Name: Wnioskowanie genotypowe tropizmu HIV-1 przy użyciu sekwencjonowania populacyjnego V3 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj metodę wnioskowania tropizmu HIV-1 przy użyciu sekwencjonowania populacyjnego regionu V3. Technika ta wykorzystuje zagnieżdżony RT-PCR i analizę bioinformatyczną do klasyfikacji wirusa jako R5 lub non-R5.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Opracowanie tego testu było wspierane przez Viiv Healthcare oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR), a także poprzez fundusz GlaxoSmithKline/CIHR Chair in Clinical Virology dla dr. Harrigana.
Wsparcie zapewnione przez Pfizer oraz ViiV Healthcare.

<ol><li>Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+cofactor%3A+functional+cDNA+cloning+of+a+seven+transmembrane%2C+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor.</a> Science. 272, 872-877 (1996).</li>
<li>Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+into+CD4%2B+cells+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+CC-CKR-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5.</a> Nature. 381, 667-673 (1996).</li>
<li>Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+%28UK-427%2C857%29%2C+a+potent%2C+orally+bioavailable%2C+and+selective+small-molecule+inhibitor+of+chemokine+receptor+CCR5+with+broad-spectrum+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).</li>
<li>Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+for+previously+treated+patients+with+R5+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).</li>
<li>Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+versus+efavirenz%2C+both+in+combination+with+zidovudine%2Flamivudine%2C+for+the+treatment+of+antiretroviral-na%C3%ADve+subjects+with+CCR5-tropic+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1.</a> J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).</li>
<li>Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trofile+HIV+co-receptor+usage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Med.+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Trofile HIV co-receptor usage assay.</a> Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).</li>
<li>Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+HIV+co-receptor+usage+based+on+genetic+and+clinical+covariates%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Ther%22%5BJournal%5D)">Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates.</a> Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).</li>
<li>Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).</li>
<li>Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).</li>
<li>Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Detection+of+CXCR4-Using+HIV+by+V3+Genotyping%3A+Application+of+Population-based+and+%27Deep%27+Sequencing+to+Plasma+RNA+and+Proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+determination+of+HIV-1+tropism+in+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting.</a> HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).</li>
</ol>

P. Richard Harrigan ma konflikty interesów z ViiV Healthcare, Virco, Merck, Abbott i Quest. Ten artykuł wideo jest sponsorowany przez ViiV Healthcare.

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu jest standardową metodą sekwencjonowania stosowaną w badaniach tropizmu. Zastosowanie kliniczne sekwencjonowania pętli V3 otoczki HIV w celu przewidywania tropizmu wirusa było do niedawna ograniczone. Wykazano, że metoda ta, w analizach retrospektywnych badań klinicznych nad marawirokiem (ViiV Healthcare), pozwala na przewidywanie tropizmu wirusa co najmniej równie skutecznie, jak inne walidowane testy stosowane w praktyce klinicznej.
Wykonanie analizy genotypowej pętli V3 w celu przewidzenia tropizmu niesie ze sobą wiele korzyści. Przede wszystkim procedura ta może być przeprowadzona w każdej placówce dysponującej sprawnym sprzętem do sekwencjonowania, co znacznie zwiększa dostępność i skraca czas oczekiwania na wyniki testów tropizmu. W przeciwieństwie do niej fenotypowy test ESTA (Enhanced Sensitivity Trofile Assay) firmy Monogram Biosciences, który uznawany jest za złoty standard w badaniu tropizmu, jest wykonywany w jednym ośrodku w południowej Kalifornii. Dodatkowe korzyści obejmują wymóg mniejszej ilości materiału wyjściowego oraz minimalną wymaganą wiremię w osoczu na poziomie 500copies/mL. Ponadto koszty operacyjne przeprowadzenia analizy genotypowej są stosunkowo niskie w porównaniu do kosztów analizy fenotypowej. Wykorzystanie oprogramowania ReCall w szczególności eliminuje konieczność ręcznego przeglądu sekwencji, co zazwyczaj jest najbardziej pracochłonnym elementem analiz genotypowych.
Przedstawiona tutaj metoda jest dość prosta i żaden z etapów nie jest ważniejszy od pozostałych. Sugerujemy przeprowadzenie PCR oraz sekwencjonowania w trzech powtórzeniach, aby zwiększyć szansę na wykrycie rzadszych gatunków w obrębie populacji wirusów w próbce. Można wykonać więcej niż trzy powtórzenia, jednak w naszej ocenie potrójne analizy są zarówno efektywne, jak i wiarygodne. Sugerujemy również zastosowanie zestawu One-Step Reverse Transcriptase PCR Kit (Qiagen), który umożliwia przeprowadzenie zarówno RT-PCR, jak i pierwszej rundy PCR w jednej reakcji, zachowując przy tym wysoką czułość i specyficzność.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Ekstrakcja RNA przy użyciu zestawu NucliSens easyMAG wersja 1.0&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Magnetic Silica</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280133</td><td>(48 x 0,6 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Lysis Buffer</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280134</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280130</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280131</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280132</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG wersja 1.0 </td><td>bioMerieux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dygestorium biologiczne klasy II A2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Jednoetapowa RT-PCR i PCR drugiej rundy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda traktowana DEPC</td><td>Ambion</td><td>cat. # 9922</td><td></td></tr><tr><td>SuperScrip III One-Step RT-PCR System z Platinum Taq High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>cat#12574-035</td><td>Wykorzystane komponenty zestawu:&lt;br/&gt;- Mieszanka enzymów SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelity&lt;br/&gt;- 2X Reaction Mix (bufor zawierający 0,4mM każdego dNTP, 2,4mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR System</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 1 759 078</td><td>Wykorzystane komponenty zestawu: - Bufor Expand High Fidelity 10X z 15 mM MgCl2 (nakrętki oznaczone cyfrą 2) - Mieszanka enzymów Expand HF PCR (3,5U/&amp;#x03BC;l) - Roztwór stokowy MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (25mM) (nakrętki oznaczone cyfrą 4)</td></tr><tr><td>dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 11969064001</td><td>(100 mM)</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa błękitu bromofenolowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# B5525</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień krezylowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# 114472-5G</td><td>stopień analityczny (wskaźnik)</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Elektroforeza żelowa&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor TAE 50X</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 24710030</td><td>(1000 ml)</td></tr><tr><td>Barwnik do żeli DNA SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (ultra czysta)</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 15510-027</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 12373-031</td><td></td></tr><tr><td>Woda typu II stopnia reagentowego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat do elektroforezy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sekwencjonowanie&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4337458</td><td>(25000 reakcji)</td></tr><tr><td>Formamida Hi-Di</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4311320</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S-2889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# 03690-100ML</td><td>0,5M, pH=8,0</td></tr><tr><td>Bufor TRIZMA Hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # T-2819</td><td>1 M, pH 9,0</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # M-1028</td><td>1 M</td></tr><tr><td>95% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy (10X) z EDTA</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 4335613</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Polymer Pop-7 (25mL) lub Polymer Pop-7 (10mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 44363929 lub cat. # 4352759</td><td></td></tr><tr><td>3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit</td><td>Applied Biosciences</td><td>Cat# 4336943</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z uchwytami na płytki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator DNA 3730xl</td><td>Applied Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genotypowe wnioskowanie o tropizmie hiv-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli v3

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Wprowadzenie: Przed podaniem leku z grupy antagonistów CCR5 w terapii HIV, pacjent musi przejść test tropizmu HIV, aby potwierdzić, że jego populacja wirusów wykorzystuje koreceptor CCR5 do wniknięcia do komórki, a nie koreceptor alternatywny. Jednym z podejść do badania tropizmu jest analiza sekwencji regionu V3 otoczki HIV, która wchodzi w interakcję z koreceptorem.
Metody: Viralne RNA jest ekstrahowane z osocza krwi. Region V3 jest powielany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej odwrotnej transkrypcji i PCR. Produkty amplifikacji są następnie sekwencjonowane i analizowane przy użyciu oprogramowania RE_Call. Sekwencje są następnie przekazywane do algorytmu bioinformatycznego, takiego jak geno2pheno, w celu wnioskowania o tropizmie wirusa na podstawie regionu V3. Sekwencje uznaje się za nie-R5, jeśli wskaźnik wyników fałszywie dodatnich w geno2pheno spadnie poniżej 5,75%. Jeśli którakolwiek z trzech sekwencji z próbki zostanie uznana za nie-R5, prawdopodobne jest, że pacjent nie odpowie na antagonistę CCR5.

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Wprowadzenie: Przed podaniem leku z grupy antagonistów receptora CCR5 w terapii HIV, pacjent musi przejść test tropizmu HIV w celu potwierdzenia, że jego lub jej...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie tropizmu wirusa u pacjenta zakażonego HIV poprzez sekwencjonowanie regionu V3 genu otoczki wirusa. W pierwszej kolejności należy wyekstrahować HIV RNA z osocza krwi pacjenta. Następnie, za pomocą zagnieźdzonej reakcji RT-PCR, należy przeprowadzić amplifikację regionu V3 białka gp120 HIV. Po tym etapie należy potwierdzić obecność produktu za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie przeprowadzić sekwencjonowanie populacyjne amplifikowanych produktów regionu V3.Na koniec przeanalizuj sekwencje za pomocą oprogramowania do odczytu zasad (base calling) i wywnioskuj wykorzystanie koreceptora, stosując algorytm genome-to-pheno. Ostatecznie wyniki te mogą wykazać, czy populacja wirusa u pacjenta jest R5 czy nie-R5, poprzez sekwencjonowanie populacyjne pętli V3 HIV-1. Główną zaletą tej metody analizy tropizmu w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fenotypowe testy komórkowe, jest możliwość jej przeprowadzenia w każdym laboratorium wyposażonym w aparaturę do sekwencjonowania, przy niższych kosztach, w krótszym czasie i przy użyciu mniejszej ilości materiału wyjściowego.Technika ta ma znaczenie dla leczenia terapią antyretrowirusową, ponieważ pozwala ustalić, czy populacja wirusowa pacjenta prawdopodobnie zareaguje na antagonistę CCR5 z próbki 500 µL osocza. Do wyekstrahowania HIV RNA należy użyć automatycznego ekstraktora EasyMag. Następnie należy przejść do pomieszczenia PCR typu clean room w celu przygotowania RT-PCR, aby zapewnić odpowiednie próbkowanie populacji wirusowej.Zaplanuj wykonanie każdej reakcji odwrotnej transkrypcji w trzech powtórzeniach w ramach tej jednokrocznej reakcji. Wykorzystaj wirusowe RNA do syntezy cDNA, specyficznie amplifikując region HIVV three przy użyciu starterów SQV three F1 oraz CO 6 0 2 prime repair. Opieraj się na składnikach na jedną reakcję.Przygotuj roztwór mieszaniny zapasowej w ilości wystarczającej dla liczby próbek do amplifikacji, korzystając z pipety wielokanałowej. Dodaj 36 µL mieszaniny próbek do każdego dołka płyty PCR. Następnie użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść odpowiednią liczbę mikrolitrów ekstraktu RNA z próbek do wyznaczonych dołków. Pamiętaj o zmianie końcówek po każdym dodaniu.Po zakończeniu przenoszenia należy przykryć dołki nakrętkami do płytek PCR. Następnie płytkę PCR należy umieścić w termocyklerze zaprogramowanym na jednokrokowy R-T-P-C-R regionu trzech HIVV. W przypadku PCR zagnieżdżonego należy użyć zestawu starterów SQV three F two oraz CD four R.Oblicz ilość odczynnika wymaganą dla liczby próbek do amplifikacji w czystym pomieszczeniu do PCR. Przygotuj mieszaninę do nested PCR, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 19 µL do każdego dołka czystej płytki PCR. Po zakończeniu procesu R-T-P-C-R przejdź do pomieszczenia poamplifikacyjnego.Za pomocą ośkanałowej pipety wielokanałowej przenieś 1 µL matrycy R-T-P-C-R do mieszaniny do nested PCR. Zmieniaj końcówki po każdym dodaniu. Przykryj dołki nakrętkami paskowymi do PCR i przenieś płytkę do termocyklera w celu amplifikacji.Wyjmij płytkę z termocyklera po powrocie temperatury do 25 °C. Aby potwierdzić, że region V3 został pomyślnie amplifikowany, w pierwszej kolejności przeanalizuj produkty za pomocą elektroforezy w żelu. Przygotuj żel agarozowy o stężeniu 1,6% z barwnikiem do żeli CyberSafe.Używając wielokanałowej pipety o objętości 10 µL, przenieś 8 µL próbek PCR do odpowiednich dołków. Do przynajmniej jednego dołka w każdym rzędzie nanieś również drabinę DNA.Przeprowadź elektroforezę żelu przy napięciu około 100 V przez 10 minut. Zwizualizuj prążki za pomocą fluorescencji ultrafioletowej i udokumentuj obraz za pomocą fotografii. Odnotuj próbki, w których wszystkie powtórzone trzykrotnie amplifikacje zakończyły się sukcesem.W razie potrzeby powtórzyć RT-PCR dla tych próbek, w których uzyskano mniej niż trzy amplifikacje produktu. Próbki amplifikowanego cDNA wirusa zostaną następnie zweryfikowane za pomocą reakcji sekwencjonowania DNA z wykorzystaniem starterów V 3 0 2 F oraz S QV three R one. Wyjąć odczynnik big di z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej.Obliczyć i przygotować odczynniki wymagane dla liczby próbek przeznaczonych do analizy. Przenieść pięć µL mieszaniny reakcyjnej do sekwencjonowania do odpowiednich dołków płytki, używając pipety wielokanałowej. Przykryć płytkę chusteczką Kim wipe i odstawić.W międzyczasie przygotuj rozcieńczenie produktu amplifikacji PCR w stosunku 1:15, dodając 180 µL sterylnej wody do pozostałego produktu PCR. Pipetą nanieś 1 µL rozcieńczonej próbki na dno odpowiedniej płytki. Zawsze wymieniaj końcówki między próbkami po zakończeniu przenoszenia każdej z nich.Zamknij płytkę za pomocą nakrętek paskowych i wymieszaj w vorteksie przez jedną sekundę. Aby odwirować płytkę, ustaw prędkość na 140 5G. Gdy prędkość wirowania osiągnie 140 5G, zatrzymaj wirowanie.Umieść płytkę w termocyklerze, aby reakcja mogła zajść. W każdej studni wytrąć DNA, dodając 4 µL 3 M octanu sodu oraz 40 µL schłodzonego 95% etanolu, a następnie ponownie zamknij zakrętki. Wstrząśnij płytką w wstrząsarku (vortex) przez 10 sekund i opukaj płytkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza.Umieść płytki w temperaturze -20 °C na czas od 30 minut do dwóch godzin. Odzyskaj DNA poprzez wirowanie przy 2000 ×g przez 20 minut. Zdejmij i wyrzuć nakrętki paskowe.Odwróć płytkę nad pojemnikiem na odpady i zlej nadsącz. Usuń pozostałości nadsączu, osuszając odwrócone płytki ręcznikiem papierowym.Złóż dwa arkusze ręcznika papierowego, aby objąć nimi płytkę. Umieść płytkę stroną skierowaną w dół w wirówce i wiruj z prędkością 140 5G. Zatrzymaj wirowanie po osiągnięciu 140 5G.Następnie przemyć 155 µL 95% etanolu i odlej ciecz. Powtórz odwirowanie. Pozostaw płytkę na dwie do pięciu minut, aby resztki etanolu odparowały.Aby zdenaturować próbki DNA, należy użyć pipety wielokanałowej i nanieść 10 µL wysokiego barwnika do maide do wszystkich dołków na płytce, w tym do tych pustych. Płytkę należy zamknąć septą i umieścić w termocyklerze w temperaturze 90 °C przez dwie minuty. Na koniec płytkę z próbkami należy włożyć do płytki sekwencyjnej, a następnie do sekwenatora.Jednym z dopuszczalnych sposobów analizy danych jest wykorzystanie oprogramowania recall do automatycznego odczytu zasad (base calling) bez ingerencji człowieka. Recall jest bezpłatnym, specjalistycznym oprogramowaniem do odczytu zasad; należy zalogować się i wybrać pliki z próbkami do przesłania za pomocą opcji przeglądania (browse). Należy zlokalizować plik z surowymi danymi sekwencjonowania i przesłać do 20 megabajtów danych.Następnie ustaw sekwencję referencyjną na V three. Kliknij process data. Wybierz wynikowy folder po prawej stronie strony, aby wyświetlić listę próbek.Te, które są czerwone, nie przeszły pomyślnie weryfikacji. Te, które są zielone, zostały zaakceptowane. Klikając na konkretną próbkę i przycisk wyświetlania, można przejrzeć sekwencję, postępować zgodnie z instrukcjami po prawej stronie strony, aby nawigować po sekwencji oraz pobrać pliki w folderze zip.Tropizm wirusowy można wywnioskować z sekwencji uzyskanych metodą sekwencjonowania populacyjnego z wykorzystaniem algorytmu korelacji genotyp-fenotyp dla koreceptorów. Z menu rozwijanego w ustawieniach istotności wybierz opcję optymalizacji na podstawie analizy danych klinycznych z badania motivate 2% oraz 5,75% FPR. Następnie wybierz opcję przesłania pliku lub wklejenia sekwencji do analizy.Pliki FASTA są dopuszczalne. Nie dodawaj innych, aby przejść do uzyskania geno Tono FPRA, predyktora odpowiedzi na antagonistów CCR5. Wygenerowany raport G two P podaje sekwencję pętli V3 w aminokwasach i wskazuje istotne pozycje mutacji związanych z wirusem n R5.Na dole raportu podano współczynnik wyników fałszywie dodatnich i zinterpretowano go pod kątem odpowiedzi na antagonistę CCR5. Raport ten można pobrać w formacie PDF. Jeśli którakolwiek z trzech sekwencji z próbki zostanie uznana za nie-R5, pacjent prawdopodobnie nie odpowie na antagonistę CCR5 zgodnie z oczekiwaniami; elektroforeza żelowa produktów RTP CR pętli V3 HIV-1 wskazuje, że nie wszystkie próbki kliniczne dają produkt.Wygenerowane sekwencje z amplifikowanych próbek można zwizualizować na chromatogramie odczytanym przez program recall. Oczekuje się uzyskania czystej sekwencji z niewielką liczbą mieszanin. Sporadycznie sekwencje mogą być nieczytelne i nie pozwalać na dokładne przypisanie zasad.Niektóre pacjentów można zidentyfikować jako posiadających wirusa niekorzystającego z CCR5, tak jak pokazano tutaj. Pacjenci ci prawdopodobnie nie zareagują na leczenie antagonistą CCR5. Jednak u większości pacjentów stwierdza się populację wirusową składającą się z wirusa korzystającego z CCR5, co jest wskazane zieloną ramką na dole raportu z analizy G2P.Po opanowaniu tej techniki, cały proces od początku do końca – od ekstrakcji po analizę – można przeprowadzić w ciągu około czterech dni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przewidywania tropizmu wirusowego przy użyciu metod sekwencjonowania populacyjnego w połączeniu z algorytmem bioinformatycznym genome pheno.To już wszystko. Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

genotypic-inference-hiv-1-tropism-using-population-based-sequencing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Genotypowe wnioski dotyczące tropizmu HIV-1 na podstawie sekwencji populacyjnych V3

Ilościowe oznaczenie poziomu RNA HIV-1 w osoczu oraz sekwencjonowanie pojedynczych genomów HIV-1 u osób z wiremią poniżej granicy wykrywalności (50-75 kopii/ml) jest trudne. W niniejszym materiale opisujemy sposób izolacji i oznaczania ilościowego wirusowego RNA z osocza przy użyciu testu real-time PCR, który wiarygodnie mierzy poziom RNA HIV-1 aż do 0,3 kopii/ml, a także metodę amplifikacji genomów wirusowych poprzez sekwencjonowanie pojedynczych genomów z próbek o bardzo niskiej ładunku...

Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Przewidywanie wykorzystania koreceptora przez HIV-1 jest niezbędne do podania nowej klasy leków antyretrowirusowych, mianowicie antagonistów koreceptorów. Można to przeprowadzić poprzez analizę sekwencji genu env i późniejszą interpretację za pomocą internetowego systemu interpretacyjnego (geno2pheno[coreceptor]).

Przewidywanie wykorzystania koreceptora HIV-1 (tropizmu) poprzez analizę sekwencji z zastosowaniem podejścia genotypowego

Testy oporności na leki dla osób zakażonych wirusem HIV-1, u których nie powiodła się terapia antyretrowirusowa (ART), mogą ukierunkować przyszłe terapie i poprawić wyniki leczenia. Optymalizacja indywidualnych i populacyjnych wyników zdrowotnych w warunkach wysokiego rozpowszechnienia HIV, ale ograniczonych zasobów, będzie ostatecznie wymagała przystępnych cenowo i dostępnych metod genotypowania i interpretacji oporności na leki.

Przystępna cenowo metoda monitorowania oporności na leki HIV-1 w warunkach ograniczonych zasobów

Patogeneza HIV-1 jest definiowana zarówno przez cechy wirusa, jak i czynniki genetyczne gospodarza. W tym miejscu opisujemy solidną metodę, która pozwala na powtarzalne pomiary w celu oceny wpływu zmienności sekwencji genu gag na zdolność replikacji wirusa in vitro.

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Poznaj metodę wnioskowania tropizmu HIV-1 przy użyciu sekwencjonowania populacyjnego regionu V3. Technika ta wykorzystuje zagnieżdżony RT-PCR i analizę bioinformatyczną do klasyfikacji wirusa jako R5 lub non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Przeglądaj więcej filmów