Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie długości życia morskich robaków Elgana, które były leczone interesującymi ich lekami. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie OP 50, szczepu bakteryjnego, który służy do karmienia robaków. Następnie generowana jest populacja robaków zsynchronizowana z wiekiem i wysiewana na 96-dołkowych płytkach wraz z żerującymi bakteriami OP 50.

W ciągu następnych dwóch dni robaki rosną do stadium larwalnego L 4 i dodaje się lek FUDR, aby zapobiec rozmnażaniu. Następnego dnia robaki osiągają dorosłość, a interesujące je leki są dodawane do poszczególnych studzienek. Od tego momentu liczba żywych i martwych robaków jest określana co dwa do trzech dni, aż wszystkie robaki umrą.

Obserwacja odbywa się za pomocą odwróconego mikroskopu, a liczba martwych i żywych robaków jest rejestrowana podczas każdej sesji. Cześć, nazywam się Greg Solis. Jestem w Petro Lab w Zakładzie Fizjologii Chemicznej w Instytucie Badawczym Scripps.

Dzisiaj pokażę Ci, jak zsynchronizować robaki i rozprowadzić je na 96 ściennych płytkach do mikromiareczkowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że pozwala na szybką identyfikację cząsteczek, które przedłużają żywotność i elegancję C. Więc zacznijmy.

Aby przygotować bakterie żerujące dla elegancji C, zacznij od dnia minus siódmego od zaszczepienia pięciu mililitrów gruźlicy zawierającej 100 mikrogramów na mililitr i persyny oraz 0,1 mikrograma na mililitr i teryny B z pojedynczą kolonią OP 50 inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce bakteryjnej wcześnie następnego ranka, rozcieńcz nocną kulturę OP 51 w 2000 roku w 300 mililitrach gruźlicy zawierających 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Inkubuj kulturę w wytrząsarce bakteryjnej przez osiem do 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia nasycenia. Nie pozwól, aby kultura rosła dłużej niż 14 godzin.

Przenieś OP 50 do sterylnej, wstępnie zważonej probówki wirówkowej Zagnieźdź OP 50 przez wirowanie przez 10 minut przy 3, 500 obr./min lub 2,200 razy G w wirówce stołowej. Wyrzuć supernatant S, ponownie zawiesij osad OP 50 i rozpocznij naszą wodę i repelat przez odwirowanie. Powtórz to, umyj dwa razy po drugim.

Umyj dokładnie i dokładnie usuń całą pozostałą wodę. Zważyć probówkę wirówkową zawierającą osad i odjąć masę pustej probówki wirówkowej w celu określenia masy osadu. Następnie dokładnie ponownie zamieszać granulat w S Complete do stężenia 100 miligramów na mililitr.

Nie należy pozostawiać żadnych grudek. Stężenie 100 miligramów na mililitr OP 50 powinno odpowiadać dwa razy 10 do 10 bakterii na mililitr. Użyj fotospektrometru, aby określić liczbę bakterii na mililitr, jeśli znana jest zależność między gęstością optyczną a liczbą bakterii na mililitr

W razie potrzeby dostosuj stężenie roztworu do karmienia OP 50 dwa razy od 10 do 10 bakterii na mililitr. Na koniec należy przechowywać roztwór OP 50 w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż zostanie wykorzystany do hodowli robaków w celu wytworzenia populacji robaków synchronicznej pod względem wieku. Rozpocznij późnym popołudniem dnia minus szóstego od 5 do 10-dniowej płytki NGM, na której populacja robaków składa się głównie z wygłodzonych larw L one.

Wysterylizuj metalową szpatułkę, krótko podgrzewając ją nad palnikiem Bunsena. Niech ostygnie. Następnie za pomocą chłodnej szpatułki wytnij kawałki agaru z talerza zawierającego wygłodzone robaki.

Przenieś kilka z tych kawałków na świeżą 10-centymetrową płytkę NGM wysianą OP 50. Wysiaduj robaki przez około 65 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż większość populacji robaków będzie składać się z poważnych dorosłych osobników. Czas potrzebny wygłodzonym zwierzętom L. one wyrośnie na poważne dorosłe osobniki może się różnić w zależności od odmiany.

Po inkubacji zbierz robaki z 10-centymetrowej płytki, zmywając je z płytki pięcioma do 10 mililitrami sterylnej wody. Przenieś roztwór wody ślimakowej do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Umyj robaki, wirując przez dwie minuty w wirówce stołowej przy 1, 200 obr./min lub 280 razy G. Wyrzuć supinat i dodaj 10 mililitrów wody.

Powtórz etap prania, usuń natant SUP i dodaj pięć mililitrów świeżo przygotowanego wybielacza. Roztwór wodorotlenku sodu inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aż robaki pękną. Pamiętaj, aby delikatnie wirować co minutę.

Monitoruj postęp reakcji pod mikroskopem preparacyjnym, gdy tylko wszystkie dorosłe osobniki się rozpuszczą. Dodaj pięć mililitrów buforu M nine, aby zneutralizować reakcję. Umyj jaja trzykrotnie 10 mililitrami buforu M nine, wirując przez dwie minuty przy 2, 500 obr./min lub 1, 100 razy G. Następnie umyj jajka raz 10 mililitrami S, całkowicie wirując przez dwie minuty przy 2, 500 obr./min lub 1, 100 razy G. Usuń snat.

Dodaj 10 mililitrów S complete i przenieś roztwór do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 30 mililitrów S complete do końcowej objętości 40 mililitrów. Delikatnie wstrząsnąć probówką przez noc w temperaturze pokojowej na mutatorze lub podobnym urządzeniu, aby następnego dnia około południa wysiać płytki zwierzęce.

Pod lunetą sekcyjną sprawdź, czy robaki wykluły się w nocy. Określ stężenie robaków w kompletnym roztworze S, licząc liczbę robaków w kroplach o pojemności 10 mikrolitrów. Za pomocą lunety sekcyjnej policz co najmniej 10 kropli na każdą próbkę. Resus.

Zawieś robaki w stężeniu od 80 do 100 robaków na mililitr. W pożywce S complete dodać karbenicylinę do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr i amfoterycynę B do końcowego stężenia 0,1 mikrograma na mililitr. Potrząśnij modyfikatorem.

W przypadku przygotowywania większych ilości robaków należy użyć 600-mililitrowej kolby non clon z nasadką filtrującą O godzinie 14:30 Dodaj OP 50 przygotowany w części pierwszej do końcowego stężenia sześciu miligramów na mililitr. Przywróć OP 50 do czterech stopni Celsjusza. Przenieś 120 mikrolitrów roztworu robaka OP 50 do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem.

Upewnij się, że podczas pipetowania należy zachować ślimaki i zawiesinę, uszczelnić płytkę za pomocą taśmy uszczelniającej, aby uniknąć zanieczyszczenia i parowania. Potrząsać płytką na wytrząsarce do mikromiareczkowania przez dwie minuty i inkubować przez dwa dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż zwierzęta osiągną etap L cztery. Następnie, aby wysterylizować zwierzęta, dodaj 30 mikrolitrów 0,6 milimolowego roztworu podstawowego FUDR do każdej studzienki.

Ten krok zwiększa końcową objętość w każdym studzience do 150 mikrolitrów i zmniejsza końcowe stężenie OP 50 z sześciu miligramów na mililitr do pięciu miligramów na mililitr. Uszczelnij płytkę za pomocą taśm uszczelniających i potrząsaj nią przez dwie do trzech minut na wytrząsarce do płytek mikrotowych. Jeśli OP 50 został dodany o godzinie 2 30 w dniu minus dwa, ważne jest, aby FUDR został dodany przed południem płytek powrotnych do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza do godziny 9:00 następnego dnia.

Większość zwierząt powinna być grobowa i zawierać kilka jaj. Każdy z nich dodaje leki, których wpływ na długość życia ma być badany w pożądanym stężeniu. W przypadku rozpuszczenia leków w DMSO, końcowe stężenia DMSO nie powinny przekraczać 0,6%, ponieważ stężenia DMSO są wyższe niż 0,6%Skróć żywotność Elgana po dodaniu leku.

Uszczelnij płytki taśmą uszczelniającą i potrząsaj nimi przez dwie do trzech minut na płytce do mikromiareczkowania. Wytrząsarka włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza. Dodanie leków może czasami zabić kilka zwierząt na talerzu, zwłaszcza jeśli używa się rozpuszczalnika innego niż woda.

Użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić, czy nie ma martwych zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, na 96 płytek światowych powinno przypadać mniej niż 10 martwych zwierząt Płytki powrotne do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza na dwa dni, aby umożliwić przedostanie się świeżego tlenu do hodowli. Usuń uszczelniacz.

Odczekaj minutę i ponownie zamknij płytkę. Potrząsaj płytką przez dwie do trzech minut na mikrotowniku Ciaśniejszy talerz, powtarzaj raz w tygodniu w piątym dniu dorosłego życia, dodaj pięć mikrolitrów 100 miligramów na mililitr roztworu OP 50, który został przygotowany wcześniej, do każdego z 96 dołków, aby zapobiec głodowi. Robaki są oceniane pod kątem długości życia na podstawie ich ruchu trzy razy w tygodniu od początku eksperymentu aż do śmierci.

Użyj odwróconego mikroskopu z obiektywem z dwoma x lub 2,5x, aby obserwować robaki w 96. Płytki studzienkowe w dniu zerowym na początku eksperymentu. Policz całkowitą liczbę robaków w każdej studzience.

Studzienki czujnikowe, które zawierają więcej niż 18 zwierząt z analizy jako zwierzęta w tych studzienkach, nie będą miały wystarczającej ilości OP 50 i będą wykazywać skutki ograniczeń dietetycznych w każdej sesji liczenia. Zapisz datę i liczbę zwierząt, które poruszają się jako żywe zwierzęta. Ruch i ciecz są znacznie łatwiejsze niż na podłożach stałych i mogą być wywołane przez silne światło.

Użycie większego powiększenia może pomóc dostrzec bardzo subtelne ruchy, takie jak te na końcu gardła. Takie subtelne ruchy są często jedynym ruchem obserwowanym u bardzo starych zwierząt. Włóż płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Powtarzaj sesje liczenia co dwa do trzech dni, aż wszystkie zwierzęta padną. Jest to projekt arkusza Excela do rejestrowania danych dotyczących żywotności dla każdej studni. Jest to współrzędna w szczepie płytki, stężenie leku i całkowita liczba zwierząt żyjących w dniu zero jest rejestrowana na początku eksperymentu.

Zapisuj datę, a także liczbę żywych i martwych zwierząt trzy razy w tygodniu, aby śledzić przetrwanie różnych populacji w każdej studni. Rysunek ten przedstawia wyniki morskiej elegancji, długości życia, krzywych zarejestrowanych w temperaturze 20 stopni Celsjusza i 25 stopni Celsjusza. Test długości życia oparty na mikromiareczkowaniu dokładnie odtwarza zmiany długości życia zależne od temperatury.

Podobnie, jak pokazano tutaj, test mikromiareczkowania na płytce odtwarza zmiany w długości życia mutantów, o których stwierdzono, że mają długość życia różną od dzikich zwierząt typu N dwóch. Rysunek ten pokazuje, jak rosnące dawki mirtazapiny wpływają na średnią długość życia morskiej elegancji. Dane uzyskane za pomocą testu na płytce mikromiareczkowej są wystarczająco ilościowe, aby określić zależności dawka-odpowiedź Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do badania dużych bibliotek chemicznych pod kątem cząsteczek, które wydłużają żywotność i widzą elegancję.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.