Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar długości życia nicieni C. elegans poddanych działaniu badanych leków. Cel ten osiąga się poprzez wstępne przygotowanie szczepu bakteryjnego OP 50, który służy jako pożywka dla nicieni. Następnie generowana jest populacja nicieni zsynchronizowana pod względem wieku, która zostaje naniesiona na płytki 96-dołkowe wraz z bakteriami pokarmowymi OP 50.

W ciągu kolejnych dwóch dni nicienie rozwijają się do czwartego stadium larwalnego (L4), a następnie dodaje się lek FUDR, aby zapobiec rozmnażaniu. Następnego dnia nicienie osiągają wiek dorosły, a do poszczególnych studzienek dodaje się badane leki. Od tego momentu co dwa lub trzy dni określa się liczbę żywych i martwych nicieni, aż do momentu śmierci wszystkich osobników.

Obserwację przeprowadza się za pomocą mikroskopu odwróconego, a w każdej sesji odnotowuje się liczbę martwych i żywych nicieni. Cześć, jestem Greg Solis. Pracuję w laboratorium Petro w Departamencie Fizjologii Chemicznej w Scripps Research Institute.

Dzisiaj pokażę Państwu, jak synchronizować nicienie i rozmieszczać je w 96-dołkowych mikropłytkach. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest umożliwienie szybkiej identyfikacji cząsteczek wydłużających czas życia C. elegans. Zatem zacznijmy.

Aby przygotować bakterie pokarmowe dla C. elegans, należy rozpocząć w dniu minus siedem, szczepiąc 5 mL TB zawierającego 100 µg/mL ampicyliny i 0,1 µg/mL kanamycyny pojedynczą kolonią OP 50; inkubować przez noc w temperaturze 37°C w wytrząsarku do bakterii. Wczesnym rankiem następnego dnia rozcieńczyć nocną kulturę OP 50 w 300 mL TB zawierającego 50 µg/mL ampicyliny. Inkubować kulturę w wytrząsarku do bakterii przez 8 do 12 godzin w temperaturze 37°C, aż do osiągnięcia stanu nasycenia. Nie dopuszczać do wzrostu kultury przez ponad 14 godzin.

Przenieś szczep OP 50 do sterylnej, wcześniej zważonej probówki do wirowania. Odwiruj OP 50 przez 10 minut przy 3 500 RPM lub 2 200 ×g w wirówce stołowej. Odlej supernatant, resuspenduj osad OP 50 w wodzie i ponownie odwiruj. Powtórz tę czynność; po drugim razie przeprowadź dwukrotne przemycie.

Przemyć ostrożnie i dokładnie usunąć całą pozostałą wodę. Zważyć probówkę wirówkową zawierającą osad i odjąć wagę pustej probówki wirówkowej, aby określić masę osadu. Następnie dokładnie resuspender osad w S Complete do stężenia 100 mg/mL.

Nie powinno pozostać żadnych grudek. Stężenie 100 mg/mL OP 50 powinno odpowiadać wartości 2 × 10¹⁰ bakterii/mL. W przypadku znanej zależności między gęstością optyczną a liczbą bakterii na mililitr, należy użyć spektrofotometru w celu określenia liczby bakterii/mL.

W razie potrzeby dostosuj stężenie roztworu pożywkowego OP 50 do wartości 2 × 10¹⁰ bakterii na mililitr. Na koniec przechowuj roztwór OP 50 w temperaturze 4 °C aż do momentu wykorzystania go w hodowli nicieni w celu uzyskania populacji o synchronizowanym wieku. W późne popołudnie w dniu minus sześć rozpocznij pracę z 5-10 dniową płytką NGM, na której populacja nicieni składa się głównie z głodujących larw L1.

Zesterylizuj metalną szpatułkę, krótko podgrzewając ją nad palnikiem Bunsena. Pozostaw ją do ostygnięcia. Następnie za pomocą schłodzonej szpatułki wycinaj kawałki agaru z płytki zawierającej zagłodzone nicienie.

Przenieś kilka z tych fragmentów na nową płytkę NGM o średnicy 10 centymetrów, zasiałą szczepem OP 50. Inkubuj nicienie przez około 65 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż większość populacji nicieni będzie składać się z dorosłych osobników w fazie „grave”. Czas potrzebny na wzrost zagłodzonych zwierząt w stadium L1 do fazy dorosłych osobników „grave” może różnić się w zależności od szczepu.

Po inkubacji zebrać nicienie z płytki o średnicy 10 centymetrów, spłukując je z powierzchni płytki od pięciu do 10 mililitrów sterylnej wody. Przenieść zawiesinę z nicieniami do stożkowatej probówki o pojemności 15 mililitrów. Przemyć nicienie, wirując je przez dwie minuty w wirówce stołowej przy 1 200 RPM lub 280 ×g. Odlać nadsącz i dodać 10 mililitrów wody.

Powtórz etap płukania, usuń nadsącz z SUP i dodaj pięć mililitrów świeżo przygotowanego roztworu wybielacza z wodorotlenkiem sodu. Inkubuj przez pięć minut w RT, aż organizmy pękną. Pamiętaj, aby delikatnie mieszać na wortexie w każdej minucie.

Monitoruj przebieg reakcji pod mikroskopem stereoskopowym niezwłocznie po rozpuszczeniu się wszystkich osobników dorosłych. Dodaj pięć mililitrów buforu M nine w celu neutralizacji reakcji. Przemyj jaja trzykrotnie 10 mililitrami buforu M nine, wirując przez dwie minuty przy 2 500 RPM lub 1 100 ×g. Następnie przemyj jaja raz 10 mililitrami S complete, wirując przez dwie minuty przy 2 500 RPM lub 1 100 ×g. Usuń supernatant.

Dodaj 10 mililitrów pożywki S complete i przenieś roztwór do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 30 mililitrów pożywki S complete do uzyskania końcowej objętości 40 mililitrów. Delikatnie wstrząśnij probówką przez noc w temperaturze pokojowej na mieszalniku lub podobnym urządzeniu, aby przygotować szczepionkę na płytki z zwierzętami na następny dzień około południa.

Pod stereomikroskopem sprawdź, czy nicienie wykluły się w ciągu nocy. Określ stężenie nicieni w roztworze S complete, licząc liczbę osobników w kroplach o objętości 10 µL. Używając stereomikroskopu, przelicz co najmniej 10 kropli dla każdej próbki.Resus.

Resuspendować nicienie w stężeniu od 80 do 100 nicieni na mililitr. Do pełnej pożywki S dodać karbenicylinę do stężenia końcowego 50 µg/mL oraz amfoterycynę B do stężenia końcowego 0,1 µg/mL. Inkubować na wytrząsarce.

W przypadku przygotowywania większych ilości nicieni należy użyć kolby nieklonalnej o pojemności 600 ml z zakrętką z filtrem. O godzinie 14:30 należy dodać szczep OP 50 przygotowany w części pierwszej do końcowego stężenia 6 mg/ml. Przenieść OP 50 do temperatury 4 °C. Przenieść 120 µl roztworu nicieni OP 50 do każdego dołka płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem.

Podczas pipetowania należy upewnić się, że nicienie pozostają w zawiesinie; następnie uszczelnić płytkę za pomocą specjalnej taśmy, aby zapobiec kontaminacji i odparowaniu. Wstrząsać płytkę na wstrząsarce do mikropłytek przez dwie minuty, a następnie inkubować przez dwa dni w temperaturze 20 °C, aż zwierzęta osiągną stadium L4. Następnie, w celu sterylizacji zwierząt, dodać 30 µL 0,6 mM roztworu zapasu FUDR do każdej studzienki.

Ten krok zwiększa końcową objętość w każdej studzience do 150 µL i zmniejsza końcowe stężenie OP 50 z 6 mg/mL do 5 mg/mL. Uszczelnij płytkę za pomocą taśm uszczelniających i wstrząsaj przez dwie do trzech minut na wytrząsarce do mikro płytek. Jeśli OP 50 dodano o 2:30 w dniu minus dwa, ważne jest, aby FUDR dodać przed południem; zwróć płytki do inkubatora w temperaturze 20 °C do godziny 9:00 rano następnego dnia.

Większość zwierząt powinna być dorosła i zawierać kilka jaj. Do każdego dodaj leki, których wpływ na długość życia ma zostać przetestowany, w pożądanym stężeniu. W przypadku rozpuszczania leków w DMSO, końcowe stężenia DMSO nie powinny przekraczać 0,6%, ponieważ stężenia DMSO wyższe niż 0,6% skracają długość życia elgan po dodaniu leku.

Uszczelnij płytki za pomocą uszczelniacza taśmowego i inkubuj je przez dwie do trzech minut na wstrząsarce do płytek mikrotitracyjnych. Przenieś płytki z powrotem do inkubatora ustawionego na 20 °C. Podanie leków może sporadycznie doprowadzić do śmierci kilku osobników na płytkę, szczególnie w przypadku zastosowania rozpuszczalnika innego niż woda.

Użyj mikroskopu odwróconego, aby sprawdzić obecność martwych zwierząt. Zazwyczaj w płytce 96-dołkowej powinno znajdować się mniej niż 10 martwych zwierząt. Wróć płytki do inkubatora w temperaturze 20 °C na dwa dni, aby umożliwić dopływ świeżego tlenu do hodowli. Usuń uszczelniacz.

Odczekać jedną minutę i ponownie zapieczętować płytkę. Wstrząsać płytką przez dwie do trzech minut na mikro-shakerze do płytek; powtarzać tę czynność raz w tygodniu w piątym dniu cyklu życia osobników dorosłych, a następnie dodać 5 µL wcześniej przygotowanego roztworu OP 50 o stężeniu 100 mg/mL do każdej z 96 studzienek, aby zapobiec głodzeniu. Żywotność nicieni ocenia się na podstawie ich ruchu trzy razy w tygodniu, od początku eksperymentu aż do momentu ich śmierci.

Użyj mikroskopu odwróconego z obiektywem 2x lub 2,5x, aby zaobserwować nicienie w płytkach 96-dołkowych w dniu zerowym na początku eksperymentu. Policz całkowitą liczbę nicieni w każdym dołku.

Studnie sensora zawierające więcej niż 18 zwierząt z analizy, ponieważ zwierzęta w tych studniach nie będą miały wystarczającej ilości OP 50 i w każdej sesji liczenia będą wykazywać efekty restrykcji kalorycznej. Zapisz datę i liczbę zwierząt, które poruszają się jako zwierzęta żywe. Ruch w cieczy jest znacznie łatwiejszy niż na podłożach stałych i może być indukowany przez silne światło.

Zastosowanie większego powiększenia może pomóc w dostrzeżeniu bardzo subtelnych ruchów, takich jak te na końcówce gardzieli. Takie subtelne ruchy są często jedynymi obserwowanymi ruchami u bardzo starych zwierząt. Przenieś płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 20 degrees Celsius.

Powtarzać sesje liczenia co dwa do trzech dni, aż wszystkie zwierzęta padną. Poniżej przedstawiono projekt arkusza Excel do rejestracji danych dotyczących długości życia dla każdej studzienki. Zapisuje się w nim współrzędne w płytce, szczep, stężenie leku oraz całkowitą liczbę żywych zwierząt w dniu zerowym, odnotowaną na początku eksperymentu.

Trzy razy w tygodniu zapisuj datę oraz liczbę zwierząt żywych i martwych, aby monitorować przeżywalność poszczególnych populacji w każdej studzience. Ten wykres przedstawia krzywe długości życia dla gatunku sea elegance, zarejestrowane w temperaturach 20 °C i 25 °C. Oparty na mikropłytkach test długości życia precyzyjnie odwzorowuje zależne od temperatury zmiany w długości życia.

Podobnie, jak pokazano tutaj, test na płytkach mikrotitracyjnych odzwierciedla zmiany w długości życia u mutantów, w przypadku których zgłoszono długość życia różniącą się od zwierząt typu dzikiego N dwa. Rysunek ten pokazuje, jak zwiększające się dawki mirtazapiny wpływają na średnią długość życia C. elegans. Dane uzyskane za pomocą testu na płytkach mikrotitracyjnych są wystarczająco ilościowe, aby określić zależności dawka-odpowiedź. Po opanowaniu tej techniki można ją wykorzystać do przesiewania dużych bibliotek chemicznych w poszukiwaniu cząsteczek przedłużających życie C. elegans.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.