Name: Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK krwi obwodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę ekspansji i oczyszczania ludzkich komórek NK z krwi obwodowej w celu zastosowań immunoterapeutycznych. Technika umożliwia uzyskanie 21 000-krotnego wzrostu komórek zachowujących wysoką cytotoksyczność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Laurence Cooper, Harjeet Singh oraz Lence Hurton za ich pracę przy tworzeniu początkowych wektorów fuzyjnych K562 aAPC i mIL21.
Finansowanie niniejszej pracy zostało zapewnione przez UT MD Anderson Physician Scientist Program, St. Baldrick's Foundation oraz Legends of Friendswood.

1. Izolacja PBMC z warstwy leukocytarnej (buffy coat)
Mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) uzyskuje się poprzez wirowanie w gradiencie gęstości na Ficoll-Paque z próbek warstwy leukocytarnej od zdrowych dawców, pobranych metodą leukaferezy.
<ol>
<li>Wirowanie z użyciem Ficoll-Paque przeprowadza się zgodnie z protokołem producenta z niewielkimi modyfikacjami.</li>
<li>Do warstwy leukocytarnej (buffy coat) pobranej od zdrowego dawcy z banku krwi dodać PBS do uzyskania objętości końcowej 140 mL (typową objętością warstwy leukocytarnej jest 40-70 mL).</li>
<li>Nanieść 35 mL próbki warstwy leukocytarnej na 15 mL Ficoll-Paque (do 4 probówek).</li>
<li>Wirować przy 400g przez 20 minut bez hamowania.</li>
<li>Odessać PBMC z interfejsu Ficoll-Paque:plazma; nie usuwać erytrocytów znajdujących się na dnie warstwy Ficoll-Paque.</li>
<li>Przemyć PBMC trzy razy PBS, wirować za każdym razem przy 400g przez 10 minut.</li>
<li>Na tym etapie PBMC można wykorzystać bezpośrednio do ekspansji komórek NK lub można wyizolować komórki NK za pomocą metody RosetteSep (Sekcja 4).</li>
<li>Pozostałe PBMC można zamrozić w FBS zawierającym 10% DMSO w ciekłym azocie.</li>
<li>Odssać Ficoll i zebrać erytrocyty z kroku 5 do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 mL, przemyć trzy razy PBS (uzupełniając do poziomu 50 mL), za każdym razem odsysając nadosad z powierzchni warstwy erytrocytów w celu usunięcia granulocytów.</li>
<li>Erytrocyty można wykorzystać natychmiast do oczyszczania komórek NK metodą RosetteSep (patrz Sekcja 4) lub przechowywać w równej objętości roztworu Alsevera w temperaturze 4°C do późniejszego użycia (erytrocyty można przechowywać maksymalnie przez 4 tygodnie).</li>
</ol>
2. Ekspansja komórek NK
Ekspansję komórek NK można rozpocząć, używając PBMC lub oczyszczonych komórek NK. Ilość PBMC wykorzystywanych do ekspansji może być zróżnicowana w zależności od pożądanej liczby komórek NK po trzech tygodniach ekspansji; szczegóły znajdują się w sekcji z reprezentatywnymi wynikami. (Patrz Uwaga 1)

STYMULACJA 1
Dzień 0
<ol>
<li>Dla każdej porcji 5x106 PBMC przeznaczonych do ekspansji, odlicz i napromieniuj 10x106 komórek K562 Cl9 mIL21 za pomocą irradiatora gamma dawką 100 Gy.</li>
<li>Po napromieniowaniu przemyj komórki PBS i resuspenduj w pośrodku do ekspansji komórek NK (NKEM).</li>
<li>Wysiej 5x106 PBMC wraz z 10x106 napromieniowanych komórek K562 Cl9 mIL21 (stosunek 1:2) w 40 mL NKEM w kolbie T75, a następnie umieść ją w pozycji pionowej w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.</li>
</ol>
Dzień 3 i 5
<ol start="4">
<li>Odwirować komórki przy 400g przez 5 min, wymienić połowę pożywki na świeżą NKEM (dodając świeże IL2 dla całej objętości pożywki) i kontynuować hodowlę.</li>
</ol>
STYMULACJA 2
Dzień 7
<ol>
<li>Policz liczbę komórek w hodowli po upływie jednego tygodnia.</li>
<li>Odstaw 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej (Patrz Uwaga 2)</li>
<li>Dla każdych 5x106 komórek przeznaczonych do restymulacji, policz i napromieniuj 5x106 K562 Cl9 mIL21 przy użyciu irradiatora gamma dawką 100 Gy.</li>
<li>Dodaj równą liczbę napromieniowanych komórek K562 Cl9 mIL21 (stosunek 1:1) i resuspenduj w NKEM do stężenia 2.5x105 całkowitej liczby komórek/mL (Patrz Uwaga 3).</li>
<li>Wysiej komórki do kolb T75 (maksymalnie 50 mL na kolbę).</li>
</ol>
Dzień 10 i 12
<ol start="6">
<li>Policz liczbę komórek.</li>
<li>Wymień całe medium na świeże NKEM, dostosowując objętość do liczby komórek (zobacz Notatkę 3).</li>
</ol>
Dzień 14
<ol start="8">
<li>Po dwóch tygodniach ekspansji należy policzyć liczbę komórek w hodowli.</li>
<li>Osobno należy odłożyć 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej (patrz Uwaga 2).</li>
<li>Jeśli ekspansja została rozpoczęta z PBMC, komórki NK można oczyścić na tym etapie ekspansji, stosując protokół oczyszczania RosetteSep (patrz Sekcja IV). Jeśli ekspansja została rozpoczęta z oczyszczonych komórek NK, należy przejść do stymulacji 3.</li>
<li>Po oczyszczaniu należy odłożyć 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej w celu zweryfikowania czystości komórek NK (podobnie jak w kroku 8).</li>
<li>Należy przejść do stymulacji 3, wykorzystując wszystkie oczyszczone komórki NK (patrz Uwaga 4).</li>
</ol>
STYMULACJA 3
<ol>
<li>Resuspendować komórki NK wraz z napromieniowanymi komórkami K562 Cl9 mIL21 (w stosunku 1:1) w pożywce NKEM, dostosowując objętość do liczby komórek (patrz Uwaga 3).</li>
</ol>
Dni 17 i 19
<ol start="2">
<li>Policz liczbę komórek.</li>
<li>Wymień medium na świeże NKEM, dostosowując objętość do liczby komórek (zob. Uwaga 3).</li>
</ol>
Dzień 21
<ol start="4">
<li>Po trzech tygodniach ekspansji należy policzyć liczbę komórek w hodowli.</li>
<li>Odzyskać 1x106 komórek do analizy cytometrycznej z wykorzystaniem pełnego panelu przeciwciał do fenotypowania komórek NK (patrz Tabela 1).</li>
<li>Zamrozić komórki w FBS zawierającym 10% DMSO przy maksymalnej gęstości 5x107 komórek na fiolkę do późniejszego użycia.</li>
</ol>
3. Test cytotoksyczności komórek NK
<ol>
<li>Odmrozić fiolkę komórek NK i wysiać je w pożywce NKEM na jeden dzień przed wykonaniem testu cytotoksyczności, aby umożliwić ich regenerację.</li>
<li>Do każdego testu cytotoksyczności komórek NK z użyciem pojedynczej linii komórek docelowych wymagane jest 6x105 komórek NK oraz 3x105 komórek docelowych (patrz Uwaga 5).</li>
<li>Przygotować pożywkę CAM, rozcieńczając Calcein-AM (roztwór stokowy 1 mg/mL w DMSO) w NKEM (patrz Uwaga 6).</li>
<li>Resuspendować 106 komórek docelowych w 1 mL pożywki CAM (patrz Uwaga 7).</li>
<li>Inkubować przez 1 h w 37 °C, okazjonalnie wstrząsając.</li>
<li>Resuspendować komórki NK do stężenia 1x106 komórek/mL i dodać 200uL zawiesiny komórek NK do każdego z 3 dołków płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U, odpowiadających stosunkowi E:T 10:1 przedstawionemu na Rysunku 1. (patrz Uwaga 8)</li>
<li>Dodać 100uL pełnej pożywki do wszystkich pozostałych dołków, z wyjątkiem dołka „Maximum”.</li>
<li>Dodać 100uL 2% Triton X-100 do dołka „Maximum”.</li>
<li>Wykonać rozcieńczenia seryjne komórek NK dla 5 kolejnych stosunków E:T, przenosząc za każdym razem 100uL komórek i dokładnie mieszając. Odrzucić 100uL z ostatnich dołków (stosunek E:T 0,3125:1).</li>
<li>Po 1 godzinie ładowania kalceinyy przemyć komórki docelowe dwukrotnie w NKEM, wirując przez 5 min przy 1200 rpm. (patrz Uwaga 9)</li>
<li>Ponownie policzyć komórki docelowe i resuspendować do stężenia 1x105 komórek/mL.</li>
<li>Dodać 100 μL komórek docelowych do każdego dołka (1x104/dołek). Wirować przez 1 min przy 100g, aby zainicjować kontakt między komórkami.</li>
<li>Inkubować w 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.</li>
<li>Delikatnie wymieszać kulturę, pipetując dozakiem 100 μL w celu jednorodnego zawieszenia uwolnionej kalceiny, odwirować płytkę przy 100g przez 5 minut, aby osadzić komórki, a następnie przenieść 100 μL supernatantu do nowej płytki, dbając o uniknięcie pęcherzyków powietrza. Ewentualne pęcherzyki usunąć za pomocą cienkiej igły.</li>
<li>Odczytać płytkę za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek (filtr wzbudzenia 485 nm, filtr emisji 530 nm). Zalecany jest odczyt od dna.</li>
<li>Obliczyć procent specyficznej lizy zgodnie ze wzorem [(uwolnienie testowe - uwolnienie spontaniczne)/(uwolnienie maksymalne - uwolnienie spontaniczne)] x 100.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie komórek NK metodą RosetteSep
<ol>
<li>Do probówki o pojemności 50 mL przenieść 100-krotną nadwyżkę RBC względem liczby PBMCs lub komórek namnożonych (stosunek RBC:PBMC 100:1).</li>
<li>W przypadku użycia świeżych RBC przejść bezpośrednio do następnego kroku; jeśli RBC były przechowywane w roztworze Alsevera, należy policzyć RBC i wyprać odpowiednią ilość (100-krotna nadwyżka) w PBS uzupełnionym o 2% FBS trzykrotnie, wirując przy 1200 rpm przez 10 minut w każdym cyklu.</li>
<li>Połączyć RBC z PBMCs z kroku 1.7 lub komórkami namnożonymi z kroku 2.10 w PBS + 2% FBS do objętości końcowej 1 mL na każde 5x107 PBMCs lub komórek namnożonych.</li>
<li>Dodać 1μL RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail na każde 1x106 PBMCs lub komórek namnożonych.</li>
<li>Dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, delikatnie mieszając co 5 minut.</li>
<li>Dodać taką samą objętość PBS + 2% FBS, delikatnie wymieszać i nanieść warstwowo na Ficoll-Paque.</li>
<li>Powtórzyć etapy wirowania na Ficoll-Paque opisane dla izolacji PBMCs (Sekcja I).</li>
<li>Policzyć odzyskane komórki NK po oczyszczaniu i odłożyć 5x105 komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej w celu oceny czystości komórek NK (Krok 8).</li>
</ol>
5. Uwagi
UWAGA 1. Komórki NK można namnażać bezpośrednio z PBMC lub z komórek NK oczyszczonych metodą RosetteSep. Odnotowano podobną wydajność namnażania, jednak u niektórych dawców liczba komórek NK może być bardzo niska, co może utrudnić oczyszczanie metodą RosetteSep przed namnażaniem.
UWAGA 2. Do fenotypowania podczas ekspansji rutynowo stosujemy CD56-FITC, CD16-PE oraz CD3-PE-Cy5, licząc komórki NK jako te, które są CD3-ujemne i CD16- lub CD56-dodatnie.
UWAGA 3. Przy każdej wymianie pożywki lub stymulacji resuspenderze komórki w stężeniu 2.5 x 105/mL, aby utrzymać liczbę komórek PBMC/NK na poziomie 2 milionów na mL lub poniżej w szczytowych fazach ekspansji. Zapobiegnie to wyczerpaniu składników odżywczych i pomoże osiągnąć maksymalną ekspansję oraz przeżywalność.
UWAGA 4. Szybkość ekspansji komórek NK zależy od dawcy; po pierwszej lub drugiej stymulacji część komórek można zamrozić, a część dalej namnażać, w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Osiągnęliśmy dobre wyniki, wykorzystując zamrożone komórki do ekspansji w późniejszym terminie.
UWAGA 5. Aby zachować margines błędu, zalecamy użycie minimum 7x105 komórek NK resuspenderowanych w 700 uls NKEM oraz 4x105 komórek docelowych zabarwionych Calcein-AM resuspenderowanych w 4 mL NKEM do przygotowania testu cytotoksyczności. W przypadku użycia pipety wielokanałowej do wysiewu komórek docelowych, w zależności od wielkości zastosowanego zbiornika na medium, mogą być wymagane większe objętości komórek (do 6x105 w 6 mL). Ponadto zalecana liczba komórek NK odnosi się konkretnie do stosunków E:T przedstawionych w protokole; w przypadku stosowania wyższych stosunków E:T należy odpowiednio zwiększyć liczbę komórek NK na mL (np. dla stosunku E:T 40:1 należy użyć 4x106 komórek/mL)
UWAGA 6. Zalecamy przeprowadzenie wstępnego miareczkowania ładowania Calcein-AM dla wybranej linii komórkowej, stosując następujące rozcieńczenia: 1:500, 1:400, 1:300, 1:200 oraz 1:100, aby uzyskać optymalną różnicę między uwalnianiem maksymalnym a spontanicznym.
UWAGA 7. W przypadku użycia adherentnej linii komórkowej jako komórek docelowych, należy najpierw przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, korzystając z nieenzymatycznego buforu do dysocjacji komórek. Jeśli przeprowadzany jest test ADCC, należy przygotować drugą probówkę z komórkami docelowymi w medium CAM.
UWAGA 8. W przypadku przeprowadzania ADCC, należy dodać te same komórki NK do 3 studzienek odpowiadających stosunkowi E:T 10:1 dla ADCC. Powtórzyć procedurę dla dodatkowych dawców. Powtórzyć procedurę dla dodatkowych komórek docelowych.
UWAGA 9. W przypadku przeprowadzania eksperymentu ADCC, po 45 minutach ładowania kalceiny, należy dodać 10ug przeciwciała specyficznego dla indukcji ADCC przeciwko komórkom docelowym. Po kolejnych 15 minutach komórki docelowe należy dwukrotnie przemyć w pożywce kompletnej, wirując przez 5 min przy 1200 rpm. Komórki należy resuspender do stężenia 1x105 cells/ mL i przejść do następnego kroku protokołu.
6. REPREZENTATYWNE WYNIKI
<img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Wykres danych dotyczących krotności ekspansji; analiza poszczególnych dawców; wykres punktowy z słupkami błędów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Gdy ekspansja jest przeprowadzana zgodnie z powyższym schematem, z wykorzystaniem 5x10⁶ PBMC jako materiału wyjściowego, typowe wydajności komórek NK wynoszą od 1x109 do 1010 komórki (zmienność zależna od dawcy). Rycina przedstawia krotność ekspansji komórek NK (n=19) w porównaniu do liczby komórek NK obecnych w produkcie wyjściowym (mediana +/- kwartyl).
<img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej przedstawiające markery powierzchniowe komórek, analiza przed i po ekspansji w dniu 21." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Ekspandowane komórki NK wykazują ekspresję różnych receptorów komórek NK, która jest porównywalna do nieekspandowanych pierwotnych komórek NK, z kilkoma wyjątkami (CD11b, CD160 oraz CD244).
<img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Schemat cytometrii przepływowej obrazujący PBMC i namnożone komórki NK za pomocą markerów CD3, CD16, proces RosetteSep." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Odzysk PBMC z warstwy leukocytarnej (Buffy coat) jest zależny od dawcy i może wynosić od 300x106 do 800x106. Komórki NK mogą stanowić 2% - 18% PBMC. W przypadku oczyszczania namnożonych komórek metodą RosetteSep, odzysk czystych komórek NK w 14. dniu wynosi od 40-70%. Stosując zalecany protokół namnażania i oczyszczania, można oczekiwać czystości komórek NK na poziomie 99%. 
<img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Liza komórek AML w zależności od stosunku E:T; wykres porównujący AML10 i AML13; analiza cytotoksyczności; komórki NK." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Ekspandowane komórki NK wykazały cytotoksyczność wobec szeregu linii komórkowych nowotworowych, w tym neuroblastoma, AML, osteosarcoma i melanoma (przedstawiono reprezentatywną aktywność zabijania komórek AML jako procent specyficznej lizy).

<ol><li>McKenna, D. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy%3A+a+six-year+single-institution+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li>
<li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Klinische+Padiatrie%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li>
<li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li>
<li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li>
<li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56%2B+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li>
<li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li>
<li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets%3A+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li>
<li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li>
<li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A%2C+4-1BB+ligand%2C+and+interleukin-15%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Pożywka do ekspansji i aktywacji komórek NK (NKEM)&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>90% RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% płodowej surowicy bydlęcej</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x penicylina / streptomycyna</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x L-glutamina</td><td>Gibco</td><td></td><td>Przed użyciem wysterylizować pożywkę przez filtr.</td></tr><tr><td>50 U/ mL IL2</td><td>Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc)</td><td></td><td>Rozcieńczone z roztworu zapasowego 200 IU/&amp;mu;l. Dodawać IL2 do wymaganej ilości pożywki bezpośrednio przed każdym użyciem.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Izolacja PBMC i komórek NK&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór Alsevera</td><td>Sigma)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>koktajl do wzbogacania ludzkich komórek NK RosetteSep</td><td>Stemcell Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Test cytotoksyczności komórek NK&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Przeciwciała&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">Lista przeciwciał użytych do fenotypowania komórek NK znajduje się w poniższej tabeli:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;Probówka 1: (objętość całkowita 100)&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Przeciwciało: izotyp FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555748</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: izotyp FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555749</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: izotyp FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: izotyp FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>340442</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: bufor FACS</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>Objętość: 80</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;Probówka 2: (objętość całkowita 100)&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD56 FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>340410</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: NKp30 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>558407</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: NKp44 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>558563</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: NKp46 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>557991</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD3 PE-Cy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555341</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD16 Alexa 647</td><td>BD Pharmingen</td><td>557710</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: bufor FACS</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>Objętość: 70</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;Probówka 3: (objętość całkowita 100)&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD56 FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>340410</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: KIR2DL1 PE</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1844P</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: KIR2DL2/3 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-618</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: KIR3DL1 PE</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB12251P</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD3 PE-Cy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555341</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: NKG2D APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>558071</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: bufor FACS</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>Objętość: 70</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;Probówka 4: (objętość całkowita 100)&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD56 FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>340410</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD11b PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>555388</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD3 PE-Cy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555341</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD27 APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>558664</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: bufor FACS</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>Objętość: 80</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;Probówka 5: (objętość całkowita 100)&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD56 FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>340410</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD266 (DNAM-1) PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>559789</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD3 PE-Cy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555341</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD160 Alexa647</td><td>eBiosciences</td><td>51-1609-42</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: bufor FACS</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>Objętość: 80</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;Probówka 6: (objętość całkowita 100)&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD56 FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>340410</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD244 (2B4) PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550816</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD3 PE-Cy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555341</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD197 (CCR7) APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-1979-42</td><td>Objętość: 5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: bufor FACS</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>Objętość: 80</td></tr></tbody></table>

ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek nk z krwi obwodowej

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

Komórki NK (natural killer) odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym przeciwko różnorodnym mikroorganizmom zakaźnym i nowotworom. Ograniczona dostępność komórek NK oraz możliwości ich ekspansji in vitro hamowały rozwój immunoterapii opartej na tych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji dużych ilości funkcjonalnych komórek NK ex vivo z wykorzystaniem komórek K562 wykazujących ekspresję związanego z błoną IL21, pełniących rolę sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC).
Dotychczasowe terapie adopcyjne z wykorzystaniem komórek NK opierały się na produkcie komórkowym uzyskanym poprzez leukaferezę dawcy w stanie stacjonarnym, a następnie deplecję limfocytów T lub selekcję pozytywną komórek NK. Produkt ten jest zazwyczaj aktywowany w IL-2 przez noc, a następnie podawany następnego dnia 1. Ze względu na niską częstotliwość występowania komórek NK we krwi obwodowej, w badaniach klinicznych podawano stosunkowo niewielkie liczby komórek NK.
Brak możliwości namnażania komórek NK in vitro był czynnikiem ograniczającym w generowaniu wystarczającej liczby komórek dla uzyskania optymalnego efektu klinicznego. Pewna ekspansja komórek NK (5-10 krotnie w ciągu 1-2 tygodni) została osiągnięta przy zastosowaniu wyłącznie wysokich dawek IL-2 2. Aktywacja autologicznych limfocytów T może pośredniczyć w ekspansji komórek NK, prawdopodobnie również poprzez uwalnianie lokalnych cytokin 3. Wsparcie za pomocą stromy mezenchymalnej lub sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) może wspomagać ekspansję komórek NK zarówno z krwi obwodowej, jak i krwi pępowinowej 4. Połączona aktywacja NKp46 i CD2 za pomocą kulek powlekanych przeciwciałami jest obecnie oferowana komercyjnie w celu ekspansji komórek NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), co skutkuje około 100-krotnym wzrostem liczby komórek w ciągu 21 dni.
Trwają badania kliniczne z wykorzystaniem komórek NK rozszerzonych lub aktywowanych za pomocą aAPC, w tym jedno z użyciem linii komórek białaczkowych CTV-1 do primingu i aktywacji komórek NK5 bez znaczącej ekspansji. Drugie badanie wykorzystuje EBV-LCL do ekspansji komórek NK, osiągając średni 490-krotny wzrost w ciągu 21 dni6. Trzecie badanie wykorzystuje aAPC na bazie K562 transdukowane 4-1BBL (CD137L) oraz błonową IL-15 (mIL-15)7, co pozwoliło na średnio 277-krotną ekspansję komórek NK w ciągu 21 dni. Chociaż komórki NK rozszerzone przy użyciu aAPC K562-41BBL-mIL15 wykazują wysoką cytotoksyczność in vitro i in vivo w porównaniu do nierozszerzonych komórek NK oraz uczestniczą w ADCC, ich proliferacja jest ograniczona przez starzenie się przypisywane skracaniu telomerów8. Niedawno zgłoszono 350-krotną ekspansję komórek NK z wykorzystaniem K562 wykazujących ekspresję MICA, 4-1BBL oraz IL159.
Opisana tutaj metoda ekspansji komórek NK zapewnia szybką proliferację tych komórek bez indukowania starzenia się, osiągając medianę 21 000-krotnej ekspansji w ciągu 21 dni.

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Komórki natural killer (NK) odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym przeciwko różnorodnym mikroorganizmom zakaźnym i nowotworom. Ograniczona dostępność ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybka ekspansja dużej liczby ludzkich komórek NK. W etapie ex vivo należy rozpocząć od wyizolowania p BMCs lub komórek NK z warstwy leukocytowej (buffy coat) lub próbki krwi pełnej. Następnie należy poddać pbmc kokulturze z sztucznymi komórkami prezentującymi antygen w celu ekspansji komórek NK.Pożywka uzupełniona o IL-2 służy do utrzymania hodowli komórek NK przez trzy tygodnie, z cotygodniową stymulacją za pomocą aPCs, dbając o to, aby liczba komórek NK nie przekroczyła 1 × 10⁶ na mililitr hodowli. Ostatecznie zweryfikowano skuteczność funkcjonalną wyhodowanych komórek NK, stosując niepromienną analizę cytotoksyczności. Typowa wydajność komórek NK w tym schemacie ekspansji skutkuje medianowym 21 000-krotnym przyrostem komórek NK po 21 dniach, które wykazują wysoką cytotoksyczność wobec różnych nowotworów, co określono za pomocą testu uwalniania wapnia.Niniejszy materiał medyczny może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii komórek NK, ponieważ uzyskanie dużej liczby komórek NK było historycznie bardzo trudne. Technika ta ma znaczenie dla immunoterapii nowotworów u ludzi, ponieważ generowanie wystarczającej ilości komórek NK do takiej terapii było historycznie bardzo trudne. Techniki tej zaprezentuje Cecily, starsza asystentka badawcza w moim laboratorium, w celu uzyskania PBMC z krwi zdrowych dawców.Zazwyczaj jako źródło wykorzystuje się warstwę leukocytową (Buffy coat) z banku krwi. Najpierw należy dodać PBS, aby dostosować objętość warstwy leukocytowej do 140 mililitrów. Następnie 35 mililitrów próbki nanosi się na 15 mililitrów fial PA w celu przeprowadzenia wirowania w gradiencie gęstości przy 400 G przez 20 minut.Bez przerywania procesu. Ostrożnie odzyskaj P BMCs z interfejsu plazmy Fial PA i odstaw probówkę z RBCs do późniejszego użycia. Przemyj P BMCs trzy razy w PBS, wirowując za każdym razem przy 400 G przez 10 minut.Użyj tej frakcji P BMCs do ekspansji komórek NK. Teraz wróć do probówki z gradientem. Odsaj tę fi.Odwirować i przenieść RBC do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, a następnie przemyć, dolewając PBS do poziomu 50 ml. Po wirowaniu odessać nadsącz, zbierając go znad warstwy RBC, aby usunąć granulocyty.Przeprowadzić trzy przemycia, a następnie resuspendować RBC w równym objętości roztworze else's i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius za maksymalnie jeden miesiąc. Tę frakcję RBC można wykorzystać do oczyszczania komórek NK metodą roset SEP po dwóch tygodniach ekspansji. Aby efektywnie powielać funkcjonalne komórki NK ex vivo, wykorzystuje się komórki K 5 62 klonu dziewiątego z błonowo związanym IL 21, określane w dalszej części jako K 5 62.Klon dziewiąty IL 21 jest wykorzystywany jako sztuczna komórka prezentująca antygen. Najpierw należy policzyć PBMC i obliczyć objętość potrzebną do wysiania 5 × 10⁶ komórek w celu ekspansji komórek NK. Dla każdego 5 × 10⁶ PBMC należy naświetlać 10 × 10⁶ komórek K 5 62 klon dziewiąty IL 21. Używając irradiatora gamma przy dawce 100 Gy, naświetlone komórki można również zamrozić do późniejszego użycia. Następnie należy przemyć uprzednio naświetlone komórki roztworem PBS i resuspendować w pożywce do ekspansji komórek NK.Następnie dodaj komórki napromieniane w stosunku 2:1 do PBMC w 40 ml pożywki do ekspansji komórek NK i umieść kolbę T75 w pozycji pionowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. W trzecim dniu odzyskaj stymulowane komórki poprzez wirowanie przy 400 ×g przez 5 minut, wymień połowę pożywki na świeżą NKEM i kontynuuj hodowlę. Powtórz wymianę pożywki w piątym dniu. Po tygodniu policz liczbę komórek i odseparuj 5 × 10⁵ komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej. Do drugiej stymulacji policz i napromieniuj komórki K 562 w stosunku 1:1.Klonuj dziewięć komórek IL 21 w celu ich namnożenia, a następnie połącz komórki w pożywce do ekspansji komórek NK w stężeniu 2,5 × 10⁵ całkowitej liczby komórek na ml. Komórki należy przenieść do kolb T75 i kontynuować hodowlę; w 10. i 12. dniu pasażuj komórki w pożywce do ekspansji komórek NK w stężeniu 2,5 × 10⁵ komórek na ml. W 14. dniu ekspansji ponownie przeprowadź zliczenie komórek oraz analizę fenotypową próbki za pomocą cytometrii przepływowej.Oczyść tę ekspansję komórek pochodzących z PBMC, stosując protokół oczyszczania rosette SEP, a następnie zweryfikuj czystość komórek NK za pomocą fenotypowania metodą cytometrii przepływowej. Przeprowadź trzecią stymulację oczyszczonych komórek NK, stosując stosunek jeden do jednego naświetlanych komórek klonu dziewięć K 5 62 IL 21. Ostatecznie, w 21. dniu, przeanalizuj namnożone komórki NK metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując pełny panel przeciwciał do fenotypowania.Zamrozić zapasy komórek w FBS zawierającym 10% DMSO przy maksymalnej gęstości 5 × 10⁷ komórek na fiolkę. Do testu cytotoksyczności należy użyć komórek NK świeżych lub zamrożonych. W przypadku użycia zamrożonych komórek NK, najpierw rozmrozić fiolkę z komórkami NK i zasiać je w NKEM na 24 godziny, aby umożliwić regenerację komórek w dniu badania. Resuspendować 10⁶ komórek docelowych w 1 ml NKEM zawierającego calcium am i inkubować przez jedną godzinę w 37 °C, okresowo wstrząsając, w płytce UBO z 96 dołkami. Dodać w trzech powtórzeniach 200 µL komórek NK w zawiesinie o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/ml i przeprowadzić rozcieńczenia seryjne komórek zgodnie z instrukcją.Po jednej godzinie nasycania wapniem należy przemyć komórki docelowe w medium do ekspansji komórek NK, dwukrotnie wirując przez pięć minut przy 400 G. Następnie należy ponownie policzyć komórki docelowe i resuspender w stężeniu 1 × 10⁵ komórek/ml. Do każdej studzienki płytki 96-dołkowej należy dodać 100 µL komórek docelowych i wirować przez jedną minutę przy 100 G w celu zainicjowania kontaktu komórkowego, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cztery godziny.Aby równomiernie zawiesić uwolniony wapń, delikatnie wymieszaj hodowlę, pipetując komórki w osadzie przy 100 G przez pięć minut, a następnie przenieś 100 µL supernatantu do nowej płaskodennej płytki 96-dołkowej, dbając o uniknięcie pęcherzyków powietrza; w razie potrzeby przebij wszelkie powstałe pęcherzyki cienką igłą. Odczytaj płytkę za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek z ustawionym filtrem wzbudzenia 485 nm i filtrem emisji 530 nm.Oblicz procent swoistej lizy. Zazwyczaj ekspansja 5×10⁶ PBMC wyizolowanych z warstwy leukocytarnej (buffy coat) daje od 1×10⁹ do 10¹⁰ komórek NK. Ekspandowane komórki NK wykazują ekspresję różnych receptorów komórek NK, która jest porównywalna z nieekspandowanymi pierwotnymi komórkami NK z warstwy leukocytarnej.Komórki NK mogą stanowić od 2% do 18% pbmc w 14. dniu. Oczyszczanie rozetkowe SEP rozszerzonych komórek pozwala na odzyskanie od 40% do 70% komórek NK obecnych w kulturze, przy czystości komórek NK na poziomie 99%, co potwierdzono za pomocą CD3-negatywnych i CD56-pozytywnych komórek. Rozszerzone komórki NK wykazały cytotoksyczność wobec szeregu linii komórek nowotworowych, w tym neuroblastoma, AML, osteosarcoma i melanoma.Tutaj reprezentatywne zabijanie w ML A jest przedstawione jako procent specyficznej lizy. Film BIOT na żywo pokazuje zabijanie linii komórkowej neuroblastoma CHP 1 34 obciążonej wapniem am po tej procedurze. Można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza produkcji cytokin przez komórki NK oraz transfer adaptacyjny w zwierzęcych modelach nowotworowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcji komórek NK.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak namnażać i oczyszczać duże liczby komórek NK. Można to przeprowadzić bezpośrednio z mononuklearnych komórek krwi obwodowej, a następnie oczyszczać komórki NK, lub rozpocząć ekspansję, wykorzystując komórki NK oczyszczone metodą rozety. Na samym początku typowy warstwowy koncentrat leukocytów (buffy coat) dostarczy od 15 do 40 milionów komórek NK, z których wszystkie mogą zostać wykorzystane do namnożenia bardzo dużych liczb komórek NK zgodnie ze schematem opisanym w niniejszej metodzie.

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK krwi obwodowej

W niniejszej pracy opisujemy metodę aktywacji i ekspansji ludzkich komórek NKT z populacji zmieszanych limfocytów T przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC). Wykorzystanie aAPC opartych na CD1d zapewnia zestandaryzowaną metodę generowania wysokiej liczby funkcjonalnych komórek NKT.

Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Ten film demonstruje technikę ekspansji komórek NK (natural killer) bezpośrednio z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą linii komórkowej zasilającej. PBMC są hodowane wspólnie z genetycznie zmodyfikowanymi komórkami odżywiającymi limfoblastoidy eksprymujące interleukinę-21 związaną z błoną (mIL-21), a hodowla jest uzupełniana cytokinami interleukiną-2 (IL-2) i interleukiną-15 (IL-15). Razem ten koktajl ligandów prowadzi do przedłużonej ekspansji komórek NK o wysokiej...

Ekspansja ex vivo komórek NK z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Tutaj prezentujemy dostosowany protokół, który może być użyty do wygenerowania dużej liczby mysich niezmiennych limfocytów T NK z mysiej śledziony. W protokole przedstawiono podejście, dzięki któremu komórki iNKT śledziony mogą być wzbogacane, izolowane i namnażane in vitro przy użyciu ograniczonej liczby zwierząt i odczynników.

Zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Protokół do badania zdarzeń wywołanych przez FcγRIIIa przez przeciwciała terapeutyczne w ludzkich komórkach NK jest opisany tutaj. Ta platforma sztucznej stymulacji umożliwia badanie dalszych funkcji efektorowych, takich jak degranulacja, produkcja chemokin/cytokin i szlaki sygnałowe, w których pośredniczą części FcγRIIIa i Fc przeciwciał zaangażowanych w wiązanie.

Ocena zdarzeń związanych z ludzkimi komórkami NK wywołanych zaangażowaniem FcγRIIIa w obecności przeciwciał terapeutycznych

Opisujemy szybki i solidny protokół wzbogacania niezmiennych komórek T natural killer (iNKT) ze śledziony myszy i rozszerzania ich in vitro do odpowiedniej liczby dla badań in vitro i in vivo.

Oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów T NK do badań in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy metodę rozszerzania naturalnego killera krwi obwodowej (PBNK), komórek NK z tkanek wątroby oraz chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-komórek NK pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB). Protokół ten demonstruje ekspansję komórek NK i CAR-NK przy użyciu ogniw zasilających 221-mIL-21 oprócz zoptymalizowanej czystości ekspandowanych komórek NK.

Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Obecny protokół pokazuje, jak odróżnić komórki CD3−/CD45+CD56+ o łagodnej cytotoksyczności od ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale (hEPSC) zarówno w warunkach hodowli 3D, jak i 2D. Pozwala to na rutynową walidację fenotypową bez niszczenia złożonego mikrośrodowiska.

Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Poznaj metodę ekspansji i oczyszczania ludzkich komórek NK z krwi obwodowej w celu zastosowań immunoterapeutycznych. Technika umożliwia uzyskanie 21 000-krotnego wzrostu komórek zachowujących wysoką cytotoksyczność.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Przeglądaj więcej filmów