Transformacja DNA plazmidowego do E. coli metodą szoku termicznego

Cześć, nazywam się Alex Hoge. Pracuję w laboratorium Gym Hall na Wydziale Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić transformację elektrycznie kompetentnych komórek e coli metodą elektroporacji.

Dzisiaj wykorzystam tę technikę do transformacji szczepu E. coli produktem ligacji, ponieważ przygotowuję sondę do przeprowadzenia in situ hybridization w całych zarodkach zebrafish. Dobrze, zaczynamy proces transformacji. Najpierw należy przygotować łaźnię wodną lub blok grzewczy ustawiony na 42 °C.

Bakterie, które właśnie wyjęto z głównej hodowli, należy utrzymać w lodzie. Dzisiaj wykorzystamy elektrokompetentne komórki z zapasów oraz DNA w lodzie. Niezbędna jest również probówka z pożywką SOC w temperaturze pokojowej lub 37°C oraz płytki z pożywką LV z dodatkiem antybiotyku.

Teraz dodam DNA do bakterii. Pracuję w pobliżu płomienia, aby nie zanieczyścić bakterii. Następnie dodaję bakterie.

Należy dodać 50 µL bakterii, a następnie natychmiast przenieść próbkę z powrotem na lód; można lekko potrząsnąć probówką, aby wymieszać bakterie z DNA, i pozostawić na lodzie do 15 minut. Po upływie 15 minut można przystąpić do szoku termicznego, który polega na inkubacji bakterii w temperaturze 42 °C przez 45 sekund. Wyjmuję probówki z lodu i przekładam je bezpośrednio do temperatury 42 °C, ustawiając timer na 45 sekund, a następnie bardzo szybko przenoszę je z powrotem z 42 °C bezpośrednio na lód.

Następnie czekamy dwie minuty. Teraz dodam pożywkę SOC do bakterii i inkubuję je w temperaturze 37°C przez 30 minut. Odmierzam 500 µL pożywki SOC, dodaję ją do bakterii i umieszczam je w mojej prowizorycznej komorze.

Jeśli zamierzają Państwo użyć probówek typu eend oraz prowizorycznej komory jako inkubatora, należy upewnić się, że probówki eend są umieszczone poziomo, ponieważ w tej pozycji będą się znacznie lepiej mieszać. Teraz możemy umieścić probówki w inkubatorze wytrząsowym. W tym celu wykorzystujemy tę niewielką komorę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Po zakończeniu inkubacji w temperaturze 37°C przejdziemy do wysiewania bakterii na podłoże LB z antybiotykami. W moim przypadku jest to chloramphenicol. Naniosłem 50 µL każdej próbki na płytkę.

Pozostałe 500 µL odwirujemy w małej wirówce stołowej, aby wytrącić bakterie. Po centryfugacji otrzymamy ładny osad; teraz usuniemy prawie całą pożywkę SOC, pozostawiając jedynie 50 µL, które następnie będziemy mogli wysiać jako stężoną zawiesinę bakterii. Odpiperowałem zatem około 450 µL.

Zostawiam taką ilość. Teraz zawieszę osad w pozostałych 50 µL pożywki SOC. Następnie mogę przenieść te 50 µL na inną płytkę.

Następnie przecieram każdą płytkę, po czym przenoszę i nakładam materiał. W rezultacie dla każdej próbki otrzymamy dwie płytki. Teraz należy wysiać bakterie na płytkę LB.

Użyję szklanych kulek autoklawowanych, ale można również użyć plastikowej rurki uformowanej w taki rozcieracz. Na płytkę Petriego wyłożę kilka kulek. Tak mi odpowiada.

W takim razie, 10 15. Po dodaniu kulek układamy wszystkie płytki w stos w ten sposób i delikatnie nimi potrząsamy, aby kulki równomiernie rozniosły bakterie po całej powierzchni płytek. Przesuwam płytki, aż wyschną.

Oznacza to, że podczas przemieszczania kulek nie powinny pojawiać się duże smugi cieczy. Na przykład w tej płytce kulki mają tendencję do zbijania się, co powoduje powstawanie wielu smug. W tym przypadku kulki poruszają się swobodnie, a ta płytka jest sucha.

Płytki są już wysuszone, więc możemy usunąć koraliki. Wyciągam je w ten sposób, aby można było je poddać recyklingowi. Teraz umieścimy płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na całą noc; płytki należy ustawić dnem do góry. Po 12 godzinach inkubacji w 37°C wyjmujemy płytkę z inkubatora.

Jak widać, na płytce, na której wysiałem 50 µL, jest mniej kolonii niż na płytce, na której wysiałem resztę. Podczas transformacji bakterii kluczowe jest uzyskanie odpowiedniej liczby kolonii na płytce, czyli właściwej gęstości. W tym przypadku kolonii jest bardzo mało, natomiast przykładem odpowiedniej gęstości jest ta płytka, na której znajduje się dokładnie właściwa liczba, czyli około 100 kolonii na płytkę.

Ta płytka jest złym przykładem, ponieważ znajduje się na niej zbyt wiele kolonii i nie można wybić pojedynczych kolonii. Przedstawiłem zatem sposób transformacji e coli dla każdej metody transformacji. Bardzo istotnym aspektem tej techniki jest utrzymywanie wszystkiego w niskiej temperaturze (na lodzie) przed szokiem termicznym.

Następnie 45 sekund w temperaturze normalnej, więcej w 42°C, a potem ponownie w lodzie. Wszystkie pozostałe etapy muszą odbywać się w ciepłej temperaturze lub w 37°C. Teraz przystąpię do screeningu kolonii za pomocą metody PCR.

Jednym z celów jest również przygotowanie dwóch płytek. Przewidujemy, że na jednej z nich pojawi się wiele kolonii, a na drugiej mniej. Istotne jest, aby płytki były bardzo suche, co można osiągnąć poprzez zastosowanie kulek osuszających lub pipety.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu konfirmacji.