Name: Transformacja plazmidowego DNA w E. coli metodą szoku cieplnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę szoku cieplnego do transformacji kompetentnych komórek E. coli plazmidowym DNA. Technika ta umożliwia przygotowanie bakterii do dalszych badań z wykorzystaniem modelu Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

transformacja dna plazmidowego do e. coli metodą szoku termicznego

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformacja plazmidowego DNA do E. coli z wykorzystaniem metody szoku termicznego jest podstawową techniką biologii molekularnej. Polega ona na wprowadzeniu obcego plazmidu lub produktu ligacji do bakterii. Niniejszy protokół wideo opisuje tradycyjną metodę transformacji z użyciem komercyjnie dostępnych bakterii chemicznie kompetentnych firmy Genlantis. Po krótkiej inkubacji w lodzie mieszaninę chemicznie kompetentnych bakterii i DNA umieszcza się w temperaturze 42°C przez 45 sekund (szok termiczny), a następnie ponownie przenosi do lodu. Dodaje się pożywkę SOC, a transformowane komórki inkubuje się w temperaturze 37°C przez 30 min z wytrząsaniem. Aby zapewnić izolację kolonii niezależnie od wydajności transformacji, na płytki wysiewa się dwie ilości transformowanych bakterii. Ten tradycyjny protokół może być z powodzeniem stosowany do transformacji większości komercyjnie dostępnych bakterii kompetentnych. Komórki TurboCells firmy Genlantis mogą być również wykorzystane w nowym, 3-minutowym protokole transformacji opisanym w instrukcji obsługi.

Transformacja DNA plazmidowego do E. coli metodą szoku termicznego

Transformacja plazmidowego DNA do komórek E. coli z wykorzystaniem metody szoku termicznego jest podstawową techniką biologii molekularnej. Polega ona na wprowadzeniu obcego...

Cześć, nazywam się Alex Hoge. Pracuję w laboratorium Gym Hall na Wydziale Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić transformację elektrycznie kompetentnych komórek e coli metodą elektroporacji.Dzisiaj wykorzystam tę technikę do transformacji szczepu E. coli produktem ligacji, ponieważ przygotowuję sondę do przeprowadzenia in situ hybridization w całych zarodkach zebrafish. Dobrze, zaczynamy proces transformacji. Najpierw należy przygotować łaźnię wodną lub blok grzewczy ustawiony na 42 °C.Bakterie, które właśnie wyjęto z głównej hodowli, należy utrzymać w lodzie. Dzisiaj wykorzystamy elektrokompetentne komórki z zapasów oraz DNA w lodzie. Niezbędna jest również probówka z pożywką SOC w temperaturze pokojowej lub 37°C oraz płytki z pożywką LV z dodatkiem antybiotyku.Teraz dodam DNA do bakterii. Pracuję w pobliżu płomienia, aby nie zanieczyścić bakterii. Następnie dodaję bakterie.Należy dodać 50 µL bakterii, a następnie natychmiast przenieść próbkę z powrotem na lód; można lekko potrząsnąć probówką, aby wymieszać bakterie z DNA, i pozostawić na lodzie do 15 minut. Po upływie 15 minut można przystąpić do szoku termicznego, który polega na inkubacji bakterii w temperaturze 42 °C przez 45 sekund. Wyjmuję probówki z lodu i przekładam je bezpośrednio do temperatury 42 °C, ustawiając timer na 45 sekund, a następnie bardzo szybko przenoszę je z powrotem z 42 °C bezpośrednio na lód.Następnie czekamy dwie minuty. Teraz dodam pożywkę SOC do bakterii i inkubuję je w temperaturze 37°C przez 30 minut. Odmierzam 500 µL pożywki SOC, dodaję ją do bakterii i umieszczam je w mojej prowizorycznej komorze.Jeśli zamierzają Państwo użyć probówek typu eend oraz prowizorycznej komory jako inkubatora, należy upewnić się, że probówki eend są umieszczone poziomo, ponieważ w tej pozycji będą się znacznie lepiej mieszać. Teraz możemy umieścić probówki w inkubatorze wytrząsowym. W tym celu wykorzystujemy tę niewielką komorę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.Po zakończeniu inkubacji w temperaturze 37°C przejdziemy do wysiewania bakterii na podłoże LB z antybiotykami. W moim przypadku jest to chloramphenicol. Naniosłem 50 µL każdej próbki na płytkę.Pozostałe 500 µL odwirujemy w małej wirówce stołowej, aby wytrącić bakterie. Po centryfugacji otrzymamy ładny osad; teraz usuniemy prawie całą pożywkę SOC, pozostawiając jedynie 50 µL, które następnie będziemy mogli wysiać jako stężoną zawiesinę bakterii. Odpiperowałem zatem około 450 µL.Zostawiam taką ilość. Teraz zawieszę osad w pozostałych 50 µL pożywki SOC. Następnie mogę przenieść te 50 µL na inną płytkę.Następnie przecieram każdą płytkę, po czym przenoszę i nakładam materiał. W rezultacie dla każdej próbki otrzymamy dwie płytki. Teraz należy wysiać bakterie na płytkę LB.Użyję szklanych kulek autoklawowanych, ale można również użyć plastikowej rurki uformowanej w taki rozcieracz. Na płytkę Petriego wyłożę kilka kulek. Tak mi odpowiada.W takim razie, 10 15. Po dodaniu kulek układamy wszystkie płytki w stos w ten sposób i delikatnie nimi potrząsamy, aby kulki równomiernie rozniosły bakterie po całej powierzchni płytek. Przesuwam płytki, aż wyschną.Oznacza to, że podczas przemieszczania kulek nie powinny pojawiać się duże smugi cieczy. Na przykład w tej płytce kulki mają tendencję do zbijania się, co powoduje powstawanie wielu smug. W tym przypadku kulki poruszają się swobodnie, a ta płytka jest sucha.Płytki są już wysuszone, więc możemy usunąć koraliki. Wyciągam je w ten sposób, aby można było je poddać recyklingowi. Teraz umieścimy płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na całą noc; płytki należy ustawić dnem do góry. Po 12 godzinach inkubacji w 37°C wyjmujemy płytkę z inkubatora.Jak widać, na płytce, na której wysiałem 50 µL, jest mniej kolonii niż na płytce, na której wysiałem resztę. Podczas transformacji bakterii kluczowe jest uzyskanie odpowiedniej liczby kolonii na płytce, czyli właściwej gęstości. W tym przypadku kolonii jest bardzo mało, natomiast przykładem odpowiedniej gęstości jest ta płytka, na której znajduje się dokładnie właściwa liczba, czyli około 100 kolonii na płytkę.Ta płytka jest złym przykładem, ponieważ znajduje się na niej zbyt wiele kolonii i nie można wybić pojedynczych kolonii. Przedstawiłem zatem sposób transformacji e coli dla każdej metody transformacji. Bardzo istotnym aspektem tej techniki jest utrzymywanie wszystkiego w niskiej temperaturze (na lodzie) przed szokiem termicznym.Następnie 45 sekund w temperaturze normalnej, więcej w 42°C, a potem ponownie w lodzie. Wszystkie pozostałe etapy muszą odbywać się w ciepłej temperaturze lub w 37°C. Teraz przystąpię do screeningu kolonii za pomocą metody PCR.Jednym z celów jest również przygotowanie dwóch płytek. Przewidujemy, że na jednej z nich pojawi się wiele kolonii, a na drugiej mniej. Istotne jest, aby płytki były bardzo suche, co można osiągnąć poprzez zastosowanie kulek osuszających lub pipety.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu konfirmacji.

transformation-of-plasmid-dna-into-e-coli-using-the-heat-shock-method

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przemiana DNA plazmidowego w E. coli metodą uderzenia cieplnego

Mutageneza celowana całych plazmidów to prosty sposób na stworzenie nieco odmiennych wariantów oryginalnego plazmidu. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwą i kosztowo efektywną metodę wprowadzania substytucji zasad w plazmidzie przy użyciu standardowych odczynników.

Własna metoda mutagenezy celowanej całych plazmidów

Źródło: Stefan, A. i wsp., Wieloaspektowe korzyści z koekspresji białek w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia procedurę przekształcania Escherichia coli w plazmid przenoszący gen oporności na antybiotyki, w tym przygotowanie komórek, elektroporację, odzyskiwanie i selekcję transformantów.

Przygotowanie i przemiana bakterii za pomocą elektroporacji wysokonapięciowej

Ten protokół demonstruje aktywność białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). Komórki E. coli dnaK756 służą jako model dla testu, ponieważ zawierają natywny, funkcjonalnie upośledzony Hsp70, co czyni je podatnymi na stres cieplny. Heterologiczne wprowadzenie funkcjonalnego Hsp70 ratuje niedobór wzrostu komórek.

Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Montaż in vivo to metoda klonowania niezależna od ligacji, która opiera się na wewnętrznych enzymach naprawy DNA u bakterii w celu złożenia fragmentów DNA przez rekombinację homologiczną. Protokół ten jest zarówno czasochłonny, jak i opłacalny, ponieważ wymagana jest niewielka liczba odczynników, a skuteczność klonowania może sięgać nawet 99%.

Zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Oczyszczanie plazmidowego DNA z E. coli jest podstawową techniką w klonowaniu molekularnym. Oczyszczanie w małej skali (miniprep) z mniej niż 5 ml hodowli bakteryjnej...

Oczyszczanie plazmidowego DNA z kolonii bakteryjnych przy użyciu zestawu Qiagen Miniprep Kit

Niniejsza praca pokazuje, jak tworzyć hybrydy RNA/DNA na poziomie chromosomowym oraz wykazać transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży.

Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

Przedstawiamy procedurę, w której dwuwymiarowa analiza w żelu agarozowym może zostać wykorzystana do identyfikacji struktury produktów pośrednich replikacji powstających po napromieniowaniu UV.

Wizualizacja indukowanych promieniami UV produktów pośrednich replikacji w E. coli przy użyciu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym

Niniejszy protokół stanowi kosztowo efektywną alternatywę dla wydajnego równoległego klarowania i oczyszczania plazmidowego DNA z kultur E. coli. Proces AcroPrep Advance rozpoczyna się od zoptymalizowanej płyty filtracyjnej do klarowania lizatu, a następnie obejmuje oczyszczanie na płycie filtracyjnej do wiązania DNA o wysokiej pojemności wiązania.

Uproszczone oczyszczanie plazmidowego DNA z kultur prokariotycznych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Poznaj metodę szoku cieplnego do transformacji kompetentnych komórek E. coli plazmidowym DNA. Technika ta umożliwia przygotowanie bakterii do dalszych badań z wykorzystaniem modelu Danio rerio.

Transformacja DNA plazmidowego do E. coli metodą szoku termicznego

Przeglądaj więcej filmów