Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Ogólnym celem procedury jest zbadanie uczenia się i pamięci u dorosłych much Drosophila melanogaster, przy czym w pierwszej kolejności określono, czy muchy wykazują deficyty motoryczne. Są one testowane w próbie negatywnej geotaksji. Następnie weryfikowane jest zachowanie pozytywnej fototaksji poprzez umieszczenie much w labiryncie w kształcie litery T i pomiar czasu latencji do przejścia do preferowanej, oświetlonej komory.

Muchy wykazujące pozytywną fototaksję są następnie warunkowane, aby kojarzyć oświetloną komorę z gorzkim smakiem chininy. Ostatecznie badane jest, jak dobrze muchy kojarzą bodziec awersyjny z oświetloną komorą, co stanowi miarę uczenia się i pamięci. Ola, witaj w laboratorium X.

Dzisiaj zaprezentujemy Państwu dwa powszechnie stosowane testy behawioralne służące do badania neurodegeneracji u drosophila. Najpierw przedstawimy test supresji awersyjnej fototaksji, który zaprezentują Wil Fredo sala, student studiów licencjackich w naszym laboratorium, oraz ja, a następnie test negatywnej geotaksji, który zaprezentuje kaiwan, doktorant w naszym laboratorium. Muchy należy utrzymywać na standardowej pożywce agarowej z mąką kukurydzianą, melasą i drożdżami w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność.

W dniu zamknięcia naczyń, podziel dziewicze muchy na grupy po 20 osobników. Muchy dziewicze rozpoznaje się po jasnym kolorze oraz ciemnozielonej plamce znajdującej się na spodniej stronie odwłoka. Muchy należy przenosić do nowej fiolki co trzy dni, a w celu zminimalizowania różnic wynikających z tła genetycznego należy używać much z tego samego miotu.

W badaniu geotaksji należy przetestować od 10 do 20 grup na genotyp lub traktowanie. Aby rozpocząć, należy podzielić muchy żeńskie i męskie na grupy po 10 osobników. Muchy te powinny być badane osobno.

Ponieważ płeć ma istotny wpływ na zachowanie, należy odczekać co najmniej jedną godzinę po znieczuleniu przed przystąpieniem do dalszych czynności, aby upewnić się, że aktywność lokomotoryczna nie jest zaburzona. Po całkowitym przygotowaniu much należy wyrównać otwory dwóch pustych fiolek polistyrenowych, łącząc je pionowo na dolnej fiolce.

Odmierz osiem centymetrów od dołu i narysuj okrąg wzdłuż obwodu. Po złożeniu aparatury przenieś grupę 10 much do dolnej probówki. Natychmiast połącz probówki i pozostaw muchy na minutę w celu aklimatyzacji przed przeprowadzeniem testu.

Po tym, jak muchy osiądą, delikatnie ostukaj je na dno probówki i zmierz liczbę much, które w ciągu 10 sekund wspiną się powyżej zaznaczenia ośmiu centymetrów. Liczbę much w danej grupie, które przekroczyły tę linię, zapisuje się jako procent całkowitej liczby much. Powtórz tę procedurę 10 razy dla każdej grupy, pozwalając muchom odpocząć przez jedną minutę między próbami.

Na sześć godzin przed analizą PS posortuj samice much do probówek polistyrenowych zawierających zwilżony wodą papier filtracyjny. Krok ten zapewnia, że muchy będą głodne i bardziej wrażliwe na smak awersyjny. W tej analizie jako bodziec awersyjny służy roztwór chininy.

Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 1 µM z roztworu zapasu 0,1 M. Labirynt w kształcie litery T składa się z kolumny centralnej z klapką oraz dwóch bocznych komór: ciemnej i oświetlonej. Na wysokości 2 mm odciąć ręczną piłą zamknięty koniec dwóch plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 15 mL, dopasować adaptery łącznikowe na obu końcach i uszczelnić połączenie parafinią.

Owiń jedną probówkę folią aluminiową, aby stworzyć komorę ciemną. Złóż TMAs, przykręcając komorę oświetloną i ciemną po obu stronach kolumny środkowej. Po zamknięciu klapki w części środkowej dokończ przygotowanie układu, podłączając źródło światła do adaptera komory oświetlonej. Bezpośrednio przed wykonaniem testu przenieś każdą muchę z grupy 10 osobników do pustej probówki wirówkowej o pojemności 15 milliliter i lekko zakręć nakrętkę, aby zapobiec ucieczce.

Następnie odkręć ciemną komorę od TMAs. Przenieś jedną muchę do probówki i natychmiast włóż ją z powrotem do labiryntu. Zgaś światła w pomieszczeniu i zapal czerwoną lampę.

Pozostaw muchę w ciemnej komorze na 30 sekund w celu aklimatyzacji, a następnie powoli włącz źródło światła oświetlające komorę jasną. Po oświetleniu otwórz zapadnię, która oddziela obie komory. Jeśli mucha przejdzie do komory jasnej w ciągu 10 sekund, uznaje się ją za fototaktyczną i gotową do treningu.

Brak reakcji w ten sposób wskazuje na problem w systemie wzrokowym i wymaga wykluczenia osobnika z testu. Po potwierdzeniu dodatniej fototaksji, należy zapędzić muchę z powrotem do ciemnej komory, zamknąć zapadkę i wyłączyć światło podczas 32-sekundowego okresu odpoczynku. Bodziec awersyjny przygotowuje się poprzez umieszczenie papieru filtracyjnego w oświetlonej komorze i naniesienie pipetą 1 mL roztworu chininy na papier filtracyjny.

Należy upewnić się, że cały papier filtracyjny jest całkowicie zwilżony bodźcami awersyjnymi. Aby rozpocząć warunkowanie, powoli otwórz zapadkę i zapal światło. Pozwól musze wejść do oświetlonej komory o zapachu chininy.

Po jednej minucie dotknij muchy, aby wróciła do ciemnej komory. Powtórz tę procedurę dziewięciokrotnie, aby przeprowadzić łącznie 10 prób warunkowania. Zazwyczaj muchy tego typu unikają oświetlonej komory po trzech do pięciu próbach treningowych bezpośrednio po zakończeniu treningu.

Przeprowadź pięć prób testowych. Jeśli wyszkolona mucha nie wejdzie w światło komory w ciągu 10 sekund, uznaje się to za sukces. Odnotowuje się i określa odsetek sukcesów w pięciu kolejnych próbach.

PC zero. Po treningu i początkowych pomiarach PC zero, każdą muchę umieszcza się z powrotem w oryginalnej ponumerowanej probówce z pokarmem i odstawia na sześć godzin. Sześć godzin po treningu przeprowadza się pięć dodatkowych prób testowych zgodnie z wcześniejszą procedurą; odsetek sukcesów w tych próbach stanowi wartość PC sześć i jest miarą pamięci krótkotrwałej.

W teście negatywnej geotaksji liczbę much przekraczających markę ośmiu centymetrów przelicza się na procent i przedstawia jako wskaźnik sukcesu wspinania się. W ciągu 10 prób, widocznych tutaj po prawej stronie, 10-dniowe samce lub samice much z nadekspresją ludzkiego białka tau wykazują znaczące deficyty lokomocyjne w porównaniu z muchami w tym samym wieku z nadekspresją GFP widocznymi po lewej stronie.

Wyniki w teście supresji awersyjnej fototaksji są reprezentowane przez średni wskaźnik przejścia lub procent udanych prób unikania. W stosunku do całkowitej liczby prób, muchy z nadekspresją białka tau przedstawione tutaj po prawej stronie wykazują słabszą zdolność do kojarzenia światła z gorzkim smakiem w porównaniu z grupą kontrolną po lewej stronie, zarówno bezpośrednio po treningu, jak i podczas testowania sześć godzin później. Po wykonaniu tej procedury można pobrać próbki do analizy immunohistochemicznej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące różnic morfologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać uczenie się i pamięć u muszek owocówek.

I pamiętajcie, że wszystko kręci się wokół Was.