Name: Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów boreliozy w jelicie kleszcza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę mikroinjekcji Borrelia burgdorferi do jelita kleszcza i lokalizację patogenu za pomocą immunofluorescencji. Technika ta znacząco skraca czas infekcji w porównaniu do naturalnych metod.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy członkom laboratorium Pal za pomoc w przygotowaniu tej demonstracji. Badanie to było wspierane przez granty PHS AI076684 oraz AI080615 z NIH/NIAID.

1. Mikroiniekcja nimf kleszczy Ixodes scapularis
1. Przygotowanie igieł
<ol>
<li>Wykonaj kilka igieł do mikroiniekcji poprzez podgrzanie i wyciągnięcie szklanych kapilar o średnicy 1 mm (World Precision Instruments) w urządzeniu do wyciągania mikropipet (Narishige). Ostrożnie wyjmij delikatne kapilary.</li>
<li>Przechowuj wyciągnięte igły (koncówkami skierowanymi do góry) na taśmie klejącej w szalce Petriego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie B. burgdorferi
<ol>
<li>Hodować B. burgdorferi w pożywce BSK 7 do uzyskania stężenia około 107 komórek na mL. Spirochety należy policzyć pod mikroskopem w ciemnym polu za pomocą komory liczbowej Petroffa-Haussera (Hausser scientific).</li>
<li>Osadzić B. burgdorferi poprzez wirowanie przy 3,0 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Usunąć supernatant i całkowicie resuspender osad w pożywce BSK, delikatnie przepuszczając go przez sterylną końcówkę 20 μL, aż do uzyskania końcowego stężenia 109 komórek na mL. Ponieważ komórki są resuspenderowane przy wysokiej gęstości i mogą się aglomerować, zawiesinę komórkową należy wykorzystać do mikroiniekcji natychmiast.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kleszczy
<ol>
<li>Naklej przezroczystą, dwustronną taśmę klejącą na szkiełko przedmiotowe.</li>
<li>Pracując na matie klejącej, ostrożnie przenieś nimfy kleszczy z pojemnika za pomocą małego pędzla.</li>
<li>Umieść wymaganą liczbę kleszczy przeznaczonych do iniekcji na taśmie klejącej, stroną brzuszną do góry, wszystkie skierowane w tym samym kierunku.</li>
</ol>
4. Iniekcja kleszczy
<ol>
<li>Do wyciągniętej igły kapilarnej pobierz 5 μL kultury B. burgdorferi, używając końcówki mikropipety 20 μL (Eppendorf). Sprawdź, czy w igle nie ma pęcherzyków powietrza i w razie potrzeby ponownie pobierz kulturę bakterii.</li>
<li>Obejrzyj kleszcza pod binokularowym mikroskopem stereotypowym i ustaw ostrość na obszar otworu odbytniczego kleszcza. Delikatnie dotknij końcówką igły kapilarnej w celu przełamania rurki w miejscu, gdzie jej średnica jest nieco mniejsza niż średnica otworu odbytniczego kleszcza, tworząc igłę do mikroiniekcji. Ten krok jest krytyczny, ponieważ każda próba iniekcji kleszczy za pomocą niewłaściwej końcówki igły powoduje obrażenia i możliwą śmierć iniekcyjnego kleszcza.</li>
<li>Umieść unieruchomione kleszcze pod binokularowym mikroskopem stereotypowym i ustaw ostrość na otwór odbytniczy, który jest przykryty dwiema ruchomymi płytkami analnymi. Używając precyzyjnej pęsety, delikatnie dotknij i wywrzyj bardzo lekki nacisk na dowolny obszar w pobliżu otworu odbytniczego. Pozwoli to na rozdzielenie płytek analnych i otwarcie poru analnego prowadzącego do jelita. Ostrożnie wprowadź końcówkę igły lekko do otworu odbytniczego przez wymuszone otwarcie płytek analnych. Wprowadzenie igły powinno być ograniczone do minimum, ponieważ szklana końcówka mogłaby uszkodzić półprzezroczyste jelito tylne łączące się z odbytnicą. Używając mikroinjektora wyposażonego w automatyczny sterownik nożny (Eppendorf), wstrzyknij roztwór B. burgdorferi, stosując następujące parametry: ciśnienie iniekcji 1 0 hektopaskali (hPa), czas iniekcji 0,2 sekundy oraz ciśnienie kompensacyjne 8 hPa. Każdy kleszcz otrzymuje jedną iniekcję.</li>
<li>Po mikroiniekcji kleszcze powinny zachowywać się podobnie jak przed zabiegiem. Na przykład kleszcz powinien pełzać w odpowiedzi na bodźce.</li>
<li>Zazwyczaj pozwalamy kleszczom regenerować się przez 48 godzin w komorze klimatycznej ustawionej na 24°C z fotoperiodem 16 godzin światła/8 godzin ciemności i wilgotnością 95%. Jeśli komora nie jest dostępna, iniekcyjne kleszcze można przechowywać w temperaturze pokojowej w wilgotnych warunkach w szczelnym pojemniku, takim jak zwykła komora eksykatora. W razie potrzeby czas regeneracji kleszczy można skrócić do kilku godzin przed wykorzystaniem ich do żerowania na myszach.</li>
</ol>
2. Lokalizacja B. burgdorferi za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej
1. Disekcja kleszczy
<ol>
<li>Nanieś kroplę soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) na czyste szkiełko przedmiotowe do sekcji oraz kolejną kroplę na poly-L-szkiełko pokryte lizyną (Sigma) do mikroskopii. Przygotować drugie szkiełko przedmiotowe z dwustronną taśmą klejącą.</li>
<li>Wyjąć kleszcza z pojemnika i umieścić go na dwustronnej taśmie klejącej za pomocą małego pędzelka.</li>
<li>Obejrzyj i ustaw ostrość na kleszcza w mikroskopie sekcyjnym. Umieść ostrze brzytwy na kleszczu pomiędzy pierwszą a drugą parą odnóży. Mocno naciśnij, przecinając kleszcza na dwie części, aby uzyskać dostęp do odwłoka. Bezzwłocznie zanurz odwłok w kropli PBS.</li>
<li>Za pomocą bardzo precyzyjnej pęsety chwyć grzbietowy i brzuszny egzoszkielet wokół miejsca nacięcia. Ostrożnie odciągnij tarczę grzbietową od kleszcza, odsłaniając brunatne dywertykuła jelitowe. Należy pamiętać, aby preparowane kleszcze przez cały czas znajdowały się w PBS.</li>
<li>Półprzezroczyste pęczki gruczołów ślinowych znajdują się po obu stronach przedniego odcinka przewodu pokarmowego i mogą zostać w tym momencie usunięte, jeśli jest to pożądane. Trzymając pozostałą część egzoszkieletu pęsetą, ostrożnie wyciągnij przewód pokarmowy z jamy brzusznej.</li>
<li>Ostrożnie oczyść jelito, usuwając wszelkie uwięzione tkanki (np. tchawicę).</li>
<li>Za pomocą końcówki precyzyjnej pęsety szybko przenieś jelito kleszcza w kropli PBS na poly-Lszkiełko z lizyną. Podziel jelito na mniejsze fragmenty, używając cienkich ostrzy lub delikatnie naciskając końcówką precyzyjnej pęsety. Ostrożnie odessij nadmiar buforu PBS znajdujący się wokół tkanek jelita.</li>
<li>Pozostawić tkanki jelitowe do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Utrwal prążki jelita kleszcza, zanurzając je w acetonie na 10 minut. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Na tym etapie preparaty na szkiełkach mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w temperaturze -20°C w szczelnym pojemniku.</li>
</ol>
2. Barwienie
<ol>
<li>Używając ręcznika papierowego, usuń nadmiar wilgoci wokół tkanki i obrysuj wysuszone jelito kleszcza za pomocą pisaka do wosku lub innego urządzenia tworzącego barierę hydrofobową. Pomoże to zatrzymać roztwory barwiące podczas kolejnych etapów inkubacji.</li>
<li>Przykryj jelito kleszcza jedną lub kilkoma kroplami buforu blokującego (0,05% Tween-20, 5% surowicy koziej w PBS) na 30 minut w temperaturze pokojowej. Surowica użyta do blokowania zależy od gatunku zwierzęcia gospodarza, z którego pochodzi przeciwciało. Od tego momentu nie dopuść do wyschnięcia preparatu na szkiełku.</li>
<li>Powoli odessij bufor blokujący. Inkubuj jelito z odpowiednimi roztworami przeciwciał pierwszorzędowych i/lub drugorzędowych. Stosujemy przeciwciała anty-B. burgdorferi znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Kirkegaard &amp; Perry Laboratories) w rozcieńczeniu 1:10 w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przykryj pojemnik folią aluminiową, aby ograniczyć ekspozycję na światło.</li>
<li>Usuń roztwór przeciwciał poprzez delikatne odessanie. Inkubuj jelito z barwnikiem fluorescencyjnym do znakowania tkanek kleszcza, takim jak 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) lub jodek propidyny. Zazwyczaj stosujemy 20 μg/mL jodku propidyny (Sigma) w PBS przez 5 min. w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przemyj 3 razy roztworem 0,05% Tween-20 w PBS.</li>
<li>Zamocuj preparat na szkiełku w buforowanym glicerolu zawierającym odczynnik zapobiegający blaknięciu, taki jak Slowfade (Invitrogen), i ostrożnie przykryj szkiełkiem coverglass. Na tym etapie preparaty można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4°C w szczelnym pojemniku. Wykonaj obrazowanie i zlokalizuj B. burgdorferi pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Na rysunku 1 przedstawiono pozycję nimfy kleszcza do mikroiniekcji oraz obraz reprezentujący lokalizację B. burgdorferi w jelicie kleszcza.
 <img src="/files/ftp_upload/2544/2544fig1.jpg" alt="Disekcja kleszczy do badania mikrobiomu; mikroskopia fluorescencyjna kolonizacji mikrobiologicznej, wektor B. aphid." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Mikroiniekcja i lokalizacja B. burgdorferi do jelita kleszcza. (A) Widok brzuszny nimfy *I. scapularis* Kleszcz w pozycji do mikroiniekcji. Otwór odbytniczy (grot strzałki) z wprowadzoną igłą do mikroiniekcji (strzałka) przedstawiono w powiększeniu na wstawce. Do wywarcia delikatnego nacisku na ciało użyto precyzyjnej pęsety, co pozwoliło na rozdzielenie płytek odbytniczych i otwarcie otworu odbytniczego w celu przeprowadzenia mikroiniekcji. Igła jest wypełniona roztworem Coomassie brilliant blue w celu zwiększenia widoczności. (B) Reprezentatywne wyniki obrazowania immunofluorescencyjnego konfokalnego dla B. burgdorferi wewnątrz jelita kleszcza. Przedstawiono przednią część dywertykulum jelita. Jądra komórkowe jelita i spirochety (strzałka) są znakowane jodkiem propidyny (kolor czerwony) lub przeciwciałami sprzężonymi z FITC przeciwkoB. burgdorferi (kolor zielony), odpowiednio. Pasek skali = 20 μm.

<ol><li>Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+Lyme+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The emergence of Lyme disease.</a> J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).</li>
<li>Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarthold%2C+SW+%22Borrelia%2C+Molecular+Biology%2C+Host+Interaction+and+Pathogenesis%22">Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis</a>. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).</li>
<li>Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OspC+facilitates+Borrelia+burgdorferi+invasion+of+Ixodes+scapularis+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands.</a> J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).</li>
<li>Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+OspA%2FB+in+the+life+cycle+of+the+Lyme+disease+spirochete%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete.</a> J Exp Med. 199, 641-648 (2004).</li>
<li>Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BB0323+function+is+essential+for+Borrelia+burgdorferi+virulence+and+persistence+through+tick-rodent+transmission+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle.</a> J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).</li>
<li>Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TROSPA%2C+an+Ixodes+scapularis+receptor+for+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi.</a> Cell. 119, 457-468 (2004).</li>
<li>Barbour, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+Lyme+disease+spirochetes%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes.</a> Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).</li>
<li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).</li>
<li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tick+antioxidant+facilitates+the+Lyme+disease+agent%27s+successful+migration+from+the+mammalian+host+to+the+arthropod+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector.</a> Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).</li>
<li>Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glass+capillary+tube+feeding%3A+a+method+for+infecting+nymphal+Ixodes+scapularis+%28Acari%3A+Ixodidae%29+with+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).</li>
<li>Policastro, P. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+infection+of+Ixodes+scapularis+larvae+%28Acari%3A+Ixodidae%29+by+immersion+in+low+passage+cultures+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi.</a> J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).</li>
<li>Fuente, dela, Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy prezentujemy procedurę opartą na mikroiniekcji w celu szybkiego i wydajnego zakażania nimf kleszczy z rodzaju Ixodes bakteryjnym patogenem B. burgdorferi. Opisujemy również procedurę konfokalnej immunofluorescencji do detekcji B. burgdorferi w jelicie kleszcza in situ. Choć nasza demonstracja dotyczy jelit nimf, podobne procedury można zastosować również w innych stadiach rozwojowych kleszczy, takich jak larwy lub osobniki dorosłe 8,9. Jednak ze względu na ich mnie...

<table><tbody><tr><td>Szklane kapilary</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy wyciągacz do szkła</td><td>Narishige International</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca Petroffa-Haussera</td><td>Hausser Scientific</td><td>3900</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipety Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik nożny FemtJet</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>Sterylizowany filtracyjnie</td></tr></tbody></table>

metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z lyme w jelicie kleszcza

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Borelioza jest wywoływana przez zakażenie krętkami z gatunku Borrelia burgdorferi, których obecność w naturze jest podtrzymywana przez cykl zakażeń kleszcz-gryzoń 1. W celu badania boreliozy w warunkach laboratoryjnych opracowano mysi model przenoszony przez kleszcze 2. Choć naiwne kleszcze mogą zostać zakażone B. burgdorferi poprzez żerowanie na zakażonych myszach, proces linienia trwa od kilku tygodni do kilku miesięcy. Dlatego opracowanie szybszych i bardziej wydajnych technik zakażania kleszczy, takich jak procedura oparta na mikroiniekcji, stanowi istotne narzędzie w badaniach nad boreliozą 3,4. Procedura ta wymaga zaledwie kilku godzin w celu uzyskania zakażonych kleszczy i pozwala na kontrolę nad podaniem równych ilości krętków w kohorcie kleszczy. Jest to szczególnie ważne, ponieważ generowanie kleszczy zakażonych B. burgdorferi poprzez naturalny proces żerowania na myszach nie gwarantuje 100% wskaźnika zakażeń i może prowadzić do zmienności ładunku patogenów wśród nakarmionych kleszczy. Ponadto mikroiniekcję można wykorzystać do zakażania kleszczy izolatami B. burgdorferi w przypadkach, gdy szczep atenuowany nie jest w stanie wywołać zakażenia u myszy, a tym samym nie może zostać nabyty naturalnie przez kleszcze 5. Technika ta może być również stosowana do wprowadzania do kleszczy różnych innych materiałów biologicznych, na przykład specyficznych przeciwciał lub dwuniciowego RNA 6. W niniejszym artykule zaprezentujemy mikroiniekcję nimf kleszczy krętkami B. burgdorferi hodowanymi in vitro. Opiszemy również metodę lokalizacji patogenów boreliozy w jelicie kleszcza z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza

Borelioza jest wywoływana przez zakażenie krętkami z gatunku Borrelia burgdorferi, które w naturze utrzymują się w cyklu zakażeń kleszcz-gryzoń 1. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest mikroiniekcja i lokalizacja komórek Borrelia bergii de ferry w jelicie kleszcza. Cel ten osiąga się najpierw poprzez przygotowanie szklanych igieł kapilarnych i napełnienie ich komórkami Beberg de Ferry. Następnie komórki Beberg de Ferry są przenoszone do jelita kleszcza za pomocą mikroiniekcji.Kleszcz zostaje następnie poddany sekcji, a tkanki jelita są usuwane. Na koniec przeprowadza się znakowanie immunofluorescencyjne beberg defer w jelicie kleszcza. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące lokalizację beberg to ferry w jelicie kleszcza przy użyciu mikroskopii konfokalnej.Witajcie, jestem dr Ruth Paul, adiunkt w Departamencie Medycyny Weterynaryjnej na Uniwersytecie Maryland. Dzisiaj dwoje członków mojego zespołu, Toro Cairo, pracownik postdoktorski, oraz Adam Coleman, student studiów doktoranckich, zaprezentują procedurę sztucznego zakażania kleszczy za pomocą mikrowstrzykiwania, którą rutynowo przeprowadzamy w laboratorium. Po mikrowstrzykiwaniu dokonamy sekcji kleszcza i obrazujemy bakterie w jelitach kleszcza przy użyciu konfokalnego mikroskopu CE.Główną zaletą mikroiniekcji u kleszczy w porównaniu do uzyskiwania pokolenia kleszczy zakażonych naturalnie jest czas trwania procedury. Mikroiniekcja skraca cały proces z tygodni do godzin, podczas gdy uzyskanie kleszczy zakażonych poprzez naturalny proces żerowania zajmuje około pięciu tygodni. Technikę tę można również dostosować do wstrzykiwania innych użytecznych odczynników, takich jak dwuniciowy RNA do RNAi lub antysera w celu specyficznej interferencji przeciwciał wewnątrz kleszcza.Aby rozpocząć, należy wykonać kilka igieł do mikroiniekcji poprzez podgrzanie i wyciągnięcie jednofilamentowych szklanych kapilar w urządzeniu do wyciągania mikropipet. Ostrożnie usuń kruche kapilary. Przechowuj zgromadzone igły końcami skierowanymi do góry na taśmie klejącej w szalce Petriego.Następnie należy hodować b berg de ferry w pożywce BSK. Po osiągnięciu stężenia około 10⁷ komórek na mililitr, należy odwirować b berg de ferry przy 3000 ×g przez 10 minut. W temperaturze pokojowej należy usunąć nadosad i całkowicie resuspendować osad w pożywce BSK, delikatnie przepuszczając go przez sterylną końcówkę 200 µL, aby uzyskać końcowe stężenie 10⁹ komórek na mililitr.Ponieważ komórki są resuspendTime przy wysokiej gęstości i mogą się zlepiać, zawiesinę komórkową należy niezwłocznie wykorzystać do mikroiniekcji. Aby przygotować kleszcze, należy nakleić przezroczystą dwustronną taśmę klejącą na szkiełko przedmiotowe, pracując na macie klejącej, a następnie ostrożnie przenieść kleszcze z pojemnika. Za pomocą małego pędzla należy umieścić na taśmie klejącej odpowiednią liczbę kleszczy przeznaczonych do iniekcji, stroną brzuszną do góry i skierowanych w tym samym kierunku. Do igły kapilarnej należy nabić 5 µL kultury Beberne de ferry. Używając końcówki pipety o pojemności 20 µL, należy sprawdzić, czy w igle nie ma pęcherzyków powietrza, a następnie ponownie nabić igłę kulturą bakteryjną.W razie potrzeby należy obejrzeć kleszcza pod binokularem i ustawić ostrość na obszarze otworu odbytniczego. Delikatnie dotknąć końcówką igły kapilarnej, aby przełamać rurkę w miejscu, gdzie jej średnica jest nieco mniejsza niż średnica otworu odbytniczego kleszcza, tworząc w ten sposób igłę do mikroiniekcji. Krok ten jest krytyczny, ponieważ każda próba iniekcji kleszczy przy użyciu nieodpowiednich końcówek igieł powoduje obrażenia i może doprowadzić do śmierci zwierzęcia.Do wstrzykniętego kleszcza. Unieruchomione kleszcze umieść pod binokularem stereoskopowym i ustaw ostrość na otwór odbytniczy, który jest przykryty dwiema ruchomymi płytkami odbytniczymi. Za pomocą precyzyjnej pęsety delikatnie dotknij i wywrzyj bardzo lekki nacisk na dowolny obszar w pobliżu otworu odbytniczego.Pozwoli to na rozdzielenie płytek analnych i otwarcie poru analnego łączącego się z jelitem. Ostrożnie wsuń końcówkę igły lekko w otwór analny poprzez wymuszone rozwarstwienie płytek analnych. Należy ograniczyć głębokość wprowadzenia igły do minimum, ponieważ szklana końcówka mogłaby uszkodzić półprzezroczyste jelito tylne łączące się z odbytnicą.Używając mikroinjektora wyposażonego w zautomatyzowany sterownik nożny, należy wstrzyknąć roztwór beberg de ferry, stosując następujące parametry: ciśnienie wtrysku 1000 hPa, czas wtrysku 0,2 s oraz ciśnienie kompensacyjne 8 hPa. Każde jajo otrzymuje pojedynczy wtrysk w ramach mikroiniekcji.Kleszcz powinien wykazywać oznaki ruchu lub pełzać w odpowiedzi na bodźce, podobnie jak przed wstrzyknięciem. Aby przeprowadzić sekcję kleszczy do mikroskopii immunofluorescencyjnej, najpierw nanieś kroplę soli fizjologicznej w buforze fosforanowym na czysty szkiełko przedmiotowe do sekcji oraz kolejną kroplę na szkiełko pokryte poli-L-lizyną. Do mikroskopii przygotuj dodatkowe szkiełko przedmiotowe z dwustronną taśmą klejącą. Następnie wyjmij kleszcza z pojemnika i umieść go na dwustronnej taśmie klejącej.Używając małego pędzla pod mikroskopem sekcyjnym, ustawiając ostrość na kleszcza, umieść ostrze żyletki na kleszczu pomiędzy pierwszą a drugą parą odnóży. Mocno dociśnij, przecinając kleszcza na dwie części i odsłaniając odwłok, a następnie niezwłocznie zanurz odwłok w kropli PBS, używając precyzyjnych pincet. Chwyć grzbietową i brzuszna część egzoszkieletu w miejscu cięcia.Ostrożnie unieś tarczkę grzbietową i odsuń ją od kleszcza, odsłaniając brązowe odgałęzienia jelita. Należy pamiętać, aby preparowane kleszcze przez cały czas znajdowały się w PBS. Półprzezroczyste pęczki gruczołów ślinowych znajdują się po obu stronach przedniego odcinka jelita i mogą zostać usunięte na tym etapie, jeśli jest to pożądane.Przytrzymując pozostałą część egzoszkieletu pęsetą, ostrożnie wyciągnij przewód pokarmowy z jamy brzusznej. Dokładnie oczyść przewód pokarmowy, usuwając wszelkie uwięzione tkanki, takie jak tchawki. Za pomocą końcówki precyzyjnej pęsety szybko przenieś przewód pokarmowy kleszcza do kropli PBS na szkiełku przedmiotowym pokrytym poli-L-lizyną.Podziel jelita na mniejsze fragmenty, używając cienkich ostrzy lub delikatnie naciskając końcówką precyzyjnej pincety. Ostrożnie odessaj nadmiar PBS znajdujący się wokół tkanek jelita. Pozostaw tkanki jelit do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.Utrwal jelito kleszcza, zanurzając je w acetonie na 10 minut. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej; na tym etapie preparaty na szkiełkach mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w temperaturze -20 °C w szczelnym pojemniku. W celu przeprowadzenia znakowania immunofluorescencyjnego jelita, obrysuj utrwalone jelito kleszcza za pomocą pisaka PAP lub innego urządzenia tworzącego barierę hydrofobową.Dzięki temu roztwory barwiące zostaną zachowane podczas kolejnych etapów inkubacji. Przykryj jelito kleszcza jedną lub kilkoma kroplami buforu blokującego na 30 minut. W temperaturze pokojowej.Surowica używana do blokowania zależy od gatunku zwierzęcia, w którym wytworzono przeciwciało. Od tego momentu nie wolno dopuścić do wyschnięcia preparatu na szkiełku. Powoli odessać bufor blokujący.Inkubować jelito z odpowiednimi roztworami przeciwciał pierwotnych i/lub wtórnych. Stosujemy przeciwciała anty-B berg znakowane fluoresceinią lub izotiocyjanianem (FXI). Inkubować przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100 w buforze blokującym przez jedną godzinę.W temperaturze pokojowej przykryć naczynie folią aluminiową, aby ograniczyć ekspozycję na światło. Usunąć roztwór przeciwciał za pomocą delikatnej aspiracji. Inkubować jelito z barwnikiem fluorescencyjnym w celu znakowania tkanek kleszcza, np. DPI lub jodkiem propidyny.Zazwyczaj stosujemy 20 µg/mL jodku propidium w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie płuczemy trzy razy 0,05% tween 20 w PBS przez pięć minut. Na koniec preparat na szkiełku montuje się w buforowanym glicerolu zawierającym odczynnik Antifa i ostrożnie przykrywa szkiełkiem nakrywką. Tak przygotowane preparaty można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C w szczelnym pojemniku, a następnie obrazować i lokalizować b berg de ferry pod mikroskopem konfokalnym.Przedstawiono tutaj mikroiniekcję u kleszcza z użyciem igły wypełnionej błękitem kumasi w celu zwiększenia widoczności. Do wywierania delikatnego nacisku na ciało użyto precyzyjnego pęsety, co umożliwia rozdzielenie płytek analnych i otwarcie otworu analnego w celu wykonania mikroiniekcji. Tutaj pokazano przedni odcinek wyrostka jelita z beberg ferry wewnątrz jelita.Jądra komórkowe jelit oraz spirochety są znakowane odpowiednio jodkiem propidyny lub przeciwciałami anty-Borrelia burgdorferi sprzężonymi z FITC. Po opanowaniu techniki ustaliliśmy, że 10 kleszczy można mikroiniekować z naturalną przeżywalnością na poziomie stu tysięcy zakażonych B. burgdorferi. Choć kleszcze można wykorzystać do dalszych eksperymentów natychmiast, zazwyczaj czekamy jeden lub dwa dni, aby upewnić się, że przeżyły procedurę, przed kontynuowaniem prac.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak generować sztucznie zainfekowane kleszcze poprzez mikro- i lokalne tworzenie barier w jelicie kleszcza z wykorzystaniem konfokalnej immunofluorescencji. Praca z kleszczami oraz cienkimi szklanymi igłami wypełnionymi ludzkim patogenem, takim jak Borrelia burgdorferi, może być niebezpieczna podczas wykonywania czynności. Należy zachować szczególną ostrożność w kwestii rozmieszczenia kleszczy i igieł oraz przez cały czas stosować środki ostrożności odpowiadające drugiemu poziomowi bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

methods-for-rapid-transfer-localization-lyme-disease-pathogens-within

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów boreliozy w żołądku kleszcza

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny z zakażonych kleszczy jest istotne dla badania mechanizmów wywoływania chorób przez patogeny przenoszone przez kleszcze. W niniejszym protokole demonstrujemy sposób pobierania hemolimfy i gruczołów ślinowych z żerujących nimf Ixodes scapularis. Przedstawiamy również metodę pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis.

Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

Borelioza jest najczęściej zgłaszaną chorobą przenoszoną przez wektory w Ameryce Północnej.  Czynnik sprawczy, Borrelia burgdorferi, jest bakterią krętkową przenoszoną przez kleszcze Ixodid.  Przenoszenie i wykrywanie infekcji w modelach zwierzęcych jest optymalizowane przez zastosowanie żywienia kleszczy, które opisujemy tutaj.

Karmienie kleszczy zwierząt w celu przeniesienia i ksenodiagnozy w badaniach nad boreliozą

Zagnieżdżony PCR to czuła, specyficzna i prosta technika, którą można zastosować do ekstraktów DNA kleszczy w celu zbadania Borrelia burgdorferi, czynnika wywołującego boreliozę. Początkowy eksperyment PCR wykorzystuje startery specyficzne dla genu do generowania długich amplikonów, które następnie stają się matrycami do późniejszej reakcji przy użyciu wewnętrznych starterów.

Wykrywanie krętka boreliozy, Borrelia burgdorferi, u kleszczy za pomocą zagnieżdżonego PCR

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Tutaj prezentujemy protokół sekwencjonowania nowej generacji dla sekwencjonowania 16S rRNA, który umożliwia identyfikację i charakterystykę społeczności mikrobiologicznych w wektorach. Metoda ta obejmuje ekstrakcję DNA, amplifikację i kodowanie kreskowe próbek za pomocą PCR, sekwencjonowanie na komórce przepływowej oraz bioinformatykę w celu dopasowania danych sekwencji do informacji filogenetycznej.

Charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA nowej generacji

Analiza hemolimfy kleszczowej stanowi ważne źródło informacji o tym, jak niektóre patogeny wywołują choroby i jak kleszcze reagują immunologicznie na tę infekcję. Niniejsze badanie pokazuje, jak zaszczepić propagule grzybów i zebrać hemolimfę od nabrzmiałych samic Rhipicephalus microplus.

Ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor Metarhizium do kleszczy Rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców

Zdolność bakteriofaga do przenoszenia DNA między komórkami bakteryjnymi czyni je skutecznymi narzędziami do genetycznej manipulacji ich bakteryjnych gospodarzy. Przedstawiono tutaj metodologię indukcji, odzyskiwania i wykorzystania φBB-1, bakteriofaga Borrelia burgdorferi, do transdukcji heterologicznego DNA między różnymi szczepami krętka boreliozy.

Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów

Przedstawiona tutaj jest metoda nawożenia kleszczy krwią in vitro za pomocą systemu sztucznej błony, aby umożliwić częściowe lub pełne zagęszczenie różnych etapów życia kleszcza.

Karmienie sztuczną membraną kleszcza dla Ixodes scapularis

Elektroporacja to szybka, szeroko stosowana metoda wprowadzania egzogennego DNA do rodzaju Rickettsia. Protokół ten zapewnia użyteczną metodę elektroporacji do transformacji obligatoryjnych bakterii wewnątrzkomórkowych w rodzaju Rickettsia.

Metoda elektroporacji do transformacji Rickettsia spp. za pomocą fluorescencyjnego wektora wahadłowego wyrażającego białko w liniach komórkowych kleszczy

Przedstawiamy protokół polegający na zbieraniu śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych oraz śródjelita po sekcji pojedynczego karmionego kleszcza, aby badać specyficzną lokalizację patogenów przenoszonych przez kleszcze w tkankach i pogłębić zrozumienie kompetencji wektorów oraz interakcji patogen-mikrobiom.

Ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (Acari: Ixodidae)

Metoda ta opisuje opracowanie systemu żywienia krwią kleszczy in vitro , wykorzystującego komorę drukowaną w 3D oraz laboratoryjnie wykonaną membranę silikonową. System umożliwia sztuczne karmienie kleszczy, umożliwiając łatwe pobieranie próbek na różnych etapach karmienia oraz wykorzystując niewielkie ilości krwi, stanowiąc nieocenione narzędzie do badania kleszczy ixoidied.

Krew kleszczy karmiąca przez sztuczną błonę w komorze wydrukowanej 3D w badaniach nad kleszczami Ixoidida

Poznaj metodę mikroinjekcji Borrelia burgdorferi do jelita kleszcza i lokalizację patogenu za pomocą immunofluorescencji. Technika ta znacząco skraca czas infekcji w porównaniu do naturalnych metod.

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza

Przeglądaj więcej filmów