Technika heterokarionu do analizy lokalizacji specyficznej dla typu komórek

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie przemieszczania się białek poprzez ekspresję pojedynczego białka sprzężonego z dwoma różnymi fluoroforami w dwóch oddzielnych liniach komórkowych, a następnie połączenie tych linii. Jest to realizowane poprzez wstępną transfekcję plazmidów zawierających gen zainteresowania połączony z jednym z dwóch różnych genów białek fluorescencyjnych do dwóch oddzielnych typów komórek. Drugim krokiem procedury jest zmieszanie komórek i umożliwienie każdemu typowi komórek akumulacji białka.

Trzecim krokiem procedury jest zahamowanie syntezy białek, a następnie fuzja komórek z wykorzystaniem glikolu polietylenowego. Ostatnim etapem procedury jest wizualizacja lokalizacji białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące zmiany w lokalizacji białek lub ich zachowaniu podczas transportu wewnątrzkomórkowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów, takie jak to, w jaki sposób zmieniają się poszczególne funkcje i zachowania białek w miarę transformacji komórek. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w zmiany specyficzne dla komórek transformowanych, może być ona również zastosowana w innych badaniach, takich jak różnicowanie komórek, biologia rozwoju oraz sygnalizacja komórkowa.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ dla każdego rodzaju komórek wymagana będzie optymalizacja warunków transfekcji oraz warunków fuzji. Pierwszą metodą wprowadzenia plazmidowego DNA do komórek zaprezentowaną w niniejszym protokole jest metoda NU Nuclear Affection, w której wykorzystuje się roztwór lonza nuclear effector; należy zacząć od wypłukania komórek, które były niedawno pasażowane i znajdują się w fazie wzrostu logarytmicznego, za pomocą soli fizjologicznej PBS, a następnie zebrać je poprzez trypsyjację. Po utracie przyczepności komórek należy zneutralizować trypsynę poprzez dodanie pożywki zawierającej serum i zebrać komórki poprzez wirowanie przy 1500 G przez pięć minut podczas wirowania komórek.

W sterylnych warunkach w komorze z laminarnym przepływem powietrza umieść wysterylizowane szkiełka zakrywowe w płytce 6-dołkowej, a następnie pipetuj 1,5 ml pełnej pożywki hodowlanej do każdego dołka. Przykryj płytkę i przenieś ją do inkubatora do hodowli komórkowych w celu ekwilibracji.

Po wirowaniu przenieś probówki do komory z laminarnym przepływem powietrza, odessaj nadsącz i resuspenduj osady komórkowe w minimalnej objętości PBS. Następnie policz komórki i rozdziel odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do sterylnych probówek do mikrocentryfugi. Pozwoli to uzyskać około 5×10⁵ komórek na próbkę. Ponownie odwiruj próbki przy 1500 G przez pięć minut.

Po zakończeniu wirowania umieścić probówki w komorze z laminarnym przepływem powietrza, odessać SNA i ostrożnie resuspenderować. Zawiesić komórki w każdej probówce w 100 µL nuclear effector solution o temperaturze pokojowej. Następnie dodać 5 µg DNA plazmidowego do każdej próbki i przenieść próbkę do nuclear effector Q vete i przykryć.

Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Włóż próbkę qve do uchwytu Q vet. Wybierz odpowiedni program efektora jądrowego i uruchom go.

Wybór najodpowiedniejszego programu może wymagać wcześniejszych testów w celu ustalenia optymalnej wydajności transfekcji przy minimalnej śmiertelności. Następnie wysiej komórki do płytki 6-dołkowej, tworząc populacje mieszane lub osobne grupy kontrolne. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze i pozwól komórkom regenerować się przez 12 godzin.

Drugą zaprezentowaną metodą przejściowej ekspresji plazmidów jest transfekcja z użyciem odczynnika kagen. Aby rozpocząć, należy dodać 0,8 µg każdej próbki DNA plazmidowego do 200 µL buforu EC w sterylnej probówce do wirowania. Następnie do każdej próbki należy dodać 6,4 µL odczynnika wzmacniającego.

Krótko wymieszaj, stukając w probówkę, i inkubuj przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Po tej krótkiej inkubacji dodaj 20 µL odczynnika oddziałującego do każdej próbki. Wymieszaj każdą probówkę, stukając w nią, i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Podczas inkubacji przygotuj dwie linie komórkowe, które zostaną wykorzystane w eksperymencie. Do transfekcji komórki powinny być niedawno pasażowane i znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego, przy konfluencji na poziomie około 80%. Przemyj komórki raz PBS i dodaj 1,5 milliliters świeżej pożywki DMEM z 10% FBS.

Po 15 minutach inkubacji odczynników do transfekcji DNA, do każdej próbki dodać 1,2 mililitra pożywki DMEM z dodatkiem 10% FBS, wymieszać poprzez pipetowanie, a następnie niezwłocznie przenieść kroplami około 700 mikrolitrów kompleksów do każdego z dwóch dołków w płytce 6-dołkowej, mieszając poprzez delikatne potrząsanie płytką. Pozostawić komórki do transfekcji na co najmniej trzy godziny w inkubatorze w komorze do hodowli komórkowych; w razie potrzeby umieścić po jednym sterylnym szkiełku nakrywkowym w każdym dołku płytki 6-dołkowej.

W celu zwiększenia adhezji komórek można zastosować powlekane szkiełka nakrywki. Następnie komórki po transfekcji należy przemyć dwukrotnie w PBS i zebrać za pomocą minimalnej trypsynizacji. Osiąga się to poprzez dodanie 100 µL roztworu trypsyny do każdej studni i wstrząśnięcie płytki, aby zapewnić całkowite pokrycie.

Następnie należy niezwłocznie odessać pozostałe trypsynę. Pozostałą trypsynę neutralizuje się poprzez ponowne zawieszenie komórek w 1,5 mililitrach świeżego DMEM z 10%FBS, a następnie wysiewa komórki jako populacje mieszane lub oddzielnie w celu uzyskania kontroli. W płytce sześciodołkowej zawierającej szkiełka przedmiotowe pozwala się komórkom na rekonwalescencję przez 12 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowej.

Niezależnie od zastosowanej metody transfekcji, procedura generowania infuzji hetero-nośnych jest taka sama. Po transfekcji należy usunąć pożywkę hodowlaną z dołków i dwukrotnie przemyć komórki roztworem PBS. Następnie zaleca się potraktowanie komórek cykloheksymidą w celu zahamowania dalszej syntezy białek.

Dodaj cyklohezymid w stężeniu 100 µg/mL w pożywce hodowlanej, aby pokryć komórki, i inkubuj przez dwie godziny w inkubatorze do hodowli komórek. Po dwóch godzinach wyjmij komórki z inkubatora i przemyj je dwukrotnie PBS. Aby zainicjować fuzję, pokryj komórki roztworem 50% glikolu polietylenowego 1000 w DMEM bez surowicy i inkubuj przez 125 sekund.

W temperaturze pokojowej usunąć roztwór PEG i przemyć komórki buforem PBS, aby usunąć pozostałości PEG. Następnie dodać 2 mL DMEM z dodatkiem 10% FBS ogrzanego do 37 °C. Inkubować komórki przez 18–24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Po inkubacji trwającej od 18 do 24 godzin wyjmij płytkę z inkubatora i dwukrotnie przemyj komórki w PBS. Następnie do każdego dołka pipetuj jeden mililiter 4% paraformaldehydu w PBS i delikatnie mieszaj przez 15 minut.

Podczas inkubacji przygotować okładki do mikroskopu, dodając jedną kroplę medium montażowego zawierającego dpi. Następnie dwa razy przemyć utrwalone komórki solą PBS i ostrożnie usunąć każdą szkiełko nakrywkę za pomocą małej pęsety. Odessać pozostały PBS za pomocą kawałka chusteczki, a następnie położyć próbkę stroną z komórkami do dołu na szkiełko mikroskopowe z medium montażowym i tappi.

Nadmiar medium montażowego należy usunąć z preparatu za pomocą ręcznika papierowego, a następnie zabezpieczyć krawędzie szkiełek nakrywkowych. Używając laku do paznokci, można teraz wizualizować komórki za pomocą konfokalnej lub epi-fluorescencyjnej mikroskopii. Na tym schemacie blokowym przedstawiono metodę hetero do analizy specyficznej dla typu komórek lokalizacji białek w trzech podstawowych krokach.

Transfekcja plazmidu wykazującego fuzję białka z markerem fluorescencyjnym z wykorzystaniem glikolu polietylenowego 1000 oraz obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, co widać na tych obrazach epi-fluorescencyjnych: pierwotne fibroblasty napletka, kontrole samofuzji wykazujące białko VP3 wirusa zakaźnego kurczego z tagiem GFP wykazują przede wszystkim lokalizację cytoplazmatyczną białka w linii raka niedrobnokomórkowego płuca H 1299. Kontrole samofuzji z tym samym białkiem VP3 z tagiem DS.RED wykazują przede wszystkim lokalizację jądrową. Heterokaryczna fuzja pierwotnych fibroblastów napletka i komórek H 1299 skutkuje wprowadzeniem materiału z komórek przekształconych do pierwotnych fibroblastów napletka i powoduje zmianę lokalizacji pochodzącego z komórek pierwotnych białka VP3 z tagiem GFP do jądra komórkowego.

Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że sukces w dużym stopniu zależy od wydajności transfekcji w konkretnych zastosowanych typach komórek, a także od optymalizacji warunków fuzji dla tych konkretnych komórek. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak flip i frap, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące analizy dynamiki lokalizacji w czasie rzeczywistym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak oceniać specyficzne dla typu komórek lokalizacje białek poprzez wprowadzanie białek znakowanych fluorescencyjnie i generowanie fuzji komórkowych.