Name: Transformacja plazmidowego DNA w E. coli metodą szoku cieplnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę szoku cieplnego do transformacji kompetentnych komórek E. coli plazmidowym DNA. Technika ta umożliwia przygotowanie bakterii do dalszych badań z wykorzystaniem modelu Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

transformacja dna plazmidowego do e. coli metodą szoku termicznego

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformacja plazmidowego DNA do E. coli z wykorzystaniem metody szoku termicznego jest podstawową techniką biologii molekularnej. Polega ona na wprowadzeniu obcego plazmidu lub produktu ligacji do bakterii. Niniejszy protokół wideo opisuje tradycyjną metodę transformacji z użyciem komercyjnie dostępnych bakterii chemicznie kompetentnych firmy Genlantis. Po krótkiej inkubacji w lodzie mieszaninę chemicznie kompetentnych bakterii i DNA umieszcza się w temperaturze 42°C przez 45 sekund (szok termiczny), a następnie ponownie przenosi do lodu. Dodaje się pożywkę SOC, a transformowane komórki inkubuje się w temperaturze 37°C przez 30 min z wytrząsaniem. Aby zapewnić izolację kolonii niezależnie od wydajności transformacji, na płytki wysiewa się dwie ilości transformowanych bakterii. Ten tradycyjny protokół może być z powodzeniem stosowany do transformacji większości komercyjnie dostępnych bakterii kompetentnych. Komórki TurboCells firmy Genlantis mogą być również wykorzystane w nowym, 3-minutowym protokole transformacji opisanym w instrukcji obsługi.

Transformacja DNA plazmidowego do E. coli metodą szoku termicznego

Transformacja plazmidowego DNA do komórek E. coli z wykorzystaniem metody szoku termicznego jest podstawową techniką biologii molekularnej. Polega ona na wprowadzeniu obcego...

Cześć, nazywam się Alex Hoge. Pracuję w laboratorium Gym Hall na Wydziale Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić transformację elektrycznie kompetentnych komórek e coli metodą elektroporacji.Dzisiaj wykorzystam tę technikę do transformacji szczepu E. coli produktem ligacji, ponieważ przygotowuję sondę do przeprowadzenia in situ hybridization w całych zarodkach zebrafish. Dobrze, zaczynamy proces transformacji. Najpierw należy przygotować łaźnię wodną lub blok grzewczy ustawiony na 42 °C.Bakterie, które właśnie wyjęto z głównej hodowli, należy utrzymać w lodzie. Dzisiaj wykorzystamy elektrokompetentne komórki z zapasów oraz DNA w lodzie. Niezbędna jest również probówka z pożywką SOC w temperaturze pokojowej lub 37°C oraz płytki z pożywką LV z dodatkiem antybiotyku.Teraz dodam DNA do bakterii. Pracuję w pobliżu płomienia, aby nie zanieczyścić bakterii. Następnie dodaję bakterie.Należy dodać 50 µL bakterii, a następnie natychmiast przenieść próbkę z powrotem na lód; można lekko potrząsnąć probówką, aby wymieszać bakterie z DNA, i pozostawić na lodzie do 15 minut. Po upływie 15 minut można przystąpić do szoku termicznego

transformation-of-plasmid-dna-into-e-coli-using-the-heat-shock-method

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przemiana DNA plazmidowego w E. coli metodą uderzenia cieplnego

Mutageneza celowana całych plazmidów to prosty sposób na stworzenie nieco odmiennych wariantów oryginalnego plazmidu. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwą i kosztowo efektywną metodę wprowadzania substytucji zasad w plazmidzie przy użyciu standardowych odczynników.

Własna metoda mutagenezy celowanej całych plazmidów

Źródło: Stefan, A. i wsp., Wieloaspektowe korzyści z koekspresji białek w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia procedurę przekształcania Escherichia coli w plazmid przenoszący gen oporności na antybiotyki, w tym przygotowanie komórek, elektroporację, odzyskiwanie i selekcję transformantów.

Przygotowanie i przemiana bakterii za pomocą elektroporacji wysokonapięciowej

Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą wprowadzania DNA do bakterii w procesie znanym jako transformacja. Tradycyjne protokoły przygotowania ogniw elektrokompetentnych są czasochłonne i pracochłonne. W artykule opisano alternatywną, szybką i wydajną metodę przygotowania ogniw elektrokompetentnych, obecnie stosowaną przez niektóre laboratoria.

Szybki protokół przygotowania elektrokompetentnych Escherichia coli i Vibrio cholerae

Ten protokół demonstruje aktywność białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). Komórki E. coli dnaK756 służą jako model dla testu, ponieważ zawierają natywny, funkcjonalnie upośledzony Hsp70, co czyni je podatnymi na stres cieplny. Heterologiczne wprowadzenie funkcjonalnego Hsp70 ratuje niedobór wzrostu komórek.

Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Montaż in vivo to metoda klonowania niezależna od ligacji, która opiera się na wewnętrznych enzymach naprawy DNA u bakterii w celu złożenia fragmentów DNA przez rekombinację homologiczną. Protokół ten jest zarówno czasochłonny, jak i opłacalny, ponieważ wymagana jest niewielka liczba odczynników, a skuteczność klonowania może sięgać nawet 99%.

Zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu

Oczyszczanie plazmidowego DNA z E. coli jest podstawową techniką w klonowaniu molekularnym. Oczyszczanie w małej skali (miniprep) z mniej niż 5 ml hodowli bakteryjnej...

Oczyszczanie plazmidowego DNA z kolonii bakteryjnych przy użyciu zestawu Qiagen Miniprep Kit

Niniejsza praca pokazuje, jak tworzyć hybrydy RNA/DNA na poziomie chromosomowym oraz wykazać transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży.

Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

Przedstawiamy procedurę, w której dwuwymiarowa analiza w żelu agarozowym może zostać wykorzystana do identyfikacji struktury produktów pośrednich replikacji powstających po napromieniowaniu UV.

Wizualizacja indukowanych promieniami UV produktów pośrednich replikacji w E. coli przy użyciu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym

Niniejszy protokół stanowi kosztowo efektywną alternatywę dla wydajnego równoległego klarowania i oczyszczania plazmidowego DNA z kultur E. coli. Proces AcroPrep Advance rozpoczyna się od zoptymalizowanej płyty filtracyjnej do klarowania lizatu, a następnie obejmuje oczyszczanie na płycie filtracyjnej do wiązania DNA o wysokiej pojemności wiązania.

Uproszczone oczyszczanie plazmidowego DNA z kultur prokariotycznych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Poznaj metodę szoku cieplnego do transformacji kompetentnych komórek E. coli plazmidowym DNA. Technika ta umożliwia przygotowanie bakterii do dalszych badań z wykorzystaniem modelu Danio rerio.

Transformacja DNA plazmidowego do E. coli metodą szoku termicznego

Przeglądaj więcej filmów