Name: Technika heterokarionowa do analizy lokalizacji specyficznej dla typu komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj technikę heterokarionową do analizy lokalizacji białek specyficznej dla typu komórki przy użyciu fluorescencyjnie znaczonych białek i mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda pozwala badać dynamikę białek w różnych typach komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Katedrze Chemii i Biochemii Worcester Polytechnic Institute za sfinansowanie badań.

1. Transfekcja linii komórkowych
Metoda transfekcji 1
(Nukleofekcja Lonza w celu zwiększenia wydajności transfekcji komórek pierwotnych)
<ol>
	<li>Przed transfekcją komórki powinny być z niedawnego pasażu i znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu. Przemyć komórki roztworem soli fosforanowej w buforze (PBS) i zebrać je poprzez trypsynizację.</li>
	<li>Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 1500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Do płytki 6-dołkowej dodać wysterylizowane szkiełka podstawowe. Szkiełka mogą być powlekane w celu zwiększenia adhezji komórek. Do każdego dołka wlać 1,5 mL pożywki hodowlanej (w tym przypadku DMEM z 10% FBS) i wyrównać temperaturę pożywki w inkubatorze.</li>
	<li>Zebrać komórki poprzez trypsynizację i resuspender w minimalnej objętości roztworu soli fosforanowej w buforze (PBS).</li>
	<li>Policzyć komórki i odwirować odpowiednią ilość suspensji, aby uzyskać ~5x10 5 komórek na próbkę.</li>
	<li>Ostrożnie resuspender komórki w 100 μL roztworu do nukleofekcji w temperaturze pokojowej na próbkę.</li>
	<li>Połączyć 100 μL suspensji komórkowej z 5 μg plazmidowego DNA i przenieść próbkę do kuwety do nukleofektora, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wybrać odpowiedni program nukleofektora (może to wymagać wcześniejszych testów w celu ustalenia optymalnej wydajności transfekcji przy minimalnej śmiertelności).</li>
	<li>Włożyć kuwetę zawierającą suspensję komórek i DNA do uchwytu kuwet nukleofektora i uruchomić wybrany program.</li>
	<li>Po zakończeniu wyjąć kuwetę i dodać do niej ~500 μL uprzednio wyrównanej temperatury pożywki hodowlanej (pobranej z płytki 6-dołkowej).</li>
	<li>Niezwłocznie przenieść próbkę do płytki 6-dołkowej do końcowej objętości 1,5 mL na dołek. Komórki należy wysiać w populacjach mieszanych lub osobno, w przypadku kontroli.</li>
</ol>
Metoda transfekcji 2
(Transfekcja linii komórkowych przy użyciu Qiagen Effectene)
<ol>
	<li>Przygotować kompleksy do transfekcji przy użyciu odczynnika Qiagen Effectene, dodając najpierw 0,8 μg każdej próbki plazmidowego DNA do 200 μL buforu EC.</li>
	<li>Dodać 6,4 μL odczynnika wzmacniającego (enhancer reagent) do każdej próbki, wymieszać krótko poprzez potrząsanie probówką i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 20 μL odczynnika Effectene do każdej próbki, wymieszać poprzez potrząsanie probówką i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotować do transfekcji dwie interesujące linie komórkowe. Niedawno pasażowane komórki (&lt;80% konfluencji) wypłukać raz w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Dodać 1,5 mL świeżej, ogrzanej i zrównoważonej pożywki wzrostowej (w tym przypadku pożywka DMEM uzupełniona o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)).</li>
	<li>Po 15-minutowej inkubacji kompleksów do transfekcji, przenieść 1,2 mL pożywki do każdej próbki. Wymieszać za pomocą pipety i natychmiast przenieść ~700 μL kompleksów do każdego z dwóch dołków na płytce 6-dołkowej. Dodawać kroplowo i mieszać, delikatnie obracając płytkę. Pozostawić komórki do transfekcji na co najmniej 3 godziny (czas ten może różnić się w zależności od typu komórek).</li>
	<li>Do nowej płytki 6-dołkowej włożyć sterylizowane szkiełka nakrywkowe. Szkiełka nakrywkowe mogą być powlekane w celu zwiększenia adhezji komórek.</li>
	<li>Po zakończeniu transfekcji komórki wypłukać dwukrotnie PBS i zebrać komórki poprzez minimalną trypsynizację: dodać około 100 μL roztworu trypsyny do każdego dołka, krótko wstrząsnąć płytką, aby w pełni pokryć każdy dołek, a następnie natychmiast odessać trypsynę. Po oderwaniu się komórek dodać 1,5 mL świeżej pożywki.</li>
	<li>Na tym etapie komórki należy wysiać na sterylne szkiełka nakrywkowe w formie populacji mieszanych lub oddzielnych (dla kontroli).</li>
	<li>Pozostawić komórki do regeneracji na 12 godzin.</li>
</ol>
2. Fuzja komórek
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę z komórek i przemyć je dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Na tym etapie zaleca się potraktowanie komórek cykloheksymidą (100 μg/mL) w celu zahamowania syntezy białek. Inkubować komórki przez 2 godziny, a następnie przemyć je dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Przeprowadzić fuzję komórek poprzez wystawienie ich na działanie 50% roztworu glikolu polietylenowego 1000 (PEG 1000) w DMEM bez surowicy przez 125 sekund w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć komórki PBS, aby usunąć roztwór PEG 1000, a następnie dodać 2 mL świeżo ogrzanej i wyrównanej osmotycznie pożywki.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 18 - 24 godziny.</li>
</ol>
Mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć komórki w PBS.</li>
	<li>Utrwalić komórki, dodając do każdej studni 1 mL 4% roztworu paraformaldehydu (w PBS). Delikatnie mieszać przez 15 minut.</li>
	<li>Dwukrotnie przemyć utrwalone komórki w PBS.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć szkiełka nakrywkowe z płytki i odsączyć nadmiar PBS. Odwrócić szkiełka na preparaty mikroskopowe z jedną kroplą medium montażowego (90% glicerolu, 100mM Tris pH 7.5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-octane) zawierającego DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole).</li>
	<li>Usunąć nadmiar medium montażowego z preparatów i zabezpieczyć szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.</li>
	<li>Wizualizować komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 2 przedstawia przykładowy eksperyment z heterokaryonami z wykorzystaniem pierwotnych fibroblastów oraz komórek raka niedrobnokomórkowego płuca H1299. Białko będące przedmiotem badania w tym eksperymencie (Chicken Anemia Virus-VP3) wykazuje głównie lokalizację cytoplazmatyczną w pierwotnych typach komórek i lokalizację jądrową w typach komórek transformowanych, co zobrazowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Białko jest eksprymowane jako białko fuzyjne z GFP (wektor pEGFP-N1, Clontech) w pierwotnych fibroblastach napletka (PFF) lub z dsRed (wektor dsRed-N1, Clontech) w komórkach H1299. Próbki kontrolne obejmujące autofuzje (dwie górne rzędy) wykazują komórki wielojądrowe bez zmian w stacjonarnych wzorcach lokalizacji. Takie zmiany mogłyby w przeciwnym razie wystąpić z powodu wrażliwości na warunki fuzji lub tworzenia się syncytiów. Fuzje heterokaryonów (dolny rząd) wykazują wniknięcie do jądra białka pochodzącego z komórki pierwotnej połączonego z GFP oraz kolokalizację z białkiem połączonym z dsRed w odpowiedzi na wprowadzenie materiału z komórki transformowanej. Przedstawiony przykład to stosunkowo rzadka fuzja heterokaryonu powstała z zaledwie dwóch komórek, jednej każdego typu, co potwierdza obecność sygnałów obu fluoroprotein. Oprócz wykrywania tego typu przejść lokalizacyjnych, aktywność transportu jądrowo-cytoplazmatycznego można łatwo wykryć poprzez obecność pojedynczego fluoroforu w obu jądrach. Ten rodzaj oznaczenia jest jasny podczas badania fuzji komórek w stosunku 1:1 i byłby zależny od inhibicji translacji.
<img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="Schemat fuzji komórek; transfekcja plazmidem GFP/dsRed; tworzenie heterokaryonu po 18-24 h; obrazowanie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Schemat metody heterokaryonu z wykorzystaniem pierwotnych fibroblastów oraz komórek raka niedrobnokomórkowego H1299. Geny zainteresowania są klonowane w celu wytworzenia fuzji w ramce odczytu z jednym z dwóch genów białek fluorescencyjnych. Następnie linie komórkowe są przejściowo transfekowane wybranym konstruktem i poddawane rekuperacji. Tworzenie heterokaryonu jest indukowane krótką ekspozycją na glikol polietylenowy (PEG), a następnie dalszą inkubacją. Na koniec, za pomocą różnych form mikroskopii fluorescencyjnej, obserwuje się lokalizację subkomórkową badanego białka.
<img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="Schemat analizy mikroskopii konfokalnej, barwienia GFP/dsRed/DAPI, fuzji komórek i tworzenia heterokaryonów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Transport nukleocytoplazmatyczny i aktywność wahadłowa białka VP3 wirusa anemii kurcząt (Chicken Anemia Virus) zwizualizowane za pomocą fuzji heterokaryonów. Górny rząd: Reprezentatywne obrazy samoistnie zfuzjowanych komórek H1299 wykazujących ekspresję dsRed-VP3. Środkowy rząd: Reprezentatywne obrazy epifluorescencyjne pierwotnych fibroblastów napletka (PFF) wykazujących ekspresję GFP-VP3 po fuzji indukowanej PEG. Dolny rząd: Fuzja heterokaryonów komórek PFF i H1299. Kolor żółty oznacza kolokalizację sygnałów GFP i dsRed. Obrazy komórek wykonano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Leica AF6000E i oprogramowania obrazowego Leica.

<ol><li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li>
<li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li>
<li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP%2FNXF1%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li>
<li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li>
<li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+Hormone+Receptor+%CE%B11+Follows+a+Cooperative+CRM1%2FCalreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li>
<li>Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptin+Nucleocytoplasmic+Shuttling+Is+Required+for+Cell+Type-Specific+Localization%2C+Apoptosis%2C+and+Recruitment+of+the+Anaphase-Promoting+Complex%2FCyclosome+to+PML+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies.</a> J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).</li>
<li>Jeffries, S., Capobianco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+by+Notch+requires+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization.</a> Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).</li>
<li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2%2FM+regulators+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li>
<li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li>
<li>Lin, X. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RXR%CE%B1+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li>
<li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li>
<li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół tworzenia heterokariotów zapewnia wydajną i łatwą do interpretacji metodę charakterystyki zachowania lokalizacji specyficznej dla typu komórek, a także aktywności transportu nukleocytoplazmatycznego. Metoda ta wykorzystuje czułość analizy fluorescencyjnej oraz możliwość obrazowania żywych komórek i prowadzenia badań nad dynamiką białek. Technika ta jest łatwo adaptowalna do wielu różnych typów komórek i nadaje się zarówno do obrazowania komórek żywych, jak i utrwalonych. Na przykład mikroskopia fluorescencyjna w odwróceniu może być stosowana do obrazowania na żywo i rejestracji wideo time-lapse. Z kolei komórki zamontowane na szkiełkach mogą być poddawane mikroskopii epifluorescencyjnej w celu określenia lokalizacji w stanie stacjonarnym lub bardziej szczegółowemu obrazowaniu konfokalnemu w celu analizy dyskretnych lokalizacji. Ponadto techniki takie jak odzyskiwanie fluorescencji po fotobleachingu (FRAP) lub utrata fluorescencji w fotobleachingu (FLIP) mogą być wykorzystywane do wyznaczania kinetyki lokalizacji1. Wprowadzenie do protokołu alternatywnych fluoroforów pozwoliłoby na równoległe przeprowadzenie eksperymentów dotyczących oddziaływań białkowych, takich jak transfer energii rezonansowej fluorescencji (FRET)2. Różnorodne inhibitory transportu wewnątrzkomórkowego, takie jak leptomycyna B lub dominujące negatywne konstrukty Ran GTPaza, mogą być stosowane w celu ustalenia zależności od konkretnych szlaków importu lub eksportu5,6,9.
<ul>
	<li>W niektórych eksperymentach dotyczących aktywności transportu wahadłowego (shuttling) należy zachować ostrożność, aby uniknąć efektów lokalizacji wynikających z syntezy nowych białek. W takich przypadkach należy zastosować inhibitory translacji lub ograniczone punkty czasowe. Niemniej jednak możliwe jest wystąpienie artefaktów spowodowanych inhibicją translacji. Dla jasnej interpretacji zachowania transportu i lokalizacji najbardziej pożądane są fuzje komórek zawierające po jednej komórce każdego typu. Może być konieczna optymalizacja liczby komórek oraz warunków fuzji (czasu i stężenia), aby sprzyjać takim korzystnym zdarzeniom fuzji w stosunku 1:1.</li>
	<li>Należy zauważyć, że w zależności od zastosowanych typów komórek konieczna będzie optymalizacja niektórych etapów protokołu. Aspekty procedury eksperymentalnej, takie jak wydajność fuzji, wydajność transfekcji oraz żywotność po fuzji, mogą się znacznie różnić w zależności od typu komórek. W szczególności pierwotne typy komórek mogą być trudne w obsłudze ze względu na złożone warunki hodowli i niską wydajność transfekcji. Zastosowanie technologii takich jak urządzenie Lonza Nucleofector może umożliwić szybkie przetwarzanie komórek, a także drastyczne zwiększenie wydajności transfekcji. Dodatkowo metody elektroporacji pozwalają na łatwe przeniesienie komórek w zawiesinie do kolejnych etapów fuzji.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>odczynnik Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>roztwór soli fosforanowo-buforowany (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;zmodyfikowana pożywka Eagle&amp;rsquo;pożywka (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>Wysokie stężenie glukozy</td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Surowica Hyclone (płodowa bydlęca)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>płytki 6-dołkowe Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do nukleofekcji HDF</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

technika heterokarionu do analizy lokalizacji specyficznej dla typu komórek

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Znaczna liczba białek jest regulowana przez transport wewnątrzkomórkowy lub transport nukleocytozolowy. Białka te pełnią zróżnicowany szereg funkcji komórkowych, w tym import i eksport RNA oraz białek do jądra, regulację transkrypcji oraz apoptozę. Co interesujące, główne reorganizacje komórkowe, w tym podział komórki, różnicowanie i transformacja, często obejmują takie procesy3,4,8,10. Szczegółowe badanie tych białek oraz ich odpowiednich mechanizmów regulacyjnych może być trudne, ponieważ bodźce wywołujące te zmiany lokalizacji mogą być nieuchwytne, a same ruchy mogą być bardzo dynamiczne i trudne do śledzenia. Badania dotyczące onkogenezy komórkowej, na przykład, wciąż czerpią korzyści z rozumienia szlaków i aktywności białek, które różnią się między normalnymi komórkami pierwotnymi a komórkami transformowanymi6,7,11,12. Ponieważ wiele białek wykazuje zmienioną lokalizację podczas transformacji lub w jej wyniku, metody pozwalające na efektywną charakteryzację tych białek oraz szlaków, w których uczestniczą, mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia onkogenezy i otworzyć nowe obszary dla celowanego działania leków.
Przedstawiamy tutaj metodę analizy transportu białek i aktywności przemieszczania się między pierwotnymi a transformowanymi komórkami ssaków. Metoda ta łączy generowanie fuzji heterokaryonowych z mikroskopią fluorescencyjną, zapewniając elastyczny protokół, który może być wykorzystany do wykrywania lokalizacji białek w stanie stacjonarnym lub dynamicznym. Jak pokazano na Ryc. 1, dwa oddzielne typy komórek są przejściowo transfektowane konstruktami plazmidowymi zawierającymi gen fluoroproteinowy połączony z badanym genem. Po ekspresji komórki są łączone za pomocą glikolu polietylenowego, a następnie lokalizacje białek mogą być obrazowane przy użyciu różnych metod. Przedstawiony tutaj protokół stanowi fundamentalne podejście, do którego można dodać techniki specjalistyczne.

Opisano elastyczną i wydajną metodę charakteryzacji specyficznej dla typu komórek lokalizacji białek oraz ich transportu nukleocytoplazmatycznego. To podejście z wykorzystaniem heterokaryonów wykorzystuje fluorescencyjnie znakowane białka fuzyjne do obrazowania lokalizacji białek po fuzji komórek. Protokół ten można zastosować do określania lokalizacji w stanie stacjonarnym lub do bardziej dynamicznych analiz w oparciu o obrazowanie żywych komórek.

Technika heterokarionu do analizy lokalizacji specyficznej dla typu komórek

Znaczna liczba białek jest regulowana poprzez transport wewnątrzkomórkowy lub transport nukleocytoplazmatyczny. Białka te wykazują zróżnicowany zestaw...

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie przemieszczania się białek poprzez ekspresję pojedynczego białka sprzężonego z dwoma różnymi fluoroforami w dwóch oddzielnych liniach komórkowych, a następnie połączenie tych linii. Jest to realizowane poprzez wstępną transfekcję plazmidów zawierających gen zainteresowania połączony z jednym z dwóch różnych genów białek fluorescencyjnych do dwóch oddzielnych typów komórek. Drugim krokiem procedury jest zmieszanie komórek i umożliwienie każdemu typowi komórek akumulacji białka.Trzecim krokiem procedury jest zahamowanie syntezy białek, a następnie fuzja komórek z wykorzystaniem glikolu polietylenowego. Ostatnim etapem procedury jest wizualizacja lokalizacji białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące zmiany w lokalizacji białek lub ich zachowaniu podczas transportu wewnątrzkomórkowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów, takie jak to, w jaki sposób zmieniają się poszczególne funkcje i zachowania białek w miarę transformacji komórek. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w zmiany specyficzne dla komórek transformowanych, może być ona również zastosowana w innych badaniach, takich jak różnicowanie komórek, biologia rozwoju oraz sygnalizacja komórkowa.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ dla każdego rodzaju komórek wymagana będzie optymalizacja warunków transfekcji oraz warunków fuzji. Pierwszą metodą wprowadzenia plazmidowego DNA do komórek zaprezentowaną w niniejszym protokole jest metoda NU Nuclear Affection, w której wykorzystuje się roztwór lonza nuclear effector; należy zacząć od wypłukania komórek, które były niedawno pasażowane i znajdują się w fazie wzrostu logarytmicznego, za pomocą soli fizjologicznej PBS, a następnie zebrać je poprzez trypsyjację. Po utracie przyczepności komórek należy zneutralizować trypsynę poprzez dodanie pożywki zawierającej serum i zebrać komórki poprzez wirowanie przy 1500 G przez pięć minut podczas wirowania komórek.W sterylnych warunkach w komorze z laminarnym przepływem powietrza umieść wysterylizowane szkiełka zakrywowe w płytce 6-dołkowej, a następnie pipetuj 1,5 ml pełnej pożywki hodowlanej do każdego dołka. Przykryj płytkę i przenieś ją do inkubatora do hodowli komórkowych w celu ekwilibracji.Po wirowaniu przenieś probówki do komory z laminarnym przepływem powietrza, odessaj nadsącz i resuspenduj osady komórkowe w minimalnej objętości PBS. Następnie policz komórki i rozdziel odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do sterylnych probówek do mikrocentryfugi. Pozwoli to uzyskać około 5×10⁵ komórek na próbkę. Ponownie odwiruj próbki przy 1500 G przez pięć minut.Po zakończeniu wirowania umieścić probówki w komorze z laminarnym przepływem powietrza, odessać SNA i ostrożnie resuspenderować. Zawiesić komórki w każdej probówce w 100 µL nuclear effector solution o temperaturze pokojowej. Następnie dodać 5 µg DNA plazmidowego do każdej próbki i przenieść próbkę do nuclear effector Q vete i przykryć.Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Włóż próbkę qve do uchwytu Q vet. Wybierz odpowiedni program efektora jądrowego i uruchom go.Wybór najodpowiedniejszego programu może wymagać wcześniejszych testów w celu ustalenia optymalnej wydajności transfekcji przy minimalnej śmiertelności. Następnie wysiej komórki do płytki 6-dołkowej, tworząc populacje mieszane lub osobne grupy kontrolne. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze i pozwól komórkom regenerować się przez 12 godzin.Drugą zaprezentowaną metodą przejściowej ekspresji plazmidów jest transfekcja z użyciem odczynnika kagen. Aby rozpocząć, należy dodać 0,8 µg każdej próbki DNA plazmidowego do 200 µL buforu EC w sterylnej probówce do wirowania. Następnie do każdej próbki należy dodać 6,4 µL odczynnika wzmacniającego.Krótko wymieszaj, stukając w probówkę, i inkubuj przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Po tej krótkiej inkubacji dodaj 20 µL odczynnika oddziałującego do każdej próbki. Wymieszaj każdą probówkę, stukając w nią, i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Podczas inkubacji przygotuj dwie linie komórkowe, które zostaną wykorzystane w eksperymencie. Do transfekcji komórki powinny być niedawno pasażowane i znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego, przy konfluencji na poziomie około 80%. Przemyj komórki raz PBS i dodaj 1,5 milliliters świeżej pożywki DMEM z 10% FBS.Po 15 minutach inkubacji odczynników do transfekcji DNA, do każdej próbki dodać 1,2 mililitra pożywki DMEM z dodatkiem 10% FBS, wymieszać poprzez pipetowanie, a następnie niezwłocznie przenieść kroplami około 700 mikrolitrów kompleksów do każdego z dwóch dołków w płytce 6-dołkowej, mieszając poprzez delikatne potrząsanie płytką. Pozostawić komórki do transfekcji na co najmniej trzy godziny w inkubatorze w komorze do hodowli komórkowych; w razie potrzeby umieścić po jednym sterylnym szkiełku nakrywkowym w każdym dołku płytki 6-dołkowej.W celu zwiększenia adhezji komórek można zastosować powlekane szkiełka nakrywki. Następnie komórki po transfekcji należy przemyć dwukrotnie w PBS i zebrać za pomocą minimalnej trypsynizacji. Osiąga się to poprzez dodanie 100 µL roztworu trypsyny do każdej studni i wstrząśnięcie płytki, aby zapewnić całkowite pokrycie.Następnie należy niezwłocznie odessać pozostałe trypsynę. Pozostałą trypsynę neutralizuje się poprzez ponowne zawieszenie komórek w 1,5 mililitrach świeżego DMEM z 10%FBS, a następnie wysiewa komórki jako populacje mieszane lub oddzielnie w celu uzyskania kontroli. W płytce sześciodołkowej zawierającej szkiełka przedmiotowe pozwala się komórkom na rekonwalescencję przez 12 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowej.Niezależnie od zastosowanej metody transfekcji, procedura generowania infuzji hetero-nośnych jest taka sama. Po transfekcji należy usunąć pożywkę hodowlaną z dołków i dwukrotnie przemyć komórki roztworem PBS. Następnie zaleca się potraktowanie komórek cykloheksymidą w celu zahamowania dalszej syntezy białek.Dodaj cyklohezymid w stężeniu 100 µg/mL w pożywce hodowlanej, aby pokryć komórki, i inkubuj przez dwie godziny w inkubatorze do hodowli komórek. Po dwóch godzinach wyjmij komórki z inkubatora i przemyj je dwukrotnie PBS. Aby zainicjować fuzję, pokryj komórki roztworem 50% glikolu polietylenowego 1000 w DMEM bez surowicy i inkubuj przez 125 sekund.W temperaturze pokojowej usunąć roztwór PEG i przemyć komórki buforem PBS, aby usunąć pozostałości PEG. Następnie dodać 2 mL DMEM z dodatkiem 10% FBS ogrzanego do 37 °C. Inkubować komórki przez 18–24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.Po inkubacji trwającej od 18 do 24 godzin wyjmij płytkę z inkubatora i dwukrotnie przemyj komórki w PBS. Następnie do każdego dołka pipetuj jeden mililiter 4% paraformaldehydu w PBS i delikatnie mieszaj przez 15 minut.Podczas inkubacji przygotować okładki do mikroskopu, dodając jedną kroplę medium montażowego zawierającego dpi. Następnie dwa razy przemyć utrwalone komórki solą PBS i ostrożnie usunąć każdą szkiełko nakrywkę za pomocą małej pęsety. Odessać pozostały PBS za pomocą kawałka chusteczki, a następnie położyć próbkę stroną z komórkami do dołu na szkiełko mikroskopowe z medium montażowym i tappi.Nadmiar medium montażowego należy usunąć z preparatu za pomocą ręcznika papierowego, a następnie zabezpieczyć krawędzie szkiełek nakrywkowych. Używając laku do paznokci, można teraz wizualizować komórki za pomocą konfokalnej lub epi-fluorescencyjnej mikroskopii. Na tym schemacie blokowym przedstawiono metodę hetero do analizy specyficznej dla typu komórek lokalizacji białek w trzech podstawowych krokach.Transfekcja plazmidu wykazującego fuzję białka z markerem fluorescencyjnym z wykorzystaniem glikolu polietylenowego 1000 oraz obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, co widać na tych obrazach epi-fluorescencyjnych: pierwotne fibroblasty napletka, kontrole samofuzji wykazujące białko VP3 wirusa zakaźnego kurczego z tagiem GFP wykazują przede wszystkim lokalizację cytoplazmatyczną białka w linii raka niedrobnokomórkowego płuca H 1299. Kontrole samofuzji z tym samym białkiem VP3 z tagiem DS.RED wykazują przede wszystkim lokalizację jądrową. Heterokaryczna fuzja pierwotnych fibroblastów napletka i komórek H 1299 skutkuje wprowadzeniem materiału z komórek przekształconych do pierwotnych fibroblastów napletka i powoduje zmianę lokalizacji pochodzącego z komórek pierwotnych białka VP3 z tagiem GFP do jądra komórkowego.Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że sukces w dużym stopniu zależy od wydajności transfekcji w konkretnych zastosowanych typach komórek, a także od optymalizacji warunków fuzji dla tych konkretnych komórek. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak flip i frap, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące analizy dynamiki lokalizacji w czasie rzeczywistym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak oceniać specyficzne dla typu komórek lokalizacje białek poprzez wprowadzanie białek znakowanych fluorescencyjnie i generowanie fuzji komórkowych.

heterokaryon-technique-for-analysis-of-cell-type-specific-localization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Technika heterokarionow do analizy lokalizacji specyficznych dla typu komórki

Film demonstruje metodę izolowania nienaruszonych jąder z komórek glejowych i macierzystych w zakręcie zębatym hipokampa myszy (DG). Tkanka DG jest mechanicznie dysocjowana w zimnym buforze homogenizacyjnym w celu uwolnienia jąder. Szczątki tkanek i inne uwolnione organelle są odrzucane, a jądra są barwione barwnikiem DNA i przeciwciałem sprzężonym z fluoroforem specyficznym dla neuronalnego antygenu jądrowego (NeuN). Sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją jest następnie stosowane do...

Technika izolowania jąder od komórek nieneuronalnych w zakręcie zębatym hipokampa

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Tkanki Drosophila często zawierają niejednorodną mieszaninę typów komórek. Aby zbadać ekspresję genów w określonych typach komórek z danej tkanki, jądra mogą być genetycznie znakowane, a następnie izolowane przy użyciu podejścia opartego na powinowactwie. Wyizolowane jądra mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak analiza ekspresji genów i immunoprecypitacja chromatyny.

Izolacja oznaczonych jąder z tkanek Drosophila w oparciu o powinowactwo do analizy ekspresji genów

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).

Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych

Tutaj prezentujemy kombinatoryczne podejście do klasyfikacji typów komórek neuronalnych przed izolacją i późniejszej charakterystyki transkryptomów jednokomórkowych. Protokół ten optymalizuje przygotowanie próbek do udanego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i opisuje metodologię zaprojektowaną specjalnie w celu lepszego zrozumienia różnorodności komórkowej.

Sekwencja RNA pojedynczej komórki zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki

Ten protokół opisuje łatwą i wygodną metodę oznaczania i wizualizacji żywych chromosomów w komórkach mitotycznych za pomocą etykiety Histone2B-GFP BacMam 2.0 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Raportujemy protokół DNA-FISH metafazowej dystrybucji, który wizualnie wykrywa liczbę kopii lokusu i jego lokalizację w genomie. To podejście umożliwia rozdzielczość pojedynczych komórek stanów amplifikacji, szczególnie w liniach komórek nowotworowych zawierających DNA pozachromosomowe i jednorodnie barwiące regiony.

Rozmazy metafazowe DNA-FISH w celu odróżnienia dodatkowego DNA chromosomowego od jednolicie barwiących się regionów w ludzkich liniach komórek nowotworowych

Poznaj technikę heterokarionową do analizy lokalizacji białek specyficznej dla typu komórki przy użyciu fluorescencyjnie znaczonych białek i mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda pozwala badać dynamikę białek w różnych typach komórek.

Technika heterokarionu do analizy lokalizacji specyficznej dla typu komórek

Przeglądaj więcej filmów