Pomiary elektrofizjologiczne z układu węchowego
March 29th, 2011
Systemy węchowe owadów dają unikalne możliwości rejestrowania reakcji wywołanych przez odorant w formie elektroantennogramów (EAG) i pojedynczych nagrań sensillum (SSR), które są zsumowanymi odpowiedziami ze wszystkich neuronów receptora zapachowego (ORN) znajdujących się na antenie i z tych znajdujących się w poszczególnych sensillach, odpowiednio.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykazanie łatwości rejestrowania reakcji węchowych układu nerwowego owadów. Osiąga się to poprzez unieruchomienie żywej i przymocowanie elektrod do anteny lub pojedynczego neuronu w celu zarejestrowania reakcji wywołanych zapachem. W pierwszym kroku szklana elektroda wypełniona solą fizjologiczną jest wbijana w oko jako mielona w drugim kroku, a wszelkie uwięzione mole są umieszczane w szklanej elektrodzie wypełnionej solą fizjologiczną, która umożliwia rejestrację reakcji elektrycznych w postaci grama antenowego do rejestrowania pojedynczych odpowiedzi jednostkowych z neuronu receptora węchowego.
Elektroda rejestrująca jest wprowadzana u podstawy słońca. Następnie sygnał antenowy jest wzmacniany i podawany do analogowego przetwornika cyfrowego w celu nagrywania i zapisywania sygnałów. Uzyskano wyniki, które pokazują zależne od dawki, indukowane przez nawanianie zapachu reakcje na podstawie zarejestrowanego sygnału elektrycznego w postaci sygnału EAG lub skoku.
Opracowaliśmy nową metodę rejestrowania enterogramu z uwięzionej życiowej pomarańczy marynarki wojennej. Główną zaletą tej techniki jest to, że przygotowanie wystarcza na długi czas, a ta sama może być używana wielokrotnie do nagrywania wielu odpowiedzi, a ta sama może być również używana do nagrywania pojedynczych odpowiedzi jednostki z pojedynczego czujnika z anteny. Skupiamy się na morskim pomarańczowym, ponieważ jest to ważne miejsce rolnicze w Kalifornii.
Jednak metoda ta może być stosowana w przypadku innych owadów epi dotter, nie tylko w celu odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące starych funkcji, ale także w celu opracowania nowych atraktantów. To badanie układu węchowego wykorzystuje pomarańczowego robaka morskiego. Ullo Ella.
Kolonia owadów jest utrzymywana na diecie marki pszenicy w komorach środowiskowych w temperaturze około 28 stopni Celsjusza, około 75% wilgotności względnej i pod 16 do ośmiu godzinnym reżimem fotograficznym od jasnego do ciemnego, twórz pojemniki dla nowo pojawiających się, umieszczając do 10 warstw nasączonych wodą ręczników papierowych w plastikowym pudełku. Codziennie zbieraj i seksuj pojawiające się, a następnie przenieś je do plastikowego pudełka. Przykryj pudełko perforowaną pokrywą, aby umożliwić cyrkulację powietrza w celu przygotowania do zapisów elektrofizjologicznych.
Najpierw zrób uchwyt na, przecinając końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby miała średnicę końcówki około dwóch milimetrów. W przypadku EAG lub SSR wybierz, która występuje od dwóch do czterech dni po wzejściu. Włóż do pipety od końca przeciwnego do końcówki za pomocą nawilżonego kipia bibuły, delikatnie popchnij w kierunku końcówki pipety.
Kontynuuj popychanie, aż czułki i część głowy wystają z końcówki, unieruchamiając odsłoniętą głowę, przykrywając głowę niewysychającą gliną, pozostawiając odsłoniętą niewielką część jednego oka i dwie czułki. Umieść preparat na mole na platformie manipulatora elektrogramu mikrom między dwoma uchwytami elektrod za pomocą elektrod szklanych o średnicy końcówki mniejszej niż jeden mikron. Zapełnij elektrody dzwonkiem centum limb.
Patrząc przez mikroskop, przebij odsłonięty obszar oka jedną elektrodą. Służy ona jako elektroda odniesienia. Kolejnym krokiem jest umieszczenie elektrod rejestrujących na antenach.
Antena samca oranżerii morskiej jest wielosegmentowa, a każdy segment ozdobiony jest dużą liczbą struktur przypominających włosy. Illa, wstawka to skaningowy mikrograf elektronowy pokazujący szczegóły illa, aby ułatwić rejestrację z anten. Odetnij dystalny jeden do dwóch segmentów ścięgnista.
Następnie włóż obie anteny do elektrody rejestrującej. Alternatywnie, w przypadku nagrań z pojedynczym czujnikiem, włóż elektrodę rejestrującą do podstawy czujnika. Potencjały czynnościowe z czujnika są wzmacniane przez przedwzmacniacz o wysokiej impedancji i wprowadzane do inteligentnego cyfrowego przetwornika analogowego USB w celu analizy w trybie offline za pomocą oprogramowania Autos Peak.
Następnym krokiem jest przygotowanie bodźca chemicznego za pomocą ZZ 1113 HEXA deca Now, który jest głównym składnikiem żeńskiej mieszanki feromonów z morskiego pomarańczowego robaka, rozcieńcz substancję chemiczną heksanem, aby uzyskać rozcieńczenia DIC. Załaduj 10 mikrolitrów roztworu stymulacyjnego Eloqua na bibułę filtracyjną watmana. Odparować rozpuszczalnik w paski, delikatnie potrząsając nim przez 10 sekund.
Pod wyciągiem umieść pasek w pięciomililitrowej strzykawce polipropylenowej, sam heksan, a pusta strzykawka będzie kontrolować przygotowanie. EAG lub SSR jest utrzymywany w nawilżonym strumieniu powietrza dostarczanym przez sterownik bodźców składni z prędkością 20 mililitrów na sekundę. Podłączyć strzykawkę zawierającą bodziec chemiczny do sterownika Airstream.
Nagraj dwie sekundy podstawowych sygnałów elektrycznych. Następnie dodaj impuls bodźca o częstotliwości czterech mililitrów na sekundę do strumienia powietrza przez 500 milisekund. Kontynuuj nagrywanie sygnałów elektrycznych jeszcze przez osiem sekund.
Odczekaj co najmniej minutę między stymulacjami. Rysunek ten pokazuje silną, zależną od dawki odpowiedź czułków powściągliwego samca. Stymulowany żeńskim składnikiem feromonowym, CZ 1113 hexaco.
Odpowiedź na heksan. Sterowanie pojazdem jest kolejno oznaczone niebieską linią. Coraz większe dawki feromonu generują kolejno większe zapisy elektrogramowe.
Ten rysunek pokazuje zewnątrzkomórkowe nagrania pojedynczych jednostek z tric andum w odpowiedzi na stymulację ze strony żeńskiego składnika feromonowego. Nagrania te wykazują reakcję pobudzającą zależną od dawki. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Korzystając z tej metody, należy unikać zanieczyszczenia i używać chemikaliów tak czystych, jak to możliwe.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł demonstruje proces rejestracji reakcji węchowych z nerwowego układu owadów, w szczególności u ćmy. Metodologia polega na ograniczeniu ruchu żywej ćmy i użyciu elektrod do rejestracji reakcji wywołanych bodźcami węchowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Systemy węchowe
Tło
- Owady posiadają złożone systemy węchowe.
- Elektroantennogramy (EAG) i rejestracji pojedynczego czułka (SSR) są kluczowymi technikami.
- Te metody pozwalają na badanie neuronów receptorów węchowych (ORN).
- Zrozumienie węchu owadów może dostarczyć wglądu w przetwarzanie sensoryczne.
Cel badania
- Zobrazowanie łatwości rejestracji reakcji węchowych u owadów.
- Demonstracja użycia elektrod do rejestracji sygnałów elektrycznych.
- Analiza odpowiedzi zależnych od dawki na różne bodźce węchowe.
Stosowane metody
- Ograniczenie żywej ćmy do eksperymentu.
- Użycie wypełnionych salina elektrod szklanych do rejestracji.
- Użycie elektrody w oku jako uziemienia.
- Wzmacnianie sygnałów z czułków i ich konwersja do analizy.
Główne wyniki
- Udane rejestracji sygnałów elektrycznych z neuronów ORN.
- Zdemonstrowane odpowiedzi zależne od dawki na bodźce węchowe.
- Zarejestrowane sygnały w postaci EAG i impulsów.
Wnioski
- Metodologia jest skuteczna w badaniu reakcji węchowych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia przetwarzania węchowego u owadów.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć te odkrycia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Electrophysiological measurements from insect olfactory systems enable high-fidelity detection of odorant-induced neural responses, supporting target validation in pest management and agrochemical discovery. The approach provides quantitative, dose-dependent readouts that facilitate mechanistic de-risking of sensory pathways and predictive confidence in lead compound screening. This method enhances translational continuity by linking molecular target engagement to functional behavioral outputs in agriculturally relevant species.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of odorant receptor neuron function to validate molecular targets involved in chemosensory signaling.
- Operational Value: Supports biological de-risking by confirming target engagement through direct electrophysiological readouts.
- Predictive Value: Dose-dependent responses allow for structure-activity relationship assessment and lead prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated olfactory systems for reproducible, high-sensitivity screening of odorant libraries.
- Quantitative Output: Generates electroantennogram (EAG) and single sensillum recording (SSR) signals as measurable endpoints for compound evaluation.
- Scalability: Enables repeated use of individual preparations, supporting longitudinal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Uses the naval orange worm, a key agricultural pest, to model chemosensory-driven behaviors relevant to field efficacy.
- Translational Biomarker Alignment: Links electrophysiological responses to behavioral outcomes such as attraction or repellency.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on functional validation of sensory targets in ecologically relevant contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional validation of olfactory targets prior to compound screening and lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of odorant receptor mechanisms and pathway clarification in insect chemosensation.
- Screening: Delivers standardized, reproducible electrophysiological outputs for screening compound libraries against native sensory systems.
- Analytics: Enables quantitative comparison of dose-response relationships to support lead identification and potency ranking.
- Translational Research: Connects neural activity to behavioral phenotypes, supporting preclinical validation of pest control strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cross-project screening of semiochemicals and behavioral modifiers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into odorant detection, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures assay standardization and preparation longevity, enabling multi-day, multi-condition recording from individual specimens.
- Strategic Value: Improves confidence in target selection, reducing late-stage attrition in agrochemical development.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds based on functional sensory responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microsurgery, and insect handling.
- Dependent on high-impedance amplifiers, analog-digital converters, and stimulus delivery systems.
- Necessitates standardized stimulus preparation and solvent evaporation protocols to avoid confounding variables.
- Adaptation across species requires adjustments in electrode placement and stimulus parameters based on antennal morphology.
- Practical limitations include preparation stability over time and susceptibility to environmental noise during recording.
