Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co pozwala na optyczne obrazowanie infekcji całego ciała u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą być zakażone patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby jest wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie ilościowego obrazu infekcji u żywych zwierząt, który może umożliwić lokalizację organizmu infekującego w tkankach i narządach gospodarza. Znieczulone myszy są najpierw zakażane dotchawiczo bakteriami bioluminescencyjnymi. Zakażonym myszom wstrzykuje się następnie lucyferian, który umożliwia przeprowadzenie obrazowania na żywo w systemie IVIS.

Po uzyskaniu obrazów całego ciała pobiera się zainfekowane płuca. Obrazowanie izolowanych narządów można wykonać, aby wykazać prawdziwą lokalizację patogenu. Po obrazowaniu płuca są homogenizowane i rozcieńczane na pożywce bakteryjnej w celu ilościowego określenia obciążenia mikrobiologicznego.

Ostatecznie uzyskuje się wyniki, które pokazują lokalizację i liczbę patogenów obecnych w organizmie gospodarza w czasie rzeczywistym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą jest to, że patogeny mogą być wizualizowane i monitorowane u żywych zwierząt za pomocą obrazowania w czasie rzeczywistym, co zapewnia wgląd w tiki przestrzenne infekcji mikrobiologicznej. Tę procedurę zademonstrują dr Mihi Chang, doktor habilitowany w moim laboratorium, oraz SWAT Cillo, badacz w moim laboratorium.

Zacznij od iniekcji dootrzewnowej, wstrzykując sześciu do 12 tygodniowym myszom z zastawką C wstępnie zmieszany roztwór znieczulający zawierający 100 mikrogramów ketaminy i 10 mikrogramów ksylazyny na gram masy myszy. Umieść myszy z powrotem w klatkach, aż znieczulenie zacznie działać. Aby ustalić, czy znieczulenie zostało zakończone, ściśnij podkładkę pod stopy każdej myszy i upewnij się, że nie wystąpi reakcja odruchowa pedału.

Gdy zwierzęta zostaną w pełni znieczulone, weź jedną mysz i umieść ją na intubacji. Stań leżąc na plecach. Użyj taśmy, aby przymocować nogi i ręce myszy do stojaka.

Przymocuj gumkę recepturkę do stojaka do intubacji. Następnie umieść go pod górnymi siekaczami myszy. Gdy mysz zostanie unieruchomiona, użyj kleszczy, aby delikatnie wyciągnąć język z ust.

Następnie delikatnie włóż wziernik z otoskopem do ust myszy i znajdź otwór krtani, który znajduje się przed przełykiem po brzusznej stronie jamy ustnej i gardła. Po zidentyfikowaniu ujścia krtani włóż jednocalowy cewnik o rozmiarze 22 zawierający drut prowadzący do tchawicy, aż piasta cewnika dotrze do siekaczy. Usuń przewód doprowadzający i podłącz cewnik do plastikowej pompy.

Następnie wepchnij powietrze do cewnika. Klatka piersiowa myszy napompuje się, jeśli intubacja jest prawidłowa. Po potwierdzeniu prawidłowego umieszczenia cewnika należy wlać pipetą 50 mikrolitrów bioluminescencyjnego roztworu bakteryjnego o pożądanym stężeniu do cewnika i podłączyć jednomililitrową strzykawkę z 50 mikrolitrami powietrza, aby wepchnąć roztwór do płuc myszy.

Dwa lub trzy razy wyjmij cewnik i umieść mysz z powrotem w klatce, aby mogła dojść do siebie po znieczuleniu. Przed wykonaniem obrazowania bioluminescencyjnego należy znieczulić myszy za pomocą izofluranu. Gdy myszy zostaną w pełni znieczulone, wyjmij je z komory indukcyjnej i delikatnie nałóż maść optyczną, aby chronić oczy zwierzęcia.

Podczas obrazowania umieść myszy w komorze obrazowania po jednym stożku nosowym na kolektorze anestezjologicznym. Użyj przegrody świetlnej między myszami, aby zapobiec odbiciu światła między sąsiednimi zwierzętami. Na koniec wstrzyknij każdej myszy dootrzewnowej 150 mikrogramów na gram masy ciała Lucyfera.

Pozwól Lucyferowi rozproszyć się po ciałach zwierzęcia przez 10 minut. Następnie rozpocznij obrazowanie. Uruchom żywe oprogramowanie do obrazowania i zainicjuj system obrazowania IVIS.

Aby najpierw ustawić parametry, kliknij Ustawienia sekwencji. Następnie wybierz tryb luminescencji i obrazowania fotograficznego. Wybierz fotograficzne obrazy luminescencyjne i strukturalne światła jako część sekwencji obrazów, aby umożliwić rekonstrukcję DLIT 3D.

Następnie ustaw czas ekspozycji na jedną minutę. Następnie ustaw binning na średni, a przysłonę na jeden. Ustaw filtr wzbudzenia na zablokowany, a filtry emisji na otwarte w celu rekonstrukcji 3D, włącz wiele filtrów o różnych długościach fal.

Aby umożliwić dokładną lokalizację źródła sygnału, wybierz pole widzenia odpowiadające liczbie wizualizowanych myszy. Po zdefiniowaniu wszystkich ustawień kliknij przycisk Dodaj w kreatorze obrazu w panelu sterowania, aby dodać konfigurację sekwencji, a następnie kliknij przycisk Pobieraj, aby rozpocząć sekwencję obrazowania podczas akwizycji. Zapisz szczegóły i warunki eksperymentu w oknie edycji obrazu i zapisz obrazy.

Na koniec wyjmij myszy z komory obrazowania i umieść je z powrotem w klatkach. Stale monitoruj zwierzęta, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia. W celu obrazowania tkanek humanitarnie poddaj myszy eutanazji.

W tym momencie aseptycznie zbierz płuca każdej myszy i przenieś narządy na sterylną szalkę Petriego. Umieść szalkę Petriego zawierającą zainfekowane płuca w komorze obrazowania i uzyskaj obrazy bioluminescencji w taki sam sposób, jak opisano wcześniej w tym filmie. Po uzyskaniu obrazów wyjmij szalkę Petriego z komory obrazowania i za pomocą sterylnych kleszczy przenieś płuca do probówki zawierającej jeden mililitr sterylnego PBS za pomocą homogenizatora homogenizuj płuca przez dwie do pięciu minut.

Przygotować seryjne rozcieńczanie homogenatów płuc w sterylnym PBS. Następnie rozlać 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na szalki Petriego zawierające selektywne podłoże. Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż kolonie bakterii będą wyraźnie widoczne.

Następnie policz CFU, aby ocenić poziom infekcji. Uruchom oprogramowanie obrazu na żywo i otwórz żądane pliki obrazów z przeglądarki plików. Na palecie narzędzi.

Kliknij Dostosuj obraz, aby zmodyfikować ustawienia korekcji i filtrowania, a także progi skali kolorów. Aby określić ilościowo intensywność luminescencji, użyj obszaru zainteresowania lub narzędzi ROI z listy rozwijanej, wybierz numer i rozmiar kształtu ROI. Następnie kliknij pomiar ROI i zapisz dane ilościowe, aby zrekonstruować obrazy 3D.

Najpierw załaduj sekwencję obrazów, w tym obrazy światła strukturalnego. Kliknij topografię powierzchni w palecie narzędzi. Następnie z listy rozwijanej wybierz kartę rekonstrukcja, aby wygenerować topografię powierzchni.

Następnie wybierz rekonstrukcję DILT 3D z palety narzędzi. Kliknij zakładkę właściwości na liście rozwijanej i ustaw właściwości tkanki oraz widmo źródłowe na mięsień. Kliknij kartę analizy i wybierz długość fali do analizy.

Następnie kliknij przycisk Start. Po dostosowaniu wszystkich ustawień kliknij przycisk rekonstrukcji, aby rozpocząć analizę 3D. Po zakończeniu rekonstrukcji 3D wybierz widok 3D, aby wyświetlić wyniki, klikając zakładkę wyników, można wyświetlić gęstość fotonów, woksele danych i parametry algorytmu, zapisać wyniki i wyeksportować dane i obrazy do dalszej analizy.

Jak pokazano na tym rysunku, dwie myszy po prawej, które zostały zakażone dotchawiczo 10 do szóstej CFU bakterii bioluminescencyjnych, wytwarzają silny sygnał z obszaru płucnego, podczas gdy niezakażona mysz po lewej nie wytwarza. Podobna analiza z wykorzystaniem wypreparowanych płuc od zakażonych myszy potwierdza, że luminescencja emanuje z płuc, a nie z jakiejś innej ściśle przylegającej tkanki. Sygnał emitowany z próbki można łatwo określić ilościowo jako całkowity strumień w obszarze zainteresowania.

Analiza tomograficzna potwierdza, że pozycja luminescencji wyświetlanej na tych obrazach jako czerwone pola mieści się w obszarze zawierającym płuca myszy, jak określono za pomocą rekonstrukcji 3D. Wreszcie, podobieństwo między zmierzoną krzywą gęstości fotonów po lewej stronie a symulowaną krzywą gęstości fotonów po prawej stronie świadczy o dobrej jakości rekonstrukcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować zwierzęta zarażone precedensem i analizować obrazy w celu lokalizacji i kwantyfikacji reminiscencji.