak szybko, jak to możliwe. Od momentu odcięcia głowy do przygotowania skrawków wszystkie czynności powinny być wykonywane z użyciem lodu i zimnych odczynników, a manipulacje tkanką należy ograniczyć do minimum, aby uniknąć zaburzeń anatomicznych.

Narzędzia wykorzystywane do tych sekcji powinny być sterylne i przeznaczone wyłącznie do manipulacji na żywej tkance. Nigdy nie należy używać narzędzi, które miały kontakt z utrwalaczami, takimi jak formaldehyd. Przekroje są zazwyczaj żywe do 36 godzin, przy czym widoczny spadek migracji, prędkości i orientacji następuje między 24 a 36 godziną.

Należy wziąć pod uwagę to ograniczenie podczas planowania eksperymentów i analiz.