Prosty sposób pomiaru wrażliwości much na etanol

Witajcie, jestem Thomas Maples z laboratorium dr. Adriana Rothena w Katedrze Psychiatrii w UT Southwestern Medical Center w Dallas. Dzisiaj zaprezentuję prostą procedurę służącą do określenia wrażliwości much na sedację wywołaną etanolem. Test ten opiera się na utracie odruchu prostowania oraz zdolności chodzenia u much po ekspozycji na etanol.

Pomiar ten można wykorzystać do określenia różnic w wrażliwości na alkohol pomiędzy różnymi szczepami drosophila oraz mutantami. Możemy również wykorzystać ten test do indukowania tolerancji u much, gdzie tolerancja definiowana jest jako zmniejszona odpowiedź na alkohol po wielokrotnej ekspozycji. Zacznijmy.

Do tego eksperymentu będą potrzebne następujące fiolki. Należy użyć ośmiu muszek owocówek, zebranych jeden lub dwa dni wcześniej. Ekspozycje można przeprowadzać zarówno na samcach, jak i samicach.

Każda fiolka powinna jednak zawierać osobniki tylko jednej płci. Pusta fiolka z pożywką, która nie zawiera much, żyletka, dwa korki do fiolek wykonane z materiału przypominającego bawełnę. Jeśli nie dysponujesz takimi korkami, możesz użyć kulek waty, mikropipetę 1000 µL z końcówkami, etanol o stężeniu 200 proof z dodatkiem barwnika spożywczego dostępnego w każdym sklepie spożywczym oraz minutnik.

W pierwszej kolejności musimy przygotować komorę ekspozycyjną, w której będziemy poddawać muchy działaniu etanolu i monitorować ich mobilność. Aby stworzyć tę komorę, należy najpierw przeciąć korek do probówki na pół za pomocą żyletki. Następnie jedną z połówek należy wcisnąć na dno probówki, zakrywając pożywkę.

Tworzy to poziomą, nielepką powierzchnię, po której mogą poruszać się muchy. W przypadku użycia kuli waty, należy ją gładko docisnąć i starać się, aby była jak najmniej puszysta, żeby muchy nie zaplątały się w włókna waty. Przy przygotowywaniu wielu komór należy upewnić się, że pokarm i korek probówki zajmują w każdej z nich taką samą ilość miejsca.

Zapewnia to, że muchy w każdej komorze są eksponowane na etanol w tej samej objętości. Przy wprawie można z łatwością eksponować równolegle trzy fiolki z muchami. Po przygotowaniu komór ekspozycyjnych można przystąpić do ekspozycji much na etanol.

Najpierw przenieś fiolkę z ośmioma muchami do komory ekspozycyjnej, uszczelniając ją korkiem z fiolki, w której pierwotnie znajdowały się muchy. Następnie nanieś pipetą 500 µL barwionego etanolu o wybranym stężeniu na jeden koniec bawełnianego korka do fiolek. Następnie zastąp korek komory ekspozycyjnej korkiem nasączonym etanolem, wkładając koniec pokryty etanolem do wnętrza komory.

Natychmiast po umieszczeniu zatyczki nasączonej etanolem w komorze ekspozycyjnej należy uruchomić stoper. Barwnik w etanolu pomaga upewnić się, że strona nasączona etanolem jest skierowana do wnętrza komory ekspozycyjnej, a nie w stronę ścianki fiolki. Jest to szczególnie istotne w przypadku stosowania kulek waty zamiast zatyczek typu buzz, ponieważ każda strona kulki waty może być skierowana do wnętrza fiolki.

W tym badaniu stosujemy 100% alkohol, który dyfunduje do komory ekspozycyjnej, gdzie muchy wdychają go z powietrza. W każdej minucie po umieszczeniu w komorze ekspozycyjnej korka nasączonego etanolem, będziemy zliczać, ile much stało się nieruchomych, co oznacza, że nie są one w stanie obrócić się i chodzić. Im dłużej muchy pozostają mobilne w każdym jednominutowym odstępie czasu, tym są bardziej odporne.

Przestrasz muchy, uderzając komorą o blat, aby upewnić się, że wszystkie muchy zdolne do ruchu, poruszają się. Obserwuj muchy przez 10 sekund po uderzeniu, aby dać im czas na rozpoczęcie ruchu lub obrócenie się w każdym jednominutowym odstępie czasu. Odnotuj, ile z ośmiu much pozostaje w bezruchu na początku eksperymentu.

Większość much po wystraszeniu szybko wbiega po ściance fiolki. Po około sześciu minutach ekspozycji na 100% ethanol zaczynają poruszać się ociężale, a w 12. minucie czasem w sposób chaotyczny. Większość much pozostanie w bezruchu, nie będąc w stanie chodzić ani obrócić się, gdy znajdą się na grzbiecie.

Jako muchy mobilne należy liczyć wyłącznie te, które są w stanie obrócić się i przejść. Muchy, które jedynie poruszają odnóżami lub skrzydłami w miejscu, należy liczyć jako muchy stacjonarne. Muchy pozostające na grzbietach przez cały okres obserwacji również należy liczyć jako stacjonarne, ponieważ niezdolność do obrócenia się jest oznaką intoksykacji. Muchy, które intensywnie wibrują skrzydłami przez cały dziesięciosekundowy czas obserwacji, należy również liczyć jako stacjonarne, nawet jeśli zmieniają położenie. Zdecydowana większość takich much pozostaje w bezruchu pomiędzy okresami gwałtownych ruchów skrzydłami.

Podsumowując, muchy, które są w stanie odwrócić się i chodzić, są uznawane za mobilne, natomiast muchy, które nie potrafią się odwrócić, poruszają odnóżami i skrzydłami w miejscu lub gwałtownie drżą skrzydłami, są uznawane za stacjonarne. Stosując te zasady, zauważamy, że wraz ze wzrostem czasu ekspozycji na opary etanolu coraz więcej much typu dzikiego staje się stacjonarnych. Wartością, której ten test używa do ilościowego określenia wrażliwości na etanol, jest mediana czasu sedacji, czyli MST.

MST definiujemy jako liczbę minut ekspozycji na etanol niezbędną do tego, aby cztery z ośmiu much w komorze ekspozycyjnej przestały się poruszać. Wartość tę łatwo określić, jeśli dokładnie cztery muchy są nieruchome w konkretnym okresie obserwacji. Na przykład, jeśli dokładnie cztery muchy są nieruchome po 11 minutach ekspozycji, to MST wynosi 11.

Jeśli dokładnie cztery muchy pozostają nieruchome po 11 minutach ekspozycji i ten stan utrzymuje się w 12. minucie, przyjmuje się pierwszą wartość, ponieważ jest to czas, w którym muchy po raz pierwszy osiągnęły swój ST. Jeśli w konkretnym okresie obserwacji cztery muchy nie są nieruchome, konieczne jest liniowe interpolowanie czasu, w którym cztery muchy stały się nieruchome. Na przykład, jeśli liczba nieruchomych much wzrasta z trzech do pięciu między dziewiątą a dziesiątą minutą ekspozycji, drogą graficzną można ustalić, że MST wynosi 9,5. Poniższe dane zebrane przy użyciu tego testu wykazują, że ten plan eksperymentalny jest dokładną metodą pomiaru wrażliwości na etanol.

W poniższych eksperymentach wykorzystano od sześciu do ośmiu fiolek (N), co zostało zaznaczone na słupkach. MST samców much typu dzikiego narażonych na 100% Ethanol wynosi około 11 minut przy niskim błędzie standardowym. Zmienność z dnia na dzień jest niska i w większości nieistotna statystycznie, niemniej jednak zalecamy pomiar próbek badawczych i kontrolnych równolegle tego samego dnia.

Należy również zauważyć, że muchy eksponowane w dniu A i dniu B nie są tymi samymi osobnikami. Są to rodzeństwo reprezentujące tę samą linię genetyczną; muchy samce i samice eksponowane na 100% Ethanol nie wykazują różnic w MST. Niemniej jednak zalecamy ograniczenie się do jednej płci.

Poddanie much samców i samic działaniu rosnących dawek etanolu pozwala na uzyskanie wyraźnej krzywej zależności efektu od dawki, która wykazuje statystycznie istotny spadek MST w funkcji zwiększonego stężenia etanolu. Test ten odtwarza również wcześniej opublikowane fenotypy, które zmierzono przy użyciu bardziej złożonej aparatury do waporyzacji etanolu – muchy z mutacją right rabbit one wykazały istotny wzrost MST. Wzrost ten zaobserwowano zarówno przy 100%, jak i 90% etanolu.

Za pomocą tego testu możemy również indukować i mierzyć tolerancję na etanol u much. Tolerancję definiuje się jako zmniejszenie odpowiedzi na alkohol po uprzedniej ekspozycji na alkohol w celu jej indukcji. Poddaj fiolkę z muchami działaniu etanolu przez czas wynoszący w przybliżeniu dwukrotność ich MST.

Na przykład poddajemy te samce szczepu dzikiego z Berlina działaniu 100% etanolu przez 24 minuty. Po ekspozycji delikatnie opukujemy osiem much z powrotem do fiolki z pożywką, gdzie pozostawiamy je do regeneracji przez cztery godziny. Po czterech godzinach regeneracji odnotowujemy pierwotny MST much na ich fiolce, ponownie poddajemy te same muchy działaniu tej samej dawki etanolu i odnotowujemy ich drugi MST.

Jak widać na tym wykresie, MST podczas drugiej ekspozycji na etanol jest znacznie wyższe niż MST podczas pierwszej ekspozycji, co wskazuje, że muchy nabyły tolerancję na działanie sedatywne etanolu. Miara tolerancji jest obliczana poprzez podzielenie drugiej wartości MST dla danej fiolki z muchami przez pierwszą wartość MST tych samych much i odjęcie jedynki; wynik wyrażany jest jako procent tolerancji, który w naszym przypadku wynosi około 50%. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.