Name: Pomiary elektrofizjologiczne z układu węchowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Poznaj metodę rejestracji odpowiedzi węchowych z układu nerwowego ćmy przy użyciu elektrod szklanych wypełnionych solą fizjologiczną. Technika ta umożliwia badanie neuronów receptorowych zapachu w neurofizjologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582, NSF 0918177 oraz Bedoukian Research Incorporation.

1. Owady
<ol>
<li>Kolonia omacnicy migdałowej, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera:Pyralidae) w naszym laboratorium wywodzi się z ciem zebranych z drzew migdałowych w Fresno, CA. Nasza kolonia owadów jest utrzymywana w komorach klimatycznych (Percival Inc, IA) w temperaturze 28 ± 2°C, przy wilgotności względnej 75 ± 10% i w reżimie świetlnym 16:8h (światło:ciemność).</li>
<li>Wylęgające się ćmy są codziennie zbierane, segregowane według płci i przenoszone do plastikowych pudełek (pojemnik na lunch 669 mL, 13 x 13 cm; wysokość 4,5 cm, Rubbermaid) z maksymalnie 10 warstwami nasączonych wodą ręczników papierowych (Thirsty Ultra Absorbent, 27,9 x 27,9 cm; Safeway). Pokrywy pudełek są perforowane, aby umożliwić cyrkulację powietrza. Taka aranżacja zapewnia ~100% RH.</li>
<li>Do pomiarów elektrofizjologicznych wykorzystujemy ćmy w wieku 2-4 dni od wylęgu, utrzymywane w warunkach wysokiej wilgotności.</li>
</ol>
2. Przygotowanie elektrofizjologiczne
<ol>
<li>Ćmy (samce lub samice) są delikatnie wpychane do końcówki pipety (200 μL, USA Scientific Inc), której góra została odcięta, aby uzyskać dużą średnicę otworu (ok. 2 mm). Ćmę delikatnie przepycha się z drugiej strony za pomocą zwilżonego fragmentu chusteczki higienicznej, aż czułki i część głowy wystaną poza końcówkę.</li>
<li>Odsłoniętą głowę unieruchamia się, pokrywając ją nie wysychającą glinką (Claytoon, Van Aken International, CA), pozostawiając odsłoniętą niewielką część jednego oka oraz dwa czułki. Tak przygotowany preparat umieszcza się na platformie mikromanipulatora EAG MP-12 (Syntech, Niemcy) pomiędzy dwoma uchwytami elektrod.</li>
<li>Stosujemy elektrody szklane wykonane z kapilar borokrzemianowych o średnicy 1,0 mm z włóknem (WPI Inc, FL), wyciągane w wyciągaczu do mikropipet Model P-97 (Sutter Instruments, CA), aby uzyskać mikroelektrody o końcówce o średnicy mniejszej niż mikrometr. Elektrody są wypełniane od tyłu roztworem ringera dla limfy sensyli (Kaissling and Thorson 1980). Jedna elektroda zostaje wbita w odsłoniętą część oka pod mikroskopem (Leica MZ75) i służy jako elektroda referencyjna, natomiast elektroda rejestrująca obejmuje dwa czułki. Aby ułatwić kontakt, przed wsunięciem do elektrody rejestrującej odcina się 1-2 dystalne segmenty czułków. W przypadku rejestracji sygnałów z poszczególnych sensyli, nieco modyfikujemy tę konfigurację, w której elektroda rejestrująca jest wbijana pod mikroskopem (Olympus BX51WI; powiększenie 800x). Potencjały czynnościowe rejestruje się poprzez wprowadzenie szklanej elektrody do podstawy sensilla. Sygnały są wzmacniane przez przedwzmacniacz o wysokiej impedancji (Syntech, Niemcy) i przekazywane do UB-IDAC w celu analizy off-line za pomocą oprogramowania AUTOSPIKE (Syntech, Niemcy). Sygnały AC są filtrowane pasmowo w zakresie 100-10 000 Hz, a potencjały czynnościowe są wyodrębniane komputerowo za pomocą algorytmu AUTOSPIKE, który odróżnia ich amplitudy szczyt-do-dołka od szumu. Odpowiedzi poszczególnych neuronów oblicza się jako wzrost (lub spadek) częstotliwości potencjałów czynnościowych (impulsy na sekundę) w stosunku do częstotliwości spontanicznej.</li>
</ol>
3. Bodźce chemiczne i protokół stymulacji
<ol>
<li>Stosuje się odczynniki najwyższej czystości. Główny składnik mieszaniny feromonowej samic omacnicy jesionowej, (Z,Z)-11,13-hexadecadienal, został pozyskany z Bedoukian Research Inc, CT. Odczynniki rozcieńcza się (w/v) w heksanie destylowanym w szkle w celu przygotowania roztworów zapasowych o stężeniu 10 μg/ μL, a następnie wykonuje się rozcieńczenia dziesięciokrotne. Alikwot (10 μL) substancji stymulującej rozpuszczonej w heksanie nanosi się na pasek papieru filtracyjnego Whatman (8x40 mm); rozpuszczalnik odparowuje poprzez delikatne potrząsanie przez 10 s pod wyciągiem, a pasek umieszcza się w strzykawce polipropylenowej o pojemności 5 mL (BD Syringes, NJ), z której wypycha się różne objętości. Jako kontrolę stosuje się sam heksan oraz pustą strzykawkę.</li>
<li>Preparat utrzymuje się w strumieniu nawilżonego powietrza dostarczanego przez kontroler bodźców Syntech (model CS-55; Syntech, Niemcy) z przepływem 20 mL/sec, do którego dodaje się impuls stymulujący o objętości 4 mL/s przez 500 ms. Sygnały rejestruje się przez 10 s, rozpoczynając pomiar 2 s przed wystąpieniem impulsu stymulującego. Preparat antenowy stymuluje się impulsem o czasie trwania 500 ms, podczas którego do głównego przepływu powietrza dodaje się ok. 2 mL oczyszczonego powietrza z polipropylenowej strzykawki 5 mL zawierającej bodziec. Po silnych odpowiedziach zachowuje się przerwę między stymulacjami wynoszącą co najmniej 1 min lub więcej.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Czułki unieruchomionych ciem (Rysunek 1) stymulowane składnikiem feromonu żeńskiego, (Z,Z)-11,13-heksadekadienalem, generują silne odpowiedzi zależne od dawki (Rysunek 2). Ten główny składnik feromonu wywołuje również zależne od dawki odpowiedzi pobudzeniowe w długich sensyllach trichodea (Rysunek 3A), co ukazano na zapisach z rejestracji pojedynczych jednostek (Rysunek 3B).
<img src="/files/ftp_upload/2489/2489fig1.jpg" alt="Obserwacja owada w kontrolowanym środowisku; okaz w przezroczystej probówce; konfiguracja badania z powiększeniem." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Żywa ćma z gatunku navel orangeworm unieruchomiona z wyeksponowaną czułką
<img src="/files/ftp_upload/2489/2489fig2.jpg" alt="Wykres amplitudy EAG pokazujący odpowiedź na heksan w różnych stężeniach (0,1, 1, 10 µg)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Zależne od dawki odpowiedzi EAG wywołane w reakcji na (Z,Z)-11,13-heksadekadienal, główny składnik feromonu samic.
<img src="/files/ftp_upload/2489/2489fig3.jpg" alt="SEM komórek rzęsatych ucha wewnętrznego; dane elektrofizjologiczne; analiza odpowiedzi słuchowej; skala mikrowoltowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Sensilla trichoid u samca ćmy z rodzaju navel orangeworm reagują na (Z,Z)-11,13-heksadekadienal w sposób zależny od dawki. (A) Czułek samca ćmy z rodzaju navel orangeworm jest wieloczłonowy, a każdy człon ozdobiony jest dużą liczbą struktur przypominających włosy – sensilla. Mikrograf elektronowy skaningowy z powiększeniem szczegółów na wstawce (Paski skali wynoszą odpowiednio 200 i 50 μM). (B) Zewnątrzkomórkowe rejestracje pojedynczych jednostek z sensillum trichoid.

<ol><li>Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaissling%2C+K-E+%22Receptors+for+Neurotransmitters.+Hormones+and+Pheromones+in+Insects%22">Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects</a>. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Ta nowatorska metoda opracowana w celu unieruchomienia żywej ćmy z gatunku navel orangeworm w celu pomiaru sygnałów węchowych okazała się wytrzymała i bardzo niezawodna. Rutynowo stosujemy tę metodę do izolacji i identyfikacji nowych atraktantów z naturalnych podłoży gospodarzy, takich jak migdały i pistacje.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>model BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemianowe 1,0 mm z włóknem</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>Wytciągacz mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler bodźców</td><td>Syntech</td><td>model CS-55</td><td></td></tr><tr><td>Przedwzmacniacze wysokiej impedancji (uniwersalna sonda jednostronna)</td><td>Syntech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz / system akwizycji danych (USB-IDAC)</td><td>Syntech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator EAG MP-12</td><td>Syntech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Z,Z)-11,13-heksadekadienal</td><td>Bedoukian Research Inc, CT.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Whatman</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001070</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka polipropylenowa 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309633</td><td></td></tr><tr><td>Koniec do pipety (200 &amp;mu;L)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik lunchbox 669 mL, 13 x 13 cm; wysokość 4,5 cm</td><td>Rubbermaid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręcznik wysokochłonne Thirsty Ultra Absorbent, 27,9 x 27,9 cm</td><td>Safeway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glina nietwardniejąca</td><td>Claytoon, Van Aken International, CA</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>Komora klimatyczna</td><td></td><td>model I-30BLL</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Układy węchowe owadów stwarzają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi wywołanych przez substancje zapachowe w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensilli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na czułku oraz neuronów znajdujących się w poszczególnych sensillach. Podejścia te zostały wykorzystane w celu lepszego zrozumienia komunikacji chemicznej owadów. Zidentyfikowane bodźce mogą następnie służyć jako atraktanty lub repelenty w strategiach zwalczania owadów szkodników.

Układy węchowe owadów zapewniają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensyli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na antenie oraz tych znajdujących się w poszczególnych sensylach.

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Układy węchowe owadów stwarzają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych przez substancje zapachowe w formie elektroantenogramów (EAG) oraz pojedynczych...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zademonstrowanie łatwości rejestrowania odpowiedzi węchowych z układu nerwowego owada. Osiąga się to poprzez unieruchomienie żywej ćmy i podłączenie elektrod do czułka lub pojedynczego neuronu w celu zarejestrowania odpowiedzi indukowanych przez substancje zapachowe. W pierwszym kroku szklaną elektrodę wypełnioną roztworem soli fizjologicznej wprowadza się do oka jako elektrodę uziemiającą, a w drugim kroku do unieruchomionej ćmy wprowadza się szklaną elektrodę wypełnioną roztworem soli fizjologicznej, co umożliwia rejestrację odpowiedzi elektrycznych w formie antenogramu w celu zarejestrowania odpowiedzi pojedynczych jednostek z neuronu receptora węchowego.Elektrodę rejestrującą wprowadza się do podstawy organu zapachowego. Następnie sygnał z anteny jest wzmacniany i przekazywany do przetwornika analogowo-cyfrowego w celu rejestracji i zapisania sygnałów. Uzyskane wyniki wykazują zależne od dawki odpowiedzi indukowane przez odoranty, na podstawie zarejestrowanego sygnału elektrycznego w formie sygnału EAG lub potencjału czynnościowego.Opracowaliśmy nową metodę rejestracji enterogramu z unieruchomionej żywej ćmy z gatunku Naval orange.

electrophysiological-measurements-from-a-moth-olfactory-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu wzrokowego ćmy

Reakcje elektrofizjologiczne neuronów sensorycznych węchu na odoranty u owadów można mierzyć za pomocą rejestracji z pojedynczych sensyli. W tym artykule wideo zademonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację z pojedynczych sensyli w czułkach muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz w palpach szczękowych komara malarycznego (Anopheles gambiae).

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

W tym filmie żywa mucha Drosophila jest zamontowana w tubie do badań elektrofizjologicznych. Elektrody są umieszczone u podstawy czułki, aby rejestrować specyficzne odpowiedzi neuronalne na feromony za pomocą neuronów receptorów węchowych muchy.

Zapisy elektrofizjologiczne z Drosophila sensilla w odpowiedzi na lotne substancje zapachowe

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Ten protokół opisuje zewnątrzkomórkowy zapis odpowiedzi potencjału czynnościowego wyzwalanych przez neurony smaku etykietowego u Drosophila.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila labellar Taste Sensilla

Opisujemy protokół używania anten owadów w postaci elektroantennogramów (EAG) na autonomicznych robotach. Nasza eksperymentalna konstrukcja pozwala na stabilne nagrania w ciągu jednego dnia i rozwiązuje indywidualne plamy zapachowe do 10 Hz. Skuteczność czujników EAG w poszukiwaniu węchu jest wykazywana poprzez kierowanie robota w kierunku źródła zapachu.

Wykorzystanie czujników elektroantennogramu owadów w autonomicznych robotach do wyszukiwania węchowego

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak prezentować substancje zapachowe o niskiej lotności do rejestracji pojedynczej sensyllum z neuronów receptora węchowego Drosophila, które reagują na długołańcuchowe feromony kutykularne.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół dla pojedynczych nagrań sensillum z sensilla basiconica na palpach aparatów gębowych owadów.

Single Sensillum Recordings dla Locust Palp Sensilla Basiconica

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje krok po kroku protokół udanych i nisko stosowanych elektroantennogramów u kilku rodzajów komarów, w tym zarówno u samic, jak i u samców.

Przewodnik krok po kroku po elektroantennografii komarów

Poznaj metodę rejestracji odpowiedzi węchowych z układu nerwowego ćmy przy użyciu elektrod szklanych wypełnionych solą fizjologiczną. Technika ta umożliwia badanie neuronów receptorowych zapachu w neurofizjologii.

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Przeglądaj więcej filmów