Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK krwi obwodowej

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie namnażanie dużej liczby ludzkich komórek NK. Ex vivo zacznij od wyizolowania p BMC lub komórek NK z kożucha lub próbki krwi pełnej. Następnie kohodowla pbmc ze sztucznym antygenem prezentującym komórki w ekspansji komórek NK.

Pożywki uzupełnione IL dwa utrzymują hodowlę komórek NK przez trzy tygodnie z cotygodniową stymulacją za pomocą a PC, dbając o utrzymanie liczby komórek NK poniżej jednego razy 10 do szóstego na mililitr hodowli. Pożywki ostatecznie potwierdzają funkcjonalną skuteczność ekspandowanych komórek NK za pomocą nieradioaktywnego testu cytotoksyczności. Typowa wydajność komórek NK przy użyciu tego schematu ekspansji powoduje medianę 21 000-krotnej ekspansji komórek NK pod koniec 21 dni, które mają wysoką cytotoksyczność wobec różnych nowotworów, jak określono za pomocą testu uwalniania wapnia.

To badanie medyczne może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii komórek NK, ponieważ historycznie bardzo trudno było uzyskać dużą liczbę komórek NK. Technika ta ma implikacje dla immunoterapii ludzkiego raka, ponieważ generowanie wystarczającej liczby komórek NK do takiej terapii było historycznie bardzo trudne. Technikę tę zademonstruje Cecily, starszy asystent naukowy w moim laboratorium, aby uzyskać krew P BMC od zdrowych dawców.

Zazwyczaj jako bank krwi płaszcz Buffy jest używany jako źródło. Najpierw dodaj PBS, aby dostosować objętość sierści Buffy do 140 mililitrów. Następnie nanieść 35 mililitrów próbki na 15 mililitrów fialu PA do wirówki do separacji gradientowej przy 400 G przez 20 minut.

Bez przerwy. Ostrożnie odzyskaj P BMC z interfejsu plazmy Fial PA i odłóż rurkę RBC do późniejszego użycia. Umyć P BMC trzykrotnie za pomocą PBS, odwirowując za każdym razem przy 400 G przez 10 minut.

Użyj tej frakcji P BMC do ekspansji komórek NK. Teraz wróć do rurki gradientowej. Odessać fi.

Zadzwoń i przenieś RBC do dwóch 50-mililitrowych probówek wirówkowych, przemyj PBS dodanym do znaku 50 mililitrów. Po odwirowaniu odessać supernatant, przesuwając górną część warstwy RBC. Aby usunąć granulocyty.

Wykonaj trzy płukania, a następnie ponownie zawieś erytrocyty w równej objętości roztworu innego rodzaju i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca. Ta frakcja RBC może być wykorzystana do rosetowego oczyszczania komórek NK SEP pod koniec dwóch tygodni ekspansji. Aby skutecznie namnażać funkcjonalne komórki NK, ex vivo K 5 62 należy sklonować dziewięć komórek z błonową IL 21, zwaną dalej K 5, 62.

Klon dziewięć IL 21 stosuje się jako sztuczny antygen prezentujący pierwsze zliczenie komórki pbmc i oblicza objętość dla pięciu razy 10 do sześciu komórek, które mają być osadzone w celu ekspansji komórek NK dla każdego pięć razy 10 do szóstej liczby pbmc i napromienia 10 razy 10 do szóstej komórki klonu K 5 62 dziewięć komórek IL 21. Za pomocą promiennika gamma o ciśnieniu 100 gramów napromieniowane komórki można również zamrozić do wykorzystania w przyszłości. Teraz umyj wstępnie napromieniowane komórki PBS i PONOWNIE zawieś w pożywce do ekspandowania komórek NK.

Teraz zobacz stosunek dwóch do jednego napromieniowanych komórek pbmc w 40 mililitrach pożywki do ekspandowania komórek NK i umieść kolbę T 75 pionowo w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla trzeciego dnia. Odzyskać stymulowane komórki przez wirowanie w stężeniu 400 G przez pięć minut, a następnie zastąpić połowę pożywki świeżym NKEM i kontynuować hodowlę. Powtórzyć zmianę pożywki w piątym dniu Pod koniec jednego tygodnia policzyć liczbę komórek odłożonych na bok pięć razy od 10 do piątej komórki do fenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej dla drugiej stymulacji i napromienić K 5 62 w stosunku jeden do jednego.

Sklonuj dziewięć komórek IL 21, aby rozszerzyć ich komórki, a następnie połącz komórki w pożywce do ekspansji komórek NK w ilości 2,5 razy 10 do piątej całkowitej liczby komórek na mililitr. Teraz zobacz komórki w kolbach T 75 i kontynuuj hodowlę w dniach 10 i 12 komórek pasażowych w pożywce do ekspansji komórek NK w ilości 2,5 razy 10 do piątej komórki na mililitr w 14 dniu ekspansji. Ponownie zlicz komórki i fenotypuj próbkę za pomocą cytometrii przepływowej.

Oczyść tę ekspansję komórek pochodzącą z PBMC za pomocą protokołu oczyszczania SEP rozety i sprawdź czystość komórek NK za pomocą fenotypowania cytometrii przepływowej. Przeprowadzić trzecią stymulację na oczyszczonych komórkach NK przy użyciu stosunku jeden do jednego napromieniowanych komórek K 5 62 klonu dziewięciu komórek IL 21. Wreszcie, w dniu 21, przeanalizuj amplifikowane komórki NK za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu pełnego panelu przeciwciał fenotypowania.

Zamrażać zapasy komórek w FBS zawierające 10% DMSO o maksymalnej gęstości pięć razy 10 do siódmych komórek na fiolkę. Do testu cytotoksyczności należy użyć świeżych lub zamrożonych komórek NK. W przypadku użycia zamrożonych komórek NK najpierw rozmraża się fiolkę z komórkami NK i nasionami w NKEM przez 24 godziny, aby umożliwić regenerację komórek w dniu testu, resus zawiesić od 10 do sześciu komórek docelowych w jednym mililitrze NKEM zawierającym wapń am i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, od czasu do czasu wstrząsając na płytce UBO 96-dołkowej, dodać trzykrotnie 200 mikrolitrów komórek NK zawieszonych raz na 10 do sześciu komórek na mililitr i przeprowadzić seryjne rozcieńczanie komórek zgodnie ze wskazaniami.

Po godzinie ładowania wapniem. Umyj komórki docelowe w pożywce do rozprężania komórek NK dwukrotnie centryfuzji przez pięć minut w temperaturze 400 G. Teraz ponownie przelicz komórki docelowe i ponownie zawieś raz od 10 do piątych komórek na mililitr. Dodać 100 mikrolitrów komórek docelowych do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i wirować przez jedną minutę w temperaturze 100 G, aby zainicjować kontakt z komórkami, inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez cztery godziny.

W celu równomiernego zawiesiny uwolnionego wapnia, należy delikatnie wymieszać kulturę, pipetując komórki osadu o stężeniu 100 G przez pięć minut i przenieść 100 mikrolitrów supernatantu do nowego płaskiego miejsca. Dolna 96-dołkowa płytka, uważając, aby w razie potrzeby uniknąć pęcherzyków, przebij wszelkie pęcherzyki, które mogą się utworzyć, za pomocą cienkiej igły. Odczyt płytki za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych ustawionego na filtr wzbudzenia 485 nanometrów i filtr emisyjny na 530 nanometrów.

Obliczać procentową lizę właściwą. Zazwyczaj ekspansja pięć razy 10 do szóstego pbmc wyizolowanego z kożucha daje od jednego razy 10 do dziewiątego i od 10 do dziesiątego. Komórki NK, rozszerzone komórki NK wyrażają różne receptory komórek NK, które są porównywalne z nierozszerzonymi pierwotnymi komórkami NK w kożuchie.

Komórki NK mogą stanowić od dwóch do 18% pbmc w 14 dniu. Oczyszczanie rozetą SEP ekspandowanych komórek może odzyskać od 40 do 70% komórek NK obecnych w hodowli przy czystości komórek NK wynoszącej 99%wskazywanej przez CD 3. Ujemne komórki dodatnie CD 56 rozszerzone komórki NK wykazały cytotoksyczność wobec szeregu linii komórek nowotworowych, w tym nerwiaka zarodkowego, kostniakomięsaka A ML i czerniaka.

Tutaj reprezentatywne zabijanie ML A jest pokazane jako procentowa liza swoista. Film BIOT na żywo pokazuje zabijanie komórek NK linii komórkowej nerwiaka zarodkowego CHP 1 34 załadowanej wapniem po tej procedurze. Inne metody, takie jak analiza produkcji cytokin przez komórki NK i transfer adaptacyjny w zwierzęcych modelach nowotworów, mogą być przeprowadzone, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcji komórek NK.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozprężać i oczyszczać dużą liczbę komórek NK. Można to osiągnąć bezpośrednio z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, a następnie oczyścić komórki NK lub rozpocząć ekspansję za pomocą komórek NK oczyszczonych metodą rozetową. Na samym początku typowy płaszcz kożuchowy daje od 15 do 40 milionów komórek NK, z których wszystkie można wykorzystać do ekspansji bardzo dużej liczby komórek NK przy użyciu schematu opisanego w tej metodzie.