Name: Ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę tworzenia ortotopowego modelu raka pęcherza moczowego u myszy C57BL/6. Technika obejmuje cewnikowanie, kauteryzację oraz przyleganie komórek nowotworowych. Model umożliwia badanie mikrośrodowiska nowotworu i testowanie terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu National Science Foundation CAREER award (CBET-0846395) oraz przez Department of Comparative Medicine na Tulane University.

1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Samice myszy C57BL/6J (Mus musculus) są weryfikowane przez dostawcę przed wysyłką pod kątem braku zaraźliwych ektopasożytów, endopasożytów z grupy helmintów oraz przeciwciał przeciwko 17 wirusom mysim. Myszy są utrzymywane w akredytowanym przez AAALAC domu zwierząt Uniwersytetu Tulane zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.1 </li>
	<li>W szczególności myszy są utrzymywane grupowo (4-5 myszy/klatka) w indywidualnie wentylowanych klatkach poliwęglanowych z filtrami mikroizolacyjnymi w pokrywach, na ściółce z twardego drewna. Mają do dyspozycji wodę z kranu oraz peletowaną karmę dla gryzoni ad libitum.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem badania myszy poddawane są 7-dniowej aklimatyzacji.</li>
</ol>
2. Komórki
<ol>
	<li>Do wywołania guzów pęcherza moczowego wykorzystywana jest linia komórkowa raka przejściowego myszy MB49.</li>
	<li>Komórki hoduje się w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy wołowej, 100 units/ml penicyliny oraz 100 units/ml streptomycyny.</li>
	<li>Kultury utrzymuje się w temperaturze 37°C i 5% CO2, wymieniając pożywkę co dwa do trzech dni.</li>
</ol>
3. Ortotopowy model nowotworu u zwierząt
Wprowadzenie modelu nowotworu pęcherza moczowego opisanego w niniejszej pracy jest modyfikacją procedury opisanej przez Gunthera i współpracowników2
<ol>
	<li>Znieczulenie indukuje się 2% izofluranem (MWI/VetOne, Meridian, ID, Cat# 501017) w tlenie, a następnie utrzymuje na poziomie 0,75-1,25%. (Można traktować jednocześnie wiele zwierząt, co wymagałoby zwiększenia stężenia izofluranu). Aby zapobiec wysychaniu rogówki, oczy smaruje się maścią okulistyczną z łzami sztucznymi. Ciepłotę ciała utrzymuje się za pomocą podgrzewanej podkładki pod papierową ściereczką.</li>
	<li>Sierść w dolnej części grzbietu zostaje przystrzyżona, aby ułatwić kontakt z metalową płytą uziemiającą, a ogoloną powierzchnię pokrywa się żelem przewodzącym.</li>
	<li>Każdą mysz umieszcza się następnie indywidualnie w pozycji grzbietnej na metalowej płycie uziemiającej, a pęcherz cewnikuje się przez cewkę moczową, używając nasmarowanego cewnika dożylnego G24 o długości 3/4 cala z usuniętym prowadnikiem.</li>
	<li>Z pęcherza moczowego odprowadza się mocz, a następnie przez cewnik do pęcherza wprowadza się platynowy drut, pozostawiając odsłonięte końce drutu po obu stronach cewnika – około 2 mm na końcu światła cewnika. Zastosowano drut platynowy ze względu na odporność tego materiału na utlenianie.</li>
	<li>Następnie do pęcherza przykłada się prąd o mocy 2,5 W przez około 0,5 sekundy, dotykając zewnętrznej części drutu urządzeniem do elektrokoagulacji ustawionym w trybie koagulacji.</li>
	<li>Drut zostaje następnie przesunięty w drugie miejsce w pęcherzu i przyłożony zostaje kolejny ładunek o mocy 2,5 W.</li>
	<li>Drut zostaje usunięty, a przez cewnik do pęcherza za pomocą strzykawki 1 ml wprowadza się 100 μl komórek MB49 o stężeniu 1x106 komórek/ml.</li>
	<li>Strzykawki pozostawia się podłączone do cewników, aby zapobiec wyciekowi zawiesin komórkowych, a myszy z cewnikami utrzymuje się w znieczuleniu przez 90 minut, aby umożliwić przytwierdzenie się komórek do miejsc oparzeń.</li>
	<li>Przed wybudzeniem każdej myszy podaje się drogą dosytrytchalną (IP) 100-200 μl sterylnej soli fizjologicznej.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu inkubacji cewniki zostają usunięte, a zwierzęta pozostawia się na podgrzewanej podkładce do momentu powrotu odruchu prostowania, po czym myszy przenosi się do ich klatek domowych.</li>
</ol>
4. Ultradźwięki
<ol>
	<li>Guzy pozostawia się do wzrostu przez 3-5 dni, zanim myszy zostaną poddane badaniu ultrasonograficznemu pęcherza moczowego w celu monitorowania wzrostu nowotworu.</li>
	<li>Przed wstępnymi badaniami ultrasonograficznymi zwierzęta znieczula się zgodnie z powyższym opisem. Myszy układa się w pozycji grzbietowej, a skórę brzucha przygotowuje poprzez przystrzyżenie futra.</li>
	<li>Przez cewkę moczową do pęcherza moczowego wprowadza się cewnik dożylny o rozmiarze 24 gauge. Na tym etapie można opróżnić pęcherz i zebrać mocz do dalszych analiz.</li>
	<li>Do pęcherza, poprzez cewnik, wprowadza się 100 μl sterylnej soli fizjologicznej, aby poprawić widoczność pęcherza w badaniu ultrasonograficznym.</li>
	<li>Na brzuch nakłada się żel przewodzący, a następnie wykonuje się ultrasonografię w celu oceny ściany i światła pęcherza.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Tkanka nowotworowa zacznie pojawiać się od 3 do 5 dni po inokulacji. Z naszego doświadczenia wynika, że w grupie 12 myszy u 50% lub więcej osobników do piątego dnia rutynowo stwierdza się wykrywalną masę tkankową w pęcherzu moczowym (0,5 - 1,0 μl, stosując wzór V=π/6·L·W·H). W przypadku użycia komórek MB 49 guzy będą nadal rosnąć, a w grupie zwierząt nieleczonych konieczna będzie eutanazja do 24. dnia. Eutanazję zaleca się w sytuacji, gdy myszy stają się letargiczne lub kachektyczne, wykazują zjeżone futro, zgarbioną postawę i brak reakcji na bodźce lub gdy utracą 20% początkowej masy ciała.
Guzy szybko rosną i po osiągnięciu masy 200 mg lub więcej wykazują centra martwicze,3 co prawdopodobnie wynika z faktu, że komórki w rozwijającym się guzie proliferują szybciej, niż jest w stanie zapewnić angiogenna podaż krwi. Postęp wzrostu guza można również monitorować pośrednio poprzez poziom krwiomoczu, który jest prawdopodobnie związany z szybką angiogenezą w rozwijających się guzach. Konsekwentnie odnotowano, że w moczu nieleczonych myszy z guzami krew pojawiała się do 14 dnia. Koncentracja erytrocytów u tych myszy wydawała się zwiększać w czasie, a objętość zbieranego moczu malała. Guzy o masie przekraczającej 50 mg można również z względną łatwością wyczuć palpacyjnie, zazwyczaj do 14 dni po inokulacji.

<ol><li>Institute of Laboratory Animal Resources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).</li>
<li>Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression-targeted+gene+therapy+for+the+treatment+of+transitional+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma.</a> Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i przepisami ustalonymi przez Institutional Care and Use Committee Uniwersytetu Tulane.

Tę małoinwazyjną metodę tworzenia ortotopowych guzów pęcherza u samic myszy można zastosować również w przypadku innych typów komórek niż MB49, choć należy spodziewać się odmiennych wyników. W przypadku użycia mniej agresywnych komórek nowotworowych, niewielkie zwiększenie mocy (w przyrostach 0,5 W w celu ustalenia nowego optimum) pozwoli uzyskać obszar bardziej podatny na przyleganie komórek nowotworowych, a dłuższy czas inkubacji wstrzykniętych komórek w pęcherzu spowoduje zwiększenie stopnia przylegania komórek w miej...

<table><tbody><tr><td>Myszy C57Bl/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>3-5-tygodniowe</td></tr><tr><td>Klatki z poliwęglanu i wentylowany regał</td><td>Lab Products</td><td>Super Mouse 750</td><td>327mm x&lt;br/&gt;190mm x&lt;br/&gt;143mm</td></tr><tr><td>Ściółka z twardego drewna</td><td>Harlan Laboratories</td><td>SaniChips klasy laboratoryjnej &amp;#8211;</td><td></td></tr><tr><td>Karma dla gryzoni</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Rodent Diet 2019</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula do żył (IV)</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>009231</td><td>24 G x &amp;#190; in. </td></tr><tr><td>Urządzenie do elektrokoagulacji</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>Aaron 900</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do USG</td><td>Sonosite</td><td>180 Plus (Vet)</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa MB49</td><td>Wake Forest University Baptist Medical Center</td><td>N.D.</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100106 500A57B</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr></tbody></table>

ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

W tej prostej procedurze guzy pęcherza moczowego są indukowane u samic myszy C57 poprzez cewnikowanie, lokalną kauteryzację i następującą po niej adhezję komórek. Po cewnikowaniu przezcewkowym i opróżnieniu pęcherzy moczowych, zwierzęta są ponownie cewnikowane, aby umożliwić wprowadzenie platynowego drutu do pęcherzy bez uszkadzania cewki moczowej lub pęcherza. Cewniki wykonane są z teflonu, który służy jako izolator drutu przewodzącego prąd elektryczny do pęcherza w celu wywołania oparzenia. Urządzenie do elektrokoagulacji jest wykorzystywane do dostarczenia mocy 2,5W do odsłoniętego końca drutu, co prowadzi do wypalenia warstw zewnątrzkomórkowych i stworzenia miejsc przyczepienia dla komórek raka, które są wprowadzane do pęcherza w zawiesinie podczas kolejnego cewnikowania. Komórki pozostają w pęcherzu przez 90 minut, po czym cewniki są usuwane, a pęcherze opróżniają się w sposób naturalny. Rozwój guza jest monitorowany za pomocą ultradźwięków. W dołączonym materiale wideo szczególną uwagę poświęcono technice cewnikowania.

Guzy pęcherza moczowego u myszy żeńskich indukuje się w sposób małoinwazyjny poprzez cewnikowanie, lokalną kauteryzację oraz następującą po niej adhezję komórek raka do miejsc oparzeń.

Ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego

W tej prostej procedurze guzy pęcherza moczowego są indukowane u samic myszy C57 poprzez zastosowanie cewnikowania, lokalnej kauteryzacji oraz ...

Jestem profesorem WT Godbe i wraz z dr Georginą Dobe chcielibyśmy zaprezentować metodę ustanowienia ortotopowego modelu raka pęcherza moczowego u myszy. Zacznijmy od kroków, które podejmujemy w celu przygotowania zwierząt do tego zabiegu. Myszy, które prezentujemy dzisiaj, to samice szczepu C 57 blacks zakupione w Jackson Laboratories.Wybrano samice ze względu na łatwość cewnikowania. Myszy mają od trzech do pięciu tygodni i zazwyczaj ważą od 16 do 20 g. Myszy znieczulono przy użyciu respiratora ustawionego na podawanie izofluranu w stężeniu 2% w tlenie przy przepływie od 0,8 do 1 l/min. Częstość oddychania była stale monitorowana, aby zapobiec wysychaniu rogówki.W trakcie tej procedury, która trwa ponad półtorej godziny, oczy są nawilżane okulistyczną maścią z łzami sztucznymi, którą nakłada się bezpośrednio na oczy, a następnie wciera. Sierść w dolnej części grzbietu zostaje przystrzyżona, aby zapewnić kontakt z metalową płytą uziemiającą, która będzie wykorzystywana podczas zabiegu elektrokoagulacji w celu wywołania oparzenia w pęcherzu moczowym. Miejsca oparzeń będą służyć jako punkty adhezji dla wprowadzonych do światła pęcherza komórek nowotworowych. Pozostałe techniki stosow

an-orthotopic-model-of-murine-bladder-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ortotopowity model raka pęcherza u myszy

Wstrzykiwanie do ściany pęcherza moczowego myszy jest przydatnym podejściem do ortotopowych badań nad biologią komórek macierzystych pęcherza oraz biologią nowotworów. Tę precyzyjną metodę mikrochirurgiczną można opanować dzięki starannej technice i praktyce.

Iniekcja w ścianę pęcherza myszy

Ustanowienie ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego w celu oceny efektów przeciwnowotworowych wewnątrz pęcherzowo podanego saRNA oraz monitorowanie wzrostu guza za pomocą ultradźwięków i obrazowania bioluminescencyjnego.

Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego oraz ocena leczenia wewnątrz pęcherzowego za pomocą saRNA

W tym filmie opisujemy ortotopową transplantację hodowanych organoidów guza pęcherza moczowego do mysiego pęcherza moczowego, aby zbadać rolę środowiska narządu w rozwoju nowotworów.

Model organoidów guza pęcherza moczowego: metoda ortotopowego przeszczepu organoidów pęcherza moczowego do mysiego pęcherza biorcy

W tym filmie opisujemy dopęcherzową procedurę dostarczania komórek rakowych do pęcherza moczowego modelu mysiego. Procedura ta pomaga wygenerować ortotopowy model guza pęcherza moczowego, który można wykorzystać do opracowania strategii terapeutycznych.

Modelowanie ortotopowego guza pęcherza moczowego w modelu mysim: procedura dopęcherzowego podawania komórek rakowych do mysiego pęcherza moczowego

Implantacja komórek nowotworowych do narządu pochodzenia może służyć jako użyteczny model przedkliniczny do oceny nowych terapii. Komórki raka pęcherza moczowego MB49 mogą być hodowane w pęcherzu moczowym po wkropleniu dopęcherzowym. Protokół ten demonstruje cewnikowanie pęcherza myszy w celu implantacji guza i dostarczenia adenowirusa.

Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

Model raka pęcherza moczowego wywołanego N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoaminą został opracowany u transgenicznych myszy ludzkich mucyny 1 (MUC1) w celu przetestowania immunoterapii ukierunkowanej na MUC1.  Po podaniu szczepionki peptydowej ukierunkowanej na MUC1 potwierdzono odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T na MUC1 poprzez pomiar poziomu cytokin w surowicy i aktywności specyficznej dla limfocytów T.

Indukcja inwazyjnego raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego u nienaruszonych immunologicznie ludzkich myszy transgenicznych MUC1: model rozwoju immunoterapii

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Ten protokół opisuje powstawanie mysich ortotopowych guzów pęcherza moczowego u samic myszy C57BL/6J oraz monitorowanie wzrostu guza.

Mysi ortotopowy model guza pęcherza moczowego i system wykrywania guzów

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Ten protokół dostarcza szczegółowych kroków eksperymentalnych w celu ustanowienia trójwymiarowej hodowli in vitro organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego raka pęcherza moczowego. Opisano metody hodowli, w tym pasażowanie, inżynierię genetyczną i ortotopowe przeszczepianie organoidów nowotworowych.

Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy

Poznaj metodę tworzenia ortotopowego modelu raka pęcherza moczowego u myszy C57BL/6. Technika obejmuje cewnikowanie, kauteryzację oraz przyleganie komórek nowotworowych. Model umożliwia badanie mikrośrodowiska nowotworu i testowanie terapii.

Ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego

Przeglądaj więcej filmów