Name: Ładowanie zakończeń nerwowych Drosophila wskaźnikami wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Poznaj technikę ładowania wskaźników wapnia do zakończeń nerwowych Drosophila. Metoda umożliwia badanie sygnalizacji wapniowej i przekazywania nerwowego w układzie nerwowym muszki owocówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
<li>Wybierz czystą szalkę do sekcji, która nie miała kontaktu z żadnymi utrwalaczami. </li>
<li>Przeprowadź sekcję larwy Drosophila w 3rd stadium (faza wędrowania) w pożywce Schneider's Drosophila Medium zawierającej Ca2+ i L-glutaminę (należy unikać przecinania nerwów oraz uszkadzania włókien mięśniowych nr 7, 6, 13 lub 12). </li>
<li>Wybierz szklaną pipetę do napełniania z końcówką o średnicy wewnętrznej 12&nbsp;mikronów. </li>
<li>Używając strzykawki i drenu (w celu wytworzenia podciśnienia w pipecie), upewnij się, że końcówka pipety nie jest zablokowana. </li>
<li>Wybierz cienki plastikowy filament do napełniania, który można wsunąć wzdłuż szklanej pipety. </li>
<li>Naciągnij ok. 1 cm 5 mM wskaźnika Ca2+ sprzężonego z dekstranem do plastikowego filamentu. </li>
<li>Przetnij wszystkie nerwy segmentalne. </li>
<li>Oprzyj pipetę na rampie w taki sposób, aby końcówka pipety mogła zbliżyć się do linii środkowej brzusznej sekcjonowanej larwy. </li>
<li>Wciągnij do końcówki pipety odcięty koniec nerwu z segmentu nr 4, nie ściskając przy tym nerwu (dołącz niewielką ilość pożywki Schneidera). </li>
<li>Zdejmij dren i wsuń plastikowy filament do pipety, aż koniec filamentu znajdzie się w odległości 50 mikronów od odciętego końca nerwu (unikaj dotykania nerwu). </li>
<li>Wtryśnij na zakończenie nerwu odpowiednią ilość wskaźnika Ca2+, aby zwiększyć objętość pożywki Schneidera o około 33% (stężenie końcowe powinno wynosić &lt; 2mM). Ważne – czynność tę należy wykonać w ciągu 5 minut od przecięcia nerwu. </li>
<li>Przechowuj preparat w ciemności w temperaturze pokojowej podczas ładowania nerwu. </li>
<li>Po 40 minutach usuń wskaźnik Ca2+ za pomocą filamentu. </li>
<li>Pozostaw pipetę na miejscu i wypełnij ją całkowicie świeżą pożywką Schneidera, która posłuży do aplikowania impulsów stymulujących nerw. </li>
<li>Pozostaw wskaźnik Ca2+ do wyrównania w nerwie przez co najmniej 60 minut, ale nie dłużej niż 4 godziny przed rozpoczęciem obrazowania Ca2+. </li>
<li>Płucz preparat świeżą pożywką Schneidera co 30 minut podczas procesu wyrównywania. </li>
<li>Na 20 minut przed obrazowaniem zastąp pożywkę Schneidera roztworem Hemolymph-Like No.6 (HL6; Macleod et al. 2002; 2003). </li>
<li>Do roztworu HL6 można dodać kwas L-glutaminowy lub glutaminian w stężeniu 7mM, aby odwrażliwić postsynaptyczne receptory glutaminianu i zapobiec skurczom mięśni wywołanym stymulacją nerwu (Macleod et al. 2004; Reiff et al. 2002; 2005). </li>
</ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

<table><tbody><tr><td>Pożywka dla owadów Schneidera&amp;rsquo;s</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>musi zawierać L-glutaminę i wapń</td></tr><tr><td>Hydrat monosodowy kwasu L-glutaminowego</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

obciążanie zakończeń nerwowych drosophila wskaźnikami wapnia

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Wapń pełni wiele ról w układzie nerwowym, ale żadna nie jest bardziej imponująca niż rola wyzwalacza uwalniania neuroprzekaźników, a żadna nie jest bardziej znacząca niż rola przekaźnika niezbędnego dla plastyczności synaptycznej, która warunkuje uczenie się i pamięć. Aby dalej wyjaśnić molekularne podstawy mechanizmów synaptycznych zależnych od Ca2+, wymagany jest system modelowy, który jest jednocześnie plastyczny genetycznie i dostępny fizjologicznie. Taki model stanowi Drosophila melanogaster. W tym systemie dostępne są genetycznie kodowane wskaźniki fluorescencyjne, które pozwalają wykrywać zmiany Ca2+ w zakończeniach nerwowych. Wskaźniki te mają jednak ograniczoną czułość na Ca2+ i często wykazują nieliniową odpowiedź. Syntetyczne wskaźniki fluorescencyjne są lepiej dostosowane do pomiaru szybkich zmian Ca2+ związanych z aktywnością nerwów. Przedstawiamy tutaj technikę wprowadzania syntetycznych wskaźników Ca2+ sprzężonych z dekstranem do żywych zakończeń nerwowych w larwach Drosophila. Szczególny nacisk położono na te aspekty protokołu, które są najbardziej krytyczne dla powodzenia techniki, takie jak unikanie wyładowań elektrostatycznych wzdłuż izolowanych nerwów, utrzymanie żywotności preparatu podczas przedłużonych okresów ładowania oraz zapewnienie przeżycia aksonów poprzez dostarczenie Ca2+ w celu wspomagania uszczelniania przeciętych końców aksonów. Dostępne są niskoprocentowe wskaźniki Ca2+ sprzężone z dekstranem, takie jak fluo-4 i rhod, które wykazują wysoki stosunek sygnału do szumu, minimalnie zakłócając presynaptyczną dynamikę Ca2+. Sprzężenie z dekstranem pomaga zapobiec sekwestracji wskaźników Ca2+ w organellach, takich jak mitochondria. Technikę ładowania można stosować w równym stopniu do larw, embrionów i osobników dorosłych.

Wapń jest powszechnie występującym przekaźnikiem w układzie nerwowym, niezbędnym do wyzwalania uwalniania neuroprzekaźników oraz zmian w sile synaptycznej. W niniejszym materiale prezentujemy technikę wprowadzania wskaźników Ca2+ do zakończeń nerwowych Drosophila. Przedstawiamy również sposób wykonania niezbędnej aparatury i podkreślamy kwestie kluczowe dla sukcesu tej techniki.

Obciążanie zakończeń nerwowych Drosophila wskaźnikami wapnia

Wapń pełni wiele funkcji w układzie nerwowym, lecz żadna z nich nie jest bardziej spektakularna niż rola wyzwalacza uwalniania neuroprzekaźników, a żadna nie jest bardziej doniosła niż...

Witam, nazywam się Greg McLeod. W moim laboratorium badamy regulację poziomu wapnia w zakończeniach nerwowych oraz jej wpływ na neurotransmisję. Badania te prowadzimy na *Oph Melanogaster*.Muszka owocowa jest atrakcyjnym modelem dla neuronaukowców ze względu na swoją plastyczność genetyczną oraz prosty i dostępny układ nerwowy. W tym układzie nerwowym dostępne są genetycznie kodowane fluorescencyjne wskaźniki wapnia, które pozwalają na wykrywanie zmian stężenia wapnia w zakończeniach nerwowych. Wskaźniki te charakteryzują się jednak ograniczoną czułością na wapń i często wykazują nieliniową odpowiedź.Wskaźniki syntetyczne są lepiej dostosowane do pomiaru szybkich zmian poziomu wapnia związanych z aktywnością nerwów. Zaprezentujemy technikę wprowadzania do żywych zakończeń nerwowych w larwach oph syntetycznych wskaźników wapnia sprzężonych z dekstryną. Sprzężenie z dekstryną pomaga zapobiec sekwestracji wskaźników wapnia w organellach, takich jak mitochondria.Technikę wprowadzania próbki można zastosować w takim samym stopniu do larw, embrionów, jak i osobników dorosłych. Larwę poddamy sekcji w małej kąpieli cygarowej na szkiełku przedmiotowym. Niebieski wosk dentystyczny będzie słu

loading-drosophila-nerve-terminals-with-calcium-indicators

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wczytywanie zakończeń nerwowych Drosophila z wskaźnikami wapnia

Opisaliśmy cechy strukturalne synaps glejowo-neuromuscularnych w nowatorskiej preparacji tkankowej żywych larw muchy typu „Inside-out”, wykorzystując barwniki fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Oznaczyliśmy zakończenia żywych neuronów za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko HRP, a także zwizualizowaliśmy przestrzeń perisynaptyczną przy użyciu fluorescencyjnych dekstranów.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Ten film opisuje obrazowanie in vivo wapnia w neuronach Drosophila za pomocą GCaMP. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak rejestrować zmiany we fluorescencji GCaMP z neuronów ciała grzyba podczas eksperymentu kondycjonowania węchowego.

Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje metodę wykrywania reakcji neuronów czuciowych u Drosophila za pomocą wiązania ligandów i obrazowania fluorescencyjnego. Ligandy wiążą się z receptorami neuronów, powodując napływ wapnia. Wapń wiąże się z kompleksami wskaźnikowymi, co prowadzi do emisji fluorescencji, która potwierdza odpowiedź neuronalną na ligand.

Wykrywanie reakcji fizjologicznych neuronów czuciowych u Drosophila

W tym filmie włókna nerwowe larw Drosophila są zanurzone w barwniku FM, który wiąże się z lipidami błony komórkowej. Mikroelektroda ssąca i impulsy elektryczne stymulują proces endocytozy, wprowadzając barwnik FM do nowo powstałych pęcherzyków endocytarnych. Ta metoda, która wizualizuje presynaptyczne etapy neuroprzekaźnictwa, jest przydatna do badania funkcji synaptycznych i uwalniania neuroprzekaźników.

Ładowanie i rozładowywanie barwnika FM za pośrednictwem mikroelektrod w komórkach nerwowych larw Drosophila

Ten film demonstruje protokół badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila wykazujących ekspresję rodopsyny kanałowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Niebieskie światło aktywuje rodopsyny kanałowe, powodując napływ wapnia i egzocytozę pęcherzyków synaptycznych. Barwnik integruje się z błonami neuronalnymi i jest internalizowany podczas endocytozy, co powoduje zwiększoną fluorescencję. Dalsza stymulacja światłem niebieskim indukuje...

Analiza recyklingu pęcherzyków synaptycznych i wychwytu barwnika fluorescencyjnego przez larwy Drosophila

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Tutaj opisujemy metodę ładowania barwnika wrażliwego na wapń przez pień nerwu żaby do zakończeń nerwowych. Przedstawiamy również protokół rejestracji i analizy szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych.

Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby

Ten protokół ocenia aktywność synaptyczną funkcjonalną między określonymi partnerami neuronowymi in vivo w centralnym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster przy użyciu genetycznie zakodowanych narzędzi. Optogenetyczna stymulacja presynaptycznych cIVda neuronów sensorycznych za pomocą CsChrimson indukuje fotokonwersję zależną od wapnia CaMPARI w postsynaptycznych interneuronach Basin-4.

Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI

Poznaj technikę ładowania wskaźników wapnia do zakończeń nerwowych Drosophila. Metoda umożliwia badanie sygnalizacji wapniowej i przekazywania nerwowego w układzie nerwowym muszki owocówki.

Obciążanie zakończeń nerwowych Drosophila wskaźnikami wapnia

Przeglądaj więcej filmów