Obciążanie zakończeń nerwowych Drosophila wskaźnikami wapnia

Witam, nazywam się Greg McLeod. W moim laboratorium badamy regulację poziomu wapnia w zakończeniach nerwowych oraz jej wpływ na neurotransmisję. Badania te prowadzimy na *Oph Melanogaster*.

Muszka owocowa jest atrakcyjnym modelem dla neuronaukowców ze względu na swoją plastyczność genetyczną oraz prosty i dostępny układ nerwowy. W tym układzie nerwowym dostępne są genetycznie kodowane fluorescencyjne wskaźniki wapnia, które pozwalają na wykrywanie zmian stężenia wapnia w zakończeniach nerwowych. Wskaźniki te charakteryzują się jednak ograniczoną czułością na wapń i często wykazują nieliniową odpowiedź.

Wskaźniki syntetyczne są lepiej dostosowane do pomiaru szybkich zmian poziomu wapnia związanych z aktywnością nerwów. Zaprezentujemy technikę wprowadzania do żywych zakończeń nerwowych w larwach oph syntetycznych wskaźników wapnia sprzężonych z dekstryną. Sprzężenie z dekstryną pomaga zapobiec sekwestracji wskaźników wapnia w organellach, takich jak mitochondria.

Technikę wprowadzania próbki można zastosować w takim samym stopniu do larw, embrionów, jak i osobników dorosłych. Larwę poddamy sekcji w małej kąpieli cygarowej na szkiełku przedmiotowym. Niebieski wosk dentystyczny będzie służył do stabilizacji szklanego kapilary do wprowadzania próbki.

Pobrać trzecią larwę wędrowną z boku niezatłoczonej fiolki. Umieścić larwę w kilku kroplach schłodzonego roztworu Schneidera i przypiąć ją przez głowę oraz ogon wzdłuż linii środkowej grzbietu. Użyć ostrych mikronozycerzy, aby wykonać nacięcie.

Wykonaj niewielkie nacięcie pomiędzy tra tutaj, wystarczająco duże, aby dolne ostrze nożyczek mogło wniknąć do środka. Przetnij kutykulę wzdłuż linii środkowej grzbietu pomiędzy traia aż do głowy. Obróć larwę o 180 stopni i przedłuż nacięcie aż do ogona.

Ważne jest, aby dolne ostrze nie zagłębiło się zbyt mocno w trzewia larwy, ponieważ uszkodziłoby to mięśnie i nerwy, które chcemy zbadać. Większość trzewi zostanie wypchnięta przez nacięcie; należy przeciąć tkankę tutaj, blisko odwłoka, a następnie przeciąć leżącą pod nią tchawiczkę aż do głowy. Powtórz tę czynność po drugiej stronie.

Usuń większość trzewi, wycinając je i wyjmując z kąpieli. Odłóż nożyczki i weź drugą pęsetę. Chwyć wycięty brzeg kutykuli i przypnij go do jednej strony.

Powtórz czynność po drugiej stronie. Przesuń się o cztery segmenty w stronę głowy, aby powtórzyć procedurę. Usuń wszelkie pozostałe wnętrzności na tym etapie. Upewnij się, że mięśnie 7, 6, 13 lub 12 nie zostały uszkodzone w żadnym z segmentów.

Jeśli którykolwiek z nich został uszkodzony, należy przeprowadzić sekcję innej larwy, ponieważ uszkodzenie to nieuchronnie prowadzi do skurczów genicznych, co utrudni późniejsze obrazowanie. W kolejnych krokach widoczne będą półkule mózgu, zwoje brzuszne i nerwy segmentalne. Koniec nacięcia ciśnieniowego w nerwie segmentalnym zostanie wciągnięty do szklanego łoża FOP, a za pomocą plastikowego filamentu wypełniającego zostanie naniesiony wskaźnik wapnia na odsłonięty koniec nerwu.

Najpierw zademonstrujemy sposób przygotowania włókna wypełniającego oraz efekt wypełniania, aby uzyskać wspomniane włókno. Zastosowana zostanie dwustopniowa technika wyciągania w stosunku do żółtego wadliwego elementu, który będzie powoli podgrzewany w połowie swojej długości, aż tworzywo stanie się miękkie i przezroczyste. W tym momencie należy przerwać podgrzewanie i natychmiast pociągnąć końcówkę do góry, aby wyciągnąć ją w cienką nić.

Ma on około pół milimetra średnicy. Odetnij włókno o długości 50 milimetrów. Następnie umieść włókno pod mikroskopem sekcyjnym i zakotwicz odcięty koniec.

Przechwyć jeden koniec kciukiem i pociągnij za drugi koniec, aby wyciągnąć cienki filament o długości 1 cm. Należy go odciąć nowym ostrzem żyletki na papierze bibułkowym, aby uniknąć zmiażdżenia i zapewnić ostre cięcie w celu przygotowania wypełnienia. Rozpocznij od kapilary o cienkich ściankach, nie zawierającej filamentu.

Wyciągnij go do postaci cienkiego, stożkowatego ostrza za pomocą wyciągacza do rurek (pet puller). Przenieś tak przygotowany element pod mikroskop stereoskopowy i nacinaj zwężoną część kawałkiem papieru ściernego. Pchnij końcówkę dystalnie względem nacięcia, oddalając ją od strony nacięcia, tak aby końcówka odłamała się prosto.

Średnica wewnętrzna zwężki powinna być większa niż średnica zewnętrzna. Na końcu włókna wypełniającego należy użyć mikropalnika, aby termokurczliwie wprowadzić zwężkę do szkła, aż osiągnie ona średnicę wewnętrzną wynoszącą około 12 micronów. Do wypolerowania tępego końca zwężki należy użyć palnika Bunsena.

Podciśnienie można przyłożyć do tępego końca efektu, używając ściśle dopasowanej rurki typu Celtic połączonej ze sztywną rurką z polietylenu i strzykawką. Tę samą rurkę i strzykawkę należy wykorzystać do pobierania i usuwania wskaźnika wapnia z filamentu. Wskaźnik wapnia powinien zostać rozpuszczony w wodzie destylowanej do stężenia pięciu mili.

Podziel ten roztwór na aliquoty o objętości 5 µL. Przechowuj je w temperaturze 4 °C. Nie zamrażaj tych aliquotów, aby pozostały w stanie niezamarzniętym do momentu użycia.

Teraz nabierz od jednego do dwóch centymetrów wskaźnika wapnia do filamentu; w ten sposób jesteś gotowy do przejścia do najbardziej krytycznego etapu tej techniki ładowania. Za pomocą nożyczek i pęsety przetnij pojedynczo nerwy najbardziej przedniego segmentu, blisko zwojów brzusznych. Najbardziej przednia masa nerwowa segmentu z brzusznego otworu.

Odetnij wszelkie zanieczyszczenia. Umieść filament wypełniający na rampie z wosku dentystycznego, kierując końcówkę w środek larwy. Podłącz rurkę scholastic oraz strzykawkę.

Pobierz niewielką ilość roztworu Schneidera do końcówki typu perfect. Następnie umieść koniec nerwu w końcówce. Dopasowanie powinno być ciasne, ale nie zbyt mocne.

Należy zablokować dalszy dostęp Schneiders do preparatu. Zazwyczaj należy usunąć rurkę scholastyczną oraz strzykawkę i podłączyć je do filamentu F. Dotknij boku filamentu do Schneiders w kąpieli, aby rozładować ładunki elektrostatyczne, a następnie niezwłocznie wprowadź efekt gumowy filamentu w odległości 50 mikronów od przecięcia nerwu, nie dotykając go bezpośrednio.

Powoli wstrzyknij wskaźnik wapnia, aby zwiększyć objętość roztworu Schneidera o około jedną trzecią. Ostateczne stężenie wskaźnika wapnia wyniesie nieco poniżej 2 mM. Przechowuj preparat w ciemnym, wilgotnym miejscu w temperaturze pokojowej przez około 40 minut. Chciałbym podkreślić tutaj dwa ważne punkty.

Najpierw w końcówce musi znajdować się roztwór fizjologiczny w celu rozcieńczenia wskaźnika wapnia, ponieważ wskaźnik wapnia został rozpuszczony w samej wodzie. Roztwór fizjologiczny musi zawierać wapń w stężeniu kilku milimoli, ponieważ uszczelnianie aksonów jest procesem zależnym od wapnia, a uszczelnianie aksonów jest niezbędne do zachowania zdrowia zakończeń nerwowych.

Drugą kwestią jest to, że od momentu przecięcia nerwów do nałożenia barwnika na przecięty koniec nerwu nie powinno upłynąć więcej niż pięć minut. Po pięciu minutach końce aksonów będą wykluczać koniugowane z dekstryną wskaźniki wapnia o masie cząsteczkowej 10 000. Dotrzymanie tego limitu czasowego będzie wymagało pewnej wprawy.

Nie należy próbować opóźniać wzrostu aksonów poprzez obniżanie poziomu wapnia, ponieważ może to upośledzić przyszłą funkcję fizjologiczną uszkodzonego nerwu. Po 40-minutowej inkubacji preparatu w pożywce Schneidersa, należy dotknąć końcem włókna wypełniającego powierzchni kąpieli i ponownie je wprowadzić, aby usunąć większość roztworu wskaźnika wapnia z końcówki oraz z wnętrza. Następnie, używając włókna, należy pobrać z kąpieli świeżą pożywkę Schneidersa i całkowicie wypełnić nią łoże.

W złożu nie może być pęcherzyków powietrza, ponieważ roztwór Schneidera będzie pełnił funkcję jednego z przewodników izolujących od kąpieli, podczas gdy szklana pipeta stymuluje nerw; ponownie umieść preparat w ciemnym miejscu na co najmniej 60 minut, ale nie dłużej niż cztery godziny, płucząc go w świeżym roztworze Schneidera co 30 minut podczas inkubacji, aby wskaźnik wapnia został przetransportowany w dół. Akson koncentruje się w zakończeniu nerwowym na 20 minut przed planowanym badaniem preparatu. Przepłucz go roztworem HL6.

Zachowaj pożądany poziom wapnia, gdy poziom ten przekracza około 0,4 millimolar; dodaj glutaminian lub kwas L-glutaminowy do roztworu HL6 w stężeniu 7 millimolar, aby zatrzymać pobudzenie nerwowo-mięśniowe. Roztwór Schneidera nie nadaje się do obrazowania wapnia, ponieważ zawiera już wysokie stężenia zarówno glutaminianu, jak i wapnia. Poziomy te będą wymagały dostosowania.

Tate jest również obecny, co sprawia, że autofluorescencyjne ładowanie oraz obrazowanie według metody Schneidera mogą być przeprowadzone w HL 6, pod warunkiem że podczas ładowania stężenie wapnia wynosi co najmniej 2 milionów. Podczas ustawiania preparatu na mikroskopie złożonym do obrazowania, należy ponownie upewnić się, że wszelkie ładunki elektrostatyczne zostały rozładowane. Następnie za pomocą pęsety należy dotknąć zarówno roztworu w kąpieli, jak i obiektywu.

Jeśli używany jest obiektyw imersyjny, należy go obniżyć do kąpieli, a następnie na moment uziemić podstawę w sposób stymulujący, lub umieścić jeden w kąpieli i wsunąć drugi w dół, wypełniając obszar; impulsy DC o napięciu poniżej 3 V i czasie trwania 300 µs niezawodnie wywołają potencjał czynnościowy w nerwie. Tutaj widzimy dwa zestawy zakończeń nerwowych w szczelinie między mięśniami sześć i siedem, które stały się widoczne dzięki wymuszeniu ekspresji cytosolowej GFP. Zostały one również wypełnione w kierunku antegradnym wskaźnikiem wapnia Rod Dextrin, który posiada inne widma wzbudzenia i emisji niż GFP.

To pole widzenia nadal zawiera zakończenia nerwowe, jednak Rod Rin wykazuje niskie powinowactwo do wapnia i jest niemal niewidoczny, gdy nerw jest w stanie spoczynku. Jest on jednak bardzo wrażliwy na wapń, który dostaje się do zakończeń podczas pojedynczych potencjałów czynnościowych lub krótkich, dwusekundowych serii bodźców. Jak pokazano tutaj w analizie fluorescencji dla zaprezentowanych wcześniej, gęsto rozmieszczonych serii o częstotliwości 80 hertz, odpowiedzi w zakończeniach typu 1 S są zazwyczaj silniejsze niż w zakończeniach typu 1 B.

Wskaźniki wapnia o niskim powinowactwie, takie jak Rod-Dextrin i Flu. Rod-Dextrin wykazał niemal liniową odpowiedź na częstotliwości stymulacji nerwowej w tych zakończeniach w zakresie od 10 do 80 hertz. Przykład przedstawiony tutaj pochodzi z zakończenia nerwowego na mięśniu numer cztery, obciążonego Rod-Dextrinem.