Name: Oznaczanie deficytów lokomotorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metody oceny deficytów lokomotorycznych oraz uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji Drosophila melanogaster. Badania behawioralne pozwalają zrozumieć podstawy genetyczne chorób neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować dr. Charlesowi Luetje za udostępnienie labiryntu w kształcie litery T oraz pomieszczenia do badań behawioralnych. Praca ta jest wspierana przez American Heart Association (dla Y.A.), National Institute for Neurological Disorder and Stroke w ramach grantu R01NS64269 (dla R.G.Z.) oraz Pew Charitable Trust (dla R.G.Z.).

1. Wprowadzenie
W tym filmie zaprezentujemy dwa testy behawioralne z wykorzystaniem Drosophila, aby zademonstrować pomiar lokomocji oraz funkcji uczenia się i pamięci, które są zaburzone w chorobach neurodegeneracyjnych. Po pierwsze, pokażemy, jak mierzyć zachowania lokomotoryczne za pomocą testu negatywnej geotaksji. Po drugie, ocenimy zdolności uczenia się i pamięci u much wykazujących dodatnią fototaksję, które zostaną wytrenowane w kojarzeniu światła z awersyjnym gorzkim smakiem, a następnie poddane testom po 6 godzinach w celu oceny funkcji pamięci. Na koniec omówimy znaczenie i ograniczenia tych testów behawioralnych.
2. Sprzęt i odczynniki
<ol>
<li>Praca z muszkami
<ul>
<li>Stereomikroskop (Zeiss)</li>
<li>Małe pędzle malarskie do przesuwania muszek</li>
<li>Aparat do narkozy Drosophila dwutlenkiem węgla (CO2) (Geneseesci, Inc)</li>
</ul>
</li>
<li>Test negatywnej geotaksji
<ul>
<li>Fiolka polistyrenowa 28,5 x 95 mm (Capitol Vial, Inc.)</li>
<li>Miniaturowy timer z alarmem/stoper (VWR International)</li>
<li>Pisaki Sharpie</li>
<li>Taśma klejąca</li>
</ul>
</li>
<li>Test supresji awersyjnej fototaksji
<ul>
<li>Wodorochlorek chininy (Sigma Aldrich; numer CAS: 619-47-7)</li>
<li>Woda destylowana</li>
<li>Cyfrowa waga pomiarowa do precyzyjnego rozcieńczania wagowego</li>
<li>Szybkozłączki, polietylen o wysokiej gęstości (NALGENE VWR nr katalogowy 62868-021)</li>
<li>Probówka do wirowania 15 mL (VWR International), odcięta na poziomie 2 mL od zamkniętego końca, aby pasowała do adaptera szybkozłączki źródła światła</li>
<li>Jednokanałowa pipeta 20 μL do nakładania roztworu chininy na papier filtracyjny wyściełający komorę</li>
<li>Labirynt T-Maze (Simple Behavioral Systems; Rysunek 1)</li>
<li>Folia aluminiowa</li>
<li>Źródło światła (Zeiss)</li>
<li>Lampa z czerwonym światłem</li>
<li>Papier filtracyjny</li>
<li>Miniaturowy timer z alarmem/stoper (VWR International)</li>
</ul>
</li>
</ol>
3. 	Przygotowanie much
<ul>
<li>Muchy są hodowane na standardowej pożywce kukurydziano-agarowej z melasą i drożdżami w temperaturze 25°C przy 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.</li>
<li>Dziewicze muchy są izolowane pod narkozą dwutlenkiem węgla w dniu ekluzji. W badaniach starzenia muchy są utrzymywane w grupach po dwadzieścia osobników w jednej fiolce i przenoszone do nowej fiolki co 3 dni. W badaniach starzenia ważne jest użycie rodzeństwa z tego samego krzyżowania rodzicielskiego, aby zminimalizować różnice wynikające z tła genetycznego.</li>
<li>W obu testach muchy są segregowane według płci i utrzymywane w grupach po dziesięć osobników w jednej fiolce. Różnice między płciami w zachowaniu są istotne, dlatego nie zaleca się mieszania samców i samic w jednym badaniu, gdyż mogłoby to utrudnić interpretację i reprodukcję danych6.</li>
<li>W teście negatywnej geotaksji muchy są dzielone na grupy po dziesięć osobników na fiolkę i badane godzinę po narkozie. Ważne jest, aby muchy całkowicie doszły do siebie po narkozie, ponieważ może ona wpływać na aktywność lokomotoryczną.</li>
<li>W teście APS muchy z każdej grupy są umieszczane w pustej polistyrenowej fiolce z nawilżonym wodą papierem filtracyjnym na sześć godzin przed wykonaniem testu. Zapewnia to głodówkę much przed badaniem, dzięki czemu będą one bardziej wrażliwe na awersyjny smak. Bezpośrednio przed wykonaniem testu każda mucha z dziesięcioosobowej grupy jest umieszczana w pustej probówce odwirnikowej o pojemności 15mL, która następnie jest lekko zakręcona, aby zapobiec ucieczce.</li>
</ul> 
4. Test negatywnej geotaksji
<ul>
<li>Geotaksis mierzy się zazwyczaj dla od dziesięciu do dwudziestu grup po dziesięć osobników tego samego genotypu lub wariantu traktowania (łącznie 10–20 much dla każdego genotypu/wariantu traktowania)7. Posortuj grupy po dziesięć samic lub samców much przy użyciu aparatury do znieczulania CO2 i umieść każdą grupę w oddzielnej fiolce. Odczekaj co najmniej jedną godzinę, aby muchy dojdzieli się z narkozy.</li>
<li>Przygotuj aparat do wspinania się dla każdej grupy w taki sposób, aby dwie puste fiolki polistyrenowe były połączone pionowo taśmą, przylegać do siebie otworami. Ważne jest, aby otwory fiolek były idealnie wyrównane, co zapewni równą powierzchnię wspinania dla much.</li>
<li>W przypadku dolnej fiolki odmierz odległość pionową 8 cm od dna i zaznacz każdą fiolkę, rysując okrąg wokół całego jej obwodu.</li>
<li>Przenieś grupę dziesięciu much do dolnej fiolki, uważając, aby żadna mucha nie uciekła. Natychmiast przykryj dolną fiolkę górną i zabezpiecz ją mocno taśmą w pobliżu stykających się otworów. Pozwól muchom zaadaptować się do nowych warunków przez 1 minutę przed przeprowadzeniem testu.</li>
<li>Delikatnie opukaj ścianki fiolki, aby muchy opadły na dno, a następnie policz liczbę much, które zdołają wspiąć się powyżej zaznaczenia 8 cm w ciągu 10 sekund od opukania.</li>
<li>Powtórz ten test dla tej samej grupy dziesięć razy, zachowując 1 minutę przerwy między każdą próbą.</li>
<li>Zapisz liczbę much w grupie, które przekroczyły markę 8 cm, jako procent całkowitej liczby much.</li>
</ul>
5. 	Test supresji awersyjnej fototaksji (test APS)
Pierwotnie opracowany na podstawie pracy Le Bourga i Buechera (202)4, test ten wykorzystuje pozytywny fototaksis u much, aby nauczyć je kojarzenia światła z bodźcami awersyjnymi (w tym przypadku gorzkiego smaku chininy). Po fazie treningu/warunkowania muchy typu dzikiego będą w stanie powiązać oświetlony obszar z awersyjnym smakiem i zaczną go unikać. Muchy z upośledzonymi zdolnościami uczenia się nie będą w stanie stworzyć tego powiązania. Co więcej, test APS może być również wykorzystywany do pomiaru funkcji pamięci krótkotrwałej u much5 poprzez poddanie wcześniej wytrenowanych owadów temu samemu badaniu 6 godzin po warunkowaniu, aby sprawdzić ich zdolność do zapamiętania wyuczonego zadania.
<ol>
<li>Przygotowanie roztworu chininy
<ul>
<li>Rozpuścić chlorowodorek chininy w wodzie destylowanej, aby przygotować 0,1M roztwór zapasowy (1,98g w 50mL wody destylowanej). Roztwór zapasowy można przechowywać w temperaturze -20°C do roku w małych alikwotach.</li>
<li>Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 1 μM poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego w wodzie destylowanej.</li>
</ul>
</li>
<li>Przygotowanie labiryntu T
<ul>
<li>Labirynt T składa się z kolumny centralnej z zapadnią oraz dwóch niezależnych komór: komory „ciemnej” i komory „oświetlonej” (Rycina 1).</li>
<li>Przygotowanie komór: wziąć dwie plastikowe probówki do wirowania o pojemności 15mL i odciąć końcówkę od dołu (zamkniętego końca) na wysokości 2 mL za pomocą piłki ręcznej. Zamontować adaptery łączące na obu końcach i uszczelnić połączenie parafilmem. Adapter na końcu probówki służy jako gniazdo dla elastycznego źródła światła. Połączyć jedną probówkę ze źródłem światła – ta probówka będzie komorą „oświetloną”. Pozostałą probówkę owinąć folią aluminiową, aby służyła jako komora „ciemna”.</li>
<li>Nanieść 180uL wody destylowanej lub roztworu chininy na papier filtracyjny i umieścić go w komorze oświetlonej.</li>
<li>Złożyć labirynt T, przykręcając komorę oświetloną i ciemną po obu stronach kolumny centralnej, przy zamkniętej zapadni znajdującej się w środku (Rycina 1).</li>
<li>Włożyć źródło światła do komory oświetlonej.</li>
</ul>
</li>
<li>Trenowanie muszek w celu tłumienia fototaksji za pomocą bodźców awersyjnych
<ul>
<li>Odkręcić komorę ciemną od labiryntu T, przenieść pojedynczą muszkę do tej komory i niezwłocznie przykręcić probówkę ciemną z powrotem do labiryntu.</li>
<li>Wyłączyć światła w pomieszczeniu i zapalić lampę czerwoną.</li>
<li>Pozwolić muszce zaaklimatyzować się w komorze ciemnej przez 30 sekund, a następnie powoli włączyć źródło światła oświetlające komorę oświetloną. Powoli otworzyć zapadnię oddzielającą obie komory.</li>
<li>Jeśli muszka przejdzie do komory oświetlonej w ciągu 10 sekund, uznaje się ją za wykazującą fototaksję dodatnią i jest ona gotowa do treningu w badaniu. Brak fototaksji wskazuje na problemy z systemem wzrokowym; muszki wykazujące fototaksję ujemną powinny zostać wykluczone z badania.</li>
<li>W celu przeprowadzenia treningu tłumienia fototaksji awersyjnej (APS) należy delikatnie zapędzić muszkę wykazującą fototaksję dodatnią z powrotem do komory ciemnej, zamknąć zapadnię i wyłączyć światło. Pozostawić 30 sekund na aklimatyzację. W tym czasie umieścić w komorze oświetlonej papier filtracyjny z roztworem chininy. Powoli otworzyć zapadnię i włączyć światło. Pozwolić muszce wejść do oświetlonej komory pokrytej chininą. Po jednej minucie zapędzić muszkę z powrotem do komory ciemnej i powtórzyć tę czynność jeszcze 9 razy. (Zazwyczaj muszki typu dzikiego unikają komory oświetlonej po 3 do 5 próbach treningowych).</li>
<li>Bezpośrednio po treningu przeprowadzić pięć prób testowych. W każdej próbie testowej, po włączeniu światła, dać wyszkolonej muszce 10 sekund na przejście do komory oświetlonej. Brak wejścia do oświetlonej probówki zostanie zapisany jako „Pass” (sukces), co jest równoważne z „zadaniem opanowanym poprzez wzmocnienie”. Wskaźnik sukcesów w pięciu kolejnych próbach zostaje zapisany i przedstawiony poniżej na Rycynie 2 jako PC0 (0 h po warunkowaniu).</li>
</ul>
</li>
<li>Ocena funkcji pamięci krótkotrwałej u muszek
<ul>
<li>Po treningu i początkowych pomiarach PC0 każda muszka zostaje przeniesiona z powrotem do swojej pierwotnej probówki z pożywką i odstawiona na sześć godzin.</li>
<li>Sześć godzin po treningu poddać każdą muszkę ponownie 5 próbom w ten sam sposób co wcześniej i zapisać liczbę razy, gdy muszka unika (pass) lub wchodzi do (fail) oświetlonej probówki. Wskaźnik sukcesów ten zostaje zapisany jako PC6 (6 h po warunkowaniu), co stanowi wskaźnik pamięci krótkotrwałej.</li>
</ul>
</li>
</ol>
6. Interpretacja danych i analiza statystyczna
<ol>
<li>Test negatywnego geotaksji
<ul>
<li>Surowe dane uzyskane z tego testu reprezentują liczbę much przekraczających znacznik 8 cm w ciągu 10 sekund w każdej grupie. Przelicz tę wartość na procenty i oblicz średni wskaźnik przejść dla każdej grupy w ciągu 10 sesji.</li>
<li>Dane są przedstawione graficznie jako średni wskaźnik przejść na grupę (genotyp, traktowanie itp.) wraz ze standardowym błędem średniej (SEM).</li>
<li>Różnice między grupami mogą być następnie określone jako statystycznie istotne lub nieistotne przy użyciu testu t-Studenta lub analizy ANOVA.</li>
</ul>
</li>
<li>Test supresji awersyjnej fototaksji
<ul>
<li>Surowe dane z tego testu reprezentowane są jako liczba razy, gdy każda mucha unika oświetlonej komory w pięciu kolejnych próbach. Wskaźnik przejść oblicza się jako procent udanych prób unikania w stosunku do całkowitej liczby prób. W ten sposób oblicz średni wskaźnik przejść dla minimum 15 much na grupę.</li>
<li>Dane są przedstawione graficznie jako średni wskaźnik przejść PC0 (bezpośrednio po warunkowaniu; wskaźnik „uczenia się”) lub średni wskaźnik przejść PC6 (6 godzin po warunkowaniu; wskaźnik „pamięci”) wraz z odpowiednim SEM.</li>
<li>Wskaźniki uczenia się i pamięci są odpowiednio porównywane między grupami, obejmując zarówno typy dzikie, jak i grupy „genetycznie zmodyfikowane-obojętne” (takie jak muchy z nadekspresją GFP).</li>
</ul>
</li>
</ol>
7. 	Reprezentatywne wyniki
W tym eksperymencie wideo oceniamy deficyty uczenia się, pamięci i funkcji motorycznych u much z nadekspresją ludzkiego białka Tau w ośrodkowym układzie nerwowym oraz porównujemy ich wyniki z wynikami much z nadekspresją GFP. Wykazano, że neuronalna nadekspresja ludzkiego białka Tau u Drosophila powoduje silną wakulizację w mózgu8 i prowadzi do znacznych deficytów funkcji uczenia się i pamięci9. Jak pokazano na Rysunku 2A, 10-dniowe samce lub samice much z nadekspresją ludzkiego białka Tau wykazują znaczne deficyty lokomocyjne w porównaniu z grupą kontrolną much w tym samym wieku z nadekspresją GFP. Ponadto muchy te nie potrafiły powiązać światła z gorzkim smakiem, co obrazuje wskaźnik przejść PC0 w porównaniu z grupą kontrolną, a także nie potrafiły zapamiętać tego powiązania, co wykazuje spadek wskaźnika przejść PC6 (Rysunek 2B). Niniejszy eksperyment stanowi dalszą walidację możliwości wykorzystania modeli Drosophila do badania ludzkich schorzeń neurodegeneracyjnych oraz odtwarzania niektórych fenotypów behawioralnych obserwowanych u ludzi i ssaków.
<img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="Aparat labiryntowy z filtrem chininowym do konfiguracji treningu światło/ciemność w eksperymencie behawioralnym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Układ labiryntu w kształcie litery T do testu supresji awersyjnej fototaksji. A. Ogólny układ eksperymentalny dla eksperymentu APSA ze źródłem światła podłączonym do „oświetlonej” probówki typu falcon, wyłożonej papierem filtracyjnym, oraz probówki „ciemnej” po lewej stronie (owiniętej folią), oddzielonych zapadką. B. Podczas fazy treningu i testowania mucha znajduje się w ciemnej komorze, a zapadka zostaje otwarta po włączeniu światła w komorze oświetlonej.
<img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy analizy odsetka przejść w teście wspinania, 10–20 dni po wykluciu, z porównaniem wariantów genetycznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki eksperymentu z zakresu negatywnego geotaksis i APS z wykorzystaniem much z nadekspresją GFP lub Tau pod kontrolą pan-neuronalnego drivera. A. W teście negatywnego geotaksji 10-dniowe muchy samce (niebieska kolumna) lub samice (czerwona kolumna) z nadekspresją GFP wykazały wyższą aktywność wspinania się niż muchy z nadekspresją Tau. B. 20-dniowe muchy samice z nadekspresją GFP wykazały lepsze funkcje uczenia się (PC0) i pamięci (PC6) niż muchy z nadekspresją Tau.

<ol><li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Lloyd, T. E. &amp, Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Le Bourg, E., Buecher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learned+suppression+of+photopositive+tendencies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Learning+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster.</a> Animal Learning & Behavior. 30, 330-341 (2002).</li>
<li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aversive+phototaxic+suppression%3A+evaluation+of+a+short-term+memory+assay+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster.</a> Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).</li>
<li>Nilsen, S. P., Chan, Y. -B., Huber, R., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-selective+patterns+of+aggressive+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).</li>
<li>Leal, S. M., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evidence+for+GABAergic+regulation+of+specific+behaviors+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).</li>
<li>Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauopathy+in+Drosophila%3A+Neurodegeneration+Without+Neurofibrillary+Tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li>
<li>Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+deficits+upon+TAU+accumulation+in+Drosophila+mushroom+body+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons.</a> Learn Mem. 11, 277-287 (2004).</li>
<li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+Suppression+Involving+Behavioral+Mutants+with+Altered+Nerve+Excitability+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 100, 597-614 (1982).</li>
<li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+mutants+in+Drosophila+and+their+effects+on+the+structure+and+function+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system.</a> J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zarówno testy negatywnej geotaksji, jak i testy APS są solidnymi badaniami behawioralnymi służącymi do pomiaru zmian w zdolnościach lokomozyjnych lub w zakresie uczenia się i pamięci, wynikających z manipulacji genetycznych lub środowiskowych. Istnieją jednak pewne niedogodności związane z tymi testami, które wymagają dalszej optymalizacji.
W teście ujemnego geotaksji mutacje w określonych genach mogą powodować poważne zaburzenia motoryczne u much. W takich przypadkach muchy z trudnością wspinają się po ściankach w odpowiedzi na grawitację po pobudzeniu. Odpowiedniejsze mogą okazać się inne testy behawioralne bezpośrednio mierzące ruch. Testy te obejmują badanie odruchu prostowania, który mierzy paraliż i drgawki10, oraz badanie zachowania optomotorycznego11, które rejestruje utratę koordynacji ruchowej.
W teście APS pierwszą przeszkodą mogą być muchy, które przypadkowo zatrzymują się przy wejściu do oświetlonej komory, nie przesuwając się naprzód. Staje się to bardziej problematyczne, jeśli jednym z badanych czynników jest starzenie, ponieważ starsze muchy są ogólnie mniej aktywne i mają tendencję do zatrzymywania się i odpoczywania przez dłuższy czas. W takim przypadku eksperymentator musi zastosować bodźce mechaniczne w celu pobudzenia do ruchu, co nie zawsze okazuje się skuteczne. Po drugie, można by argumentować, że brak wejścia do oświetlonej komory wynika z utraty dodatniej fototaksji. Rzadko jest to jednak przypadkiem, gdyż wcześniejsze prace wykazały, że muchy odzyskują reaktywność na światło po usunięciu negatywnego wzmocnienia4. Po trzecie, czas kontaktu z bodźcem awersyjnym może się różnić między poszczególnymi próbami. Zróżnicowanie to można zazwyczaj zredukować, wyściełając wewnętrzną ścianę komory nasączonym papierem filtracyjnym, aby zapobiec unikaniu przez muchy chininy. Dodatkowo eksperymentator może upewnić się, że każda mucha spędza wystarczająco dużo czasu w kontakcie z papierem filtracyjnym, wydłużając czas przebywania w komorze ponad standardową 1 minutę.
Podsumowując, testy negatywnej geotaksji oraz APS są szybkimi i prostymi sposobami oceny deficytów behawioralnych i ilościowo wskazują na zdolności lokomotoryczne oraz funkcje uczenia się i pamięci u Drosophila. Testy te są szczególnie przydatne w modelowaniu ludzkich schorzeń neurodegeneracyjnych u Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Probówka polistyrenowa</td><td>Capitol Vial, Inc.</td><td>28Fly</td><td>Probówka polistyrenowa 28,5 x 95 mm; ważna jest jakość materiału, zbyt śliska powierzchnia uniemożliwi muszkom wspinaczkę.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop do mikrodissekcji</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1432-979</td><td>Przewód światłowodowy z dwoma ramionami w kształcie gęsiej szyi (12V/30W)</td></tr><tr><td>Wodorochlorek chininy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6119-47-7</td><td>Rozpuścić w wodzie destylowanej.</td></tr><tr><td>Szybkozłącza</td><td>Nalge Nunc international</td><td>62868-021</td><td>Polietylen o wysokiej gęstości</td></tr><tr><td>Labirynt w kształcie litery T</td><td>Simple Behavioral Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednokanałowa pipeta 200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>022443305</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u drosophila

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Postępy w metodach genetycznych umożliwiły badanie genów zaangażowanych w ludzkie choroby neurodegeneracyjne z wykorzystaniem Drosophila jako systemu modelowego1. Większość tych schorzeń, w tym choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona, charakteryzuje się zależnym od wieku pogorszeniem funkcji uczenia się, pamięci oraz koordynacji ruchowej2. W niniejszej pracy wykorzystujemy testy behawioralne, w tym test negatywnej geotaksji3 oraz test supresji awersyjnej fototaksji (test APS)4,5, aby wykazać, że niektóre cechy behawioralne związane z ludzką neurodegeneracją mogą być odtworzone u muszek. W teście negatywnej geotaksji wykorzystuje się naturalną tendencję muszek do poruszania się przeciwko grawitacji pod wpływem pobudzenia, aby badać geny lub warunki, które mogą upośledzać sprawność lokomocyjną. W teście APS badane są funkcje uczenia się i pamięci u muszek wykazujących fototaksję dodatnią, które zostały przeszkolone, aby kojarzyć światło z awersyjnym gorzkim smakiem, a w konsekwencji unikać tej naturalnej tendencji do ruchu w stronę światła. Testowanie tych przeszkolonych muszek 6 godzin po treningu służy do oceny funkcji pamięci. Dzięki zastosowaniu tych testów można w łatwy sposób badać wpływ czynników genetycznych lub środowiskowych na rozwój neurodegeneracji u muszek.

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Postępy w metodach genetycznych umożliwiły badanie genów zaangażowanych w ludzkie choroby neurodegeneracyjne z wykorzystaniem *Drosophila* jako systemu modelowego1. Większość z...

Ogólnym celem procedury jest zbadanie uczenia się i pamięci u dorosłych much Drosophila melanogaster, przy czym w pierwszej kolejności określono, czy muchy wykazują deficyty motoryczne. Są one testowane w próbie negatywnej geotaksji. Następnie weryfikowane jest zachowanie pozytywnej fototaksji poprzez umieszczenie much w labiryncie w kształcie litery T i pomiar czasu latencji do przejścia do preferowanej, oświetlonej komory.Muchy wykazujące pozytywną fototaksję są następnie warunkowane, aby kojarzyć oświetloną komorę z gorzkim smakiem chininy. Ostatecznie badane jest, jak dobrze muchy kojarzą bodziec awersyjny z oświetloną komorą, co stanowi miarę uczenia się i pamięci. Ola, witaj w laboratorium X.Dzisiaj zaprezentujemy Państwu dwa powszechnie stosowane testy behawioralne służące do badania neurodegeneracji u drosophila. Najpierw przedstawimy test supresji awersyjnej fototaksji, który zaprezentują Wil Fredo sala, student studiów licencjackich w naszym laboratorium, oraz ja, a następnie test negatywnej geotaksji, który zaprezentuje kaiwan, doktorant w naszym laboratorium. Muchy należy utrzymywać na standardowej pożywce agarowej z mąką kukurydzianą, melasą i drożdżami w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność.W dniu zamknięcia naczyń, podziel dziewicze muchy na grupy po 20 osobników. Muchy dziewicze rozpoznaje się po jasnym kolorze oraz ciemnozielonej plamce znajdującej się na spodniej stronie odwłoka. Muchy należy przenosić do nowej fiolki co trzy dni, a w celu zminimalizowania różnic wynikających z tła genetycznego należy używać much z tego samego miotu.W badaniu geotaksji należy przetestować od 10 do 20 grup na genotyp lub traktowanie. Aby rozpocząć, należy podzielić muchy żeńskie i męskie na grupy po 10 osobników. Muchy te powinny być badane osobno.Ponieważ płeć ma istotny wpływ na zachowanie, należy odczekać co najmniej jedną godzinę po znieczuleniu przed przystąpieniem do dalszych czynności, aby upewnić się, że aktywność lokomotoryczna nie jest zaburzona. Po całkowitym przygotowaniu much należy wyrównać otwory dwóch pustych fiolek polistyrenowych, łącząc je pionowo na dolnej fiolce.Odmierz osiem centymetrów od dołu i narysuj okrąg wzdłuż obwodu. Po złożeniu aparatury przenieś grupę 10 much do dolnej probówki. Natychmiast połącz probówki i pozostaw muchy na minutę w celu aklimatyzacji przed przeprowadzeniem testu.Po tym, jak muchy osiądą, delikatnie ostukaj je na dno probówki i zmierz liczbę much, które w ciągu 10 sekund wspiną się powyżej zaznaczenia ośmiu centymetrów. Liczbę much w danej grupie, które przekroczyły tę linię, zapisuje się jako procent całkowitej liczby much. Powtórz tę procedurę 10 razy dla każdej grupy, pozwalając muchom odpocząć przez jedną minutę między próbami.Na sześć godzin przed analizą PS posortuj samice much do probówek polistyrenowych zawierających zwilżony wodą papier filtracyjny. Krok ten zapewnia, że muchy będą głodne i bardziej wrażliwe na smak awersyjny. W tej analizie jako bodziec awersyjny służy roztwór chininy.Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 1 µM z roztworu zapasu 0,1 M. Labirynt w kształcie litery T składa się z kolumny centralnej z klapką oraz dwóch bocznych komór: ciemnej i oświetlonej. Na wysokości 2 mm odciąć ręczną piłą zamknięty koniec dwóch plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 15 mL, dopasować adaptery łącznikowe na obu końcach i uszczelnić połączenie parafinią.Owiń jedną probówkę folią aluminiową, aby stworzyć komorę ciemną. Złóż TMAs, przykręcając komorę oświetloną i ciemną po obu stronach kolumny środkowej. Po zamknięciu klapki w części środkowej dokończ przygotowanie układu, podłączając źródło światła do adaptera komory oświetlonej. Bezpośrednio przed wykonaniem testu przenieś każdą muchę z grupy 10 osobników do pustej probówki wirówkowej o pojemności 15 milliliter i lekko zakręć nakrętkę, aby zapobiec ucieczce.Następnie odkręć ciemną komorę od TMAs. Przenieś jedną muchę do probówki i natychmiast włóż ją z powrotem do labiryntu. Zgaś światła w pomieszczeniu i zapal czerwoną lampę.Pozostaw muchę w ciemnej komorze na 30 sekund w celu aklimatyzacji, a następnie powoli włącz źródło światła oświetlające komorę jasną. Po oświetleniu otwórz zapadnię, która oddziela obie komory. Jeśli mucha przejdzie do komory jasnej w ciągu 10 sekund, uznaje się ją za fototaktyczną i gotową do treningu.Brak reakcji w ten sposób wskazuje na problem w systemie wzrokowym i wymaga wykluczenia osobnika z testu. Po potwierdzeniu dodatniej fototaksji, należy zapędzić muchę z powrotem do ciemnej komory, zamknąć zapadkę i wyłączyć światło podczas 32-sekundowego okresu odpoczynku. Bodziec awersyjny przygotowuje się poprzez umieszczenie papieru filtracyjnego w oświetlonej komorze i naniesienie pipetą 1 mL roztworu chininy na papier filtracyjny.Należy upewnić się, że cały papier filtracyjny jest całkowicie zwilżony bodźcami awersyjnymi. Aby rozpocząć warunkowanie, powoli otwórz zapadkę i zapal światło. Pozwól musze wejść do oświetlonej komory o zapachu chininy.Po jednej minucie dotknij muchy, aby wróciła do ciemnej komory. Powtórz tę procedurę dziewięciokrotnie, aby przeprowadzić łącznie 10 prób warunkowania. Zazwyczaj muchy tego typu unikają oświetlonej komory po trzech do pięciu próbach treningowych bezpośrednio po zakończeniu treningu.Przeprowadź pięć prób testowych. Jeśli wyszkolona mucha nie wejdzie w światło komory w ciągu 10 sekund, uznaje się to za sukces. Odnotowuje się i określa odsetek sukcesów w pięciu kolejnych próbach.PC zero. Po treningu i początkowych pomiarach PC zero, każdą muchę umieszcza się z powrotem w oryginalnej ponumerowanej probówce z pokarmem i odstawia na sześć godzin. Sześć godzin po treningu przeprowadza się pięć dodatkowych prób testowych zgodnie z wcześniejszą procedurą; odsetek sukcesów w tych próbach stanowi wartość PC sześć i jest miarą pamięci krótkotrwałej.W teście negatywnej geotaksji liczbę much przekraczających markę ośmiu centymetrów przelicza się na procent i przedstawia jako wskaźnik sukcesu wspinania się. W ciągu 10 prób, widocznych tutaj po prawej stronie, 10-dniowe samce lub samice much z nadekspresją ludzkiego białka tau wykazują znaczące deficyty lokomocyjne w porównaniu z muchami w tym samym wieku z nadekspresją GFP widocznymi po lewej stronie.Wyniki w teście supresji awersyjnej fototaksji są reprezentowane przez średni wskaźnik przejścia lub procent udanych prób unikania. W stosunku do całkowitej liczby prób, muchy z nadekspresją białka tau przedstawione tutaj po prawej stronie wykazują słabszą zdolność do kojarzenia światła z gorzkim smakiem w porównaniu z grupą kontrolną po lewej stronie, zarówno bezpośrednio po treningu, jak i podczas testowania sześć godzin później. Po wykonaniu tej procedury można pobrać próbki do analizy immunohistochemicznej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące różnic morfologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać uczenie się i pamięć u muszek owocówek.I pamiętajcie, że wszystko kręci się wokół Was.

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ocena defektu aktywności ruchowej, uczenia się i pamięci w modelach Drosophila neurodegeneracji

Opisano metodę pomiaru pamięci asocjacyjnej dorosłego Drosophila. Test opiera się na zdolności muchy do kojarzenia prezentowanego zapachu z negatywnym wzmacniaczem (porażeniem prądem), a następnie przywoływania tych informacji w późniejszym czasie, co pozwala na pomiar pamięci.

Drosophila Uczenie się szoku węchowego u dorosłych

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Przedstawiamy zoptymalizowany, niedrogi i wiarygodny test negatywnej geotaksji u Drosophila melanogaster jako model zaburzeń neurodegeneracyjnych. Będąc bardziej wrażliwym na łagodne wady narządu ruchu, test ten pomoże w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych interakcji genetycznych i celów leków.

Analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu Drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Ten protokół opisuje test uczenia się i zapamiętywania u Drosophila zwany warunkowaniem zalotów. Ten klasyczny test opiera się na zmniejszeniu zachowań związanych z zalotami samców po odrzuceniu seksualnym przez niepodatną samicę z premfetem. Ta naturalna forma plastyczności behawioralnej może być wykorzystana do testowania uczenia się, pamięci krótkotrwałej i pamięci długotrwałej.

Drosophila Warunkowanie zalotów jako miara uczenia się i pamięci

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Ten krok po kroku protokół analizuje zachowanie Drosophila w ujemnej geotaksji za pomocą zautomatyzowanego systemu wielocylindrowego, który pomieści setki much i synchronizuje ich działania za pomocą silnika elektrycznego. Po synchronizacji zachowanie ujemnej geotaksji much jest badane, nagrywane cyfrowo i analizowane za pomocą oprogramowania RflyDetection.

Automatyczne, szybkie, iteracyjne badanie ujemnej geotaksji do analizy zachowania wspinaczy u dorosłych w modelu Drosophila neurodegeneracji

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Celem tej procedury jest wypreparowanie tkanki mięśnia podłużnego grzbietu (DLM) w celu oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych DLM (NMJs) w modelach chorób neurodegeneracyjnych przy użyciu Drosophila melanogaster.

Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłych Drosophila w związku z neurodegeneracją

Obecny protokół ocenia aktywność lokomotoryczną Drosophila poprzez śledzenie i analizowanie ruchu much na ręcznie wykonanej arenie za pomocą oprogramowania typu open source Fiji, kompatybilnego z wtyczkami do segmentacji pikseli każdej klatki na podstawie nagrania wideo w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia parametrów prędkości, odległości itp.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Poznaj metody oceny deficytów lokomotorycznych oraz uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji Drosophila melanogaster. Badania behawioralne pozwalają zrozumieć podstawy genetyczne chorób neurodegeneracyjnych.

Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów