Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów boreliozy w jelicie kleszcza
February 14th, 2011
Badania nad boreliozą często wymagają generowania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co zwykle trwa kilka tygodni. Tutaj demonstrujemy procedurę infekcji kleszcza opartą na mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Demonstrujemy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi w kleszczach.
Ogólnym celem tej procedury jest mikroiniekcja i lokalizacja komórek borrelia berg de ferry w jelicie kleszcza. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie szklanych igieł kapilarnych i wypełnienie ich komórkami Beberg de Ferry. Następnie komórki odraczające Beberg są przenoszone do jelita kleszcza za pomocą mikroiniekcji.
Kleszcz jest następnie preparowany, a tkanki jelitowe są usuwane. Na koniec przeprowadza się znakowanie immunofluorescencyjne odroczenia bebergu w jelicie kleszcza. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują lokalizację bebergu do przenoszenia się w jelicie kleszcza za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Cześć, nazywam się dr Ruth Paul Paul, jestem adiunktem na Uniwersytecie Maryland na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej. Dzisiaj dwóch moich laborantów Toro Cairo, doktoranta i Adam Coleman, doktorant, pokażą Wam procedurę sztucznego zakażenia kleszczy za pomocą mikroiniekcji, którą rutynowo wykonujemy w laboratorium. Po mikroiniekcji przeprowadzimy sekcję kleszcza i zobrazujemy bakterie w jelicie kleszcza za pomocą konfokalnego mikroskopu CE.
Główną zaletą mikroiniekcji kleszcza pokoleniu naturalnie zakażonych kleszczy jest czas trwania zabiegu. Mikroiniekcja skraca całą procedurę z tygodni godzin, ponieważ potrzeba około pięciu tygodni, aby wytworzyć zakażone kleszcze w naturalnym procesie karmienia. Technikę tę można również dostosować do wstrzykiwania innych użytecznych odczynników, takich jak dwuniciowy RNA dla RNAi lub surowice odpornościowe do specyficznej interferencji przeciwciał wewnątrz kleszcza.
Aby rozpocząć wytwarzanie kilku igieł do mikroiniekcji, podgrzewając i ciągnąc jednomilimetrowe szklane rurki kapilarne w szklanym urządzeniu do wyciągania mikropipet. Ostrożnie wyjmij delikatne rurki kapilarne. Przechowuj zebrane igły końcówką skierowaną do góry na taśmie klejącej na szalce Petriego.
Następnie uprawiaj b berg de ferry w kulturze BSK. Pożywka do stężenia około 10 do siedmiu komórek na mililitr granulki b berg de ferry przez odwirowanie w 3000 razy G przez 10 minut. W temperaturze pokojowej usunąć snat i całkowicie ponownie zawiesić osad w podłożu BSK, delikatnie przechodząc przez sterylną mikrokońcówkę o pojemności 200 mikrolitrów do końcowego stężenia od 10 do dziewięciu komórek na mililitr.
Ponieważ komórki są ponownie zawieszane przy dużej gęstości komórek i mogą się zlepiać, zawiesinę komórek należy natychmiast użyć do mikroiniekcji w celu przygotowania kleszczy, umieścić przezroczystą dwustronną taśmę klejącą na szkiełku roboczym na lepkiej macie, ostrożnie usunąć kleszcze z pojemnika Za pomocą małej szczotki umieść wymaganą liczbę kleszczy do wstrzyknięcia na taśmie klejącej brzuszną stroną do góry, skierowaną w tym samym kierunku. Załaduj pięć mikrolitrów kultury beberg de ferry do połączonej igły kapilarnej. Używając końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów, sprawdź, czy igła nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza i ponownie załaduj igłę kulturą bakteryjną.
W razie potrzeby obejrzyj kleszcza pod mikroskopem dwuokularowym i skup się na obszarze otworu odbytu kleszcza. Delikatnie dotknąć końcówki igły kapilarnej, aby przerwać rurkę, której średnica jest nieco mniejsza niż średnica otworu odbytu kleszcza, tworzącego igłę do mikroiniekcji. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ każda próba wstrzyknięcia kleszczy z nieodpowiednimi końcówkami igieł powoduje obrażenia i możliwą śmierć.
Do wstrzykniętego kleszcza. Umieść unieruchomione kleszcze pod mikroskopem dwuokularowym i skup się na otworze odbytu, który jest pokryty dwiema ruchomymi płytkami odbytu. Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie dotykaj i wywieraj bardzo łagodny nacisk na dowolny obszar w pobliżu otworu odbytu.
Umożliwi to oddzielenie płytek odbytu i otwarcie porów odbytu, które łączą się z jelitem. Ostrożnie włóż końcówkę igły lekko do otworu odbytu przez wymuszony otwór płytek odbytu. Wkłucie igły powinno być ograniczone do minimum, ponieważ szklana końcówka może uszkodzić półprzezroczyste tylne jelito, które łączy się z odbytnicą.
Za pomocą mikrowtryskiwacza wyposażonego w zautomatyzowany sterownik nożny wstrzyknij roztwór Beberg de Ferry, używając następujących parametrów: 1000 Hector Pascals ciśnienie wtrysku 0,2 sekundy czas wtrysku i osiem Hectora Pascala ciśnienie kompensacyjne. Każdy kleszcz otrzymuje pojedynczą iniekcję po mikroiniekcji.
Kleszcz powinien wykazywać oznaki ruchu lub pełzać w odpowiedzi na bodźce podobne do tych przed wstrzyknięciem. Aby wypreparować kleszcze do mikroskopii immunofluorescencyjnej, najpierw umieść kroplę soli fizjologicznej buforowanej fosforanem na czystym szkiełku do sekcji, a drugą na szkiełku pokrytym poli lizyną Do mikroskopii przygotuj kolejne szkiełko z dwustronną taśmą klejącą. Następnie usuń kleszcza z pojemnika i umieść go na dwustronnej taśmie klejącej.
Używając małego pędzla pod mikroskopem preparacyjnym view i skup się na kleszczu, umieść ostrą żyletkę na kleszczu między pierwszą a drugą parą nóg. Dociśnij mocno przecinając kleszcza na dwie części, odsłaniając brzuch, natychmiast zanurz brzuch w kropli PBS za pomocą cienkich kleszczy. Chwyć egzoszkielet grzbietowy i brzuszny wokół miejsca cięcia.
Ostrożnie pociągnij tarczę grzbietową do góry i odsuń ją od kleszcza, odsłaniając brązowawy kolor uchyłka jelita. Uważaj, aby przez cały czas trzymać kleszcze preparujące pod PBS. Półprzezroczyste wiązki gruczołów sali znajdują się po obu stronach przedniej części jelita i w razie potrzeby można je usunąć w tym momencie.
Trzymając pozostały egzoszkielet na miejscu za pomocą kleszczy, ostrożnie wyciągnij jelito z brzucha. Ostrożnie oczyść jelito, usuwając wszelkie uwięzione tkanki, takie jak tchawica. Za pomocą końcówki cienkich kleszczy szybko przenieś jelito kleszcza do kropelki PBS na szkiełku z poli l-lizyny.
Podziel jelito na mniejsze kawałki za pomocą cienkich ostrzy lub delikatnie naciskając końcówką cienkich kleszczy. Ostrożnie odessać nadmiar PBS wokół tkanek jelitowych. Pozwól tkankom jelitowym wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Napraw jelito kleszcza, zanurzając je w acetonie na 10 minut. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, szkiełka o temperaturze pokojowej można przechowywać na tym etapie przez miesiące w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w hermetycznym pojemniku. W celu immunofluorescencyjnego znakowania jelita, narysuj okrąg wokół utrwalonego jelita kleszcza za pomocą pisaka lub innego hydrofobowego urządzenia wyściełającego barierę.
Pomoże to zatrzymać roztwory barwiące podczas kolejnych etapów inkubacji. Przykryj jelito kleszcza jedną lub kilkoma kroplami buforu blokującego na 30 minut. W temperaturze pokojowej.
Surowica stosowana do blokowania zależy od źródła, z którego pochodzi zwierzę żywicielskie przeciwciała. Nie pozwól, aby szkiełko wyschło od tego momentu. Powoli zasysać bufor blokujący.
Inkubować jelito z odpowiednimi roztworami przeciwciał pierwszorzędowych i/lub wtórnych. Używamy fluoresceiny, izotiocyjanianu lub FXI oznaczonych anty B berg. Odroczyć przeciwciało w rozcieńczeniu od 1 do 100 w buforze blokującym na jedną godzinę.
W temperaturze pokojowej przykryj pojemnik folią aluminiową, aby ograniczyć ekspozycję na światło. Usunąć roztwór przeciwciała przez delikatne aspiracje. Inkubuj jelito za pomocą barwnika fluorescencyjnego, aby oznaczyć tkanki kleszczy, takie jak DPI lub jodek propidyny.
Zwykle używamy 20 mikrogramów na mililitr jodku perydu w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, myjemy trzy razy 0,05% 20 w PBS przez pięć minut. Na koniec zamontuj szkiełko w buforowanym glicerolu zawierającym odczynnik Antify i ostrożnie przykryj szklaną osłoną. Na tym etapie szkiełka ślizgowe mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze czterech stopni Celsjusza w hermetycznym pojemniku i zlokalizowane pod mikroskopem konfokalnym.
Mikroiniekcja kleszcza jest pokazana tutaj z igłą wypełnioną błękitem kumasi dla widoczności. Cienkie kleszcze służą do wywierania delikatnego nacisku na ciało, co umożliwia oddzielenie płytek odbytu i otwarcie porów odbytu w celu mikroiniekcji. Tutaj przedni obszar uchyłka jelita jest pokazany z promem beberga w jelicie.
Jądra jelitowe i krętki są znakowane odpowiednio jodkiem propidyny lub fitzy sprzężonym promem anty beberg. Po opanowaniu odkryliśmy, że 10 kleszczy może być mikro wstrzyknięta moc, z której naturalnie przeżyło sto tysięcy i zostało zarażonych fer. Chociaż kleszcze można natychmiast wykorzystać do innych eksperymentów, zazwyczaj czekamy jeden lub dwa dni, aby upewnić się, że kleszcze przetrwają procedurę przed kontynuowaniem.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować sztuczne zakażone kleszcze przez mikro i zlokalizowane robaki barierowe w jelicie kleszcza za pomocą konfokalnych przepływów immunologicznych. Mikro Praca z kleszczami i cienkimi szklanymi igłami wypełnionymi ludzkim patogenem, takim jak narybek brelia brior, może być niebezpieczna podczas pracy. Zwracaj uwagę na lokalizację kleszczy i igieł i przez cały czas stosuj środki ostrożności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego drugiego.
Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę opartą na mikroiniekcji do zakażania kleszczy patogenem Borrelia burgdorferi, znacznie skracając czas potrzebny na zakażenie kleszcza. Dodatkowo, pokazano technikę immunofluorescencji do lokalizowania patogenu w tkankach kleszcza.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia wektorów
- Lokalizacja patogenu
Tło
- Choroba z Lyme jest spowodowana bakterią Borrelia burgdorferi.
- Kleszcze są głównymi wektorami przenoszącymi tego patogenu.
- Tradycyjne metody zakażania kleszczy są czasochłonne.
- Szybkie metody zakażania mogą poprawić efektywność badań.
Cel badania
- Opracować szybszą metodę zakażania kleszczy B. burgdorferi.
- Umożliwić lokalizacje in situ patogenu w tkankach kleszcza.
- Poprawić zrozumienie interakcji kleszcz-patogen.
Zastosowane metody
- Przygotowanie szklanych igieł kapilarnych do mikroiniekcji.
- Mikroiniekcja komórek B. burgdorferi do jelita kleszcza.
- Sekcja kleszczy w celu izolowaniu tkanek jelitowych.
- Imunofluoescencyjne znakowanie B. burgdorferi w tkankach jelitowych.
Główne wyniki
- Skuteczna mikroiniekcja B. burgdorferi do jelit kleszcza.
- Skuteczna lokalizacja patogenu wykazana przez immunofluorescencje.
- Wyniki zwizualizowane za pomocą mikroskopu konfokalnego.
- Metoda znacznie zmniejsza czas zakażenia kleszcza.
Wnioski
- Technika mikroiniekcji jest wykonalną alternatywą do zakażania kleszczy.
- Imunofluoescencja umożliwia precyzyjną lokalizację patogenów.
- To podejście może ułatwić dalsze badania nad przenoszeniem choroby z Lyme.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid and controlled infection of tick vectors with Borrelia burgdorferi enables efficient study of pathogen-vector interactions critical for Lyme disease research. This microinjection approach reduces infection timelines from weeks to hours, supporting high-throughput screening and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides reproducible pathogen delivery, enhancing predictive confidence in target validation and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Borrelia burgdorferi-tick gut interactions to validate therapeutic targets involved in pathogen persistence and transmission.
- Operational Value: Delivers standardized pathogen loads across tick cohorts, reducing variability in infection models and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports functional target de-risking by allowing controlled exposure to pathogen strains, including those attenuated in murine models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates infected tick tissues suitable for downstream immunofluorescence and confocal imaging assays to quantify pathogen localization and burden.
- Operational Value: Produces quantifiable, microscopy-ready outputs that enable standardization of pathogen detection readouts across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large numbers of uniformly infected ticks, supporting assay reproducibility and platform reuse in vector-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a disease-relevant system for studying Borrelia burgdorferi localization in the tick gut, bridging in vitro findings to vector-based pathophysiology.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of pathogen distribution within tick tissues, informing hypotheses about tissue-specific virulence factors and transmission mechanisms.
- Preclinical Model Refinement: Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering consistent pathogen exposure for evaluating intervention efficacy in tick-borne disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation by enabling rapid generation of infected tick vectors and standardized pathogen localization readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of pathogen-vector interactions by delivering controlled quantities of Borrelia burgdorferi to the tick gut for mechanistic interrogation.
- Screening: Produces standardized, infected tick tissues suitable for quantitative immunofluorescence assays, enhancing reproducibility in pathogen detection workflows.
- Analytics: Generates confocal microscopy-based readouts of pathogen localization and burden, enabling comparative analysis across experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Connects in vitro pathogen culture to tick tissue localization, supporting biomarker alignment and pathophysiological relevance in vector-borne disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for infecting ticks with diverse biological agents, including antibodies and RNAi reagents, extending utility beyond Borrelia burgdorferi studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pathogen-vector interactions through localized pathogen detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of tick infection models, reducing time and resource investment compared to natural feeding methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency in early discovery by providing rapid, standardized pathogen exposure models for target de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of Lyme disease research initiatives through reliable, high-fidelity infection models that reduce biological variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques, tick handling, and confocal immunofluorescence microscopy.
- Depends on glass capillary needle preparation, microinjector instrumentation, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of injection parameters and gut dissection protocols across teams to ensure consistent pathogen delivery and localization readouts.
- Adaptation to different tick species or pathogen strains may require optimization of needle size, injection pressure, and bacterial concentration.
- Practical limitations include the technical skill required for successful microinjection and gut dissection, as well as the need for biosafety level two containment when handling human pathogens.
