Wnioskowanie genotypowe tropizmu HIV-1 przy użyciu sekwencjonowania populacyjnego V3

Ogólnym celem tej procedury jest wywnioskowanie tropizmu wirusowego u pacjenta zakażonego wirusem HIV poprzez sekwencjonowanie regionu V trzy genu otoczki wirusa w celu rozpoczęcia ekstrakcji H-I-V-R-N-A z osocza krwi pacjenta. Następnie amplifikuj region V trzy HIV GP one 20 za pomocą zagnieżdżonego R-T-P-C-R. Następnie zidentyfikuj obecność produktu za pomocą elektroforezy żelowej, a następnie sekwencjonowania populacyjnego amplifikowanych produktów V trzy.

Na koniec przeanalizuj sekwencje za pomocą oprogramowania do wywoływania zasad i wywnioskuj użycie koreceptorów za pomocą algorytmu genomu do fenoterapii. Ostatecznie wyniki te mogą pokazać, czy grupa wirusowa pacjenta ma wartość R 5, czy nie R 5, poprzez sekwencjonowanie populacyjne trzeciej pętli HIVV. Tak więc główną zaletą tej techniki jest test wojskowy w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy fenotypowe oparte na komórkach, jest to, że można go przeprowadzić w dowolnym laboratorium wyposażonym w aparaturę do sekwencjonowania w celu obniżenia kosztów w krótszym czasie i przy mniejszej ilości materiału wyjściowego.

Technika ta jest istotna w leczeniu terapią przeciwretrowirusową, ponieważ może określić, czy populacja wirusowa pacjenta może zareagować na antagonistę CCR pięć Od 500 mikrolitrów osocza. Użyj automatycznego ekstraktora Easy Mag, aby wydobyć H-I-V-R-N-A. Teraz przenieś się do czystego pomieszczenia A PCR, aby skonfigurować R-T-P-C-R w celu zapewnienia odpowiedniego pobierania próbek populacji wirusa.

Zaplanuj wykonanie każdej reakcji odwrotnej transkrypcji w trzech egzemplarzach w tej jednoetapowej reakcji. Użyj wirusowego RNA do syntezy CDNA, w szczególności amplifikacji regionu trzech HIVV za pomocą SQV three F1 i CO 6 0 2 prime repair. Na podstawie poszczególnych składników reakcji.

Przygotować podstawowy roztwór mieszaniny wystarczający do liczby próbek, które mają być amplifikowane, za pomocą pipety powtarzalnej Dodać 36 mikrolitrów mieszanki próbek do każdego dołka płytki PCR. Teraz przełącz się na pipetę wielokanałową, aby przekształcić mikrolitry ekstraktu próbki RNA do każdego z wyznaczonych dołków. Zadbaj o to, aby wymieniać wskazówki między każdym dodatkiem.

Po zakończeniu transferu przykryj dołki nakrętkami pasków PCR. Następnie umieść płytkę PCR w termocyklerze zaprogramowanym na jednoetapowy R-T-P-C-R z trzeciego regionu HIVV. W przypadku zagnieżdżonego PCR należy użyć naprawy startera SQV three F two i CD four R.

Obliczyć ilość odczynnika wymaganą do liczby próbek, które mają być amplifikowane w pomieszczeniu czystym do PCR. Wygeneruj zagnieżdżoną mieszaninę PCR, a następnie użyj pipety powtarzalnej, aby podzielić 19 mikrolitrów na dołek czystej płytki PCR. Po zakończeniu R-T-P-C-R przenieś się do pomieszczenia po wzmocnieniu.

Użyj ośmiokanałowej pipety wielokanałowej, aby przenieść jeden mikrolitr matrycy R-T-P-C-R do zagnieżdżonej mieszanki PCR. Zmieniaj wskazówki między każdym dodawaniem. Przykryj studzienki nakrętkami pasków PCR i przenieś płytkę do termocyklera w celu amplifikacji.

Wyjmij płytkę z termocyklera, gdy temperatura powróci do 25 stopni Celsjusza. Aby potwierdzić, że region V trzy został pomyślnie amplifikowany, najpierw przeanalizuj produkty za pomocą elektroforezy żelowej. Przygotuj żel 1,6% AROS z cyberbezpieczną plamą z żelu.

Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 10 mikrolitrów. Przenieś osiem mikrolitrowych próbek PCR do odpowiednich studzienek. Załaduj również drabinę DNA do co najmniej jednej studzienki w rzędzie.

Uruchom żel pod napięciem około 100 woltów przez 10 minut. Wizualizuj pasma za pomocą fluorescencji ultrafioletowej i dokumentuj obraz za pomocą fotografii. Zanotuj próbki, w których wszystkie potrójne amplifikacje zakończyły się powodzeniem.

W razie potrzeby powtórzyć R-T-P-C-R dla próbek z mniej niż trzema amplifikacjami produktu. Amplifikowane próbki CDNA wirusa są dalej weryfikowane za pomocą reakcji sekwencjonowania DNA, które zostaną przeprowadzone przy użyciu starterów V, 3, 0, 2, F i S, QV, trzech R-one. Wyjmij duży odczynnik di z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej.

Obliczyć i przygotować odczynniki wymagane do określenia liczby próbek, które mają być przeprowadzone. Porcjować pięć mikrolitrów reakcji sekwencjonowania, mieszać do odpowiednich studzienek płytkowych za pomocą pipety wielokanałowej. Przykryj talerz chusteczką Kim i odłóż go na bok.

W międzyczasie należy przygotować rozcieńczenie od 1 do 15 amplifikowanego produktu PCR, dodając 180 mikrolitrów sterylnej wody do pozostałego produktu PCR. Odpipetować jeden mikrolitr rozcieńczonej próbki na dno odpowiedniej płytki. Studzienki zawsze zmieniają końcówki między próbkami po zakończeniu przenoszenia próbki.

Uszczelnij płytkę nakrętkami paskowymi i wiruj przez jedną sekundę. Aby odwirować płytkę, ustaw prędkość na 140 5G. Gdy prędkość wirowania osiągnie 140 5G, zatrzymaj wirowanie.

Umieść płytkę w termocyklerze, aby reakcja mogła przebiegać. W każdym dołku wytnij DNA czterema mikrolitrami trzech molowych octanu sodu i 40 mikrolitrami schłodzonego 95% etanolu, ponownie zamknij nakrętki. Utrzymuj płytkę w korze przez 10 sekund i postukaj w płytkę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Umieść talerze w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na okres od 30 minut do dwóch godzin. Odzyskać DNA przez odwirowanie w temperaturze 2000 G przez 20 minut. Usuń i wyrzuć nasadki pasków.

Odwróć talerz nad pojemnikiem na odpady i zdekantuj super natin. Pozbądź się pozostałych super natinów. Osuszając odwrócone talerze na ręczniku papierowym.

Złóż dwa arkusze ręcznika papierowego, aby ułożyć talerz. Umieść płytkę stroną zadrukowaną do dołu w wirówce i wiruj z prędkością 140 5G. Zatrzymanie wirowania, gdy osiągnie 140 5G.

Następnie umyć 155 mikrolitrami 95% etanolu i zdekantować. Następnie powtórz wirowanie. Pozostaw płytkę na dwie do pięciu minut, aby umożliwić odparowanie ostatniego etanolu.

W celu denaturacji próbek DNA należy za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadzić 10 mikrolitrów barwnika o wysokiej zawartości barwnika do wszystkich dołków na płytce, w tym tych, które są puste. Zamknij płytkę septimą i umieść w termocyklerze w temperaturze 90 stopni Celsjusza na dwie minuty. Na koniec umieść płytkę z próbką na płytce sekwencyjnej i w sekwencerze.

Jedną z akceptowalnych metod analizy danych jest wykorzystanie oprogramowania do automatycznego wywoływania bazy bez interwencji człowieka. Recall to bezpłatne, niestandardowe oprogramowanie do połączeń, zaloguj się i wybierz przykładowe pliki do przesłania za pomocą opcji przeglądania. Zlokalizuj plik z nieprzetworzonymi danymi sekwencjonowania i prześlij do 20 megabajtów.

Następnie ustaw sekwencję odwołań na V trzy. Kliknij opcję Przetwarzaj dane. Wybierz folder wynikowy po prawej stronie, aby wyświetlić listę przykładów.

Te, które są czerwone, zawiodły. Te, które są zielone, już minęły. Klikając na konkretną próbkę i przycisk widoku, możesz przejrzeć sekwencję, postępować zgodnie z instrukcjami po prawej stronie strony, aby poruszać się po sekwencji, pobrać pliki do folderu zip.

Tropizm wirusowy można wywnioskować z sekwencji generowanych przez sekwencjonowanie populacyjne przy użyciu algorytmu koreceptorów geno do fenoreceptorów. Z menu rozwijanego istotnego ustawienia wybierz zoptymalizowane na podstawie analizy danych klinicznych z motywacji 2% i 5,75% FPR. Teraz wybierz, czy chcesz przesłać lub wkleić sekwencję do analizy.

Pliki FASTA są dopuszczalne. Nie należy dodawać innych postępowań w celu uzyskania predyktora geno Tono FPRA odpowiedzi na antagonistów CCR pięciu. Wygenerowany raport G2P dostarcza sekwencji trzech pętli V w aminokwasach i wskazuje odpowiednie pozycje mutacji związanych z wirusem innym niż R pięć.

Na dole raportu podano odsetek wyników fałszywie dodatnich, który jest interpretowany pod kątem odpowiedzi na antagonistę CCR five. Raport ten można pobrać w formie pliku PDF. Jeśli wywnioskuje się, że którakolwiek z trzech sekwencji z próbki nie jest R, jest mało prawdopodobne, że pacjent zareaguje na antagonistę CCR pięć, ponieważ oczekiwano Elektroforeza żelowa RTP CR Amplifikacje pętli HIV jeden na trzy wskazują, że nie wszystkie próbki kliniczne wytwarzają produkt.

Wygenerowane sekwencje z amplifikowanych próbek można zwizualizować na chromatogramie odczytywanym przez przywołanie. Oczekuje się czystej sekwencji z niewielką liczbą mieszanin. Czasami sekwencje mogą być niechlujne i niepodatne na dokładne przypisanie bazy.

U niektórych pacjentów można zidentyfikować wirusa innego niż CCR 5, jak pokazano tutaj. Jest mało prawdopodobne, aby pacjenci ci zareagowali na leczenie antagonistą CCR 5. Stwierdzono jednak, że większość pacjentów ma populację wirusową składającą się z CCR pięć przy użyciu wirusa, jak wskazano w zielonym polu na dole raportu z analizy G2P.

Tak więc po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około cztery dni od początku do końca. To od ekstrakcji do analizy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przewidywać tropizm wirusowy za pomocą metod sekwencjonowania populacyjnego w połączeniu z algorytmem bioinformatycznym genomu fenologicznego.

W porządku, to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.