Transformacja plazmidowego DNA w E. coli metodą szoku cieplnego

Cześć, nazywam się Alex Hoge. Pracuję w siłowni Hall Lab na Wydziale Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. A dzisiaj pokażę Ci, jak przekształcić kompetentne elektrycznie E. coli metodą każdego wstrząsu.

Więc dzisiaj używam tej techniki do transformacji coli za pomocą mojego produktu do lacji, ponieważ próbuję przeprowadzić całe dosiadanie u danio pręgowanego. Dobrze, więc zaczniemy robić transformację. Więc najpierw musisz mieć kąpiel wodną lub suchy autobus w 42 stopniach.

Musisz mieć swoje bakterie, które właśnie zabrałeś z głównego miasta, w lodzie. Dzisiaj używamy elektrycznych komórek kompetencyjnych z itów, a także twojego DNA w lodzie. Potrzebna jest również tubka z pożywką SOC o temperaturze domowej lub 37 oraz płytki z LV i pożywką antybiotykową.

Więc teraz dodam DNA z bakteriami. Pracuję więc przy płomieniu, aby nie zanieczyścić bakterii. Więc dodaję lację z bakteriami.

Jest to 50 mikrolitrów bakterii, a następnie natychmiast z powrotem w lodzie, możesz go trochę strzepnąć, aby wymieszać bakterie i swoje DNA, i pozostawić na maksymalnie 15 minut w lodzie. Tak więc minęło 15 minut i jesteśmy gotowi do przeprowadzenia szoku cieplnego, który polega na umieszczeniu bakterii w temperaturze 42 stopni na 45 sekund. Więc wyjmuję rurki z lodu bezpośrednio pod kątem 42 stopni, 30 timerów 45 sekund, a następnie bardzo szybko wkładam je z powrotem do lodu i kładę je z 42 bezpośrednio na lodzie.

A potem czekamy dwie minuty. Więc teraz zamierzam dodać pożywkę SOC do bakterii i umieścić je w temperaturze 37 na 30 minut. Więc waporyzuję 500 mikrolitrów pożywki SOC, wkładam ją do bakterii i umieszczam je w mojej małej prowizorycznej koorze.

Więc jeśli zamierzasz używać eend tubes i prowizorycznej komory do swojego inkubatora, upewnij się, że ustawiasz eend tubes poziomo, ponieważ w ten sposób będą się trząść znacznie lepiej. Więc teraz jesteśmy gotowi do włożenia probówek do shakera. Dlatego mamy tę małą komorę pod kątem 37 stopni przez 30 minut.

Więc teraz zakończyliśmy inkubację w temperaturze 37 stopni i zamierzamy umieścić bakterie na talerzu na funtach plus antybiotykach. Więc w moim przypadku jest to chloral. Więc w I 50 mikrolitrów każdej próbki i połóż ją na talerzu.

Więc z pozostałymi 500 mikrolitrami obracasz je na małym blacie, niektórzy odmawiają, aby obrać bakterie. Tak więc po ifikacji otrzymujemy ładną granulkę i to, co zamierzamy teraz zrobić, to usunąć prawie wszystkie podłoża SOC, po prostu zostawić 50 mikrolitrów, a następnie możemy pokryć te 50 mikrolitrów skoncentrowanych bakterii. Więc płacę, zapłaciłem około 450 mikrolitrów.

Po prostu zostawiam tyle. Więc teraz zamierzam zawiesić paletę w 50 mikrolitrach po lewej stronie nośnika SOC. A potem mogę nałożyć te 50 mikrolitrów na inny talerz

Opieram się więc każdej palecie, a potem kukiełkuję ją i nakładam na talerz. Tak więc na końcu będą dwie płytki na próbkę. Więc teraz musimy rozprowadzić bakterie na płytce LB.

Więc użyję kilku szklanych koralików do autoklawu, ale możesz też użyć rury przechodzącej, którą uformujesz w rozsiewacz w ten sposób. Położę więc kilka koralików na szalce Petriego. Lubię to.

Cóż, 10 15. Więc po dodaniu koralików układasz wszystkie talerze w taki stos i delikatnie nimi potrząsasz, aby koraliki równomiernie rozprowadziły bakterie wszędzie równomiernie na talerzach. Więc kiedy przesuwam talerze, aż wyschną.

Oznacza to, że nie powinieneś widzieć dużych smug płynu, gdy poruszasz się za pomocą koralików. Na przykład na tej płycie koraliki mają tendencję do zapadania się razem i widzą wiele smug. To pot, który jest, koraliki poruszają się swobodnie, ten jest suchy.

Więc teraz talerze są suche, więc możemy wyrzucić koraliki. Więc po prostu ciągnę w ten sposób, abyś mógł je poddać recyklingowi. Więc teraz umieścimy płytkę w inkubatorze o 37 na noc, a ty położysz płytki do góry nogami po 12 godzinach inkubacji w 37, wyjmujemy płytkę z inkubatora.

I jak widać, mamy mniej kolonii na talerzu, na którym nakładam go na 50 mikrolitrów, niż na talerzu, na którym poszatkowałem resztę. To, co jest ważne podczas transformacji bakterii, to posiadanie odpowiedniej ilości kolonii na talerzu, odpowiedniej gęstości. Tak więc w tym miejscu masz bardzo mało kolonii, ale jeśli chcesz mieć więcej kolonii, dobrym przykładem może być ta płytka, gdzie jest dokładnie odpowiednia gęstość, około 100 kolonii na płytkę.

Ta tabliczka jest złym przykładem, ponieważ jest zbyt wiele kolonii i nie można wybierać pojedynczych kolonii. Właśnie pokazałem wam, jak przekształcić E. coli za pomocą każdej transformacji. Tak więc bardzo ważnym aspektem tej techniki jest utrzymanie wszystkiego lub lodu przed szokiem.

Potem 45 sekund normalnie, więcej przy 42 stopniach z powrotem w lodzie. A potem wszystko inne musi mieć ciepłą temperaturę lub 37 stopni. Więc teraz zamierzam przebadać moje kolonie za pomocą badań przesiewowych PCR.

Jednym z więc punktów jest posiadanie dwóch talerzy. Więc po pierwsze, spodziewamy się, że będziemy mieli dużo kolonii, a te jedne kolonie mniej. A co ważne, talerze są bardzo suche za pomocą koralików lub fajki.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w potwierdzeniu.