Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza
14 lutego 2011
Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest mikroiniekcja i lokalizacja komórek Borrelia bergii de ferry w jelicie kleszcza. Cel ten osiąga się najpierw poprzez przygotowanie szklanych igieł kapilarnych i napełnienie ich komórkami Beberg de Ferry. Następnie komórki Beberg de Ferry są przenoszone do jelita kleszcza za pomocą mikroiniekcji.
Kleszcz zostaje następnie poddany sekcji, a tkanki jelita są usuwane. Na koniec przeprowadza się znakowanie immunofluorescencyjne beberg defer w jelicie kleszcza. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące lokalizację beberg to ferry w jelicie kleszcza przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
Witajcie, jestem dr Ruth Paul, adiunkt w Departamencie Medycyny Weterynaryjnej na Uniwersytecie Maryland. Dzisiaj dwoje członków mojego zespołu, Toro Cairo, pracownik postdoktorski, oraz Adam Coleman, student studiów doktoranckich, zaprezentują procedurę sztucznego zakażania kleszczy za pomocą mikrowstrzykiwania, którą rutynowo przeprowadzamy w laboratorium. Po mikrowstrzykiwaniu dokonamy sekcji kleszcza i obrazujemy bakterie w jelitach kleszcza przy użyciu konfokalnego mikroskopu CE.
Główną zaletą mikroiniekcji u kleszczy w porównaniu do uzyskiwania pokolenia kleszczy zakażonych naturalnie jest czas trwania procedury. Mikroiniekcja skraca cały proces z tygodni do godzin, podczas gdy uzyskanie kleszczy zakażonych poprzez naturalny proces żerowania zajmuje około pięciu tygodni. Technikę tę można również dostosować do wstrzykiwania innych użytecznych odczynników, takich jak dwuniciowy RNA do RNAi lub antysera w celu specyficznej interferencji przeciwciał wewnątrz kleszcza.
Aby rozpocząć, należy wykonać kilka igieł do mikroiniekcji poprzez podgrzanie i wyciągnięcie jednofilamentowych szklanych kapilar w urządzeniu do wyciągania mikropipet. Ostrożnie usuń kruche kapilary. Przechowuj zgromadzone igły końcami skierowanymi do góry na taśmie klejącej w szalce Petriego.
Następnie należy hodować b berg de ferry w pożywce BSK. Po osiągnięciu stężenia około 10⁷ komórek na mililitr, należy odwirować b berg de ferry przy 3000 ×g przez 10 minut. W temperaturze pokojowej należy usunąć nadosad i całkowicie resuspendować osad w pożywce BSK, delikatnie przepuszczając go przez sterylną końcówkę 200 µL, aby uzyskać końcowe stężenie 10⁹ komórek na mililitr.
Ponieważ komórki są resuspendTime przy wysokiej gęstości i mogą się zlepiać, zawiesinę komórkową należy niezwłocznie wykorzystać do mikroiniekcji. Aby przygotować kleszcze, należy nakleić przezroczystą dwustronną taśmę klejącą na szkiełko przedmiotowe, pracując na macie klejącej, a następnie ostrożnie przenieść kleszcze z pojemnika. Za pomocą małego pędzla należy umieścić na taśmie klejącej odpowiednią liczbę kleszczy przeznaczonych do iniekcji, stroną brzuszną do góry i skierowanych w tym samym kierunku. Do igły kapilarnej należy nabić 5 µL kultury Beberne de ferry. Używając końcówki pipety o pojemności 20 µL, należy sprawdzić, czy w igle nie ma pęcherzyków powietrza, a następnie ponownie nabić igłę kulturą bakteryjną.
W razie potrzeby należy obejrzeć kleszcza pod binokularem i ustawić ostrość na obszarze otworu odbytniczego. Delikatnie dotknąć końcówką igły kapilarnej, aby przełamać rurkę w miejscu, gdzie jej średnica jest nieco mniejsza niż średnica otworu odbytniczego kleszcza, tworząc w ten sposób igłę do mikroiniekcji. Krok ten jest krytyczny, ponieważ każda próba iniekcji kleszczy przy użyciu nieodpowiednich końcówek igieł powoduje obrażenia i może doprowadzić do śmierci zwierzęcia.
Do wstrzykniętego kleszcza. Unieruchomione kleszcze umieść pod binokularem stereoskopowym i ustaw ostrość na otwór odbytniczy, który jest przykryty dwiema ruchomymi płytkami odbytniczymi. Za pomocą precyzyjnej pęsety delikatnie dotknij i wywrzyj bardzo lekki nacisk na dowolny obszar w pobliżu otworu odbytniczego.
Pozwoli to na rozdzielenie płytek analnych i otwarcie poru analnego łączącego się z jelitem. Ostrożnie wsuń końcówkę igły lekko w otwór analny poprzez wymuszone rozwarstwienie płytek analnych. Należy ograniczyć głębokość wprowadzenia igły do minimum, ponieważ szklana końcówka mogłaby uszkodzić półprzezroczyste jelito tylne łączące się z odbytnicą.
Używając mikroinjektora wyposażonego w zautomatyzowany sterownik nożny, należy wstrzyknąć roztwór beberg de ferry, stosując następujące parametry: ciśnienie wtrysku 1000 hPa, czas wtrysku 0,2 s oraz ciśnienie kompensacyjne 8 hPa. Każde jajo otrzymuje pojedynczy wtrysk w ramach mikroiniekcji.
Kleszcz powinien wykazywać oznaki ruchu lub pełzać w odpowiedzi na bodźce, podobnie jak przed wstrzyknięciem. Aby przeprowadzić sekcję kleszczy do mikroskopii immunofluorescencyjnej, najpierw nanieś kroplę soli fizjologicznej w buforze fosforanowym na czysty szkiełko przedmiotowe do sekcji oraz kolejną kroplę na szkiełko pokryte poli-L-lizyną. Do mikroskopii przygotuj dodatkowe szkiełko przedmiotowe z dwustronną taśmą klejącą. Następnie wyjmij kleszcza z pojemnika i umieść go na dwustronnej taśmie klejącej.
Używając małego pędzla pod mikroskopem sekcyjnym, ustawiając ostrość na kleszcza, umieść ostrze żyletki na kleszczu pomiędzy pierwszą a drugą parą odnóży. Mocno dociśnij, przecinając kleszcza na dwie części i odsłaniając odwłok, a następnie niezwłocznie zanurz odwłok w kropli PBS, używając precyzyjnych pincet. Chwyć grzbietową i brzuszna część egzoszkieletu w miejscu cięcia.
Ostrożnie unieś tarczkę grzbietową i odsuń ją od kleszcza, odsłaniając brązowe odgałęzienia jelita. Należy pamiętać, aby preparowane kleszcze przez cały czas znajdowały się w PBS. Półprzezroczyste pęczki gruczołów ślinowych znajdują się po obu stronach przedniego odcinka jelita i mogą zostać usunięte na tym etapie, jeśli jest to pożądane.
Przytrzymując pozostałą część egzoszkieletu pęsetą, ostrożnie wyciągnij przewód pokarmowy z jamy brzusznej. Dokładnie oczyść przewód pokarmowy, usuwając wszelkie uwięzione tkanki, takie jak tchawki. Za pomocą końcówki precyzyjnej pęsety szybko przenieś przewód pokarmowy kleszcza do kropli PBS na szkiełku przedmiotowym pokrytym poli-L-lizyną.
Podziel jelita na mniejsze fragmenty, używając cienkich ostrzy lub delikatnie naciskając końcówką precyzyjnej pincety. Ostrożnie odessaj nadmiar PBS znajdujący się wokół tkanek jelita. Pozostaw tkanki jelit do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
Utrwal jelito kleszcza, zanurzając je w acetonie na 10 minut. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej; na tym etapie preparaty na szkiełkach mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w temperaturze -20 °C w szczelnym pojemniku. W celu przeprowadzenia znakowania immunofluorescencyjnego jelita, obrysuj utrwalone jelito kleszcza za pomocą pisaka PAP lub innego urządzenia tworzącego barierę hydrofobową.
Dzięki temu roztwory barwiące zostaną zachowane podczas kolejnych etapów inkubacji. Przykryj jelito kleszcza jedną lub kilkoma kroplami buforu blokującego na 30 minut. W temperaturze pokojowej.
Surowica używana do blokowania zależy od gatunku zwierzęcia, w którym wytworzono przeciwciało. Od tego momentu nie wolno dopuścić do wyschnięcia preparatu na szkiełku. Powoli odessać bufor blokujący.
Inkubować jelito z odpowiednimi roztworami przeciwciał pierwotnych i/lub wtórnych. Stosujemy przeciwciała anty-B berg znakowane fluoresceinią lub izotiocyjanianem (FXI). Inkubować przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100 w buforze blokującym przez jedną godzinę.
W temperaturze pokojowej przykryć naczynie folią aluminiową, aby ograniczyć ekspozycję na światło. Usunąć roztwór przeciwciał za pomocą delikatnej aspiracji. Inkubować jelito z barwnikiem fluorescencyjnym w celu znakowania tkanek kleszcza, np. DPI lub jodkiem propidyny.
Zazwyczaj stosujemy 20 µg/mL jodku propidium w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie płuczemy trzy razy 0,05% tween 20 w PBS przez pięć minut. Na koniec preparat na szkiełku montuje się w buforowanym glicerolu zawierającym odczynnik Antifa i ostrożnie przykrywa szkiełkiem nakrywką. Tak przygotowane preparaty można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C w szczelnym pojemniku, a następnie obrazować i lokalizować b berg de ferry pod mikroskopem konfokalnym.
Przedstawiono tutaj mikroiniekcję u kleszcza z użyciem igły wypełnionej błękitem kumasi w celu zwiększenia widoczności. Do wywierania delikatnego nacisku na ciało użyto precyzyjnego pęsety, co umożliwia rozdzielenie płytek analnych i otwarcie otworu analnego w celu wykonania mikroiniekcji. Tutaj pokazano przedni odcinek wyrostka jelita z beberg ferry wewnątrz jelita.
Jądra komórkowe jelit oraz spirochety są znakowane odpowiednio jodkiem propidyny lub przeciwciałami anty-Borrelia burgdorferi sprzężonymi z FITC. Po opanowaniu techniki ustaliliśmy, że 10 kleszczy można mikroiniekować z naturalną przeżywalnością na poziomie stu tysięcy zakażonych B. burgdorferi. Choć kleszcze można wykorzystać do dalszych eksperymentów natychmiast, zazwyczaj czekamy jeden lub dwa dni, aby upewnić się, że przeżyły procedurę, przed kontynuowaniem prac.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak generować sztucznie zainfekowane kleszcze poprzez mikro- i lokalne tworzenie barier w jelicie kleszcza z wykorzystaniem konfokalnej immunofluorescencji. Praca z kleszczami oraz cienkimi szklanymi igłami wypełnionymi ludzkim patogenem, takim jak Borrelia burgdorferi, może być niebezpieczna podczas wykonywania czynności. Należy zachować szczególną ostrożność w kwestii rozmieszczenia kleszczy i igieł oraz przez cały czas stosować środki ostrożności odpowiadające drugiemu poziomowi bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).
Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia opartą na mikroiniekcji metodę zakażania kleszczy bakteriami Borrelia burgdorferi, która znacząco skraca czas wymagany do zainfekowania kleszczy. Ponadto zaprezentowano technikę immunofluorescencji służącą do lokalizacji patogenu w tkankach kleszcza.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia wektorów
- Lokalizacja patogenów
Wstęp
- Borelioza jest wywoływana przez bakterię Borrelia burgdorferi.
- Kleszcze są głównymi wektorami przenoszącymi ten patogen.
- Tradycyjne metody zakażania kleszczy są czasochłonne.
- Szybkie metody zakażania mogą zwiększyć efektywność badań.
Cel badania
- Opracowanie szybszej metody zakażania kleszczy bakterią B. burgdorferi.
- Umożliwienie lokalizacji in situ patogenu w tkankach kleszcza.
- Poprawa zrozumienia interakcji między kleszczem a patogenem.
Zastosowane metody
- Przygotowanie szklanych kapilar do mikroiniekcji.
- Mikroiniekcja komórek B. burgdorferi do jelita kleszcza.
- Disekcja kleszczy w celu wyizolowania tkanek jelita.
- Oznakowanie immunofluorescencyjne B. burgdorferi w tkankach jelita.
Główne wyniki
- Skuteczna mikroiniekcja B. burgdorferi do jelit kleszczy.
- Wykazana efektywna lokalizacja patogenu za pomocą immunofluorescencji.
- Wyniki zwizualizowane przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
- Metoda znacząco skraca czas zakażania kleszczy.
Wnioski
- Technika mikroiniekcji stanowi skuteczną alternatywę dla zakażania kleszczy.
- Immunofluorescencja pozwala na precyzyjną lokalizację patogenów.
- Podejście to może ułatwić dalsze badania nad transmisją boreliozy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka i kontrolowana infekcja kleszczy wektorowych bakteriami Borrelia burgdorferi umożliwia efektywne badanie oddziaływań między patogenem a wektorem, co ma kluczowe znaczenie dla badań nad chorobą z Lyme. Ta metoda mikroiniekcji skraca czas infekcji z tygodni do godzin, wspierając wysokoprzepustowe przesiewanie oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Metoda ta zapewnia powtarzalne dostarczanie patogenu, zwiększając pewność prognostyczną w procesach walidacji celów oraz opracowywania testów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie interakcji między *Borrelia burgdorferi* a jelitem kleszcza w celu walidacji celów terapeutycznych zaangażowanych w persistencję i transmisję patogenu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane dawki patogenów w kohortach kleszczy, co redukuje zmienność w modelach zakażeń i poprawia powtarzalność analiz.
- Wartość predykcyjna: Wspiera funkcjonalne ograniczanie ryzyka w odniesieniu do celu poprzez umożliwienie kontrolowanej ekspozycji na szczepy patogenów, w tym te atenuowane w modelach mysich.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie zakażonych tkanek kleszczy odpowiednich do dalszych analiz z wykorzystaniem immunofluorescence i obrazowania konfokalnego w celu ilościowego oznaczenia lokalizacji i obciążenia patogenem.
- Wartość operacyjna: Umożliwia uzyskanie mierzalnych wyników przygotowanych do analizy mikroskopowej, co pozwala na standaryzację odczytów wykrywania patogenów w kampaniach przesiewowych.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie dużych liczebności jednorodnie zakażonych kleszczy, co wspiera powtarzalność analiz i ponowne wykorzystanie platformy w systemach przesiewowych opartych na wektorach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia system istotny z punktu widzenia choroby do badania lokalizacji Borrelia burgdorferi w jelitach kleszcza, łącząc wyniki otrzymane in vitro z patofizjologią zależną od wektora.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Umożliwia wizualizację rozprzestrzeniania się patogenu w tkankach kleszcza, co pozwala na formułowanie hipotez dotyczących tkankowo specyficznych czynników wirulencji i mechanizmów transmisji.
- Udoskonalenie modelu przedklinicznego: Wspiera decyzje o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, zapewniając spójną ekspozycję na patogen w celu oceny skuteczności interwencji w modelach chorób przenoszonych przez kleszcze.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje kontinuum odkryć – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną – umożliwiając szybkie generowanie zakażonych wektorów kleszczowych oraz standaryzowane odczyty lokalizacji patogenów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących interakcji patogen-wektor poprzez dostarczanie kontrolowanych ilości Borrelia burgdorferi do jelita kleszcza w celu badania mechanizmów tych procesów.
- Przesiew: Pozwala na otrzymanie ustandaryzowanych, zainfekowanych tkanek kleszcza, odpowiednich do ilościowych analiz immunofluorescencyjnych, co zwiększa powtarzalność w procesach detekcji patogenów.
- Analityka: Generuje wyniki lokalizacji i obciążenia patogenem w oparciu o mikroskopię konfokalną, umożliwiając analizę porównawczą pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi i interwencjami.
- Badania translacyjne: Łączy hodowlę patogenów in vitro z ich lokalizacją w tkankach kleszcza, wspierając dopasowanie biomarkerów i znaczenie patofizjologiczne w modelach chorób przenoszonych przez wektory.
- Zastosowania szerokiego profilu: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do zakażania kleszczy różnymi czynnikami biologicznymi, w tym przeciwciałami i odczynnikami RNAi, rozszerzając użyteczność metody poza badania nad Borrelia burgdorferi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w interakcjach patogen-wektor dzięki lokalnej detekcji patogenu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność modeli zakażeń kleszczy, redukując nakłady czasu i zasobów w porównaniu z metodami naturalnego żerowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność podejmowania decyzji go/no-go we wczesnej fazie odkrywania poprzez zapewnienie szybkich, standaryzowanych modeli ekspozycji na patogen w celu minimalizacji ryzyka związanego z celem.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację inicjatyw badawczych nad boreliozą z uwzględnieniem ryzyka dzięki niezawodnym, wysokiej wierności modelom zakażeń, które redukują zmienność biologiczną.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikroiniekcji, obchodzeniu się z kleszczami oraz konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.
- Zależy od przygotowania szklanych kapilar, aparatury mikroinjektora oraz infrastruktury mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga standaryzacji parametrów iniekcji i protokołów dyssekcji jelit w obrębie zespołów badawczych, aby zapewnić spójność dostarczania patogenów i odczytów lokalizacji.
- Adaptacja do różnych gatunków kleszczy lub szczepów patogenów może wymagać optymalizacji rozmiaru igły, ciśnienia iniekcji oraz stężenia bakterii.
- Ograniczenia praktyczne obejmują umiejętności techniczne niezbędne do prawidłowego przeprowadzenia mikroiniekcji i dyssekcji jelit, a także konieczność zachowania poziomu bezpieczeństwa biologicznego BSL-2 podczas pracy z patogenami ludzkimi.
