Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zademonstrowanie łatwości rejestrowania odpowiedzi węchowych z układu nerwowego owada. Osiąga się to poprzez unieruchomienie żywej ćmy i podłączenie elektrod do czułka lub pojedynczego neuronu w celu zapisu odpowiedzi indukowanych przez substancje zapachowe. W pierwszym kroku w oko wprowadza się szklaną elektrodę wypełnioną roztworem soli fizjologicznej, która służy jako uziemienie, a w drugim kroku w dowolną z unieruchomionych ciem wprowadza się szklaną elektrodę wypełnioną roztworem soli fizjologicznej, co umożliwia rejestrację odpowiedzi elektrycznych w formie antenogramu w celu zapisu odpowiedzi pojedynczych jednostek z neuronu receptora węchowego.

Elektrodę rejestrującą wprowadza się u podstawy czułka. Następnie sygnał antenowy jest wzmacniany i przekazywany do przetwornika analogowo-cyfrowego w celu rejestracji i zapisu sygnałów. Uzyskane wyniki wykazują zależne od dawki odpowiedzi indukowane przez substancje zapachowe, na podstawie zarejestrowanego sygnału elektrycznego w formie sygnału EAG lub impulsu (spike).

Opracowaliśmy nową metodę rejestracji enterogramu z unieruchomionej żywej ćmy z gatunku Naval orange. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że preparat zachowuje żywotność przez długi czas, dzięki czemu ta sama ćma może być wykorzystana wielokrotnie do rejestracji wielu odpowiedzi, a także do rejestracji odpowiedzi pojedynczych jednostek z poszczególnych sensorów anteny. Skupiliśmy się na gatunku Naval orange, ponieważ jest on istotnym z punktu widzenia rolnictwa szkodnikiem w Kalifornii.

Niemniej jednak metoda ta może być stosowana w przypadku innych owadów z grupy epi dotter, nie tylko w celu odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące funkcji organów, ale także w procesie opracowywania nowych atraktantów. Niniejsze badanie układu węchowego ciem wykorzystuje gatunek Ullo Ella, znanego jako robak pomarańczowy.

Kolonię owadów utrzymuje się na diecie z otrębów pszennych w komorach klimatycznych przy temperaturze około 28°C, wilgotności względnej około 75% oraz w fotoperiodzie 16 godzin światła i 8 godzin ciemności. Pojemniki dla nowo wyklutych ciem przygotowuje się, umieszczając do 10 warstw nasączonych wodą ręczników papierowych w plastikowym pudełku. Wyklute ćmy należy codziennie zbierać i rozpoznawać pod kątem płci, a następnie przenieść do plastikowego pudełka. Pudełko należy przykryć perforowaną pokrywą, aby zapewnić cyrkulację powietrza przed przystąpieniem do rejestracji elektrofizjologicznych.

Najpierw przygotuj uchwyt dla ćmy, odcinając końcówkę pipety o pojemności 200 µL tak, aby średnica wierzchołka wynosiła około dwóch milimetrów. Do badania EAG lub SSR wybierz ćmę od dwóch do czterech dni po wyjściu z poczki. Umieść ćmę w pipecie od strony przeciwnej do wierzchołka, używając zwilżonego kawałka papieru ręcznika, i delikatnie przesuń owada w stronę końcówki pipety.

Kontynuuj wpychanie ćmy, aż czułki i część głowy wystaną z końcówki; unieruchom odsłoniętą głowę, pokrywając ją nie wysychającą glinką, pozostawiając odsłonięty niewielki fragment jednego oka oraz dwa czułki. Umieść preparat ćmy na platformie mikromanipulatora elektrogramu pomiędzy dwoma uchwytami elektrod, używając elektrod szklanych o średnicy końcówki poniżej 1 µm. Wypełnij elektrody płynem Ringer’a dla kończyn.

Patrząc przez mikroskop, przebij jedną elektrodą odsłonięty obszar oka. Służy ona jako elektroda odniesienia. Następnym krokiem jest umieszczenie elektrod rejestrujących na czułkach.

Czułek samca ciemnicy mącznika jest wieloczłonowy, a każdy człon ozdobiony jest dużą liczbą struktur przypominających włosy. Illa; wstawka przedstawia zdjęcie z transmisyjnego mikroskopu elektronowego ukazujące szczegóły illa w celu ułatwienia rejestracji sygnałów z czułków. Odetnij jeden lub dwa dystalne człony czułka.

Następnie należy wprowadzić obie anteny do elektrody rejestrującej. Alternatywnie, w przypadku pomiarów z jednego sensilla, elektrodę rejestrującą wprowadza się u podstawy sensilla. Potencjały czynnościowe z sensilli są wzmacniane przez przedwzmacniacz o wysokiej impedancji i przekazywane do inteligentnego cyfrowo-analogowego przetwornika USB w celu późniejszej analizy offline przy użyciu oprogramowania autos spike.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie bodźca chemicznego z wykorzystaniem ZZ 1113 HEXA deca Now, który jest głównym składnikiem mieszaniny feromonów samic omacnicy pomarańczowej; należy rozcieńczyć substancję chemiczną w heksanie w celu przygotowania rozcieńczeń DIC. Nanieś 10 µL roztworu bodźca na papier filtracyjny Whatman. Odparuj rozpuszczalnik, delikatnie potrząsając papierem przez 10 sekund.

Pod wyciągiem laboratoryjnym umieść pasek w pięciomililitrowej strzykawce z polipropylenu; sam heksan oraz pusta strzykawka służą jako kontrole przygotowania. EAG lub SSR jest utrzymywany w zwilżonym strumieniu powietrza dostarczanym przez kontroler bodźca w ilości 20 ml/s. Podłącz strzykawkę zawierającą bodziec chemiczny do kontrolera strumienia powietrza.

Należy zarejestrować sygnały elektryczne linii bazowej przez dwie sekundy. Następnie do strumienia powietrza należy dodać impuls stymulujący o natężeniu 4 ml/s przez 500 ms. Rejestrację sygnałów elektrycznych należy kontynuować przez kolejne osiem sekund.

Zachować co najmniej jedną minutę przerwy między stymulacjami. Rycina ta przedstawia wyraźną odpowiedź zależną od dawki z czułków unieruchomionej samca ćmy. Stymulacja została przeprowadzona z użyciem komponentu feromonu samicy, CZ 1113 hexaco.

Odpowiedź na heksan. Kontrola nośnika jest przedstawiona kolejno linią niebieską. Większe dawki feromonu generują sukcesywnie większe zapisy elektrogramu.

Rysunek ten przedstawia zewnątrzkomórkowe rejestracje pojedynczych jednostek z triccha u samca w odpowiedzi na stymulację komponentem feromonu żeńskiego. Rejestracje te wykazują zależną od dawki odpowiedź pobudzeniową. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać przeprowadzona w ciągu kilku godzin.

Stosując tę metodę, należy zadbać o uniknięcie kontaminacji i używać odczynników o jak najwyższej czystości.