Podskórne zakażenie opornego na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA)

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie przeżywalności i rozprzestrzeniania się gronkowca złocistego opornego na metycylinę lub MA, a także poziomu chemokin i cytokin w miejscach infekcji. Osiąga się to poprzez usunięcie sierści z grzbietów myszy, aby umożliwić wyraźny obszar obserwacji. Jako drugi krok.

MRSA w zawiesinie będzie podawany myszom podskórnie trzy dni po zakażeniu, patologie infekcji i liczbę bakterii można ocenić, określając liczbę jednostek tworzących kolonie z homogenatów tkankowych na płytkach agarowych. Witaj jak się masz? Nazywam się De Lordon.

Zajmuję się badaniem pocztowym. Cześć, nazywam się Mariel Sanchez. Jestem doktorantką i nazywam się Andrea Huda.

Jestem pracownikiem naukowym, jesteśmy częścią laboratorium George'a Lee na oddziale pediatrycznym w Cedar-Sinai Medical Center. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny, takie jak modelowanie ciężkiej infekcji, w tym zapalenia mięśni, zapalenia wielomięśniowego i martwiczego zapalenia powięzi. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w ciężkie infekcje awaryjne, może być również stosowana do innych systemów, takich jak paciorkowce grupy A i inne organizmy.

Dodatkowo możemy badać funkcję i patogenezę innych organizmów, które powodują zapalenie mięśni i zapalenie wielomięśniowe. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej procedurze mogą mieć problemy, ponieważ jeden z pracowników globalnego regulatora w obszarach caucus jest wysoce zmienny. Jeśli nie zostanie zachowana ostrożność, zebrane dane mogą się znacznie różnić, co spowoduje trudności z interpretacją danych dotyczących daty.

Zacznijmy. W obiekcie BSL two przygotuj płytkę z agarem z krwią owczą w bazie TSA i sterylną pętlę za pomocą zamrożonego bloku. Przenieś kulturę Mercer z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Następnie za pomocą sterylnej pętli rozbij na talerzu mały kawałek lodu z kultury podstawowej. Po zdobyciu małego wióra kultury podstawowej Mercer natychmiast przenieś ją z powrotem do zamrażarki, aby uniknąć rozmrożenia, ponieważ wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie spowoduje uszkodzenie kultury podstawowej. Użyj pętli, aby rozciągnąć agar, ułatwiając wzrost poszczególnych kolonii Mercer.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc bez dodatku CO2. Następnego dnia. Przygotuj i oznacz zarówno nowy arkusz jaja krwi, płytkę TSA, jak i 15-mililitrową tubkę z zatrzaskiem trzema mililitrami THB.

Pobrać wyhodowaną przez noc płytkę M SSA i zbadać fenotyp hemolityczny kolonii. Za pomocą sterylnej pętli wybierz kolonię, która ma fenotyp zgodny z poprzednimi koloniami eksperymentalnymi. Zaszczep THB wybraną kolonią, używając tej samej smugi pętli.

Na płytce inkubuje się roztwór THB w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc z wytrząsaniem z prędkością 220 obrotów na minutę. Bakterie te zostaną wykorzystane do zaszczepienia kultury w celu podskórnego zakażenia myszy w późniejszych etapach. Umieść również płytkę z agarem z krwią w inkubatorze.

Płytka zostanie użyta następnego ranka w celu potwierdzenia, że fenotyp hemolityczny bakterii w roztworze THB odpowiada fenotypowi pierwotnie wybranej kolonii. Jeśli fenotyp hemolizy nie jest zgodny z oryginalnym klonem, nie rozpoczynaj eksperymentu. Przenieś mysz na platformę i zgol futro z jej grzbietu.

Jeśli zwierzę jest zbyt agresywne, może być konieczne uspokojenie izofluorem. Nałóż około pięciu milimetrów sześciennych kremu do usuwania włosów, takiego jak NA, na ogolony obszar. NA można kupić w lokalnej aptece.

Upewnij się, że kupiłeś krem do depilacji zawierający olejek dla dzieci, ponieważ produkt bez oliwki dla niemowląt będzie zbyt stymulujący dla myszy. Pozostaw krem do inkubacji na powierzchni skóry przez około minutę, podczas gdy krem do depilacji inkubuje zwilż kilka ręczników papierowych wodą podwójnie destylowaną po minucie. Użyj mokrych ręczników papierowych, aby wytrzeć ogolony obszar do czysta.

Upewnij się, że skóra jest wolna od kremu do depilacji, podgrzej 10 mililitrów THB w 50-mililitrowej tubce z nakrętką w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bakterii przez cztery do 10 godzin. Przenieś 20 mikrolitrów nocnej kultury bakterii do wstępnie podgrzanego THB. Spowoduje to rozcieńczenie nocnego najemnika.

Zawieszenie od jednego do 500. Umieść probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 220 obrotów na minutę przez około dwie i pół do trzech godzin po okresie inkubacji. Użyj więcej THB, aby dodatkowo rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną do 1 do 10 i zmierz zawiesinę za pomocą spektrofotometru.

O chłonności 514 nanometrów. Kontynuuj ponowną inkubację zawiesiny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 220 obrotów na minutę, aż rozcieńczona zawiesina w proporcji jeden do 10 osiągnie 0,25. Aby zebrać wirówkę Mer , 50-mililitrową rurkę o ciśnieniu 3 225 razy większym niż grawitacja przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wyrzuć supinatonowy Resus.

Zawieś paletę bakteryjną w 10 mililitrach DPBS i ponownie umyj bakterie, powtarzając etap wirowania dla tego modelu ciężkiej infekcji. Ponownie zawiesić osad bakteryjny w około jednym mililitrze DPBS, co daje około 10 do 10 jednostek tworzących kolonię na mililitr. Złóż płytki A-R-T-S-A z krwią owczą, seryjnie rozcieńcz bakterie od 10 do jednego do 10 do ośmiokrotnie na płytce DPBS.

10 mikrolitrów kropli seryjnie rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej na płytce z agarem z krwią w trzech egzemplarzach. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji płytek przez 16 do 18 godzin, obserwuj i zapisuj fenotyp hemolizy inokulki.

Policz jednostki tworzące kolonie na płytkach. Inokulara infekcji zostanie obliczona na podstawie jednostki tworzącej kolonię. Numer na tabliczkach.

Przygotować strzykawkę ze 100 mikrolitrami zawiesiny bakteryjnej w przygotowanym wcześniej DPBS. Przed wstrzyknięciem myszom należy podać środki uspokajające, tak aby ich częstość oddechów wynosiła mniej więcej raz na sekundę. W celach demonstracyjnych na tym filmie pokazano mysz poddaną eutanazji.

Po wstrzyknięciu wstrzyknąć M ser w jedną flankę. Przenieś mysz z powrotem do klatki. Obserwuj zwierzęta przez trzy do pięciu godzin po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że mysz jest żywa przed przeniesieniem z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt.

Codziennie po uśmierceniu zwierząt należy monitorować zmiany chorobowe na grzbietach zwierząt. Zmierz i zapisz wielkość i stan zmian na skórze. Zarówno obszary zmian skórnych, jak i mięśniowych określa się ilościowo, mnożąc długość i szerokość zmiany w milimetrach.

Zmiany o nieregularnym kształcie muszą być podzielone na mniejsze symetryczne części, a każdy fragment musi być mierzony tą samą metodą. Przygotuj 1,5 mililitra mikroprobówki wirówkowe ze 100 mikrolitrami DPBS do pobrania tkanek. Naciąć skórę sterylną żyletką i wyciąć zmianę sterylnymi nożyczkami.

Podczas wycinania zmiany upewnij się, że wycięto również około dwóch do pięciu milimetrów zdrowej skóry otaczającej ten obszar. Umieść zmianę w probówkach do pobierania tkanek w celu analizy zmian w mięśniach. Ostrożnie zdejmij skórę, aby zmierzyć rozmiar i zarejestrować stan zmiany na tkance mięśniowej.

Zbierz śledzionę i nerki. Umieść te tkanki w osobnych probówkach do pobierania pokarmów. Homogenizować tkanki, mieszając strzykawką o pojemności jednego mililitra przez około 30 sekund.

Dodaj 900 mikrolitrów DPBS do każdej probówki. Złóż płytki THA, wiruj homogenizowane próbki tkanek przez pięć minut. Próbkę należy rozcieńczyć seryjnie.

Zawieszenia mają tendencję do jednego do 10 do sześciu razy. W 96 dołkach płytki dozują 10 mikrolitrów każdej seryjnie rozcieńczonej zawiesiny na płytki. Inkubuj płytki w inkubatorze bakterii o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego ranka policz jednostki tworzące kolonie z płytek i oblicz liczbę jednostek tworzących kolonie na podstawie współczynników rozcieńczenia. Jeśli infekcja zostanie wykonana prawidłowo, natychmiast po wstrzyknięciu podskórnym na powierzchni skóry pojawi się pęcherzyk. Jeśli nie zaobserwuje się pęcherzyka, wstrzyknięcie może być zbyt głębokie, co może mieć wpływ na wynik zakażenia.

Wielkość zmiany i przeżywalność bakterii mogą być oceniane w różnych momentach po zakażeniu MSA. Następujące zmiany skórne zostały zbadane w trzecim dniu po zakażeniu i są przykładami zmiany na płycie CD: jedna mysz zakażona na jednym boku z jednym razy 10 do siedmiu jednostek tworzących kolonię. Zmiany mięśniowe zwykle znajdują się w tkance poniżej zmian skórnych.

Poniżej znajdują się przykłady zbieżnych zmian powierzchniowych mięśni dla wcześniej pokazanych zdjęć zmian skórnych. Są to zmiany mięśniowe obserwowane w trzecim dniu po zakażeniu u myszy zakażonej jedną liczbą od 10 do siedmiu jednostek tworzących kolonię. Obszar zmiany określa się jako długość razy szerokość zmiany mierzoną w milimetrach i może być mierzony w celu oceny uszkodzenia tkanki skóry.

Liczbę jednostek tworzących kolonie bakterii zlokalizowanych w miejscu zakażenia można określić ilościowo na zmianach wyciętych. Liczba jednostek tworzących kolonie może wskazywać, czy czynnik wirulencji zapewnia MSA przewagę w zakresie przeżycia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o stosowaniu standardowych środków ostrożności związanych z użyciem igieł i drobnoustrojów wysoce zjadliwych Postępując zgodnie z tą procedurą.

Wreszcie, ponieważ model ropnia, którego używamy, 1,000 razy niższy wzrok w porównaniu z naszym modelem, może być wykorzystany do odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: Jakie są czynniki S, które sprzyjają uporczywemu zakażeniu RSA? Nie zapominaj, że praca ze strzykawkami wypełnionymi Mars A może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak wyrzucenie strzykawki bezpośrednio do ostrego narzędzia, ważne jest, aby uniknąć przypadkowego dźgnięcia igłą. Ponadto w tym eksperymencie ważne jest przestrzeganie standardowych protokołów BS O2, aby zapewnić prawidłową dezynfekcję obszaru roboczego.

Więc to wszystko. Dzięki za oglądanie. Cześć, do widzenia.