Name: Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Poznaj metodę pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych. Protokół umożliwia szybkie badanie związków wpływających na długowieczność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejszy protokół został opracowany pierwotnie w Fred Hutchinson Cancer Research Center w Seattle przez Xiaolan Ye i Michaela Petraschecka w laboratorium Lindy Buck. Powyższa wersja szczegółowa została przygotowana w celu udostępnienia całej procedury szerszej społeczności naukowej. Dziękujemy Carol Taylor, Sarah LeBoeuf i Andy'emu Tomacelli za krytyczną recenzję protokołu. Jest to manuskrypt nr 2866 z The Scripps Research Institute. Laboratorium Petraschecka jest finansowane przez program Novartis ADI.

Przegląd: Protokół jest podzielony na cztery części. Część 1 opisuje sposób przygotowania bakterii paszowych. Część 2 opisuje sposób przygotowania hodowli nicieni. Część 3 opisuje sposób oceny długości życia. Część 4 przedstawia reprezentatywne wyniki, a część 5 opisuje sposób przygotowania wymaganych roztworów. Eksperymenty dotyczące długości życia trwają kilka tygodni. Dla każdego kroku protokołu podano tydzień, dzień i porę dnia, aby ułatwić planowanie. Stadium L4 (Dzień 0) służy jako punkt odniesienia dla całego protokołu.
1. Przygotowanie bakterii karmowych
W tej sekcji opisano przygotowanie bakterii stanowiących pożywkę. Specyficzny szczep E. coli wykorzystywany do karmienia C.elegans nazywa się OP50. Przed przystąpieniem do niniejszego protokołu, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej hodowli nicieni innymi bakteriami, szczep OP50 został uczyniony opornym na karbenycylinę i ampicylinę21. Szczep OP50 należy przygotować od czterech do pięciu dni wcześniej. Wszystkie materiały mające kontakt z OP50 muszą być sterylne.
Dzień -7: Czwartek (tydzień 1): Zaszczepić 5 mL TB zawierającego 100 μg/mL ampicyliny i 0,1 μg/mL amfoterycyny B pojedynczą kolonią OP50 i inkubować przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem.
Dzień -6: piątek (tydzień 1).
Godzina 8:30 rano. Zaszczep kulturę wcześnie, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na osiągnięcie przez nią stanu saturacji
<ol>
<li>Rozcieńczyć kulturę nocną OP50 w stosunku 1:2000 w 300 mL pożywki TB zawierającej 50 μg/mL ampicyliny. Inkubować kulturę w wytrząsarce bakteryjnej przez 8-12 godzin w temperaturze 37°C aż do osiągnięcia stanu nasycenia. Nie dopuszczać do wzrostu kultury powyżej 14 godzin.</li>
<li>Przenieść OP50 do sterylnej, uprzednio zważonej probówki do wirowania. Odwirować OP50 przez 10 min przy 3500 rpm (2200 x g) w wirówce stołowej w celu uzyskania osadu.</li>
<li>Odlać nadsącz i resuspender osad OP50 w sterylnej wodzie, a następnie ponownie odwirować. Powtórzyć ten etap płukania dwukrotnie.</li>
<li>Po drugim płukaniu ostrożnie usunąć całą pozostałą wodę. W probówce nie powinna pozostać żadna woda. Zważyć probówkę do wirowania z osadem i odjąć masę pustej probówki, aby wyznaczyć masę osadu.</li>
<li>Dokładnie resuspender osad w pożywce S-complete do uzyskania stężenia 100 mg/mL. Nie powinny pozostać żadne grudki.</li>
<li>Stężenie 100 mg/mL OP50 powinno odpowiadać 2 x1010 bakterii/mL. Użyć spektrofotometru do wyznaczenia liczby bakterii na mL, jeżeli znana jest zależność między gęstością optyczną a liczbą bakterii na mL. W razie potrzeby dostosować stężenie roztworu karmowego OP50 do poziomu 2 x1010 bakterii/mL.</li>
<li>Przechowywać roztwór OP50 w temperaturze 4°C aż do momentu wykorzystania go do hodowli nicieni.</li>
</ol>

2. Przygotowanie zsynchronizowanej hodowli nicieni
W tej sekcji opisano przygotowanie hodowli nicieni. Jej celem jest uzyskanie populacji nicieni o zsynchronizowanym wieku. Wszystkie materiały mające kontakt z C.elegans po zabiegu wybielaniem w kroku 5 muszą być sterylne. Płytki przechowuje się w temperaturze 20°C, chyba że wskazano inaczej.
Dzień -6: Piątek (tydzień 1), godz. 16:00: Przenieść zwierzęta na nową płytkę
<ol>
<li>Pobierz 5-10 dniową płytkę NGM, na której większość populacji nicieni stanowią zagłodzone larwy L1.</li>
<li>Zesterylizuj metalną szpatułkę, krótko podgrzewając ją nad palnikiem Bunsena. Pozostaw do ostygnięcia. Za pomocą schłodzonej szpatułki wytnij kawałki agaru z płytki zawierającej zagłodzone nicienie. Przenieś kilka takich kawałków na nową płytkę NGM o średnicy 10 cm zaszczepioną szczepem OP50. Inkubuj przez około 65 godzin w temperaturze 20 °C, aż większość populacji nicieni będą stanowiły zapłodnione dorosłe osobniki. Czas potrzebny na wzrost zagłodzonych zwierząt L1 do stadium zapłodnionych osobników dorosłych może różnić się w zależności od szczepu.</li>
</ol>
Dzień -3: Poniedziałek (tydzień 2) godz. 10:00: Utworzenie synchronicznej populacji
<ol start="3">
<li>Zebrać nicienie z płytki 10 cm, spłukując je z powierzchni 5-10 mL sterylnej wody. Przenieść zawiesinę nicieni w wodzie do probówki stożkowej o pojemności 15 mL.</li>
<li>Przemyć nicienie, wirując przez 2 min w wirówce stołowej przy 1200 rpm (280 x g). Odlać nadsącz i dodać 10 mL wody. Powtórzyć czynność.</li>
<li>Usunąć nadsącz i dodać 5 mL świeżo przygotowanego roztworu wybielacza/NaOH (2,5 mL domowego wybielacza, 1 mL 10N NaOH, 6,5 mL H2O). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) do momentu rozpadu organizmów. Pamiętać o delikatnym mieszaniu w wortexie w każdej minucie. Monitorować przebieg reakcji pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
<li>Gdy tylko wszystkie dorosłe osobniki ulegną rozpuszczeniu, dodać 5 mL buforu M9 w celu zneutralizowania reakcji.</li>
<li>Przemyć jaja trzy razy 10 mL buforu M9, wirując przez 2 min przy 2500 rpm (1100 x g).</li>
<li>Przemyć jaja raz 10 mL pożywki S-complete, wirując przez 2 min przy 2500 rpm (1100 x g).</li>
<li>Usunąć nadsącz, dodać 10 mL pożywki S-complete i przenieść roztwór do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Dodać 30 mL pożywki S-complete do uzyskania końcowej objętości 40 mL. Delikatnie wstrząsać probówką przez noc w temperaturze pokojowej na nutatorze lub podobnym urządzeniu.</li>
</ol>
Dzień -2: wtorek (tydzień 2), godz. 12:00: Wysiew zwierząt do płytek
<ol start="10">
<li>Pod mikroskopem stereoskopowym sprawdź, czy nicienie wykluły się w ciągu nocy. Wyznacz stężenie nicieni w roztworze S-complete, licząc liczbę osobników w kroplach o objętości 10 μL przy użyciu mikroskopu stereoskopowego. Policz co najmniej 10 kropli dla każdej próbki.</li>
<li>Resuspenduj nicienie w roztworze S-complete do stężenia 80-100 worms/ mL. Dodaj karbenicylinę (stok 100 mg/ mL) do stężenia końcowego 50 μg/ mL oraz amfoterycynę B (stok 250 μg/ mL) do stężenia końcowego 0,1 μg/ mL. Mieszaj na nutatorze. W przypadku przygotowywania większych ilości nicieni użyj kolby Nunclon o pojemności 600 mL z nakrętką z filtrem.</li>
<li>O godzinie 14:30 dodaj szczep OP50 przygotowany w Części 1 do stężenia końcowego 6 mg/ mL (= 1,2 x109 bacteria/ mL). Przenieś OP50 z powrotem do temperatury 4°C.</li>
<li>Przenieś 120 μL zawiesiny nicieni z OP50 do każdej studzienki płytki 96-dołkowej. Użyj płytek 96-dołkowych z przezroczystym dnem. Podczas pipetowania upewnij się, że nicienie pozostają w zawiesinie.</li>
<li>Uszczelnij płytkę za pomocą taśmy uszczelniającej, aby zapobiec kontaminacji i odparowaniu. Wstrząsaj płytkę na wytrząsarce do płytek mikrotytrujących przez 2 min, a następnie inkubuj przez 2 dni w temperaturze 20°C, aż zwierzęta osiągną stadium L4.</li>
</ol>
Dzień 0: Czwartek (tydzień 2) przed południem: Sterylizacja zwierząt poprzez dodanie fluorodeoksyurydyny (FUDR)
<ol start="15">
<li>Aby wysterylizować zwierzęta, należy dodać 30 μL roztworu zapasowego FUDR o stężeniu 0,6 mM do każdej studni. Ten etap zwiększa końcową objętość w każdej studni do 150 μL i zmniejsza końcowe stężenie OP50 z 6 mg/mL do 5 mg/mL (1x109 bakterii/mL). Uszczelnij płytkę za pomocą taśm uszczelniających i wstrząsaj przez 2-3 min na wstrząsarku do płytek mikrotitracyjnych. Jeśli OP50 dodano o 2:30 w dniu -2, ważne jest, aby FUDR został dodany przed południem. Włóż płytki z powrotem do inkubatora ustawionego na 20°C</li>
</ol>
Dzień 1: Piątek (tydzień 2): Dodanie leków do hodowli
<ol start="16">
<li>Do godziny 9:00 większość zwierząt powinna być ciążna i posiadać po kilka jaj. Dodać leki, których wpływ na długość życia ma zostać przetestowany, w pożądanym stężeniu. W przypadku rozpuszczania leków w DMSO końcowe stężenie DMSO nie powinno przekraczać 0,6%, ponieważ stężenia DMSO wyższe niż 0,6% skracają żywotność C.elegans. Po dodaniu leku uszczelnić płytki taśmą uszczelniającą i potrząsać przez 2-3 min na wytrząsarce do płytek mikrotitracyjnych. Przenieść płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 20°C</li>
<li>Dodawanie leków może sporadycznie doprowadzić do śmierci kilku osobników na płytkę, szczególnie w przypadku stosowania rozpuszczalnika innego niż woda. Użyć mikroskopu odwróconego, aby sprawdzić obecność martwych zwierząt. Zazwyczaj na płytce 96-dołkowej powinno znajdować się mniej niż 10 martwych osobników. Przenieść płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 20°C.</li>
</ol>
Dzień 4: poniedziałek (tydzień 3): Wymiana uszczelniaczy
<ol start="18">
<li>Aby umożliwić dopływ świeżego tlenu do hodowli, należy usunąć uszczelnienie, odczekać 1minute i ponownie uszczelnić płytkę. Płytkę należy inkubować przez 2-3 minuty na wytrząsarce do płytek mikrotitracyjnych. Czynność tę należy powtarzać raz w tygodniu.</li>
</ol>
Dzień 5: wtorek (tydzień 3): Dodaj świeżą hodowlę OP50, aby zapobiec głodowaniu
<ol start="19">
<li>Do każdego z 96 dołków dodaj 5 μL przygotowanego w części 1 roztworu OP50 o stężeniu 100 mg/mL, aby zapobiec głodzeniu.</li>
</ol>
3. Ocena długości życia.
W tej sekcji opisano sposób monitorowania przeżywalności zsynchronizowanej populacji nicieni z części 2 aż do śmierci zwierząt. Do obserwacji zwierząt w płytkach 96-dołkowych należy użyć mikroskopu odwróconego z obiektywem 2x lub 2,5x. Dane dotyczące przeżywalności należy rejestrować trzy razy w tygodniu: w poniedziałki, środy i piątki. Aby określić, czy zwierzęta żyją, czy nie, należy kierować się ich ruchem. Silne światło, zwłaszcza niebieskie, pobudza zwierzęta do ruchu. Martwych zwierząt nie należy usuwać z testu. Okazyjnie zdarza się, że zwierzęta, które nie poruszały się i zostały uznane za martwe podczas poprzedniego liczenia, mogą zacząć się poruszać w późniejszym czasie.
<ol>
<li>W dniu 0, na początku eksperymentu, należy policzyć całkowitą liczbę nicieni w każdej studni. Studnie zawierające więcej niż 18 zwierząt należy wykluczyć z analizy, ponieważ zwierzęta w tych studniach nie będą miały dostępu do wystarczającej ilości OP50 i wykażą efekty restrykcji dietetycznej.</li>
<li>Aby zwiększyć szansę na poruszanie się zwierząt, należy wstrząsać płytką 96-dołkową na wstrząsarce do płytek mikrotitracyjnych przez 2 min przed liczeniem.</li>
<li>Podczas każdej sesji liczenia należy zapisać datę oraz liczbę zwierząt, które się poruszają, uznając je za żywe. Ruch w cieczy jest znacznie łatwiejszy niż na podłożu stałym i może być indukowany silnym światłem. Zastosowanie większego powiększenia może pomóc w dostrzeżeniu bardzo subtelnych ruchów, takich jak ruchy końcówki gardła. Takie subtelne ruchy są często jedynymi obserwowanymi ruchami u bardzo starych zwierząt.</li>
<li>Płytki należy zwrócić do inkubatora ustawionego na 20°C</li>
<li>Kroki 2–4 należy powtarzać co dwa do trzech dni, aż wszystkie zwierzęta padną.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki.

W tej sekcji przedstawiono przykład sposobu prowadzenia dokumentacji danych dotyczących długości życia uzyskanych w tym teście oraz niektóre reprezentatywne wyniki.
Rycina 1A przedstawia przykład sposobu rejestrowania danych dotyczących długości życia podczas tego testu. Arkusz programu Excel służy do monitorowania przeżywalności populacji w każdym dołku. Na początku eksperymentu dla każdego dołka zapisuje się jego współrzędne na płytce, szczep, lek, stężenie leku oraz całkowitą liczbę żywych zwierząt w dniu 0 (X0). Datę oraz liczbę zwierząt żywych i martwych należy rejestrować trzy razy w tygodniu, aby śledzić przeżywalność poszczególnych populacji w każdym dołku. Aby przedstawić wyniki na wykresie, należy obliczyć ułamek zwierząt żywych dla każdego dnia i nanieść go jako funkcję czasu wyrażonego w dniach. Wartości p należy obliczyć przy użyciu pakietów statystycznych, takich jak STATA lub podobnego oprogramowania.
Średnia długość życia C.elegans jest zależna od temperatury. Rycina 1B pokazuje, że zależne od temperatury zmiany długości życia są dokładnie odtwarzane przez test długości życia oparty na mikropłytkach22. Podobnie, test z wykorzystaniem mikropłytek odtwarza zmiany długości życia u mutantów, w przypadku których zgłoszono długość życia różniące się od zwierząt typu dzikiego N223-24 25(Ryc. 1C).
Analizę tę można również wykorzystać do sformułowania bardziej ilościowych wniosków. Na Rys. 1D przedstawiono średnią długość życia w funkcji stężenia mirtazapiny7. Każdy punkt danych reprezentuje średnią długość życia populacji od 7 do 12 osobników, z których każda populacja znajdowała się w oddzielnej studzince. Mimo że liczba zwierząt w jednej studzince jest stosunkowo niewielka (5–15 osobników), zmienność między studzinkami jest relatywnie mała, co widać po słupkach błędów.
 
 <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Analiza długości życia C. elegans z użyciem mirtazapiny; dane eksperymentalne, krzywe przeżywalności, wykres statystyczny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Test długości życia oparty na płytkach mikrotitracyjnych dokładnie odwzorowuje zmiany długości życia raportowane w literaturze. 
(A) Przykładowe dane zebrane w arkuszu kalkulacyjnym Excel. Podczas każdej sesji liczenia zapisywano datę, współrzędne dołka oraz liczbę zwierząt żywych i martwych. Na początku eksperymentu określono całkowitą liczbę zwierząt w każdym dołku. (B) Krzywa przeżywalności zwierząt typu dzikiego (N2) hodowanych w temperaturze 20°C i 25°C. (C) Krzywe przeżywalności szczepów posiadających mutacje wpływające na długość życia. Wszystkie cztery szczepy badano równolegle w temperaturze 20°C. (D) Krzywa zależności dawka-odpowiedź dla zwierząt N2 traktowanych mirtazapiną. Średnia długość życia przedstawiona jako funkcja stężenia mirtazapiny. Słupki błędu oznaczają S.E.M dla 8 dołków na warunek. 

 
5. Materiały.


bufor M9, 1000 mL
<ul>
<li>6 g Na2HPO4</li>
<li>3 g KH2PO4</li>
<li>5 g NaCl</li>
<li>0.25 g MgSO4∙7H2O</li>
<li>Dodać wodę dejonizowaną do objętości 1000 mL</li>
<li>Autoklawować</li>
</ul>
Bufor fosforanowo-potasowy pH 6.0, 1000 mL
<ul>
<li>136 g KH2PO4</li>
<li>Dopełnić dejonizowaną wodą do 900 mL</li>
<li>Dostosować pH do 6,0 za pomocą 5M KOH</li>
<li>Dopełnić dejonizowaną wodą do 1000 mL</li>
<li>Autoklawować</li>
</ul>
Roztwór śladowy metali
<ul>
<li>1,86 g Na2EDTA</li>
<li>0,69 g FeSO4 ∙7H2O</li>
<li>0,20 g MnCl2 ∙ 4H2O</li>
<li>0,29 g ZnSO4 ∙7H2O</li>
<li>0,016 g CuSO4</li>
<li>1000 mL wody dejonizowanej</li>
<li>Sterylizować w autoklawie i przechowywać w ciemności.</li>
</ul>
pożywka S-basal, 1000 mL
<ul>
<li>5,9 g NaCl</li>
<li>50 mL 1M fosforanu potasu, pH 6,0</li>
<li>1000 mL wody dejonizowanej</li>
<li>Autoklaw</li>
<li>Pozostawić roztwór do ostygnięcia, a następnie dodać 1 mL cholesterolu o stężeniu 5mg/mL (rozpuszczonego w Et-OH).</li>
</ul>
Cytrynian potasu 1M, 1000 mL
<ul>
<li>268,8 g cytrynianu potasu</li>
<li>26,3 g kwasu cytrynowego monohydratu</li>
<li>Dodać 900 mL wody dejonizowanej</li>
<li>Dostosować pH do 6,0 za pomocą 5M KOH</li>
<li>Dopełnić wodą dejonizowaną do 1000 mL</li>
<li>Autoklawować</li>
</ul>
pożywka S-complete, 1000 mL
<ul>
<li>977 mL S-basal</li>
<li>10 mL 1M cytrynian potasu pH 6 (sterylny)</li>
<li>10 mL roztwór mikroelementów (sterylny)</li>
<li>3 ml 1M CaCl2 (sterylny)</li>
<li>3 mL 1M MgSO4 (sterylny)</li>
</ul>
Agar NGM
<ul>
<li>3,0g NaCl</li>
<li>2,5g Peptonu (z kazeiny, trawienie trysynowe)</li>
<li>17g Agaru</li>
<li>Dopełnić wodą dejonizowaną do 975 mL i dodać mieszadło magnetyczne</li>
<li>Autoklawować</li>
<li>Po autoklawowaniu schłodzić do 55°C i dodać następujące składniki:
<ul>
<li>0,5 mL 1M CaCl2 (sterylne)</li>
<li>1 mL 5mg/mL cholesterolu w etanolu</li>
<li>1 mL 1M MgSO4 (sterylne)</li>
<li>25 mL buforu fosforanowego potasu, pH 6,0 (sterylne)</li>
</ul></li>
</ul>
TB, 1000 mL
<ul>
<li>12g Bacto Tryptone</li>
<li>24 g ekstraktu drożdżowego</li>
<li>4 mL glicerolu</li>
<li>Dodać 900 mL wody dejonizowanej</li>
<li>Autoklawować</li>
<li>Po autoklawowaniu schłodzić do 55°C i dodać następujący składnik:
<ul>
<li>dodać 100 mL 0,17M KH2PO4/0,72M K2HPO4</li>
</ul></li>
</ul>
0,6 mM fluorodeoksyurydyny (FUDR, sigma kat# F0503), 1000 mL
<ul>
<li>100 mg FUDR</li>
<li>Rozpuścić w 670 mL sterylnego pożywki S-complete, przygotowując aliquoty po 10 mL lub 45 mL.</li>
<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ul>
Carbenycylina 100 mg/mL, 10 mL
<ul>
<li>1 g Karbenicyliny</li>
<li>10 mL sterylnej wody dejonizowanej</li>
<li>Sterylny filtrat i podział na aliquoty</li>
<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
<li>Stosować w stężeniu końcowym 50 μg/ mL</li>
</ul>
250ug/ mL Amfoterycyny B, 4 mL
<ul>
<li>1mg Amfoterycyny B</li>
<li>4 mL Et-OH</li>
<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C</li>
<li>Stosować w stężeniu końcowym 0,1 μg / mL</li>
</ul>

<ol><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li>
<li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li>
<li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li>
<li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li>
<li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li>
<li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li>
<li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li>
<li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li>
<li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li>
<li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li>
<li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK%2C+LKB1%2C+and+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li>
<li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li>
<li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li>
<li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase%2Fcatalase+mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li>
<li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li>
<li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+MPP%2B+model+of+Parkinson%27s+disease+for+high-throughput+drug+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegener+Dis%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li>
<li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony protokół umożliwia pomiar długości życia C.elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych. Jak pokazano w sekcji z reprezentatywnymi wynikami, metoda ta wiarygodnie powiela poprzednie ustalenia i dostarcza informacji ilościowych. Wykorzystując ten test, z sukcesem przebadaliśmy ponad 89 000 cząsteczek pod kątem ich wpływu na długość życia C.elegans.
W celu przesiewania leków pomiar długości życia w formacie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej oferuje kilka zalet w porównaniu z klasycznym testem na podłożach stałych. Pozwala on na zmniejszenie nakładu pracy potrzebnej do przygotowania pożywek, ograniczenie przestrzeni inkubacyjnej oraz zmniejszenie ilości wymaganego leku. Format 96-dołkowy oraz konfiguracja mikroskopowa umożliwiają automatyzację całego testu w celu prowadzenia przesiewów wysokoprzepustowych.
Podczas opracowywania testu sprawdzono wpływ wielu wartości dla każdej zmiennej oraz ich kombinacji na długość życia C.elegans. Testy te obejmowały różne stężenia OP50 w zakresie od 3 do 10 mg/ mL (3, 4, 6, 8, 10 mg/ mL), różną liczbę nicieni na dołek w zakresie od 7 do 45 (7, 10, 15, 22, 45 nicieni/dołek), różne objętości hodowli w zakresie od 40 do 150 μL na dołek (40, 60, 80, 100, 120, 150 μL) oraz zmiany w składzie buforu. W przypadku karmienia szczepem OP50 opornym na karbenicylinę stwierdzono, że ani karbenicylina, ani amfoterycyna B w podanych stężeniach nie wpływają na długość życia C.elegans. Ciągłe, delikatne wstrząsanie płytek, często zalecane w płynnych hodowlach C.elegans, okazało się zbędne przy małych objętościach stosowanych w tym teście. Delikatne wstrząsanie jest jednak wymagane w przypadku zastosowania płytek mikrotitracyjnych z większymi dołkami. Wartości wskazane w niniejszym protokole zostały starannie dobrane na podstawie statystycznego porównania różnych badanych warunków.
Najbardziej zaskakującą cechą tego testu jest prawdopodobnie fakt, że C.elegans można hodować w płytkach 96-dołkowych uszczelnionych taśmą. Porównania bezpośrednie nie wykazały żadnych różnic w długości życia zwierząt hodowanych w płytkach nieszczelnych, w płytkach uszczelnionych plastikowym zamknięciem lub w płytkach uszczelnionych zamknięciami umożliwiającymi wymianę powietrza. W każdym z tych trzech wariantów zwierzęta rozwijały się bardzo jednorodnie od stadium L1 do dorosłych osobników zapłodnowanych w ciągu 65 godzin i wykazywały bardzo zbliżoną długość życia. Zwierzęta hodowane równolegle na NGM rozwijały się nieco szybciej, ale różnica ta była niezależna od braku lub obecności uszczelnienia.
Przedstawiony protokół opiera się na żywych bakteriach, ale może zostać przystosowany do bakterii martwych. Jednak w teście w fazie ciekłej pojedyncza przeżywająca bakteria może szybko się namnożyć i ponownie zasiedlić hodowlę. W naszych doświadczeniach jedynym niezawodnym sposobem na zabicie bakterii w stopniu umożliwiającym ich wykorzystanie w hodowli ciekłej jest przedłużona ekspozycja bakterii na promieniowanie gamma.
Ważnym punktem do rozważenia podczas planowania eksperymentu nad długością życia jest moc detekcji. W zależności od wielkości efektu, działanie badanego leku musi zostać przetestowane w wielu studzienkach. W typowym analizie 4 studzienki z lekiem i 4 studzienki kontrolne, odpowiadające w przybliżeniu 40-50 zwierzętom w każdej, powinny wystarczyć do wykrycia 30% wzrostu długości życia w ponad 95% eksperymentów. Wzrosty rzędu 14% są wykrywane tylko w 60% przypadków i dlatego wymagają większej liczby powtórnych studzienek.
Obfitość danych dotyczących długości życia, uzyskanych dzięki temu testowi, może zostać wykorzystana do opracowania parametrów modeli Gompertza specyficznych dla danego eksperymentu lub szczepu1. Modele Gompertza te są użyteczne do określenia mocy detekcji oraz oszacowania liczby wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych w badaniach przesiewowych na dużą skalę. Zweryfikowaliśmy przewidywania tych modeli w ślepych próbach i wykorzystaliśmy je do oszacowania liczby wyników fałszywie ujemnych w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych (wyniki nieopublikowane).
Podsumowując, przewidujemy, że przedstawiony test okaże się bardzo użyteczny w identyfikacji małych cząsteczek przedłużających długość życia C.elegans oraz w badaniu leżących u ich podstaw mechanizmów.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Znana również jako Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDR jest dezaktywowany przez ciepło, rozmrażać w zimnej wodzie</td></tr><tr><td>Mianseryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Stosować jako kontrolę pozytywną w końcowym stężeniu 50&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Cyproheptadyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Alternatywna kontrola pozytywna w końcowym stężeniu 10 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>Poliestrowa, niesterylna</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>Nietraktowana, przezroczysta, sterylna w opakowaniu jednostkowym, polistyrenowa</td></tr><tr><td>Kolba Nunclon</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>Stosowana do dużych objętości</td></tr></tbody></table>

pomiar długości życia caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Długość życia jest procesem biologicznym regulowanym przez kilka szlaków genetycznych. Jedną ze strategii badania biologii starzenia się jest analiza zwierząt posiadających mutacje w komponentach szlaków regulujących wiek. Jeśli mutacje te zaburzają funkcję szlaku regulującego wiek, a w konsekwencji zmieniają długość życia całego organizmu, dostarczają one istotnych informacji o mechanizmach tych procesów1-3.
Inną strategią badania regulacji długości życia jest wykorzystanie małych cząsteczek do zaburzania szlaków regulujących starzenie. Do tej pory zidentyfikowano szereg cząsteczek, które wydłużają życie w różnych organizmach modelowych i są wykorzystywane jako narzędzia do badania biologii starzenia4-16. Liczba dotychczas zidentyfikowanych cząsteczek jest niewielka w porównaniu z genetycznym „zestawem narzędzi” dostępnym do badania biologii starzenia.
Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych modeli wykorzystywanych do badania starzenia się ze względu na doskonałe właściwości genetyczne oraz krótki, trwający trzy tygodnie cykl życia. W ostatnim czasie C. elegans stał się organizmem modelowym w badaniach przesiewowych leków opartych na fenotypie5,7,16-20 dzięki niewielkim rozmiarom oraz możliwości hodowli na płytkach mikrotitracyjnych.
Przedstawiamy tutaj metodę pomiaru długości życia C.elegans na 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych. Metoda ta została opracowana i z sukcesem zastosowana do przesiewania dużych bibliotek w celu znalezienia cząsteczek wydłużających życie C.elegans7. Niezawodność testu oceniono w kilku próbach: po pierwsze, mierząc długość życia zwierząt typu dzikiego hodowanych w różnych temperaturach; po drugie, mierząc długość życia mutantów o zmienionej długości życia; po trzecie, mierząc zmiany w długości życia w odpowiedzi na różne stężenia leku przeciwdepresyjnego mirtazapiny. Wcześniej wykazano, że mirtazapina wydłuża życie C.elegans7. Wyniki tych testów pokazują, że metoda ta pozwala na replikację wcześniejszych odkryć z innych analiz i ma charakter ilościowy. Format mikrotitracyjny sprawia również, że ten test długości życia jest kompatybilny z zautomatyzowanymi systemami do dozowania cieczy i umożliwia integrację z platformami automatycznymi.

W niniejszym protokole przedstawiamy metodę pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych

Długość życia jest procesem biologicznym regulowanym przez kilka szlaków genetycznych. Jedną ze strategii badania biologii starzenia się jest analiza zwierząt, u których występuje ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar długości życia nicieni C. elegans poddanych działaniu badanych leków. Cel ten osiąga się poprzez wstępne przygotowanie szczepu bakteryjnego OP 50, który służy jako pożywka dla nicieni. Następnie generowana jest populacja nicieni zsynchronizowana pod względem wieku, która zostaje naniesiona na płytki 96-dołkowe wraz z bakteriami pokarmowymi OP 50.W ciągu kolejnych dwóch dni nicienie rozwijają się do czwartego stadium larwalnego (L4), a następnie dodaje się lek FUDR, aby zapobiec rozmnażaniu. Następnego dnia nicienie osiągają wiek dorosły, a do poszczególnych studzienek dodaje się badane leki. Od tego momentu co dwa lub trzy dni określa się liczbę żywych i martwych nicieni, aż do momentu śmierci wszystkich osobników.Obserwację przeprowadza się za pomocą mikroskopu odwróconego, a w każdej sesji odnotowuje się liczbę martwych i żywych nicieni. Cześć, jestem Greg Solis. Pracuję w laboratorium Petro w Departamencie Fizjologii Chemicznej w Scripps Research Institute.Dzisiaj pokażę Państwu, jak synchronizować nicienie i rozmieszczać je w 96-dołkowych mikropłytkach. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest umożliwienie szybkiej identyfikacji cząsteczek wydłużających czas życia C. elegans. Zatem zacznijmy.Aby przygotować bakterie pokarmowe dla C. elegans, należy rozpocząć w dniu minus siedem, szczepiąc 5 mL TB zawierającego 100 µg/mL ampicyliny i 0,1 µg/mL kanamycyny pojedynczą kolonią OP 50; inkubować przez noc w temperaturze 37°C w wytrząsarku do bakterii. Wczesnym rankiem następnego dnia rozcieńczyć nocną kulturę OP 50 w 300 mL TB zawierającego 50 µg/mL ampicyliny. Inkubować kulturę w wytrząsarku do bakterii przez 8 do 12 godzin w temperaturze 37°C, aż do osiągnięcia stanu nasycenia. Nie dopuszczać do wzrostu kultury przez ponad 14 godzin.Przenieś szczep OP 50 do sterylnej, wcześniej zważonej probówki do wirowania. Odwiruj OP 50 przez 10 minut przy 3 500 RPM lub 2 200 ×g w wirówce stołowej. Odlej supernatant, resuspenduj osad OP 50 w wodzie i ponownie odwiruj. Powtórz tę czynność; po drugim razie przeprowadź dwukrotne przemycie.Przemyć ostrożnie i dokładnie usunąć całą pozostałą wodę. Zważyć probówkę wirówkową zawierającą osad i odjąć wagę pustej probówki wirówkowej, aby określić masę osadu. Następnie dokładnie resuspender osad w S Complete do stężenia 100 mg/mL.Nie powinno pozostać żadnych grudek. Stężenie 100 mg/mL OP 50 powinno odpowiadać wartości 2 × 10¹⁰ bakterii/mL. W przypadku znanej zależności między gęstością optyczną a liczbą bakterii na mililitr, należy użyć spektrofotometru w celu określenia liczby bakterii/mL.W razie potrzeby dostosuj stężenie roztworu pożywkowego OP 50 do wartości 2 × 10¹⁰ bakterii na mililitr. Na koniec przechowuj roztwór OP 50 w temperaturze 4 °C aż do momentu wykorzystania go w hodowli nicieni w celu uzyskania populacji o synchronizowanym wieku. W późne popołudnie w dniu minus sześć rozpocznij pracę z 5-10 dniową płytką NGM, na której populacja nicieni składa się głównie z głodujących larw L1.Zesterylizuj metalną szpatułkę, krótko podgrzewając ją nad palnikiem Bunsena. Pozostaw ją do ostygnięcia. Następnie za pomocą schłodzonej szpatułki wycinaj kawałki agaru z płytki zawierającej zagłodzone nicienie.Przenieś kilka z tych fragmentów na nową płytkę NGM o średnicy 10 centymetrów, zasiałą szczepem OP 50. Inkubuj nicienie przez około 65 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż większość populacji nicieni będzie składać się z dorosłych osobników w fazie „grave”. Czas potrzebny na wzrost zagłodzonych zwierząt w stadium L1 do fazy dorosłych osobników „grave” może różnić się w zależności od szczepu.Po inkubacji zebrać nicienie z płytki o średnicy 10 centymetrów, spłukując je z powierzchni płytki od pięciu do 10 mililitrów sterylnej wody. Przenieść zawiesinę z nicieniami do stożkowatej probówki o pojemności 15 mililitrów. Przemyć nicienie, wirując je przez dwie minuty w wirówce stołowej przy 1 200 RPM lub 280 ×g. Odlać nadsącz i dodać 10 mililitrów wody.Powtórz etap płukania, usuń nadsącz z SUP i dodaj pięć mililitrów świeżo przygotowanego roztworu wybielacza z wodorotlenkiem sodu. Inkubuj przez pięć minut w RT, aż organizmy pękną. Pamiętaj, aby delikatnie mieszać na wortexie w każdej minucie.Monitoruj przebieg reakcji pod mikroskopem stereoskopowym niezwłocznie po rozpuszczeniu się wszystkich osobników dorosłych. Dodaj pięć mililitrów buforu M nine w celu neutralizacji reakcji. Przemyj jaja trzykrotnie 10 mililitrami buforu M nine, wirując przez dwie minuty przy 2 500 RPM lub 1 100 ×g. Następnie przemyj jaja raz 10 mililitrami S complete, wirując przez dwie minuty przy 2 500 RPM lub 1 100 ×g. Usuń supernatant.Dodaj 10 mililitrów pożywki S complete i przenieś roztwór do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 30 mililitrów pożywki S complete do uzyskania końcowej objętości 40 mililitrów. Delikatnie wstrząśnij probówką przez noc w temperaturze pokojowej na mieszalniku lub podobnym urządzeniu, aby przygotować szczepionkę na płytki z zwierzętami na następny dzień około południa.Pod stereomikroskopem sprawdź, czy nicienie wykluły się w ciągu nocy. Określ stężenie nicieni w roztworze S complete, licząc liczbę osobników w kroplach o objętości 10 µL. Używając stereomikroskopu, przelicz co najmniej 10 kropli dla każdej próbki.Resus.Resuspendować nicienie w stężeniu od 80 do 100 nicieni na mililitr. Do pełnej pożywki S dodać karbenicylinę do stężenia końcowego 50 µg/mL oraz amfoterycynę B do stężenia końcowego 0,1 µg/mL. Inkubować na wytrząsarce.W przypadku przygotowywania większych ilości nicieni należy użyć kolby nieklonalnej o pojemności 600 ml z zakrętką z filtrem. O godzinie 14:30 należy dodać szczep OP 50 przygotowany w części pierwszej do końcowego stężenia 6 mg/ml. Przenieść OP 50 do temperatury 4 °C. Przenieść 120 µl roztworu nicieni OP 50 do każdego dołka płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem.Podczas pipetowania należy upewnić się, że nicienie pozostają w zawiesinie; następnie uszczelnić płytkę za pomocą specjalnej taśmy, aby zapobiec kontaminacji i odparowaniu. Wstrząsać płytkę na wstrząsarce do mikropłytek przez dwie minuty, a następnie inkubować przez dwa dni w temperaturze 20 °C, aż zwierzęta osiągną stadium L4. Następnie, w celu sterylizacji zwierząt, dodać 30 µL 0,6 mM roztworu zapasu FUDR do każdej studzienki.Ten krok zwiększa końcową objętość w każdej studzience do 150 µL i zmniejsza końcowe stężenie OP 50 z 6 mg/mL do 5 mg/mL. Uszczelnij płytkę za pomocą taśm uszczelniających i wstrząsaj przez dwie do trzech minut na wytrząsarce do mikro płytek. Jeśli OP 50 dodano o 2:30 w dniu minus dwa, ważne jest, aby FUDR dodać przed południem; zwróć płytki do inkubatora w temperaturze 20 °C do godziny 9:00 rano następnego dnia.Większość zwierząt powinna być dorosła i zawierać kilka jaj. Do każdego dodaj leki, których wpływ na długość życia ma zostać przetestowany, w pożądanym stężeniu. W przypadku rozpuszczania leków w DMSO, końcowe stężenia DMSO nie powinny przekraczać 0,6%, ponieważ stężenia DMSO wyższe niż 0,6% skracają długość życia elgan po dodaniu leku.Uszczelnij płytki za pomocą uszczelniacza taśmowego i inkubuj je przez dwie do trzech minut na wstrząsarce do płytek mikrotitracyjnych. Przenieś płytki z powrotem do inkubatora ustawionego na 20 °C. Podanie leków może sporadycznie doprowadzić do śmierci kilku osobników na płytkę, szczególnie w przypadku zastosowania rozpuszczalnika innego niż woda.Użyj mikroskopu odwróconego, aby sprawdzić obecność martwych zwierząt. Zazwyczaj w płytce 96-dołkowej powinno znajdować się mniej niż 10 martwych zwierząt. Wróć płytki do inkubatora w temperaturze 20 °C na dwa dni, aby umożliwić dopływ świeżego tlenu do hodowli. Usuń uszczelniacz.Odczekać jedną minutę i ponownie zapieczętować płytkę. Wstrząsać płytką przez dwie do trzech minut na mikro-shakerze do płytek; powtarzać tę czynność raz w tygodniu w piątym dniu cyklu życia osobników dorosłych, a następnie dodać 5 µL wcześniej przygotowanego roztworu OP 50 o stężeniu 100 mg/mL do każdej z 96 studzienek, aby zapobiec głodzeniu. Żywotność nicieni ocenia się na podstawie ich ruchu trzy razy w tygodniu, od początku eksperymentu aż do momentu ich śmierci.Użyj mikroskopu odwróconego z obiektywem 2x lub 2,5x, aby zaobserwować nicienie w płytkach 96-dołkowych w dniu zerowym na początku eksperymentu. Policz całkowitą liczbę nicieni w każdym dołku.Studnie sensora zawierające więcej niż 18 zwierząt z analizy, ponieważ zwierzęta w tych studniach nie będą miały wystarczającej ilości OP 50 i w każdej sesji liczenia będą wykazywać efekty restrykcji kalorycznej. Zapisz datę i liczbę zwierząt, które poruszają się jako zwierzęta żywe. Ruch w cieczy jest znacznie łatwiejszy niż na podłożach stałych i może być indukowany przez silne światło.Zastosowanie większego powiększenia może pomóc w dostrzeżeniu bardzo subtelnych ruchów, takich jak te na końcówce gardzieli. Takie subtelne ruchy są często jedynymi obserwowanymi ruchami u bardzo starych zwierząt. Przenieś płytki z powrotem do inkubatora o temperaturze 20 degrees Celsius.Powtarzać sesje liczenia co dwa do trzech dni, aż wszystkie zwierzęta padną. Poniżej przedstawiono projekt arkusza Excel do rejestracji danych dotyczących długości życia dla każdej studzienki. Zapisuje się w nim współrzędne w płytce, szczep, stężenie leku oraz całkowitą liczbę żywych zwierząt w dniu zerowym, odnotowaną na początku eksperymentu.Trzy razy w tygodniu zapisuj datę oraz liczbę zwierząt żywych i martwych, aby monitorować przeżywalność poszczególnych populacji w każdej studzience. Ten wykres przedstawia krzywe długości życia dla gatunku sea elegance, zarejestrowane w temperaturach 20 °C i 25 °C. Oparty na mikropłytkach test długości życia precyzyjnie odwzorowuje zależne od temperatury zmiany w długości życia.Podobnie, jak pokazano tutaj, test na płytkach mikrotitracyjnych odzwierciedla zmiany w długości życia u mutantów, w przypadku których zgłoszono długość życia różniącą się od zwierząt typu dzikiego N dwa. Rysunek ten pokazuje, jak zwiększające się dawki mirtazapiny wpływają na średnią długość życia C. elegans. Dane uzyskane za pomocą testu na płytkach mikrotitracyjnych są wystarczająco ilościowe, aby określić zależności dawka-odpowiedź. Po opanowaniu tej techniki można ją wykorzystać do przesiewania dużych bibliotek chemicznych w poszukiwaniu cząsteczek przedłużających życie C. elegans.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar Caenorhabditis elegans Określanie długości życia na 96-dołkowych płytkach mikrotytrowymych

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

Ten film opisuje tradycyjną, opartą na płytkach metodę pomiaru długości życia C. elegans. Przykładowy protokół mierzy długość życia robaków poddanych działaniu RNAi.

Analiza długości życia: pomiar długowieczności C. elegans

C. elegans jest atrakcyjnym organizmem modelowym do badania szlaków transdukcji sygnałów zaangażowanych w odporność na stres oksydacyjny. Tutaj przedstawiamy protokół pomiaru odporności zwierząt C. elegans na stres oksydacyjny w fazie ciekłej, przy użyciu kilku środków utleniających w 96-dołkowych płytkach.

Pomiar odporności Caenorhabditis elegans na stres oksydacyjny w 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Opisany jest podstawowy protokół oceny toksyczności substancji chemicznych u zwierzęcia modelowego, Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest wygodna i przydatna przy opracowywaniu farmaceutyków, a także przy ocenie ryzyka związanego z różnymi zanieczyszczeniami środowiska.

Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy metodę Replica Set, podejście do ilościowego pomiaru długości życia/przeżycia i zdrowia C. elegans w sposób wysoce wydajny i solidny, umożliwiając w ten sposób badanie wielu schorzeń bez poświęcania jakości danych. Protokół ten szczegółowo opisuje strategię i udostępnia narzędzie programowe do analizy danych zestawu replik.

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Poznaj metodę pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych. Protokół umożliwia szybkie badanie związków wpływających na długowieczność.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych

Przeglądaj więcej filmów