Podskórna infekcja groncem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie przeżywalności i rozprzestrzeniania się gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA), a także poziomu chemokin i cytokin w miejscach zakażenia. W tym celu usuwa się sierść z grzbietów myszy, aby uzyskać wyraźny obszar obserwacji. W drugim kroku.

MRSA w zawiesinie zostanie podany myszom podskórnie trzy dni po zakażeniu; patologie infekcji oraz liczbę bakterii można ocenić, wyznaczając liczbę jednostek tworzących kolonie z homogenatów tkanek na płytkach z agarem. Witaj, jak się miewasz? Nazywam się De Lordon.

Jestem pracownikiem naukowym po doktoracie. Cześć, nazywam się Mariel Sanchez. Jestem doktorantką, a ja jestem Andrea Huda.

Jestem pracownikiem naukowym w laboratorium George'a Lee w oddziale pediatrii Cedar-Sinai Medical Center. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny, takie jak modelowanie ciężkich infekcji, w tym zapalenia mięśni, zapalenia wielomięśniowego oraz zapalenia powięzi z martwicą. Chociaż metoda ta pozwala uzyskać wgląd w przebieg ciężkich infekcji nagłych, może być ona stosowana również w odniesieniu do innych układów, takich jak paciorkowce grupy A oraz inne organizmy.

Dodatkowo możemy badać funkcję i patogenezę innych organizmów wywołujących zapalenie mięśni oraz zapalenie wielomięśniowe. Zazwyczaj osoby rozpoczynające tę procedurę mogą napotkać trudności, ponieważ jeden z regulatorów globalnych obszarów caucus jest wysoce zmienny. Jeśli nie zachowa się ostrożności, zebrane dane mogą wykazywać znaczne wariacje, co spowoduje trudności w ich interpretacji.

Zacznijmy. W laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL 2 przygotuj płytkę z agarem z krwią owczą na bazie TSA oraz sterylną pętlę, wykorzystując blok mrożący. Wyjmij kulturę szczepową Mercer z przechowywania w temperaturze -80 °C.

Następnie, używając sterylnej pętli, odłam mały kawałek lodu z kultury macierzystej i przenieś go na płytkę. Po pobraniu niewielkiego fragmentu kultury macierzystej Mercer, niezwłocznie przenieś ją z powrotem do zamrażarki, aby uniknąć rozmrożenia, ponieważ powtarzane cykle zamrażania i rozmrażania uszkodzą kulturę macierzystą. Użyj pętli do wysiewania na agarze, aby umożliwić wzrost pojedynczych kolonii Mercer.

Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez noc bez dodatku CO2. Następnego dnia przygotować i opisać nową płytkę z agarem krwi, płytkę TSA oraz probówkę z nakrętką typu snap o pojemności 15 ml zawierającą 3 ml THB.

Wyjmij szalkę z pożywką M SSA po inkubacji nocnej i zbadaj fenotyp hemolityczny kolonii. Za pomocą sterylnej pętli wybierz kolonię o fenotypie zgodnym z koloniami z poprzednich eksperymentów. Zaszczep pożywkę THB wybraną kolonią, stosując tę samą technikę posiewu kreskowego.

Płytkę z roztworem THB inkubuje się w temperaturze 37°C przez noc z wytrząsaniem przy 220 obr./min. Bakterie te zostaną wykorzystane do inokulacji hodowli w celu wywołania infekcji podskórnej u myszy w kolejnych krokach. Płytkę z agarem krwawym należy również umieścić w inkubatorze.

Płytkę wykorzysta się następnego ranka, aby potwierdzić, że fenotyp hemolityczny bakterii w roztworze THB jest zgodny z fenotypem pierwotnie wyselekcjonowanej kolonii. Jeśli fenotyp hemolizy nie jest zgodny z oryginalnym klonem, nie należy rozpoczynać eksperymentu. Przenieś mysz na platformę i ogol futro na jej grzbiecie.

Jeśli zwierzę jest nadmiernie agresywne, konieczna może być sedacja izofluranem. Na ogoloną skórę należy nanieść około 5 mm³ kremu do depilacji, np. NA. Preparat NA można nabyć w lokalnej aptece.

Należy upewnić się, że zakupiony krem do depilacji zawiera olej dla dzieci, ponieważ produkt bez tego składnika będzie zbyt drażniący dla myszy. Pozostaw krem na powierzchni skóry na około jedną minutę. Podczas inkubacji kremu do depilacji zwilż kilka ręczników papierowych wodą dwukrotnie destylowaną. Po upływie minuty użyj mokrych ręczników papierowych, aby dokładnie wytrzeć ogoloną obszar.

Upewnij się, że skóra jest wolna od kremu do depilacji. Podgrzej wstępnie 10 ml THB w probówce z nakrętką o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C w inkubatorze do bakterii przez okres od 4 do 10 godzin. Przenieś 20 µl nocnej hodowli bakterii do wstępnie podgrzanego THB. Pozwoli to na rozcieńczenie nocnej hodowli.

Zawiesina w rozcieńczeniu od 1:100 do 1:500. Probowkę należy umieścić w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 220 obr./min na około dwie i pół do trzech godzin. Po okresie inkubacji należy użyć większej ilości podłoża THB, aby dodatkowo rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną do 1:10, a następnie zmierzyć zawiesinę za pomocą spektrofotometru.

Przy absorbancji 514 nm. Inkubuj zawiesinę w 37°C przy wstrząsaniu z prędkością 220 obr./min aż do momentu, gdy rozcieńczenie 1:10 zawiesiny osiągnie wartość 0,25. Aby zebrać M er, wiruj probówkę 50 ml przy 3 225 ×g przez 10 minut w temperaturze 4°C, odrzuć nadsącz i resuspenduj.

Zawiesić osad bakteryjny w 10 mililitrach DPBS i ponownie przemyć bakterie, powtarzając etap wirowania dla tego modelu ciężkiej infekcji. Ponownie zawiesić osad bakteryjny w około jednym mililitrze DPBS, co pozwoli uzyskać stężenie około 1 × 10¹⁰ jednostek tworzących kolonie (CFU) na mililitr. Przygotować płytki agarowe z krwią owczą A-R-T-S-A, wykonać seryjne rozcieńczenia bakterii od 10⁻¹ do 10⁻⁸ w DPBS i wysiać na płytki.

Nanieś krople po 10 µL seryjnie rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej na płytkę z agarem krwi w trzech powtórzeniach. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Po inkubacji trwającej od 16 do 18 godzin zaobserwuj i zapisz fenotyp hemolizy szczepu.

Policz jednostki tworzące kolonie na płytkach. Dawka inokulum infekcyjnego zostanie obliczona na podstawie liczby jednostek tworzących kolonie na płytkach.

Przygotuj strzykawkę z 100 µL wcześniej przygotowanej zawiesiny bakteryjnej w DPBS. Przed wstrzyknięciem myszy należy poddać sedacji, tak aby częstość ich oddechów wynosiła około jednego oddechu na sekundę. Na potrzeby demonstracyjne w tym filmie pokazano mysz poddaną eutanazji.

Wstrzyknij M ser w jeden bok po wykonaniu iniekcji. Przenieś mysz z powrotem do klatki. Obserwuj zwierzęta przez trzy do pięciu godzin po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że mysz żyje przed przeniesieniem jej z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt.

Codziennie monitoruj zmiany na grzbietach zwierząt po ich uśmierceniu. Zmierz i zapisz wielkość oraz stan zmian na skórze. Powierzchnię zmian skórnych i mięśniowych wyznacza się poprzez pomnożenie długości i szerokości zmiany w milimetrach.

Zmiany o nieregularnym kształcie należy podzielić na mniejsze, symetryczne fragmenty, a każdy z nich zmierzyć tą samą metodą. Przygotować probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierające 100 µl DPBS do pobierania tkanek. Naciąć skórę sterylnym ostrzem brzytwy i wyciąć zmianę za pomocą sterylnych nożyczek.

Podczas wycinania zmiany należy upewnić się, że wycięto również około dwóch do pięciu milimetrów zdrowej skóry otaczającej ten obszar. Umieść zmianę w probówkach do pobierania tkanek w celu analizy zmian mięśniowych. Ostrożnie odwarstw skórę, aby zmierzyć rozmiar i odnotować stan zmiany w tkance mięśniowej.

Pobierz śledzionę i nerki. Umieść te tkanki w osobnych probówkach do pobierania próbek. Zhomogenizuj tkanki, mieszając je za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL przez około 30 sekund.

Do każdej probówki dodać 900 µL DPBS. Przygotować płytki THA i mieszać homogenizowane próbki tkanek w wortexie przez pięć minut. Próbkę poddać rozcieńczeniu seryjnem.

Zawiesiny rozcieńczamy w szeregu od 1 do 10⁶. Na płytki 96-dołkowe nanosi się po 10 µL każdej kolejno rozcieńczonej zawiesiny. Płytki inkubuje się przez noc w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C.

Następnego ranka należy zliczyć jednostki tworzące kolonie z płytek i obliczyć ich liczbę w oparciu o stopnie rozcieńczenia. Jeśli infekcja została przeprowadzona prawidłowo, bezpośrednio po wstrzyknięciu podskórnym na powierzchni skóry powinien pojawić się pęcherzyk. Brak pęcherzyka może oznaczać, że iniekcja została wykonana zbyt głęboko, co może wpłynąć na wynik infekcji.

Wielkość zmian oraz przeżywalność bakterii można oceniać w różnych punktach czasowych po zakażeniu MSA. Następujące zmiany skórne zostały zbadane w trzeciej dobie po zakażeniu i stanowią przykłady zmian u myszy CD1 zakażonej w jednym boku dawką 1×10⁷ jednostek tworzących kolonie. Zmiany mięśniowe znajdują się zazwyczaj w tkance poniżej zmian skórnych.

Poniżej przedstawiono przykłady odpowiadających im zmian na powierzchni mięśni dla wcześniej pokazanych zdjęć zmian skórnych. Są to zmiany w mięśniach zaobserwowane w trzeciej dobie po zakażeniu u myszy zainfekowanej dawką 1 × 10⁷ jednostek tworzących kolonie. Powierzchnię zmiany określa się jako iloczyn długości i szerokości zmiany zmierzonej w milimetrach; może ona służyć do oceny uszkodzenia tkanki skóry.

Liczbę jednostek tworzących kolonie bakterii zlokalizowanych w miejscu infekcji można określić ilościowo w wyciętych zmianach chorobowych. Liczba jednostek tworzących kolonie może wskazać, czy czynnik wirulencji zapewnia MSA przewagę przeżycia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o stosowaniu standardowych środków ostrożności ze względu na użycie igieł i wysoce patogennych drobnoustrojów.

W przypadku modelu ropnia stosujemy dawkę inokulum 1 000 razy niższą niż w naszym podstawowym modelu, co pozwala na udzielenie odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: jakie czynniki S sprzyjają trwałej infekcji RSA? Należy pamiętać, że praca ze strzykawkami wypełnionymi Mars A może być niezwykle niebezpieczna, dlatego konieczne jest przestrzeganie środków ostrożności, takich jak bezpośrednie wyrzucanie strzykawki do pojemnika na odpady ostre, aby uniknąć przypadkowego zakłucia igłą. Ponadto w tym eksperymencie ważne jest przestrzeganie standardowych protokołów BSO 2, aby zapewnić właściwą dezynfekcję obszaru roboczego.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie. Cześć. Cześć, do widzenia.