Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Ogólnym celem tej procedury jest szybka ekspansja dużej liczby ludzkich komórek NK. W etapie ex vivo należy rozpocząć od wyizolowania p BMCs lub komórek NK z warstwy leukocytowej (buffy coat) lub próbki krwi pełnej. Następnie należy poddać pbmc kokulturze z sztucznymi komórkami prezentującymi antygen w celu ekspansji komórek NK.

Pożywka uzupełniona o IL-2 służy do utrzymania hodowli komórek NK przez trzy tygodnie, z cotygodniową stymulacją za pomocą aPCs, dbając o to, aby liczba komórek NK nie przekroczyła 1 × 10⁶ na mililitr hodowli. Ostatecznie zweryfikowano skuteczność funkcjonalną wyhodowanych komórek NK, stosując niepromienną analizę cytotoksyczności. Typowa wydajność komórek NK w tym schemacie ekspansji skutkuje medianowym 21 000-krotnym przyrostem komórek NK po 21 dniach, które wykazują wysoką cytotoksyczność wobec różnych nowotworów, co określono za pomocą testu uwalniania wapnia.

Niniejszy materiał medyczny może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii komórek NK, ponieważ uzyskanie dużej liczby komórek NK było historycznie bardzo trudne. Technika ta ma znaczenie dla immunoterapii nowotworów u ludzi, ponieważ generowanie wystarczającej ilości komórek NK do takiej terapii było historycznie bardzo trudne. Techniki tej zaprezentuje Cecily, starsza asystentka badawcza w moim laboratorium, w celu uzyskania PBMC z krwi zdrowych dawców.

Zazwyczaj jako źródło wykorzystuje się warstwę leukocytową (Buffy coat) z banku krwi. Najpierw należy dodać PBS, aby dostosować objętość warstwy leukocytowej do 140 mililitrów. Następnie 35 mililitrów próbki nanosi się na 15 mililitrów fial PA w celu przeprowadzenia wirowania w gradiencie gęstości przy 400 G przez 20 minut.

Bez przerywania procesu. Ostrożnie odzyskaj P BMCs z interfejsu plazmy Fial PA i odstaw probówkę z RBCs do późniejszego użycia. Przemyj P BMCs trzy razy w PBS, wirowując za każdym razem przy 400 G przez 10 minut.

Użyj tej frakcji P BMCs do ekspansji komórek NK. Teraz wróć do probówki z gradientem. Odsaj tę fi.

Odwirować i przenieść RBC do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, a następnie przemyć, dolewając PBS do poziomu 50 ml. Po wirowaniu odessać nadsącz, zbierając go znad warstwy RBC, aby usunąć granulocyty.

Przeprowadzić trzy przemycia, a następnie resuspendować RBC w równym objętości roztworze else's i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius za maksymalnie jeden miesiąc. Tę frakcję RBC można wykorzystać do oczyszczania komórek NK metodą roset SEP po dwóch tygodniach ekspansji. Aby efektywnie powielać funkcjonalne komórki NK ex vivo, wykorzystuje się komórki K 5 62 klonu dziewiątego z błonowo związanym IL 21, określane w dalszej części jako K 5 62.

Klon dziewiąty IL 21 jest wykorzystywany jako sztuczna komórka prezentująca antygen. Najpierw należy policzyć PBMC i obliczyć objętość potrzebną do wysiania 5 × 10⁶ komórek w celu ekspansji komórek NK. Dla każdego 5 × 10⁶ PBMC należy naświetlać 10 × 10⁶ komórek K 5 62 klon dziewiąty IL 21. Używając irradiatora gamma przy dawce 100 Gy, naświetlone komórki można również zamrozić do późniejszego użycia. Następnie należy przemyć uprzednio naświetlone komórki roztworem PBS i resuspendować w pożywce do ekspansji komórek NK.

Następnie dodaj komórki napromieniane w stosunku 2:1 do PBMC w 40 ml pożywki do ekspansji komórek NK i umieść kolbę T75 w pozycji pionowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. W trzecim dniu odzyskaj stymulowane komórki poprzez wirowanie przy 400 ×g przez 5 minut, wymień połowę pożywki na świeżą NKEM i kontynuuj hodowlę. Powtórz wymianę pożywki w piątym dniu. Po tygodniu policz liczbę komórek i odseparuj 5 × 10⁵ komórek do fenotypowania metodą cytometrii przepływowej. Do drugiej stymulacji policz i napromieniuj komórki K 562 w stosunku 1:1.

Klonuj dziewięć komórek IL 21 w celu ich namnożenia, a następnie połącz komórki w pożywce do ekspansji komórek NK w stężeniu 2,5 × 10⁵ całkowitej liczby komórek na ml. Komórki należy przenieść do kolb T75 i kontynuować hodowlę; w 10. i 12. dniu pasażuj komórki w pożywce do ekspansji komórek NK w stężeniu 2,5 × 10⁵ komórek na ml. W 14. dniu ekspansji ponownie przeprowadź zliczenie komórek oraz analizę fenotypową próbki za pomocą cytometrii przepływowej.

Oczyść tę ekspansję komórek pochodzących z PBMC, stosując protokół oczyszczania rosette SEP, a następnie zweryfikuj czystość komórek NK za pomocą fenotypowania metodą cytometrii przepływowej. Przeprowadź trzecią stymulację oczyszczonych komórek NK, stosując stosunek jeden do jednego naświetlanych komórek klonu dziewięć K 5 62 IL 21. Ostatecznie, w 21. dniu, przeanalizuj namnożone komórki NK metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując pełny panel przeciwciał do fenotypowania.

Zamrozić zapasy komórek w FBS zawierającym 10% DMSO przy maksymalnej gęstości 5 × 10⁷ komórek na fiolkę. Do testu cytotoksyczności należy użyć komórek NK świeżych lub zamrożonych. W przypadku użycia zamrożonych komórek NK, najpierw rozmrozić fiolkę z komórkami NK i zasiać je w NKEM na 24 godziny, aby umożliwić regenerację komórek w dniu badania. Resuspendować 10⁶ komórek docelowych w 1 ml NKEM zawierającego calcium am i inkubować przez jedną godzinę w 37 °C, okresowo wstrząsając, w płytce UBO z 96 dołkami. Dodać w trzech powtórzeniach 200 µL komórek NK w zawiesinie o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/ml i przeprowadzić rozcieńczenia seryjne komórek zgodnie z instrukcją.

Po jednej godzinie nasycania wapniem należy przemyć komórki docelowe w medium do ekspansji komórek NK, dwukrotnie wirując przez pięć minut przy 400 G. Następnie należy ponownie policzyć komórki docelowe i resuspender w stężeniu 1 × 10⁵ komórek/ml. Do każdej studzienki płytki 96-dołkowej należy dodać 100 µL komórek docelowych i wirować przez jedną minutę przy 100 G w celu zainicjowania kontaktu komórkowego, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cztery godziny.

Aby równomiernie zawiesić uwolniony wapń, delikatnie wymieszaj hodowlę, pipetując komórki w osadzie przy 100 G przez pięć minut, a następnie przenieś 100 µL supernatantu do nowej płaskodennej płytki 96-dołkowej, dbając o uniknięcie pęcherzyków powietrza; w razie potrzeby przebij wszelkie powstałe pęcherzyki cienką igłą. Odczytaj płytkę za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek z ustawionym filtrem wzbudzenia 485 nm i filtrem emisji 530 nm.

Oblicz procent swoistej lizy. Zazwyczaj ekspansja 5×10⁶ PBMC wyizolowanych z warstwy leukocytarnej (buffy coat) daje od 1×10⁹ do 10¹⁰ komórek NK. Ekspandowane komórki NK wykazują ekspresję różnych receptorów komórek NK, która jest porównywalna z nieekspandowanymi pierwotnymi komórkami NK z warstwy leukocytarnej.

Komórki NK mogą stanowić od 2% do 18% pbmc w 14. dniu. Oczyszczanie rozetkowe SEP rozszerzonych komórek pozwala na odzyskanie od 40% do 70% komórek NK obecnych w kulturze, przy czystości komórek NK na poziomie 99%, co potwierdzono za pomocą CD3-negatywnych i CD56-pozytywnych komórek. Rozszerzone komórki NK wykazały cytotoksyczność wobec szeregu linii komórek nowotworowych, w tym neuroblastoma, AML, osteosarcoma i melanoma.

Tutaj reprezentatywne zabijanie w ML A jest przedstawione jako procent specyficznej lizy. Film BIOT na żywo pokazuje zabijanie linii komórkowej neuroblastoma CHP 1 34 obciążonej wapniem am po tej procedurze. Można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza produkcji cytokin przez komórki NK oraz transfer adaptacyjny w zwierzęcych modelach nowotworowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcji komórek NK.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak namnażać i oczyszczać duże liczby komórek NK. Można to przeprowadzić bezpośrednio z mononuklearnych komórek krwi obwodowej, a następnie oczyszczać komórki NK, lub rozpocząć ekspansję, wykorzystując komórki NK oczyszczone metodą rozety. Na samym początku typowy warstwowy koncentrat leukocytów (buffy coat) dostarczy od 15 do 40 milionów komórek NK, z których wszystkie mogą zostać wykorzystane do namnożenia bardzo dużych liczb komórek NK zgodnie ze schematem opisanym w niniejszej metodzie.